專利名稱：臍帶間質(zhì)干細胞來源膜性囊泡及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于藥物研發(fā)，細胞生物學、分子生物學領域。涉及臍帶間質(zhì)干細胞(human umbilical cordmesenchymal stem cell，hucMSC)中活性成分膜性囊泡(exosome)的提取 及其在制備治療肝腎損傷及皮膚疾病藥物中應用。
背景技術：
hucMSC移植治療肝、腎及皮膚損傷疾病越來越引起人們的重視，但由于MSC存在 移植存活率低及長期臨床應用可能存在致瘤隱患等不足使得其臨床應用受到限制，因此， 尋找一種操作簡單、安全有效的基于MSC的非細胞療法顯得十分重要。研究表明MSC主要 通過旁分泌效應來改善心肌功能，而MSC分泌的膜性囊泡是旁分泌中最有效的活性成分， 在細胞信息傳遞中起著重要作用，具有組織損傷修復潛能。膜性囊泡(exosome)含有其來源細胞的胞膜和胞質(zhì)蛋白成分，因此它較易與鄰近 細胞的胞膜發(fā)生融合，進而將一個細胞的胞膜及胞質(zhì)蛋白傳遞給另一個細胞，在不同細胞 間進行信息傳遞。此外，許多細胞包括MSC分泌的膜性囊泡還包含著能夠在細胞間進行轉(zhuǎn) 移的RNAOiiRNA及microRNAs)，通過在細胞間水平轉(zhuǎn)移方式激活靶細胞產(chǎn)生一些列生物學 效應。因此，膜性囊泡在細胞微環(huán)境中具有十分重要的作用。Brimo等研究發(fā)現(xiàn)MSC可分泌 一種直徑SOnm-Iym大小的非可溶性微泡，它對急性腎損傷具有修復作用。這些從MSC上清 中分離出來的微泡在體外能夠促進腎小管上皮細胞的增殖及抗凋亡，將其標記后注射到急 性腎損傷動物模型體內(nèi)，可發(fā)現(xiàn)微泡在6h內(nèi)即在腎損傷部位發(fā)生了聚集。2008年Timmers 等首次報道人胚胎干細胞來源的MSC培養(yǎng)上清液經(jīng)25倍濃縮后在豬心肌缺血再灌注損傷 模型中能減小心肌梗死面積，有效的保護心臟功能，同時，他們還將MSC-CM按直徑大小分 級過濾后通過靜脈或冠狀動脈分別注入小鼠心肌缺血再灌注模型體內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅分子量 大于IOOOKDa和直徑在50-100nm的大的復合物對小鼠心肌缺血再灌注損傷有修復和保護 作用，而MSC-CM中的其他成分沒有修復作用，進一步的研究發(fā)現(xiàn)這種復合物可能就是胚胎 干細胞來源的MSC分泌的膜性囊泡。這些研究表明，MSC可通過旁分泌膜性囊泡在細胞間 進行信息傳遞進而通過某種機制對受損組織進行修復，這一旁分泌機制為基于臍帶MSC的 非細胞治療奠定了重要基礎。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種臍帶間質(zhì)干細胞來源的膜性囊泡(hucMSC-exosome)，并 提供該膜性囊泡在制備治療肝、腎及皮膚損傷疾病藥物中的應用。本發(fā)明的目的是通過以下方式實現(xiàn)的臍帶間質(zhì)干細胞來源的膜性囊泡，是通過 下述方法提取，包括(1)分離培養(yǎng)人臍帶間質(zhì)干細胞；(2)間質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基制備；(3) 膜性囊泡分離純化；其中，步驟(1)人臍帶間質(zhì)干細胞的分離培養(yǎng)包括取無菌新生兒新鮮臍帶，經(jīng)磷 酸鹽緩沖液(PBS)反復沖洗后，剪成直徑約1 2mm大小的組織塊；含10%胎牛血清L-DMEM營養(yǎng)液，5%C02、37°C飽和濕度培養(yǎng)；去除非貼壁細胞，貼壁細胞80%融合后0. 25%胰蛋白 酶消化進行傳代培養(yǎng)。