專利名稱：應(yīng)用分泌型卷曲相關(guān)蛋白的藥用組合物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)成骨活性的組合物和方法。更具體地說，本發(fā)明涉及用成骨細(xì)胞系產(chǎn)生的分泌型卷曲相關(guān)蛋白(SFRP)、其部分以及以其為基礎(chǔ)的抗體和核酸(包括反義核酸)調(diào)節(jié)成骨活性的方法和藥用組合物。
背景技術(shù)：
有關(guān)成骨調(diào)節(jié)和骨相關(guān)疾病的課題近來獲得了相當(dāng)?shù)年P(guān)注；例如在婦女健康領(lǐng)域，對骨質(zhì)疏松性骨相關(guān)疾病特別關(guān)注。骨骼骨恒定重建貫穿終生。在此重建過程中，成骨 細(xì)胞骨形成和隨后的破骨細(xì)胞骨吸收之間存在著脆弱的平衡。作為衰老過程的正常組成部分，骨基質(zhì)經(jīng)歷各種結(jié)構(gòu)性變化，其性質(zhì)仍未完全確定。對人的骨衰老相關(guān)變化的研究大多數(shù)集中于在形態(tài)水平闡明骨變化或定量比較骨丟失速率。辨別骨疾病相關(guān)機(jī)制對于理解骨生理學(xué)和骨疾病至關(guān)重要。盡管已經(jīng)鑒定并克隆了無數(shù)參與調(diào)節(jié)骨細(xì)胞的基因和基因家族以及由它們編碼的多肽，但由于成骨途徑的復(fù)雜性使得它們的功能還沒有獲得清楚認(rèn)識。WNT某閔家族Wnt糖蛋白家族是一組在細(xì)胞發(fā)育調(diào)節(jié)中起重要作用的基因及其編碼蛋白。Wnt蛋白是由12個(gè)以上的結(jié)構(gòu)相關(guān)分子組成的生長因子家族，參與調(diào)節(jié)基本生物過程，例如凋亡、胚胎發(fā)生、器官發(fā)生、形態(tài)發(fā)生和腫瘤發(fā)生(綜述見Nusse和Varmus 1992 Cell 69:1073-1087)。這些多肽為多能因子，與其它分泌型蛋白(如轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-P、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、神經(jīng)生長因子(NGF)和骨形成蛋白(BMP))具有相似生物活性。一個(gè)叫做Wnt-x的Wnt生長因子家族一員優(yōu)先在骨組織和骨衍生細(xì)胞中表達(dá)，并且似乎參與保持成熟成骨細(xì)胞(骨形成細(xì)胞)表型(PCT/US94/14708 ；W0 95/17416)。卷曲蛋白家族研究表明，某些Wnt蛋白作用于稱為“Frizzled”的蛋白家族,所述“Frizzled”蛋白家族起Wnt蛋白受體作用，或者為Wnt受體復(fù)合物組分(綜述見Moon等，1997 Cell 88:725-728 和 Barth 等，1997Curr. Opin. Cell Biol. 9 :683-690)。卷曲蛋白包含氨基端分泌信號序列、被認(rèn)為結(jié)合Wnt的半胱氨酸富集結(jié)構(gòu)域(CRD)、7個(gè)推定的類似于G蛋白偶聯(lián)受體的跨膜結(jié)構(gòu)域以及胞質(zhì)羧基端。1996 年，Hoang 等(J. Biol. Chem. 271 :26131-26137)報(bào)道發(fā)現(xiàn)了第一種分泌型卷曲相關(guān)蛋白(SFRP)。該蛋白由于在骨發(fā)育中的卷曲基序而叫做“Frzb”，根據(jù)其在大鼠體內(nèi)刺激軟骨形成活性的能力由牛關(guān)節(jié)軟骨提取物純化并克隆。還克隆了所述?；虻娜祟愅次铩Ｈ欢?，與卷曲蛋白不同，F(xiàn)rzb不含有蛇形跨膜結(jié)構(gòu)域。因此，此卷曲蛋白家族新成員似乎是Wnt的分泌型受體。Frzb cDNA編碼325aa/36，000道爾頓的蛋白，主要在四肢骨骼中表達(dá)。最高水平的表達(dá)見于發(fā)育長骨，與骺成軟骨細(xì)胞相對應(yīng)；于是向骨化中心表達(dá)下降，最終消失。近來的研究表明，SFRP參與凋亡，并因此已經(jīng)鑒定出某些SFRP為分泌型凋亡相關(guān)蛋白(“SARP”)。近來也已經(jīng)鑒定了 SFRP家族的其它成員，顯示為Wnt作用的拮抗劑。目前存在至少 5 個(gè)已知的人 SFRP/SARP 基因SFRP-l/FrzA/FRP-l/SARP-2、SFRP-2/SDF-5/SARP-l、SFRP-3/Frzb-l/FrzB/Fritz, SFRP-4 和 SFRP-5/SARP-3 (Leimeister 等，1998 Mechanismsof Development 75 :29_42，該參考文獻(xiàn)內(nèi)容結(jié)合到本文中)。盡管SARP/SFRP在凋亡中所起的準(zhǔn)確作用尚不明了，但這些蛋白似乎抑制或增強(qiáng)程序化細(xì)胞死亡過程。
總之，非常需要明確鑒定治療人類骨疾病(包括骨吸收性疾病，如骨質(zhì)疏松)和調(diào)節(jié)骨形成的靶。發(fā)明概述按照本發(fā)明，提供調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物成骨活性的方法和藥用組合物，所述藥用組合物含有分泌型卷曲相關(guān)蛋白(SFRP)或其調(diào)節(jié)部分。本發(fā)明的其它組合物使用由所述蛋白或其部分形成的抗體，或者可以使用編碼所述蛋白或其部分的核酸，包括反義序列。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，SFRP得自人成骨細(xì)胞。本發(fā)明組合物調(diào)節(jié)的成骨活性包括調(diào)節(jié)骨生長和骨密度。SFRP具有SEQ ID NO :2顯示的氨基酸序列，該序列是通過表達(dá)SEQ ID NO :1顯示的多核苷酸序列獲得的。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，SFRP為SFRP-1 (SEQ ID NO 2)。另一方面，本發(fā)明的方法包括治療哺乳動(dòng)物(特別是人)骨疾病的方法，包括給予上述藥用組合物的步驟。照此，治療骨疾病的方法包括但不限于以下幾種疾病(a)骨形成疾病，(b)骨吸收疾病和(C)骨密度疾病。在本發(fā)明的另一方面，所述骨疾病為選自以下的退行性骨疾病神經(jīng)退行性疾病、肌肉退行性疾病和骨退行性疾病。所述骨退行性疾病選自骨質(zhì)減少、骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括鑒定調(diào)節(jié)SFRP活性的受試化合物的方法。在該方法中，如下測定調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物成骨活性的化合物首先將含SFRP的樣品在含受試化合物的測試培養(yǎng)基中溫育，第二步是確定SFRP活性，其中相對于單獨(dú)的SFRP而言活性增加說明所述化合物為SFRP激活劑，活性降低說明所述化合物為SFRP抑制劑。在再一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括調(diào)節(jié)Wnt介導(dǎo)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法，包括使所述細(xì)胞與上述SFRP接觸，其中所述Wnt活性受到調(diào)節(jié)。另外，本發(fā)明涉及促進(jìn)骨細(xì)胞培養(yǎng)物的骨形成或骨修復(fù)的方法，該方法包括從骨培養(yǎng)物中分離所述細(xì)胞，導(dǎo)入表達(dá)SFRP (具有SEQ IDNO 2顯示的氨基酸序列)的重組構(gòu)建物，最后將所述細(xì)胞送回到所述骨培養(yǎng)物中。所述構(gòu)建物優(yōu)選表達(dá)編碼完整SFRP蛋白或其部分的核酸序列的反義序列。另一個(gè)實(shí)施方案涉及能夠與具有SEQ ID NO :1顯示的核酸序列的多核苷酸雜交的多核苷酸探針。這樣的探針用于檢測得自哺乳動(dòng)物宿主的樣品中的SFRP多核苷酸的診斷方法，包括檢測樣品中是否存在SFRP。IV.附圖簡述胤I顯示了導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)人成骨細(xì)胞(hOB)分泌型卷曲相關(guān)蛋白(SFRP) cDNA的成骨RADE結(jié)果。