一種從人臍帶中提取間充質(zhì)干細胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及干細胞及組織工程領(lǐng)域，特別是一種從人臍帶中提取間充質(zhì)干細胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是干細胞的一類，來源于發(fā)育早期中胚層，是具有高度自我更新和多向分化潛能的多功能干細胞，并能在特定條件下分化為軟骨細胞、成骨細胞、肌肉細胞、脂肪細胞等；由于間充質(zhì)干細胞具有強大的增殖能力、較強的多向分化潛能、以及其低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)功能，成為組織工程中的理想種子細胞；因而在細胞替代治療和組織工程方面顯示出巨大價值而備受關(guān)注。
[0003]在成體干細胞中，間充質(zhì)干細胞廣泛存在于全身各種組織中，特別是骨髓、脂肪組織、臍血，甚至外周血也發(fā)現(xiàn)有間充質(zhì)干細胞。臨床研究中的MSCs主要來自于骨髓，其含量很少，約占骨髓單個核細胞總數(shù)的1/104?1/105，且其數(shù)量及分化潛能隨年齡增加而降低。
[0004]胚胎期的MSCs可能基于其端粒長度的優(yōu)勢，具有更加強大的增殖及分化能力。因此，較小胎齡的hUCMSCs (人臍帶來源的間充質(zhì)干細胞)更能滿足臨床研究的需要。胚胎形成過程中，滋養(yǎng)層細胞形成胎膜、臍帶、胎盤。臍帶是連于胎兒臍部與胎盤間的條索狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)含來自中胚層的膠樣結(jié)蒂組織，結(jié)構(gòu)上含有一條靜脈和兩條動脈，三條血管一端與胎盤相續(xù)，另一端與胎兒血管連接，血管周圍富含膠原結(jié)締組織-wharton’ s jelly。間充質(zhì)干細胞隨著胎兒的成熟及其血液循環(huán)，大部分定位在臍靜脈內(nèi)皮下層和胎盤。
[0005]臍帶wharton’ s jelly來源的MSCs是新近發(fā)現(xiàn)的一類MSCs,有研究表明每厘米臍帶中含有4X 15個MSCs，其充足的數(shù)量、廣泛的來源、更強的增殖分化能力以及極低的免疫原性，不涉及法律倫理等優(yōu)勢越來越受到人們的重視。然而人臍帶MSCs的培養(yǎng)并非易事，特別是如何穩(wěn)定、高效地從臍帶中獲得MSCs是其能否成為理想MSCs來源的關(guān)鍵。
[0006]據(jù)文獻報道人臍帶間充質(zhì)干細胞的分離方法主要有組織貼壁法和酶消化法。組織塊貼壁法是將臍帶切割為細小組織塊直接貼附于培養(yǎng)基上，利用間充質(zhì)干細胞具有遷移能力這一重要特性而獲得直接貼壁的MSCs，一般15天左右可獲得原代細胞，這一周期過長，而酶消化法因其周期較短，而成為目前主要的研究方向。
[0007]近年來，酶消化法多采用膠原酶與胰蛋白酶并用，或添加透明質(zhì)酸酶、梭菌酶等聯(lián)合消化，增加其對臍帶組織的分離作用，以期獲得更多的間充質(zhì)干細胞。袁源、Sarugaser等應用透明質(zhì)酸酶、胰酶及膠原酶等酶復合物消化臍帶組織，所分離獲得的MSCs在14個細胞/cm。如何短時間獲取大量功能狀態(tài)良好的臍帶間充質(zhì)干細胞，維持MSCs的原始狀態(tài)，及控制MSCs分化方向是當前研究的熱點也是難點。對于UMSCs臍帶間充質(zhì)干細胞的體外培養(yǎng)，目前大多添加胎牛血清(FBS)，但臨床應用上不允許使用動物來源制品，只能選擇昂貴的無血清專用培養(yǎng)基，從而造成細胞培養(yǎng)成本的大幅增加。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]針對現(xiàn)有人臍帶間充質(zhì)干細胞的分離，培養(yǎng)技術(shù)中存在的問題與不足，本發(fā)明的目的是提供一種人臍帶間充質(zhì)干細胞的分離，培養(yǎng)方法，克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題。
[0009]其解決問題的技術(shù)方案是:
一種人臍帶間充質(zhì)干細胞的分離方法，由下述步驟組成:
步驟一:將在無菌條件下獲得的臍帶用磷酸鹽緩沖液清洗血跡，然后在培養(yǎng)皿中用酒精棉球消毒臍帶，剪成2cm的小段，擦拭掉臍帶里面以及外面殘留的血液，再剖除動、靜脈以及臍帶外膜，制成組織塊；
步驟二:將步驟一中獲得的臍帶組織塊剪成Imm3大小的碎塊放入50ml離心管中，加入等體積的膠原酶I，置于37°C培養(yǎng)箱中持續(xù)消化3-10h ；