步驟(2)間質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基制備包括取3 5代的間質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng) 48h ；收集培養(yǎng)上清液，2000g，10min離心除去細胞碎片；0. 22 y m無菌濾膜過濾得到間質(zhì)干 細胞條件培養(yǎng)基。步驟(3)膜性囊泡分離純化包括間質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基4°C，1000g離心lOmin， 收集上清；lOOKDaMWCO超濾離心管中，4°C，1000g離心30min，得到含膜性囊泡濃縮液；濃縮 液移至30%的蔗糖/D20密度墊上(1. 210g/cm3)，4°C，100000g離心60min，收集底部2ml的 緩沖墊；PBS稀釋緩沖墊，100kDa MWC0超濾離心管中，1000g離心30min，收集的膜性囊泡濃 縮液，0. 22 ym濾膜過濾除菌，得到臍帶間質(zhì)干細胞來源膜性囊泡。將本發(fā)明所述的臍帶間質(zhì)干細胞來源的膜性囊泡用于治療肝腎損傷模型的效果 評價(1) 一般情況精神狀態(tài)和活動狀態(tài)、進食和大小便情況；(2)肝腎功能與血清生化指 標；(3)肝腎膠原分泌；(4)肝腎病理組織結(jié)構與形態(tài)；(5)肝腎免疫組織化學；(6)上皮組 織病理組織結(jié)構與形態(tài)。所述的肝、腎及皮膚損傷疾病模型包括四氯化碳所致小鼠急性肝損傷模型、順鉬 所致大鼠腎損傷模型、大鼠急性腎缺血再灌注損傷模型及大鼠皮膚燙傷模型。上述利用本發(fā)明所述的人臍帶間質(zhì)干細胞膜性囊泡作為藥物輸注小鼠急性肝損 傷、大鼠腎損傷及大鼠皮膚燙傷模型的實驗證明，該藥物能夠改善肝、腎功能及皮膚狀態(tài)， 促進肝、腎及皮膚病理恢復，，降低死亡率，達到阻滯和逆轉(zhuǎn)肝腎損傷的發(fā)展目的，為臨床治 療肝腎損傷開辟新途徑。本發(fā)明的優(yōu)點在于1.本發(fā)明人臍帶間質(zhì)干細胞膜性囊泡的制備技術方案簡便、易操作、保存方便。2.本發(fā)明所利用人臍帶間質(zhì)干細胞膜性囊泡可-80°C保存，避免了 MSC凍存復蘇 的不便，融解后即可使用，使用時間易于掌握。3.人臍帶間質(zhì)干細胞膜性囊泡用于肝、腎及皮膚損傷疾病的治療，其使用濃度、劑 量及途徑更易控制，技術可推廣程度高，安全性好。4.為臨床治療肝、腎及皮膚損傷開辟間質(zhì)干細胞活性成分療法的新途徑。
圖lhucMSC-exosome電鏡下形態(tài)，40 100nm的膜性微囊結(jié)構，圓形或橢圓形 (X9700)。圖2SDS-PAGE電泳及Western-blot分析膜性囊泡(exosome)蛋白含量及特異標 志A人臍帶MSCs來源的膜性囊泡SDS-PAGE凝膠電泳圖像；B ffestem-blot檢測人臍帶 MSCs來源的膜性囊泡表達⑶9分子。圖3huCMSC-eX0S0me表面標志CD9、CD44流式分析A前向散射、側(cè)向散射散點圖； B未標記膜性囊泡對照；C膜性囊泡⑶29標記；D膜性囊泡⑶44標記。圖4huCMSC-eXOSOme治療20%深II度SD大鼠燙傷模型療效觀察(治療后24小 時)。圖5huCMSC-eXOSOme治療20%深II度SD大鼠燙傷模型療效觀察(治療后4天)。
圖6TUNEL染色檢測hucMSC-exosome抑制缺氧腎小管上皮細胞(NRK-52E)凋亡， 腎小管上皮細胞細胞缺氧/復氧或順鉬作用后，細胞核皺縮，TUNEL深染，細胞形態(tài)較大，且 不規(guī)則。加入膜性囊泡后，細胞形態(tài)較好，隨膜性囊泡濃度增高TUNEL陽性細胞逐漸減少。 A對照組(損傷未治療組)；B低濃度組；C中濃度組；D高濃度組。圖7huCMSC-eXOSOme對順鉬作用腎小管上皮細胞的體外保護，結(jié)果表明腎小管上 皮細胞細胞在缺氧4小時，復氧48小時后，細胞增殖緩慢，加入膜性囊泡后細胞增殖有所恢 復，且呈現(xiàn)出濃度依賴關系。