該圖顯示了用處于三個(gè)不同分化期(增殖期、成熟期和前骨細(xì)胞)的三種hOB細(xì)胞系(h0B-03-C5、h0B-03-CE6和h0B-01-Cl)進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)的差異顯示聚合酶鏈反應(yīng)(DD-PCR)凝膠的放射自顯影。箭頭指示276個(gè)堿基對(bp)的hOB SFRP基因片段(即RADE片段)，在h0B-03-C5和h0B-03-CE6細(xì)胞中PGE2處理上調(diào)該基因片段，但在h0B_01_Cl細(xì)胞中TGF-P I處理下調(diào)該基因片段。還可以看出，hOB-Ol-Cl細(xì)胞表達(dá)該基因的基礎(chǔ)水平高?；揪植繉Ρ葯z索工具(BLAST)對公共數(shù)據(jù)庫檢索該基因片段顯示，此cDNA與小鼠SFRP-1和牛FrzA基因同源。Ml顯示用對照、PTH、PGE2和TGF- ^ I處理24小時(shí)后，由h0B_03_C5細(xì)胞分離的poly A+RNA的RNA印跡放射自顯影。在此實(shí)驗(yàn)中，切除的hOB SFRP RADE基因片段和克隆的甘油醛磷酸脫氫酶(GAPDH) cDNA都用做探針。箭頭指示由PGE2處理所述細(xì)胞徹底上調(diào)的 hOB SFRP mRNA( 4. 4kb)。顯示了用對照、PGE2和TGF- @ I處理24小時(shí)后，由h0B_03_C5細(xì)胞分離的poly A+RNA的RNA印跡放射自顯影。在該實(shí)驗(yàn)中，克隆的hOB SFRP RADE基因片段和克隆的GAPDH cDNA都用作探針。再次表明，用PGE2處理所述細(xì)胞徹底下調(diào)hOB SFRP mRNA。Mi顯示了用對照、PTH、PGE2和TGF-P I處理24小時(shí)后由h0B-03_CE6細(xì)胞或h0B-01-Cl細(xì)胞分離的poly A+RNA的RNA印跡放射自顯影。在該實(shí)驗(yàn)中，切除的hOB SFRP RADE基因片段和克隆的GAPDH cDNA都用作探針。箭頭指示用PGE2處理h0B_03_CE6細(xì)胞徹底上調(diào)但用PTH處理h0B-01-Cl細(xì)胞下調(diào)的hOB SFRPmRNA0還可以發(fā)現(xiàn)h0B_01_Cl細(xì)胞表達(dá)所述mRNA的基礎(chǔ)水平高。圖5顯示了用對照和TGF- 13 I處理24小時(shí)后由h0B_01-CI細(xì)朐分離的do I v A+RNA的RNA印跡放射自顯影。在該實(shí)驗(yàn)中，全長(1.1kb)克隆的hOB SFRP cDNA和克隆的￠-肌動(dòng)蛋白cDNA都用作探針。結(jié)果顯示用TGF-P I處理所述細(xì)胞下調(diào)hOB SFRP mRNA。此外，還可以發(fā)現(xiàn)h0B-01-Cl細(xì)胞表達(dá)高基礎(chǔ)水平的所述mRNA。M_6顯示了分離自23種不同人組織的poly A+RNA的RNA印跡放射自顯影。在該實(shí)驗(yàn)中，切除的hOB SFRP RADE基因片段和克隆的P -肌動(dòng)蛋白cDNA都用作探針。箭頭指示的hOB SFRP mRNA在心臟和腎臟高度表達(dá)、在胎盤和子宮中等表達(dá)、在腦、胰腺和其它組織低水平表達(dá)而在胸腺和淋巴細(xì)胞不表達(dá)。Ml顯示了用對照、PTH、PGE2和TGF-P I處理24小時(shí)后，由Sa0S_2人骨肉瘤成骨細(xì)胞樣細(xì)胞和正常人成骨細(xì)胞(hOB)的外植塊培養(yǎng)物分離的poly A+RNA的RNA印跡放射自顯影。在該實(shí)驗(yàn)中，全長克隆的hOB SFRP cDNA和克隆的GAPDH cDNA都用作探針。結(jié)果顯示Sa0S-2細(xì)胞表達(dá)低基礎(chǔ)水平的hOB SFRP mRNA，其表達(dá)不受這些因子的調(diào)節(jié)。相比之下，hOB細(xì)胞表達(dá)中等水平的、受PGE2處理上調(diào)的所述mRNA。對PGE2處理的hOB細(xì)胞的TaqMan定量RT-PCR分析表明，PGE2將SFRP mRNA水平上調(diào)10倍。顯示了在用對照或PGE2處理24小時(shí)后由人胎盤或h0B_03_CE6細(xì)胞分離的總RNA的反轉(zhuǎn)錄酶(RT)-PCR產(chǎn)物的DNA印跡放射自顯影。用人FRP-1/SARP-2特異性寡核苷酸引物進(jìn)行RT-PCR，并將DNA印跡與人FRP-1/SARP-2特異性內(nèi)部寡核苷酸探針雜交。此RT-PCR產(chǎn)物的預(yù)期大小為1. lkb。如同所預(yù)期的一樣，結(jié)果顯示胎盤表達(dá)FRP-1/SARP-2mRNA,而PGE2處理h0B-03_CE6細(xì)胞強(qiáng)烈上調(diào)所述mRNA的表達(dá)。M_9 顯示使用 Coulter 細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行的 h0B_03_C5、h0B-03_CE6 和 hOB-Ol-Cl細(xì)胞存活實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。結(jié)果表示為相對于第0天對照(即6孔板每孔約200，000個(gè)細(xì)胞)的百分率。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，h0B-03-C5細(xì)胞在含血清的培養(yǎng)基中于39°C緩慢增殖，而h0B-03-CE6細(xì)胞停止分裂，但在6天的溫育中存活。相反，h0B-01-Cl細(xì)胞經(jīng)歷了加速的細(xì)胞死亡，這與這些細(xì)胞中的hOB SFRP mRNA高基礎(chǔ)水平表達(dá)相關(guān)。

圖10顯示俥用Coulter細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行的h0B_03_C5細(xì)胞(圖10A)、h0B-03_CE6細(xì)胞(圖10B)和h0B-01-Cl細(xì)胞(圖10C)存活實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。對于這些實(shí)驗(yàn)，用對照或PGE2 (圖1OA和10B)或者對照和TGF-P I (圖10C)在無血清培養(yǎng)基中于39°C處理所述細(xì)胞3或6天。結(jié)果表示為相對于第0天對照(即6孔板每孔約200，000個(gè)細(xì)胞)的百分率。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，hOB細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中的存活力隨時(shí)間下降。另外，對于h0B-03-C5細(xì)胞和h0B-03-CE6細(xì)胞，用PGE2處理加速了這種下降速率。這種細(xì)胞死亡速率的增加與PGE2處理后這些細(xì)胞中的hOB SFRP mRNA水平上調(diào)有關(guān)。相反，用下調(diào)hOB SFRPmRNA水平的TGF-P I處理h0B-01-Cl細(xì)胞增強(qiáng)細(xì)胞存活力。fill顯示了用PGE2處理h0B-03_C5細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡或程序性細(xì)胞死亡。使用膜聯(lián)蛋白V-FITC經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測凋亡。圖A顯示，既不會(huì)被膜聯(lián)蛋白V染色也不會(huì)被碘化丙 錠染色(死細(xì)胞染色)的存活細(xì)胞數(shù)隨PGE2濃度增加而降低。相反，圖B顯示被膜聯(lián)蛋白V染色但不被碘化丙錠染色的凋亡細(xì)胞數(shù)隨PGE2濃度增加而增加。同樣，圖C顯示既可以被膜聯(lián)蛋白V染色也可以被碘化丙錠染色的死細(xì)胞數(shù)隨PGE2濃度增加而增加。圖12顯示使用Coulter細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行的h0B_03_C5細(xì)胞(圖A)和h0B-03_CE6細(xì)胞(圖B)的另一個(gè)存活力實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。