步驟三:加入8-10倍消化液體積的生理鹽水稀釋步驟二中的消化液，200目篩網(wǎng)過濾，800g，15min離心收集細胞；
步驟四:合并細胞沉淀,再加入2倍體積的生理鹽水沖洗細胞，500g, 5min離心，收集細胞；
步驟五:使用添加有5%組成為:3%-6%結(jié)合蛋白；0.5%-1.5%生長因子；0.5%-1.5% (組氨酸:脯氨酸3:1) ；0.03%-0.07%固醇類激素；0.1%-0.5%【(維生素B1:維生素B2:維生素B6:維生素 B12 1:1:1:1):維生素 C:維生素 D:維生素 E I:1:1:1]；0.01%-0.03% (鐵:鋅:鑰:鈷2:2:1:1)；0.5%-l.5%粘附因子；87.4%_95.36%去離子水的血清替代物的MEM-α培養(yǎng)基重懸細胞并接種于1cm細胞培養(yǎng)皿中，于37°C、體積分數(shù)為5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)，3-4d后添加新鮮的含有5%血清替代物的MEM- α培養(yǎng)基，待細胞達到80%融合時用
0.05%胰酶消化，傳代培養(yǎng)；
步驟六:待細胞擴增至3-6 X 17個時用0.05%胰酶消化，800g，15min離心收集細胞，用新鮮的含有5%血清替代物的MEM- α培養(yǎng)基重懸，加入凍存保護劑并使用程序降溫儀凍存細胞，程序為:以l°C/min的速率降至-5°C后，以3°C/min的速率降至-20°C，再以1°C /min的速率降至_60°C，最后以5°C /min的速率降至_120°C，結(jié)束后放入液氮中凍存。
[0010]本發(fā)明用單一膠原酶消化，既減少了成本又可以快速獲得間充質(zhì)干細胞。本發(fā)明還采用無血清替代物取代了常用的胎牛血清，降低了成本的同時既能縮短原代細胞貼壁時間又能保證細胞的正常增值與生長，縮短間充質(zhì)干細胞倍增時間，最重要的是避免了胎牛血清中可能存在的病毒污染。本發(fā)明使用了程序降溫儀來凍存細胞，減少對細胞的傷害，提高凍存年限和細胞活性?？s短了操作流程，減少污染。本發(fā)明不僅能保證在較短的時間內(nèi)獲取生長狀態(tài)良好的間充質(zhì)干細胞，而且能夠提高細胞純度。分離出來的細胞在6-9天可達80%融合。由細胞流式檢測結(jié)果可知，在第一代細胞中，目的細胞的含量即可達到85%左右。
【具體實施方式】
[0011]以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作出詳細說明實施例一
一種人臍帶間充質(zhì)干細胞的分離方法，由下述步驟組成:
步驟一:將在無菌條件下獲得的臍帶用磷酸鹽緩沖液清洗血跡，然后在培養(yǎng)皿中用酒精棉球消毒臍帶，剪成2cm的小段，擦拭掉臍帶里面以及外面殘留的血液，再剖除動、靜脈以及臍帶外膜，制成組織塊；
步驟二:將步驟一中獲得的臍帶組織塊剪成Imm3大小的碎塊放入50ml離心管中，力口入等體積的膠原酶I，置于37°C培養(yǎng)箱中持續(xù)消化3-10h ；
步驟三:加入8-10倍消化液體積的生理鹽水稀釋步驟二中的消化液，200目篩網(wǎng)過濾，800g，15min離心收集細胞；
步驟四:合并細胞沉淀,再加入2倍體積的生理鹽水沖洗細胞，500g, 5min離心，收集細胞；
步驟五:使用添加有5%組成為:3%結(jié)合蛋白；0.5%生長因子；0.5%組氨酸:脯氨酸3:I) ；0.03%固醇類激素；0.1%【(維生素B1:維生素B2:維生素B6:維生素B12 1:1:1:1):維生素C:維生素D:維生素E 1:1:1:1】；0.01% (鐵:鋅:鑰:鈷2:2:1:1) ;0.5%粘附因子；95.36%去離子水的MEM-α培養(yǎng)基重懸細胞并接種于1cm細胞培養(yǎng)皿中，于37°C、體積分數(shù)為5%C02培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)，3-4d后添加新鮮的含有5%血清替代物的MEM- α培養(yǎng)基，待細胞達到80%融合時用0.05%胰酶消化1-2分鐘，傳代培養(yǎng)；
步驟六:待細胞擴增至3-6 X 17個時用0.05%胰酶消化，800g，15min離心收集細胞，用新鮮的含有5%血清替代物的MEM- α培養(yǎng)基重懸，加入凍存保護劑并使用程序降溫儀凍存細胞，程序為:以l°C/min的速率降至-5°C后，以3°C/min的速率降至-20°C，再以1°C /min的速率降至_60°C，最后以5°C /min的速率降至_120°C，結(jié)束后放入液氮中凍存。
[0012]實施例二
一種人臍帶間充質(zhì)干細胞的分離方法，由下述步驟組成:
步驟一:將在無菌條件