圖ShucMSC-exosome修復四氯化碳(CCL4)誘導小鼠急性肝損傷，正常小鼠肝組織 表面光滑、質(zhì)軟，無結(jié)節(jié)和囊腫，色澤粉紅，未見淤血、脂肪變性，無明顯腫大或萎縮；CCLJ^ 傷組小鼠肝臟被膜光澤差，粗糙，呈暗紅色；臍帶間質(zhì)干細胞移植組小鼠肝臟表面顆?；?低，無灰白色結(jié)節(jié)；膜性囊泡治療組小鼠肝組織表面與臍帶間質(zhì)干細胞治療組相似，肝表面 光滑度增加，顆粒化降低。圖9huCMSC-eXOSOme修復四氯化碳(CCL4)誘導小鼠急性肝損傷后，肝組織切片HE 染色顯示與CCL4組相比，細胞結(jié)構更加完整，炎癥細胞降低。TUNEL染色結(jié)果表明exosome 治療后組織凋亡比例明顯降低。
具體實施例方式實施例一臍帶間質(zhì)干細胞來源膜性囊泡(hucMSC-exosome)的制備1、分離培養(yǎng)人臍帶間質(zhì)干細胞按本課題組先前建立的人臍帶MSC分離培養(yǎng)及鑒定方法體外培養(yǎng)擴增人臍帶 MSC(Chun Qiao，et al. Cell Biology International，2008，32 :8_15)。具體是取無菌新 生兒新鮮臍帶，經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)反復沖洗后，剪成直徑約1 2mm大小的組織塊；含 10%胎牛血清L-DMEM營養(yǎng)液，5%C02、37°C飽和濕度培養(yǎng)；去除非貼壁細胞，貼壁細胞80% 融合后0. 25%胰蛋白酶消化進行傳代培養(yǎng)。2.人臍帶間質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基(MSC-CM)的制備選擇增殖能力強，狀態(tài)好的健康人臍帶MSC，無血清培養(yǎng)48h后收集培養(yǎng)上清 液，2000g，IOmin離心除去細胞碎片等，再經(jīng)0. 22 μ m無菌濾膜過濾后即為MSC-CM，用于 exosome的分離。3. hucMSC-exosome 的分離鑒定(1)hucMSC-exosome的分離將收集的人臍帶MSC-CM于4 °C條件下，分別采用 濾膜分級過濾濃縮、濃縮超濾及梯度超速離心法、HPLC法分離并純化hucMSC-CM來源的 exosome，將收集的exosome濃縮液定量，0. 22 μ m濾膜過濾除菌，分裝，于_80°C冷藏備用。(2)hucMSC-exosome的鑒定①透射電鏡觀察exosome —般形態(tài)，取懸置均勻的 exosome溶液，3%磷鎢酸溶液負染后電鏡下觀察exosome形態(tài)，并拍攝電鏡照片(圖1)，隨 機選取20個exosome，根據(jù)標尺記錄其直徑。②SDS-PAGE分離蛋白及凝膠圖象分析，將提 取的exosome經(jīng)10% SDS-PGAE電泳分離蛋白，取出分離膠并用0. 05%考馬斯亮藍R-250染 色，脫色后采用影像分析儀掃描圖像并分析(如圖2A)。③western-blot檢測⑶9、⑶81、 Alix及hsp70等蛋白分子，檢測exosome相關蛋白在hucMSC-exosome中的表達(如圖2B)。 ④流式細胞術檢測hucMSC-exosome表面標志，將分離純化后的exosome與FITC或PE標記的鼠抗人CD29、CD44、HLA-DR等作用后，經(jīng)流式細胞儀檢測，并與其來源MSC進行比較(如 圖3)。實施例二 hucMSC-exosome對小鼠20%深II度SD大鼠燙傷模型的療效觀察(1)實驗動物分組與20%深II度燙傷模型制備潔級SD大鼠，體重約120 130g， 數(shù)量共6只，雌雄各半，分為對照組、臍帶間質(zhì)干細胞治療組，臍帶間質(zhì)干細胞exosome治療 組，每組2只，雌雄各一只。將麻醉好的大鼠放置于操作臺上，根據(jù)Rubner公式計算出20% 的大鼠體表面積。