以和圖10描述的相似方式進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)，但是，對于這些實(shí)驗(yàn)，在存在或不存在人SARP-2的有義(對照)或反義的定向起始位點(diǎn)的硫代磷酸寡核苷酸的情況下，用載體對照(即0. 1%乙醇)或PGE2共處理所述細(xì)胞。結(jié)果表示為相對于第0天對照(即6孔板每孔約200，000個(gè)細(xì)胞)的百分率或者表示為相對于載體處理對照的百分率。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，用SARP-2的反義寡核苷酸共處理hOB細(xì)胞逆轉(zhuǎn)了 PGE2加速細(xì)胞死亡速率的能力，而用有義(對照)寡核苷酸共處理對該過程沒有影響。SI3顯示使用Coulter細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行的h0B-01-Cl-PS_09細(xì)胞存活力實(shí)驗(yàn)的結(jié)果(圖A)。對于這些實(shí)驗(yàn)，用hOB SFRP cDNA( S卩SFRP-1/FRP-1/SARP-2)哺乳動(dòng)物表達(dá)質(zhì)?；蚩蛰d體(即PCDNA3.1)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞。結(jié)果表示為第0天對照細(xì)胞的百分率。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，與對該過程沒有影響的空載體相比，hOB細(xì)胞過量表達(dá)hOBSFRP/SFRP-1/FRP-1/SARP-2加速細(xì)胞死亡速率。圖B顯示分離自空載體細(xì)胞(V)或SARP-2過量表達(dá)細(xì)胞(S)的poly A+RNA的RNA雜交的結(jié)果。該分析證明SARP-2細(xì)胞表達(dá)的SFRP-1/FRP-1/SARP-2mRNA遠(yuǎn)比所述載體細(xì)胞多。圖14 顯示用表達(dá)空載體的 h0B-01-Cl-PS-09 細(xì)胞(pcDNA3.1)和 SFRP-1/FRP-1/SARP-2過量表達(dá)細(xì)胞的亞克隆(SARP-2克隆#1)進(jìn)行的另一個(gè)細(xì)胞存活力實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。圖A顯示分離自所述細(xì)胞的RNA的TaqMan定量RT-PCR分析的結(jié)果。該分析表明，SARP-2克隆#1細(xì)胞表達(dá)的人SFRP-l/FRP-l/SARP-2mRNA比空載體表達(dá)細(xì)胞高50-60倍。同樣，如圖B所示，使用Coulter細(xì)胞計(jì)數(shù)器檢測細(xì)胞數(shù)，SARP-2克隆#1細(xì)胞死亡速率比空載體對照細(xì)胞快3倍。SI5為分離自對照或PGE2處理24小時(shí)的h0B_03_CE6細(xì)胞的全細(xì)胞提取物的蛋白質(zhì)印跡放射自顯影。用￠-連環(huán)蛋白的單克隆抗體(分子量為92，000)探測免疫印跡。結(jié)果顯示用PGE2處理hOB細(xì)胞下調(diào)￠-連環(huán)蛋白水平，這與hOB SFRP/SFRP-1/FRP-1/SARP-2對fct信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的拮抗作用相一致。圖16 顯示了 h0B-01-Cl-PS-09 細(xì)胞(圖 A)和 h0B-02-Cl-PS_02 細(xì)胞(圖 B)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。TCF-熒光素酶報(bào)道基因測定的檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染人[h]或大鼠[r]SARP-2或人Frzb-1表達(dá)質(zhì)粒在hOB細(xì)胞中下調(diào)Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(與pcDNA3.1空載體對照相比)。該測定是fct信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和￠-連環(huán)蛋白核活性的可信檢測。圖17概述了使用hOB細(xì)胞和hOB SFRP/SFRP-1/FRP-1/SARP-2的骨合成代謝藥物的篩選模式。該篩選模式可鑒定調(diào)節(jié)SFRP-1/FRP-1/SARP-2作用的化合物。MI8圖示高通量篩選(HTS)測定抑制成骨細(xì)胞/骨細(xì)胞的SFRP-1/FRP-1/SARP-2功能的化合物的實(shí)例。使用CyQuant DNA熒光測定的結(jié)果顯示，過量表達(dá)SFRP-1/FRP-1/SARP-2的h0B-01-Cl-PS-09細(xì)胞(SARP_2#1細(xì)胞)比表達(dá)空載體的細(xì)胞(pcDNA3.1)死得快。而且，SFRP-1/FRP-1/SARP-2抗肽抗血清(SARP-2AS)阻斷所述基因過量表達(dá)引起的細(xì)胞死亡。圖19概沭了用于產(chǎn)牛SFRP-1/SARP-2基因敲除小鼠的策略。P -半乳糖苷酶和新霉素抗性表達(dá)盒取代編碼整個(gè)半胱氨酸富集結(jié)構(gòu)域(CRD)的小鼠SFRP-1/SARP-2基因外顯 子I。圖20圖示分離自雌件和雄件野牛型(WT)和敲除(KO)SFRP-1小鼠的腎臟的polyA+RNA的RNA印跡。該印跡顯示W(wǎng)T腎臟表達(dá)高水平的SFRP-1mRNA (4. 4kb)，而KO腎臟不表
達(dá)該基因。Sli顯示了得自雄性(圖A)和雌性(圖B)野生型(+/+)和敲除(-/_)SFRP-1的小鼠股骨的微型計(jì)算機(jī)X射線斷層顯象(miCTo-CT)分析的結(jié)果。當(dāng)與+/+對照小鼠相比時(shí)，由該方法測定的數(shù)據(jù)表明，-/_小鼠的成骨參數(shù)(即BV/TV，Tb. Th.，Conn. Den.，Tb. N. &Tb. Sp.)升高。圖22是一組圖，顯示了 (A)hOB細(xì)胞的細(xì)胞增殖；(B)于39°C維生素D3處理hOB細(xì)胞能夠/增強(qiáng)上調(diào)堿性磷酸酶活性；和(C)維生素隊(duì)于341不能誘導(dǎo)hOB細(xì)胞分泌骨鈣蛋白，見實(shí)施例A詳細(xì)介紹。圖23圖示關(guān)于PTH-1受體mRNA表達(dá)的實(shí)施例A的結(jié)果；其中于39°C培養(yǎng)hOB細(xì)胞48小時(shí)與細(xì)胞保持于34°C相比，使PTH-1受體的穩(wěn)態(tài)mRNA水平增加7倍。圖24圖示PTH 1-34濃度逐漸增加對hOB細(xì)胞胞內(nèi)環(huán)腺苷酸(cAMP)的作用的實(shí)施例A的結(jié)果。M25圖示用合成糖皮質(zhì)激素地塞米松處理時(shí)上調(diào)hOB細(xì)胞的堿性磷酸酶活性的作用，見實(shí)施例A詳細(xì)介紹。圖26圖示在使用Flexerall Strain Unit時(shí)機(jī)械性感覺刺激對前骨性hOB細(xì)胞作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。V.發(fā)明詳述本發(fā)明涉及其表達(dá)在三種不同人成骨細(xì)胞(hOB)細(xì)胞系中受到成骨藥物或骨形成藥物體外調(diào)節(jié)的基因。在本發(fā)明的一個(gè)方面，該基因的表達(dá)在hOB分化期被上調(diào)，提示所述基因可能參與成骨過程。DNA序列分析表明，該基因片段與稱作分泌型卷曲相關(guān)蛋白(SFRP) -1 的小鼠 cDNA 具有顯著的序列同一性(Rattner 等，1997 Proc. Natl. Acad. Sc1. USA94 =2859-2863)。隨后的cDNA克隆和其它的序列分析表明，稱為hOB SFRP的該基因與人FRP-1/SARP-2 相同(Finch 等，1997Proc. Natl. Acad. Sc1. USA 94 :6770-6775 ；Melkonyan等，1997 Proc. Natl. Acad. Sc1. USA 94:13636-13641)。hOB SFRP 的表征預(yù)示了其作為新型骨質(zhì)疏松藥物靶的用途和在鑒定骨合成代謝藥物的新型藥物篩選中的用途。術(shù)語“骨形成”是骨合成和礦化過程。成骨細(xì)胞調(diào)節(jié)該過程。術(shù)語“骨生長”是骨骼增長過程。該過程為以下兩種形式之一 (I)直接產(chǎn)生于間充質(zhì)細(xì)胞或骨髓細(xì)胞的膜內(nèi)骨形成；(2)產(chǎn)生于軟骨的縱向或軟骨(endichindual)骨形成。術(shù)語“成骨”與以上定義的術(shù)語骨形成同義。術(shù)語“分泌型卷曲相關(guān)蛋白”或“SFRP”為Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的分泌型受體，具有許許多多使其成為細(xì)胞生長和分化的有用研究工具的特征。卷曲樣基因家族編碼具有未知功能跨膜結(jié)構(gòu)域的細(xì)胞膜蛋白。術(shù)語“分泌型凋亡相關(guān)蛋白”或“SARP”與以上定義的術(shù)語分泌型卷曲相關(guān)蛋白或SFRP同義。術(shù)語“蛋白”、“肽”和“多肽”交互使用，包括純化和重組產(chǎn)生的、包含通過肽鍵線性連接的氨基酸的SFRP分子。本發(fā)明的氨基酸可為L型或D型，只要所述多肽的生物活性得以保持。本發(fā)明的SFRP蛋白還可以包括通過反應(yīng)(包括糖基化、乙酰化和磷酸化)翻譯后修飾的蛋白。所述多肽還包括類似物、等位基因和等位變異體，與野生型蛋白或天然蛋白相t匕，它們可含有不影響SFRP蛋白的生物活性或功能活性的氨基酸衍生物或非氨基酸部分。術(shù)語氨基酸是指天然存在的氨基酸及其衍生物(諸如TyrMe和PheCl)，以及特征在于既存在可利用的羧基也存在氨基的其它部分。所述多肽可包含的非氨基酸部分包括例如氨基酸模擬結(jié)構(gòu)。模擬結(jié)構(gòu)和氨基酸具有大致相同的官能團(tuán)空間排布，但不必同時(shí)具有氨基酸特
征的氨基和羧基?！巴蛔兊鞍住笔侵咐缤ㄟ^定點(diǎn)誘變或其它操作、通過轉(zhuǎn)錄或翻譯錯(cuò)誤引起氨基酸序列微小變化的SFRP蛋白或多肽，或者通過合理設(shè)計(jì)合成制備的SFRP蛋白或多肽。這些微小改變產(chǎn)生其蛋白或多肽的生物活性與野生型或天然存在的多肽或蛋白相比發(fā)生改變的氨基酸序列。突變蛋白的實(shí)例包括本文描述的SEQ ID N0:2的SFRP-1。本文使用的術(shù)語“疏水性”包括非極性的氨基酸、氨基酸衍生物、氨基酸模擬物和化學(xué)部分。疏水性氨基酸包括？化、￥&1、1'印、116和1^11。本文使用的術(shù)語“帶正電荷的氨基酸”是指帶正電荷的氨基酸、氨基酸衍生物、氨基酸模擬物和化學(xué)部分。帶正電荷的氨基酸包括例如Lys、Arg和His。當(dāng)“純化的”用來指SFRP蛋白或多肽時(shí)，區(qū)別于天然的或天然存在的蛋白或多肽，因?yàn)樗鼈円约兓问酱嬖?。本文描述的這些“純化的” SFRP蛋白或多肽或任一種設(shè)想的變異體，應(yīng)當(dāng)是指基本不含通常在其自然或天然環(huán)境中與其結(jié)合的污染物的化合物或分子。術(shù)語“大致純”或“分離的”沒有將多核苷酸或多肽同與其非天然結(jié)合的物質(zhì)的混合物排除在外?！疤烊弧?SFRP多肽、蛋白或核酸分子是指由天然或“野生型”資源中回收的SFRP。“組合物”是指活性物質(zhì)(即本發(fā)明的SFRP)和另一種惰性(例如可檢測物質(zhì)或標(biāo)記物)或活性的化合物或組合物(例如佐劑)的組合。“藥用組合物”是指包括作為活性物質(zhì)的SFRP (特別是SFRP-1)與使所述組合物適于體外、體內(nèi)或活體外診斷或治療使用的惰性或活性載體的組合。
本文使用的術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”包括任一種標(biāo)準(zhǔn)藥用載體，諸如磷酸緩沖鹽溶液、水和乳劑(如油/水或水/油乳劑)以及各種類型的潤濕劑。所述組合物還可以包括穩(wěn)定劑和防腐劑。載體、穩(wěn)定劑和佐劑的實(shí)例參見Martin, Remington' s Pharm. Sc1.,第 15 版(MackPub1. Co. ,Easton (1975))。涉及本文描述的SFRP的術(shù)語“核酸”是指單鏈和雙鏈DNA、cDNA、基因組源DNA和RNA，以及相互之間互補(bǔ)的正鏈和負(fù)鏈核酸，包括反義RNA?！昂怂岱肿印笔强膳c“多核苷酸”交互使用的術(shù)語，均指多聚形式的任意長度核苷酸(或者核糖核苷酸或者脫氧核糖核苷酸)或其類似物。所述術(shù)語還包括已知類型的修飾，例如本領(lǐng)域已知的標(biāo)記(例如Sambrook等(1989)同上)、甲基化、“加帽”、類似物取代一個(gè)或多個(gè)天然存在的核苷酸、核苷酸間修飾(例如非電荷連接的修飾(例如氨基甲酸甲酯))、包含懸垂部分的修飾(例如蛋白(包括核酸酶、毒素、抗體、信號肽等))、嵌入劑修飾(例如吖啶、補(bǔ)骨脂素等)、包含螯合劑的修飾(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化金屬等)、包含烷化劑的修飾、修飾性連接的修飾(例如a異頭核酸等)以及未修飾形式的多核苷酸。所述多核苷酸可進(jìn)行化學(xué)修飾或生物化學(xué)修飾，或者可含有非天然或衍化核苷酸堿基。所述核苷酸可與所述多核苷酸的編碼mRNA互補(bǔ)。這些互補(bǔ)核苷酸包括但不限于能夠形成三股螺旋的核苷酸或反義核苷酸。本發(fā)明還 提供包含非天然存在序列的重組多核苷酸，正如改變的野生型多肽序列，包括但不限于由于缺失、插入、取代一個(gè)或多個(gè)核苷酸或通過融合至其它多核苷酸序列而產(chǎn)生的改變的野生型多肽序列。如果天然狀態(tài)的SFRP多核苷酸或使用本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的方法對其進(jìn)行了操作的SFRP多核苷酸可以被轉(zhuǎn)錄和/或翻譯產(chǎn)生多肽或成熟蛋白，則認(rèn)為SFRP多核苷酸“編碼” SFRP多肽。因此，術(shù)語多核苷酸除了包括編碼序列之外，還應(yīng)包括加工序列和其它不編碼成熟蛋白氨基酸的序列。所述多核苷酸的反義鏈也被認(rèn)為編碼所述序列。術(shù)語“重組”多核苷酸或DNA是指通過組合兩種互相分離的序列節(jié)段而制備的多核苷酸，所述組合通過基因工程技術(shù)或化學(xué)合成人工操作分離的DNA節(jié)段實(shí)現(xiàn)。如此操作時(shí)，人們可將具有需要功能的DNA節(jié)段連接在一起，以產(chǎn)生需要的功能組合。SFRP DNA、RNA或多核苷酸的“類似物”是指在形式和/或功能(特別是增強(qiáng)序列特異性氫鍵鍵合互補(bǔ)核苷酸序列上的堿基對的能力)上類似于天然存在的多核苷酸，但在例如具有罕見或非天然堿基或改變的主鏈方面不同于DNA或RNA的大分子。參見例如Uhlmann等，(1990)Chemical Reviews 90:543-584?！胺蛛x的”當(dāng)用來指SFRP核酸分子時(shí)，是指與其它的細(xì)胞組分分離，所述其它的細(xì)胞組分通常與胞內(nèi)的天然或野生型SFRP DNA或RNA相結(jié)合?！半s交”是指可在不同“嚴(yán)格”條件下進(jìn)行的雜交反應(yīng)。增加雜交反應(yīng)嚴(yán)格性的條件在本領(lǐng)域廣為人知并目.已經(jīng)在參見例如Sambrook等，同上中公開。相關(guān)條件的實(shí)例包括(按照嚴(yán)格性增加的順序):25°C、37°C、50°C和68°C的溫育溫度；10 X SSC、6 X SSC、I X SSC和0.1 X SSC的緩沖液濃度(其中SSC為0. 15M NaCl和15mM檸檬酸鹽緩沖液)以及使用其它緩沖系統(tǒng)的等同緩沖液；0 %、25 %、50 %和75 %的甲酰胺濃度，5分鐘至24小時(shí)的溫育時(shí)間，洗滌時(shí)間延長、頻率增加或緩沖液濃度降低。“Tm”是這樣的攝氏溫度在該溫度下,在所述實(shí)驗(yàn)條件下，由Watson-Crick堿基對反向氫鍵鍵合互補(bǔ)鏈組成的多核苷酸雙鏈50%解離為單鏈。Tm可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)公式計(jì)算，例如Tm = 81. 5+16. 61og[Na+] +0. 41(% G/C)-0. 