剪去背部毛發(fā)，硫代硫化鈉脫毛后，將其置于82°C水中，8秒鐘后，迅速取 出，用紗布擦干(避免進一步加重創(chuàng)面損傷)，補給生理鹽水6ml，用無菌紗布包扎。(2)治療方法燙傷后3h，在燙傷面外周取3個點進行皮下定點注射。對照組、臍 帶間質(zhì)干細胞治療組，臍帶間質(zhì)干細胞exosome治療組動物分別注射500 yl 0. 1M/L PBS、 500 u 1 3.0X102/u 1臍帶間質(zhì)干細胞懸液，500ul蛋白濃度為29. 14ug/u 1臍帶間質(zhì)干 細胞來源的exosome。治療后外以敷料適度包扎固定，單籠飼養(yǎng)。(3)療效觀察在治療后24h(如圖4)、96h(如圖5)發(fā)現(xiàn)損傷后皮膚創(chuàng)面顏色變紅， 質(zhì)地變軟、結(jié)痂，無滲出液、感染、潰破、脫痂。HE染色觀察表明損傷皮膚組織的上皮細胞增 殖增加，炎癥細胞浸潤降低。實施例三AucMSC-exosome對大鼠腎小管上皮細胞(NRK)缺氧模型的修復作用NRK細胞缺氧模型的建立NRK細胞5% C02，2% 02，37°C，飽和濕度的條件下缺氧 4小時，后加入eXOSOme48小時后，檢測各項指標。加入劑量低劑量組(0.5mg/5X 105cells)中劑量組(lmg/5X105cells)高劑量組(2mg/5X105cells)利用流式細胞術，TUNEL,免疫組織化學評價hucMSCs分泌的exosome在體外對NRK 細胞缺氧模型的修復作用。應用定量PCR，Western blot等技術初步探討損傷修復的主要機 制。NRK細胞缺氧/復氧或順鉬作用后，細胞核皺縮，TUNEL深染，細胞形態(tài)較大，且不規(guī)則。 加入exosome后，細胞形態(tài)較好，隨exosome濃度增高TUNEL陽性細胞逐漸減少(如圖6)。 NRK細胞在缺氧4h，復氧48h后，細胞增殖緩慢，加入exosome后細胞增殖有所恢復，且呈現(xiàn) 出濃度依賴關系。NRK細胞缺氧/復氧后，細胞G2期為0. 0%，而低濃度exosome治療后， G2開始有恢復，中濃度和高濃度exosome治療后，G2期基本恢復正常(如圖7)。實施例三AucMSC-exosome對小鼠CCL4急性肝損傷模型治療作用(1)小鼠肝損傷模型的建立肝損傷動物模型體重20 23g BALB/c小鼠30只，分為3組(hucMSCs處理 組，exosome處理組，空白對照組)，雌雄各半，禁水24h后腹腔注射10%四氯化碳0. 3ml/ kg. bw0腹腔注射四氯化碳后72h分別放血處死各組SD大鼠數(shù)只，取肝臟將其固定于4%甲 醛中，經(jīng)常規(guī)脫水，石蠟包埋，切5 ii m厚切片，常規(guī)HE染色、Masson染色和Retculin染色， 光鏡下觀察。肝小葉中央?yún)^(qū)中央靜脈周圍出現(xiàn)較多壞死細胞，壞死細胞范圍達高倍視野的 10 %，壞死細胞類型包括凝固性壞死和溶解性壞死，壞死區(qū)有少量炎細胞浸潤，局部網(wǎng)狀纖 維支架尚存；除明顯壞死外，肝小葉中央?yún)^(qū)有少量細胞氣球樣變和脂肪變性。肝損傷模型建 立。
(2) exosome治療肝損傷模型研究①在(1)基礎上，各處理組小鼠腹腔注射10%四氯化碳72h后，分別經(jīng)尾靜脈或肝 局部定點輸注hucMSCs和exosome，每只小鼠輸注的細胞量為3X106，exosome為500 μ g， 體積為200 μ 1，空白對照組尾靜脈輸注等體積的PBS。②實驗組和對照組在輸注細胞后的 第2d、4d、8d采尾靜脈血，檢測血清ALB、AST等指標；③各組在輸注細胞或exosome后的第 2d、4d、8d，分別處死1只小鼠取腎臟、心臟、肝臟、肺、腦等制備組織切片，熒光顯微鏡下觀 察細胞及exosome定位情況。免疫組化觀察細白蛋白(Albumin，ALB)、核增殖抗原(PCNA) 等指標，TUNNEL檢測細胞凋亡，同時通過病理組織切片觀察肝臟組織的修復情況；④采用 RT-PCR、Real-time PCR等方法分析測定各處理組和對照組的肝細胞功能相關基因的表達 水平；⑤在輸注細胞或exosome后的第2d、4d、8d，收集肝組織提取mRNA和總蛋白，檢測增 殖、凋亡相關通路活化；⑥長期觀察各處理組小鼠的生存時間，制作KM生存曲線。