61(% F)-600/L其中Na+為陽離子濃度(通常為鈉離子)(mol/L) ； (% G/C)為G和C堿基在雙鏈中占總堿基的百分比數(shù)；(％F)為溶液中的甲酰胺百分比(重量/體積)；而1為雙鏈兩條鏈的核苷酸數(shù)。多核苷酸的“穩(wěn)定雙鏈體”或在生化反應(yīng)中任意兩種或多種組分之間形成的“穩(wěn)定復(fù)合體”，是指在雙鏈體或復(fù)合體形成與其隨后的檢測之間保持 足夠長時(shí)間的雙鏈體或復(fù)合體。所述雙鏈體或復(fù)合體必須能夠經(jīng)得起在形成時(shí)刻和檢測時(shí)刻之間存在或引入的任何條件，這些條件隨所要進(jìn)行的測定或反應(yīng)而改變?？扇芜x存在和可除去雙鏈體或復(fù)合體的介入條件包括清洗、加熱、在反應(yīng)混合物中加入其它的溶質(zhì)或溶劑(如變性劑)以及與其它的反應(yīng)物競爭。穩(wěn)定的雙鏈體或復(fù)合體可以為不可逆或可逆的，但必須滿足該定義的其它要求。因此，在反應(yīng)混合物中可以形成瞬時(shí)復(fù)合體，但只要其自然離解或由于新施加的條件或檢測前引入的操作而解離，就不能構(gòu)成穩(wěn)定復(fù)合體。當(dāng)兩個(gè)單鏈多核苷酸(特別是在高嚴(yán)格條件下)以反向構(gòu)型形成穩(wěn)定雙鏈體時(shí)，所述鏈基本“互補(bǔ)”。一個(gè)雙鏈多核苷酸可與另一個(gè)多核苷酸“互補(bǔ)”，只要第一個(gè)多核苷酸的一條鏈和第二個(gè)多核苷酸可形成穩(wěn)定雙鏈體。由單鏈多核苷酸序列預(yù)測的互補(bǔ)序列是預(yù)期與所述單鏈多核苷酸按照普遍接受的堿基配對原則形成氫鍵鍵合的最佳標(biāo)準(zhǔn)核苷酸序列?！坝辛x”鏈和“反義”鏈當(dāng)用于同一情況時(shí)，是指相互之間互補(bǔ)的單鏈SFRP多核苷酸。它們可為雙鏈多核苷酸的反向鏈，或者一條鏈可按照普遍接受的堿基配對原則由另一條鏈預(yù)測出來。除非另有說明或暗示，否則可隨意將一條鏈或另一條鏈指定為“有義”鏈或“反義”鏈。如果每個(gè)線性序列的核苷酸順序都相同并且未發(fā)生取代、缺失或物質(zhì)置換，則SFRP核苷酸線性序列與另一條線性序列“相同”。顯然，依據(jù)Watson-Crick堿基配對，具有相似結(jié)構(gòu)的嘌呤和嘧啶含氮堿基在功能上可以相同；而且，類似含氮堿基(特別是尿嘧啶和胸腺嘧啶)的互相取代或含氮堿基的修飾(如甲基化)不構(gòu)成物質(zhì)置換。當(dāng)RNA序列反映了多核糖核苷酸中含氮堿基的順序，DNA序列反映了多脫氧核糖核苷酸中含氮堿基的順序，而兩個(gè)序列滿足了此定義的其它要求時(shí)，則所述RNA和DNA多核苷酸具有相同的序列。當(dāng)至少一個(gè)序列為包含多義殘基的簡并寡核苷酸時(shí)，如果至少一種替代形式的簡并寡核苷酸與其對比序列相同，那么這兩個(gè)序列相同。例如，如果AYAAA(SEQ ID NO 5)是ATAAA(SEQID NO 6)和ACAAA(SEQ ID NO 7)的混合物，則AYAAA(SEQ ID NO 3)與 ATAAA(SEQ ID NO 4)相同。當(dāng)在兩種多核苷酸之間進(jìn)行對比時(shí)，隱含性知道很容易獲得互補(bǔ)鏈，可以選定或預(yù)測所對比的多核苷酸之間同一性程度最大的有義鏈或反義鏈。例如，當(dāng)要對比的一種或兩種多核苷酸為雙鏈時(shí)，如果第一種多核苷酸的一條鏈與第二種多核苷酸的一條鏈相同時(shí)，則所述兩種序列相同。同樣，當(dāng)多核苷酸探針被描述為與其靶相同時(shí)，顯然它是參與所述探針和所述靶之間雜交反應(yīng)的靶的互補(bǔ)鏈。如果兩種線性序列都能夠與同一互補(bǔ)多核苷酸雜交形成雙鏈體，則一種所述核苷酸線性序列與另一種所述線性序列“基本相同”或“等同”。應(yīng)當(dāng)理解的是，盡管不總是明確指出申請人涉及特定核酸分子，但也包括其等同物。更優(yōu)選在較高嚴(yán)格條件下雜交的序列。顯然，雜交反應(yīng)可適應(yīng)核苷酸序列的插入、缺失和取代。因此，線性核苷酸序列即使部分核苷酸殘基不精確對應(yīng)或匹配時(shí)也可基本相同。相比之下更優(yōu)選與本文公開的本發(fā)明更緊密對應(yīng)或匹配的序列。一般而言，如果約25個(gè)殘基的多核苷酸區(qū)與另一個(gè)多核苷酸區(qū)至少約80%相同；更優(yōu)選至少約90%相同；更優(yōu)選至少約95%相同；甚至更優(yōu)選所述序列100%相同，則所述兩個(gè)多核苷酸區(qū)基本相同。40個(gè)或更多個(gè)殘基的多核苷酸區(qū)與另一個(gè)區(qū)在同源部分序列對比后，如果至少約75%相同；更優(yōu)選至少約80%相同；更優(yōu)選至少約85%相同；甚至更優(yōu)選至少約90%相同；再更優(yōu)選所述序列100%相同，則所述兩個(gè)多核苷酸區(qū)基本相同。在確定多核苷酸序列是否基本相同時(shí)，特別優(yōu)選保留與其對比的多核苷酸的功能性的序列。可通過不同的參數(shù)測定功能性。例如，如果所述多核苷酸用于涉及與另一個(gè)多核苷酸雜交的反應(yīng)，那么優(yōu)選在相似的條件下與相同靶雜交的序列。一般而言，DNA雙鏈體的Tm取決于錯(cuò)配殘基的位置，對于200個(gè)或更多個(gè)殘基的雙鏈體來說，序列同一性每降低
I%，Tm將下降約10°C ;對于少于40個(gè)殘基的雙鏈體來說，序列同一性每降低I %，Tm下降約50°C (參見例如Meinkoth等)。約100個(gè)殘基的基本相同或等同序列一般和互相之間各自的互補(bǔ)序列在低于Tm約20°C的溫度形成穩(wěn)定雙鏈體；優(yōu)選在低于Tm約15°C的溫度形成穩(wěn)定雙鏈體；更優(yōu)選在低于Tm約10°C的溫度形成穩(wěn)定雙鏈體；甚至更優(yōu)選在低于Tm約5°C的溫度形成穩(wěn)定雙鏈體；再更優(yōu)選在約Tm的溫度形成穩(wěn)定雙鏈體。在另一個(gè)實(shí)施例中，如果所述多核苷酸編碼的多肽是其功能的重要組成部分，那么優(yōu)選編碼相同或基本相同多肽的序列。因此，產(chǎn)生保守氨基酸取代的核苷酸差異優(yōu)于產(chǎn)生非保守氨基酸取代的核苷酸差異，而產(chǎn)生非保守氨基酸取代的核苷酸差異又優(yōu)于產(chǎn)生非保守取代的核苷酸差異，更優(yōu)選不改變氨基酸序列的核苷酸差異，甚至更優(yōu)選相同的核苷酸。導(dǎo)致多肽中插入或缺失的多核苷酸插入或缺失優(yōu)于使下游編碼區(qū)位相失調(diào)的多核苷酸插入或缺失；甚至更優(yōu)選不包含插入或缺失的多核苷酸序列。雜交特性和多核苷酸編碼的多肽序列的相對重要性取決于本發(fā)明的應(yīng)用。如果兩個(gè)多核苷酸在相似的最大嚴(yán)格條件下都能夠和特定的第三個(gè)多核苷酸形成穩(wěn)定雙鏈體，則該多核苷酸與另一個(gè)多核苷酸具有相同的特征或與其等同。除了相似的雜交特性之外,所述多核苷酸最好還編碼基本相同的多肽。多核苷酸序列的“保守”殘基是指在對比的兩個(gè)或多個(gè)相關(guān)序列的相同位置未發(fā)生改變的殘基。相對保守的殘基是指在更相關(guān)序列中比序列中其它位置出現(xiàn)的殘基更保守的殘基?！跋嚓P(guān)”多核苷酸具有較大比例的相同殘基。本文使用的“簡并”寡核苷酸序列是如下的至少兩種相關(guān)原始多核苷酸序列產(chǎn)生的設(shè)計(jì)序列在原始序列中保守的殘基保留在簡并序列中，而在原始序列中不保守的殘基在簡并序列中可以有若干選擇。例如，簡并序列AYASA(SEQ ID NO 8)可由原始序列ATACA (SEQID NO 9)和 ACAGA (SEQ ID NO 10)確定，其中 Y 為 C 或 T，而 S 為 C 或 G。Y 和 S 是“多義”殘基的實(shí)例。簡并節(jié)段是包含簡并序列的多核苷酸節(jié)段。顯然，包含簡并序列的合成寡核苷酸實(shí)際上是除多義位置之外具有相同序列的緊密相關(guān)多核苷酸的混合物。這樣的寡核苷酸通常合成為在多義位置的所有可能核苷酸組合的混合物。混合物中的每個(gè)寡核苷酸都被稱為“替代形式”。本文使用的多核苷酸“片段”或“插入片段”一般表示全長形式的亞區(qū)，但也可以包括整個(gè)全長多核苷酸。如果一個(gè)多核苷酸從根本上講來源于另一個(gè)多核苷酸，那么這兩個(gè)不同的多核苷酸互相“對應(yīng)”。例如，信使RNA對應(yīng)于其轉(zhuǎn)錄基因。cDNA對應(yīng)于其例如通過反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)或基于RNA序列信息通過化學(xué)合成DNA而產(chǎn)生的RNA。cDNA還對應(yīng)于編碼所述RNA的基因。如果多核苷酸在所對比的不同的物種、品系或變異體中具有相似的功能，諸如編碼相關(guān)多肽，那么所述多核苷酸也互相“對應(yīng)”?！疤结槨碑?dāng)在SFRP多核苷酸操作的范圍內(nèi)使用時(shí)，是指作為試劑提供的寡核苷酸，它通過與靶雜交來檢測可能存在于目標(biāo)樣品中的靶。通常，探針包含標(biāo)記物或標(biāo)記物通過其可在雜交反應(yīng)之前或緊接雜交反應(yīng)之后結(jié)合的物質(zhì)。合適的標(biāo)記物包括但不限于放射性同位素、熒光染料、化學(xué)發(fā)光化合物、染料和蛋白(包括酶)。 “引物”是通常具有自由3' -OH基團(tuán)的寡核苷酸，通過與靶雜交結(jié)合可能存在于目標(biāo)樣品中的靶，由此促進(jìn)與所述靶互補(bǔ)的多核苷酸的多聚化。生產(chǎn)重復(fù)拷貝的相同多核苷酸的方法，諸如PCR或基因克隆，在本文統(tǒng)稱為“擴(kuò)增”或“復(fù)制”。例如，可復(fù)制單鏈或雙鏈DNA，以形成具有相同序列的其它DNA。例如，可通過RNA指導(dǎo)的RNA聚合酶或通過反轉(zhuǎn)錄DNA然后進(jìn)行PCR復(fù)制RNA。在后一種情況下，擴(kuò)增的RNA拷貝為具有相同序列的DNA?！熬酆厦告?zhǔn)椒磻?yīng)”(“PCR”)是使用一個(gè)或多個(gè)引物以及聚合催化劑(諸如反轉(zhuǎn)錄酶或DNA聚合酶，特別是熱穩(wěn)定聚合酶)制備目標(biāo)多核苷酸的復(fù)制拷貝的反應(yīng)。一般來說，PCR包括反復(fù)形成的三個(gè)步驟“退火”，其中調(diào)節(jié)溫度以允許寡核苷酸引物和要擴(kuò)增的多核苷酸形成雙鏈體；“伸長”，其中調(diào)節(jié)溫度，以便使用與其形成雙鏈體的多核苷酸作為模板，用DNA聚合酶伸長已形成雙鏈體的寡核苷酸；以及“解鏈”，其中調(diào)節(jié)溫度，以便解離所述多核苷酸和伸長的寡核苷酸。然后重復(fù)循環(huán)，直至獲得需要量的擴(kuò)增多核苷酸。在Mullis的USP第4，683，195號和Mullis等的USP第4，683，202號中講述了 PCR法?；蛑械脑ǖ幌抻趩?dòng)子區(qū)、增強(qiáng)子區(qū)、阻抑蛋白結(jié)合區(qū)、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、翻譯起始位點(diǎn)、蛋白編碼區(qū)、內(nèi)含子和外顯子以及轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止位點(diǎn)。特定多核苷酸的“反義”拷貝是指能夠氫鍵鍵合所述多核苷酸并因此能夠調(diào)節(jié)所述多核苷酸表達(dá)的互補(bǔ)序列。其為上述的DNA、RNA或其類似物，包括具有改變主鏈的類似物。反義拷貝結(jié)合的多核苷酸可以為單鏈形式或者雙鏈形式。本文使用的術(shù)語“有效連接”意指相對于必須的調(diào)節(jié)序列(例如啟動(dòng)子或增強(qiáng)子)定位DNA分子，使得所述啟動(dòng)子以穩(wěn)定或瞬時(shí)方式控制所述DNA分子轉(zhuǎn)錄為RNA?！拜d體”是指將插入的核酸分子轉(zhuǎn)移至宿主細(xì)胞內(nèi)部和/或在宿主細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移插入核酸分子的自我復(fù)制核酸分子。該術(shù)語包括主要起復(fù)制核酸作用的載體和起轉(zhuǎn)錄和/或翻譯DNA或RNA作用的表達(dá)載體。還包括提供一種以上的上述功能的載體?！八拗骷?xì)胞”包括任何單獨(dú)的細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物，它們可以是或已經(jīng)成為載體或加入的外源核酸分子和/或蛋白的受體?！八拗骷?xì)胞”還包括單個(gè)細(xì)胞的后代，所述后代由于天然、偶然或有目的的突變，與原始親代細(xì)胞可以不必完全相同(在形態(tài)學(xué)或基因組DNA互補(bǔ)物或總DNA互補(bǔ)物方面)。
“抗體”是能夠結(jié)合抗原的免疫球蛋白分子。本文使用的術(shù)語不僅包括完整的免疫球蛋白分子，而且包括抗獨(dú)特型抗體、突變體、片段、融合蛋白、人源化蛋白和包含具有需要特異性的抗原識別部位的修飾免疫球蛋白分子?！翱贵w復(fù)合物”是組合的抗體(如上所定義)及其結(jié)合配偶體或配體。用于本發(fā)明的“合適細(xì)胞”包括但不限于表達(dá)SFRP的細(xì)胞，例如骨髓細(xì)胞，優(yōu)選hOB細(xì)胞。本文將核酸分子的“生物等同物”定義為和參比核酸分子具有基本同一性的核酸分子。參比核酸分子的片段是生物等同物的一個(gè)實(shí)例。SFRP多肽或蛋白的“生物等同物”是保留參比蛋白或多肽相同特征的多肽或蛋白， 并且包括參比蛋白或多肽的片段。還可以使用市售的自動(dòng)化肽合成儀，如Applied Biosystems, Inc. ,Foster City,CA生產(chǎn)的型號為430A或431A的設(shè)備，通過化學(xué)合成獲得SFRP蛋白和多肽，在SED ID NO2中提供了氨基酸序列。合成的蛋白或多肽可被沉淀并通過例如高效液相色譜(HPLC)進(jìn)一步純化。因此，本發(fā)明還提供以下的化學(xué)合成本發(fā)明蛋白的方法提供所述蛋白的序列(例如SEQ ID NO 2)和試劑(諸如氨基酸和酶)，并以正確的方向?qū)被岷途€性序列連接在一起?；蛘?，可通過例如 Sambrook 等，Molecular Cloning A LaboratoryManual,第二版，(Cold Spring Harbor Laboratory (1989))描述的眾所周知的重組方法,使用例如以下描述和例舉的宿主細(xì)胞和載體系統(tǒng)，獲得所述蛋白和多肽。本發(fā)明還提供通過培養(yǎng)含編碼需要蛋白的核酸分子的宿主細(xì)胞產(chǎn)生SFRP、其類似物、突變蛋白或片段的方法，其中所述核酸有效連接至RNA轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子?？赏ㄟ^使用含有需要蛋白的核酸序列的啟動(dòng)子和終止子序列的基因構(gòu)建物，將需要的蛋白引入到宿主細(xì)胞中。在合適的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，使得所述核酸被轉(zhuǎn)錄和翻譯為蛋白。在一個(gè)單獨(dú)的實(shí)施方案中，所述蛋白被進(jìn)一步純化。本發(fā)明的蛋白還可以與各種液相載體組合，所述液相載體例如無菌溶液或水溶液、藥學(xué)上可接受的載體、懸浮液和乳濁液。非水性溶劑的實(shí)例包括丙基乙二醇、聚乙二醇和植物油。當(dāng)用于制備抗體時(shí)，所述載體還可以包括用于非特異性增強(qiáng)特異性免疫應(yīng)答的佐劑。熟練的技術(shù)人員可以很容易地確定是否需要佐劑并選擇一種佐劑。然而，僅為了說明目的，合適的佐劑包括但不限于弗氏完全佐劑和不完全佐劑、無機(jī)鹽和多核苷酸。SFRP/SARP的治療用涂盡管SFRP/SARP基因家族僅僅在最近才被發(fā)現(xiàn)，其生物學(xué)仍有許多問題需要了解，但這些蛋白還是具有幾種潛在的治療用途。因?yàn)橐阎猣ct與原癌基因有關(guān)，所以SFRP/SARP由于其能夠拮抗Wnt活性而可以起腫瘤抑制劑的作用。這些蛋白還可以用于組織再生。例如，因?yàn)镕rzB-1刺激體內(nèi)的異位軟骨形成活性，所以它可以用于加快骨折康復(fù)或髖和膝更換后的關(guān)節(jié)愈合(專利申請?zhí)朩O 98/16641 Al)。最后，因?yàn)镾FRP/SARP似乎控制凋亡，所以這些蛋白還可以用于治療各種退行性疾病，包括神經(jīng)退行性疾病、肌退行性疾病和骨退行性疾病。藥用組合物本發(fā)明還提供包含任一種上述蛋白、突變蛋白、片段、抗體、編碼所述蛋白、突變蛋白、抗體或其片段的核酸分子以及表達(dá)所述核酸分子的載體和宿主細(xì)胞、以及可接受的固體或液體載體緩沖液或稀釋劑的組合物。使用足以實(shí)現(xiàn)對成骨活性或凋亡活性的需要調(diào)節(jié)作用的有效量的一種或多種活性成分。