正常小鼠肝組織表面光滑、質(zhì)軟，無結(jié)節(jié)和囊腫，色澤粉紅，未見淤血、脂肪變性， 無明顯腫大或萎縮；CCL4損傷組小鼠肝臟被膜光澤差，粗糙，呈暗紅色；臍帶間質(zhì)干細胞 移植組小鼠肝臟表面顆粒化降低，無灰白色結(jié)節(jié)；膜性囊泡治療組小鼠肝組織表面與臍帶 間質(zhì)干細胞治療組相似，肝表面光滑度增加，顆粒化降低(如圖8)。免疫組化檢測發(fā)現(xiàn) exosome治療后肝組織增殖增加、凋亡降低(如圖9)。
權利要求
一種臍帶間質(zhì)干細胞來源膜性囊泡，其特征在于通過以下方法制得(1)培養(yǎng)人臍帶間質(zhì)干細胞；(2)間質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基制備；(3)膜性囊泡分離純化。
2.根據(jù)權利要求1所述的臍帶間質(zhì)干細胞來源膜性囊泡，其特征在于，步驟(1)具體 是取無菌新生兒新鮮臍帶，經(jīng)磷酸鹽緩沖液反復沖洗后，剪成直徑約1 2mm大小的組織 塊；含10%胎牛血清L-DMEM營養(yǎng)液，5% C02、37°C飽和濕度培養(yǎng)；去除非貼壁細胞，貼壁細 胞80%融合后0. 25%胰蛋白酶消化進行傳代培養(yǎng)。
3.根據(jù)權利要求1所述的臍帶間質(zhì)干細胞來源膜性囊泡，其特征在于，步驟(2)是: 3 5代的間質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)48h ；收集培養(yǎng)上清液，2000g，lOmin離心除去細胞碎片； 0. 22um無菌濾膜過濾得到間質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基。
4.根據(jù)權利要求1所述的臍帶間質(zhì)干細胞來源膜性囊泡，其特征在于，步驟(3)是間 質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基4°C，1000g離心lOmin，收集上清；lOOKDa MWC0超濾離心管中，4°C， 1000g離心30min，得到含膜性囊泡濃縮液；濃縮液移至30 %的蔗糖/D20密度墊上，4°C， 100000g離心60min，收集底部2ml的緩沖墊；PBS稀釋緩沖墊，100kDa MWC0超濾離心管中， 1000g離心30min，收集的膜性囊泡濃縮液，0. 22 u m濾膜過濾除菌，得到臍帶間質(zhì)干細胞來 源膜性囊泡。
5.權利要求1-4之一所述的臍帶間質(zhì)干細胞來源膜性囊泡在制備治療肝、腎或皮膚損 傷疾病藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明涉及臍帶間質(zhì)干細胞中活性成分膜性囊泡(exosome)的提取及其在制備治療肝腎損傷及皮膚疾病藥物中應用。所說的臍帶間質(zhì)干細胞來源膜性囊泡，是通過以下方法制得(1)培養(yǎng)人臍帶間質(zhì)干細胞；(2)間質(zhì)干細胞條件培養(yǎng)基制備；(3)膜性囊泡分離純化。本發(fā)明所述的人臍帶間質(zhì)干細胞膜性囊泡作為藥物輸注小鼠急性肝損傷、大鼠腎損傷及大鼠皮膚燙傷模型的實驗證明，該藥物能夠改善肝、腎功能及皮膚狀態(tài)，促進肝、腎及皮膚病理恢復，降低死亡率，達到阻滯和逆轉(zhuǎn)肝腎損傷的發(fā)展目的，為臨床治療肝腎損傷開辟新途徑。
文檔編號A61K35/44GK101890050SQ201010226049
公開日2010年11月24日 申請日期2010年7月14日 優(yōu)先權日2010年7月14日
發(fā)明者嚴永敏, 朱偉, 毛飛, 沈俐, 許文榮, 錢暉, 黃玲 申請人:江蘇大學