可通過常規(guī)的需要活性的劑量-反應(yīng)曲線測定有效量。當(dāng)在藥學(xué)上使用所述組合物時(shí)，它們可與“藥學(xué)上可接受的載體”組合用于診斷和治療用途。所述組合物的配制對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是眾所周知的。本發(fā)明的藥用組合物可包含一種或多種其它的活性組分并優(yōu)選包括藥學(xué)上可接受的載體。所述其它的活性組分可與基于上述的一種或多種SFRP的活性組分的作用協(xié)同作用。在替代實(shí)施方案中，加入其它的活性組分，因?yàn)槠浜蚐FRP對相同的疾病或病癥起作用，但作用方式與基于SFRP的活性組分不同，或者所述其它的活性組分可對存在于人或動(dòng)物體內(nèi)的其它疾病或病癥起作用。合適的藥學(xué)上可接受的載體和/或稀釋劑包括任何和全部的常規(guī)溶劑、分散介質(zhì)、填充劑、固體載體、水性溶液、包衣劑、抗菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”是指在給予患者中不引起變態(tài)反應(yīng)或其它不適當(dāng)作用的載體。合適的藥學(xué)上可接受的載體包括例如水、鹽水、磷酸緩沖鹽溶液、葡萄糖、甘油、乙醇等中的一種或多種，以及它們的組合。藥學(xué)上可接受的載體還可以包括微量的增強(qiáng)所述組合物的一種或多種活性組分的有效期或有效性的輔助物質(zhì)，如潤濕劑或乳化劑、防腐劑或緩沖劑。這樣的用于藥學(xué)活性物質(zhì)的介質(zhì)和物質(zhì)在本領(lǐng)域是眾所周知的。常規(guī)培養(yǎng)基或物質(zhì)例外不能使用的情況是 它與所述活性成分不相容，還設(shè)想了其在本發(fā)明的免疫原性組合物中的應(yīng)用。這些組合物還可以用于制備診斷和治療與神經(jīng)退行性疾病(即Huntington氏病、Alzheimer氏病、脊髓損傷)、肌退行性疾病(即肌肉營養(yǎng)不良、重癥肌無力、肌強(qiáng)直性肌病)和骨退行性疾病(即骨質(zhì)疏松)相關(guān)的病理的藥物。在某些實(shí)施方案中，在所述組合物中使用結(jié)合整個(gè)或部分SFRP蛋白的抗體，以治療任一種上述疾病或病癥?？赏ㄟ^常規(guī)方法制備多克隆抗體和單克隆抗體。一般來說，產(chǎn)生的抗體針對(a) SFRP蛋白特異氨基酸序列和(b)更可能具有抗原性的氨基酸序列?？赏ㄟ^進(jìn)行序列分析和使用任何常規(guī)序列排列和序列對比程序選擇SFRP蛋白特異性序列。一般優(yōu)選用在一個(gè)末端或多個(gè)末端(最好在兩端)具有親水性的氨基酸序列產(chǎn)生抗體。除了使用親水性氨基酸以外，在優(yōu)選的實(shí)施方案中所述親水性氨基酸還可為堿性(非酸性)?？墒褂萌魏卧黾涌乖缘陌被?。例如，脯氨酸經(jīng)常用于所述序列的中央部分。當(dāng)產(chǎn)生抗SFRP蛋白特異性初始測試序列的抗體時(shí)，可根據(jù)產(chǎn)生抗體量的下降或增加來檢測抗原性。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，產(chǎn)生針對含SFRP蛋白的至少8個(gè)連續(xù)氨基酸(優(yōu)選至少10個(gè)連續(xù)氨基酸)的序列的抗體。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中，產(chǎn)生針對含約15個(gè)至約30個(gè)氨基酸的氨基酸序列的抗體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，產(chǎn)生針對含SEQ ID NO 2的SFRP蛋白的氨基酸217-231的序列或其序列變異體的抗體。本發(fā)明的組合物可通過各種途徑給予需要促進(jìn)神經(jīng)、肌肉、軟骨和骨生長的個(gè)體，所述途徑包括但不限于靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、鞘內(nèi)、顱內(nèi)和局部給予。所述組合物可通過體內(nèi)或活體外方法直接給予至器官或器官細(xì)胞。這些組合物可以為溶液形式或微粒形式，或者可以加入到微球或微泡中，包括微膠粒和脂質(zhì)體。工業(yè)實(shí)用件上述組合物提供用于篩選為合適細(xì)胞Wnt受體激動(dòng)劑或拮抗劑的藥物或藥用化合物的篩選測定的組分。
此外，預(yù)期本發(fā)明的SFRP多核苷酸可用作診斷劑或用于檢測與SFRP編碼基因或一個(gè)或多個(gè)參與fct信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的基因有關(guān)的遺傳異常的的用途。所述遺傳異常包括核苷酸的點(diǎn)突變、缺失或插入。若干遺傳篩選法均適合使用本發(fā)明可提供的探針，所述遺傳篩選法包括限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)或PCR。該基因突變表明出現(xiàn)異常的風(fēng)險(xiǎn)增高。按照下文提供的詳述，所述蛋白或其片段可用于體外無細(xì)胞和細(xì)胞測定系統(tǒng)，以篩選抑制或增強(qiáng)fct受體途徑和凋亡的藥物和藥用化合物，或測試與該途徑相關(guān)的疾病(例如骨形成性疾病、癌發(fā)生和心血管疾病)的可能療法。所述蛋白或其片段還可以調(diào)節(jié)胚胎發(fā)生。藥物篩選方法可用于鑒定SFRP蛋白的激活劑或抑制劑。例如，在藥物存在下的軟骨生長與單獨(dú)的SFRP相比增加可能表明激活了 SFRP，而減少可能表明抑制了 SFRP活性?？墒褂帽景l(fā)明的方法篩選各種化合物。它們包括肽、大分子、小分子、化學(xué)混合物和生物混合物。所述化合物可以是生物化合物、合成化合物、有機(jī)化合物或無機(jī)化合物。 在本發(fā)明中，合適的細(xì)胞用于制備診斷測定、表達(dá)SFRP或制備核苷酸型診斷試劑盒。所述細(xì)胞可由酵母、細(xì)菌、真菌或病毒制備或產(chǎn)生。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞為hOB細(xì)胞，特別是稱為h0B-01-Cl-PS-09細(xì)胞(保藏于Manassas，Va的美國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號PTA-785)的新型永生化前骨細(xì)胞系，具有h0B-01-Cl-PS-09細(xì)胞的鑒定特征的成骨細(xì)胞以及由其制備的成骨細(xì)胞(例如子代細(xì)胞)。永生化是指基本連續(xù)和永久建立的具有顯著無限細(xì)胞分裂潛能的細(xì)胞培養(yǎng)物。也就是說，所述細(xì)胞可基本無限地培養(yǎng)，即在快速生長條件下培養(yǎng)至少約6個(gè)月，優(yōu)選在較慢生長條件下培養(yǎng)更長時(shí)間，并可以使用常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)快速連續(xù)繁殖。換種方式說，本發(fā)明的細(xì)胞可培養(yǎng)至少約100、150或200個(gè)群體倍增。這些細(xì)胞產(chǎn)生具有正常人成骨細(xì)胞特征的補(bǔ)充蛋白，并能夠進(jìn)行成骨細(xì)胞分化。它們可用于成骨細(xì)胞對各種物質(zhì)(諸如激素、細(xì)胞因子和生長因子)敏感性的細(xì)胞培養(yǎng)研究或用于組織治療。這些細(xì)胞為先前由Bodine等1996Endocrinology 137 :4592-4604公開的h0B-01-Cl細(xì)胞系的衰老后亞克隆。因此，如我們在本文的報(bào)導(dǎo)，SFRP為骨質(zhì)疏松的新型藥物靶，某些實(shí)施方案涉及編碼至少一種SFRP蛋白的全部或部分的基因或核酸的表達(dá)。所述核酸或基因在人成骨細(xì)胞(hOB)細(xì)胞系中的表達(dá)與細(xì)胞死亡和凋亡的加速相關(guān)聯(lián)。本發(fā)明的h0B-01ClPS-09細(xì)胞相對于其它hOB細(xì)胞特別有效，因?yàn)椤?09”表示的細(xì)胞為成熟成骨細(xì)胞。另外，這些細(xì)胞為骨細(xì)胞(即成熟細(xì)胞)，相比之下其它hOB細(xì)胞通常為成骨細(xì)胞。而且，h0B-01-Cl-PS-09細(xì)胞表達(dá)非常低水平的FRP-l/SARP-2 mRNA。因此，h0B-01-Cl-PS_09細(xì)胞系是研究FRP-1/SARP-2再引入和過量表達(dá)作用的獨(dú)特體外模型。h0B-01-Cl-PS-09細(xì)胞的另一個(gè)重要特征在于它們既可用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染研究，也可用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染研究。以下列出該細(xì)胞相對于親代h0B-01-Cl細(xì)胞的眾多優(yōu)勢中的幾種h0B-01-Cl-PS-09細(xì)胞是真正的永生，在34°C的分裂快2-3倍，且它們還保留親代細(xì)胞的許多前骨細(xì)胞特征。h0B-01-Cl-PS-09細(xì)胞可用于建立過量表達(dá)潛在的骨質(zhì)疏松藥物靶的穩(wěn)定細(xì)胞系。所述穩(wěn)定細(xì)胞系因而對表征這些藥物靶以及開發(fā)鑒定調(diào)節(jié)其的化合物的高通量篩選和測定很有價(jià)值。實(shí)施例本發(fā)明由以下的實(shí)施例進(jìn)一步描述。提供所述實(shí)施例僅為了參照具體的實(shí)施方案闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例盡管描述了本發(fā)明的某些具體方面，但不限制或限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例A hOB細(xì)朐的產(chǎn)牛和分析h0B-01-Cl細(xì)胞是得自成人骨的條件轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，如實(shí)呈現(xiàn)前骨細(xì)胞表型。這些細(xì)胞用溫度敏感型大T-抗原(tsA 209)轉(zhuǎn)化，并在T-抗原突變體 有活性時(shí)于34°C的許可溫度增殖；然而，當(dāng)T-抗原突變體無活性時(shí)，所述細(xì)胞于非許可溫度(> 370C )停止分裂。盡管h0B-01-Cl細(xì)胞是建立的第一個(gè)骨細(xì)胞系，并適于探索研究，但它們具有某些藥物開發(fā)劣勢。同其它的SV-40大T-抗原轉(zhuǎn)化的人細(xì)胞系一樣，h0B-01-Cl細(xì)胞在培養(yǎng)15-20代后經(jīng)歷轉(zhuǎn)捩和衰老。因此，盡管經(jīng)常被稱為“永生化”，但所述細(xì)胞系實(shí)際上僅為“延長生命”。h0B-01-Cl細(xì)胞還在34°C培養(yǎng)時(shí)緩慢增殖，倍增時(shí)間為約每5-6天一次。為了克服某些這樣的缺點(diǎn)，建立了 h0B-01-Cl-PS-09細(xì)胞系。通過在之前傳代培養(yǎng)轉(zhuǎn)捩點(diǎn)(即傳代15-20代)后的親代h0B-01-Cl細(xì)胞系直至增殖恢復(fù)(傳代20-25代)，產(chǎn)生h0B-01-Cl-PS-09細(xì)胞。然后擴(kuò)增培養(yǎng)衰老后細(xì)胞并亞克隆。使用反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)分析特征鑒定克隆，以檢測甲狀旁腺激素(PTH)-1受體mRNA的表達(dá)水平。選擇h0B-01-Cl-PS_09細(xì)胞進(jìn)一步特征鑒定，因?yàn)樵摽寺∮?9°C表達(dá)最高水平的PTH-1受體mRNA。該細(xì)胞系在克隆和擴(kuò)增步驟經(jīng)過大約20-25次群體倍增，隨后傳代超過50次。這些細(xì)胞系可傳代數(shù)百次。因此，h0B-01-Cl-PS-09細(xì)胞是真正的永生細(xì)胞系。同親代h0B-01-Cl細(xì)胞系一樣，h0B-01-Cl-PS-09細(xì)胞不能在組織培養(yǎng)皿上形成單層培養(yǎng)物和留出空間。所述細(xì)胞似乎還通過長細(xì)胞突起(long cellular process)形成細(xì)胞-細(xì)胞接觸。根據(jù)電子顯微鏡分析，所述細(xì)胞具有使人聯(lián)想到前骨細(xì)胞的指樣細(xì)胞突出物(projection),當(dāng)它們接觸鄰近細(xì)胞時(shí)這些突起形成空位連接。如同親代細(xì)胞系一樣，據(jù)免疫細(xì)胞化學(xué)測定，h0B-01-Cl-PS-09細(xì)胞也表達(dá)tsA 209大T-抗原。與親代h0B-01-Cl細(xì)胞系不同，h0B-01-Cl-PS-09細(xì)胞在許可溫度的增殖快2-3倍，倍增時(shí)間為每2-3天I次(圖22A)。然而，同親代細(xì)胞一樣，h0B-01-Cl-PS-09細(xì)胞在非許可溫度停止分裂(圖22A)。該觀察結(jié)果表明，盡管細(xì)胞已經(jīng)通過了轉(zhuǎn)捩點(diǎn)成為永生細(xì)胞，但它們?nèi)匀恍枰钚訲-抗原進(jìn)行增殖。而且，同親代細(xì)胞系一樣，h0B-01-Cl-PS-09細(xì)胞需要T-抗原失活，以便展現(xiàn)增強(qiáng)的骨細(xì)胞表型。堿性磷酸酶和骨鈣蛋白是骨細(xì)胞譜系的兩個(gè)重要標(biāo)志。如圖22B所示，當(dāng)于39°C溫育所述細(xì)胞時(shí)，維生素D3處理上調(diào)堿性磷酸酶活性的能力增加了約4倍。而且，如圖22C所示，維生素D3在34°C不能誘導(dǎo)所述細(xì)胞分泌骨隹丐蛋白。然而，當(dāng)所述細(xì)胞于39°C溫育時(shí)，secosteroid將該骨特異性基質(zhì)蛋白產(chǎn)量上調(diào)
11倍。應(yīng)當(dāng)指出的是，h0B-01-Cl-PS-09細(xì)胞表達(dá)的堿性磷酸酶基礎(chǔ)水平和分泌的骨鈣蛋白基礎(chǔ)水平與親代細(xì)胞系相似。因此，h0B-01-Cl-PS-09細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上和生物化學(xué)上都類似于親代h0B-01-Cl細(xì)胞，因此是研究人前骨細(xì)胞生物學(xué)的可靠體外模型。如上所述，根據(jù)其高水平表達(dá)PTH-1受體mRNA選擇用于進(jìn)一步特征鑒定的h0B-01-Cl-PS-09細(xì)胞系。如圖23所示，于39°C溫育所述細(xì)胞48小時(shí)與在34°C維持的細(xì)胞相比，PTH-1受體mRNA的穩(wěn)態(tài)水平增加7倍。因?yàn)镻TH-1受體表達(dá)是成骨細(xì)胞/骨細(xì)胞分化的標(biāo)志，所以這還表明所述細(xì)胞在非許可溫度具有更明確的骨細(xì)胞表型。和PTH-1受體表達(dá)增強(qiáng)相一致，于39°C預(yù)溫育h0B-01-Cl-PS-09細(xì)胞48小時(shí)，然后用濃度逐漸增加的人PTH 1-34 (hPTH 1-34)于37°C處理10分鐘，使胞內(nèi)環(huán)腺苷酸(cAMP)水平產(chǎn)生5_6倍的劑量依賴性增加(圖24)。相比之下，于34°C預(yù)溫育所述細(xì)胞沒有導(dǎo)致在hPTH 1-34處理后接著發(fā)生cAMP濃度增加。因此，在tsA-209 T-抗原失活后PTH-1受體表達(dá)和反應(yīng)性都得到增強(qiáng)。此cAMP測定的一個(gè)潛在用途是在PTH-1受體表達(dá)水平急劇變化的條件下，能夠用重要的靶細(xì)胞特征鑒定PTH-類似物或PTH-模擬物的活性。除了維生素DjPPTH之外，h0B-01-Cl-PS-09細(xì)胞對其它的骨活性藥物也有反應(yīng)例如糖皮質(zhì)激素和轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-P I。用合成糖皮質(zhì)激素地塞米松于34°C處理所述細(xì)胞使堿性磷酸酶活性上調(diào)約2倍(圖25)，當(dāng)于39°C溫育所述細(xì)胞時(shí)這種作用再一次被增強(qiáng)。同樣，用重組人(rh)TGF-P I于39°C處理所述細(xì)胞導(dǎo)致肝細(xì)胞生長因子(HGF)分泌 劑量依賴性降低。已經(jīng)證實(shí)HGF起破骨細(xì)胞趨化因子的作用，并因此可以在調(diào)節(jié)骨吸收方面起作用。骨細(xì)胞的一個(gè)重要特性是能夠?qū)C(jī)械感受刺激產(chǎn)生應(yīng)答，如在負(fù)重訓(xùn)練過程中發(fā)生的機(jī)械感受刺激。體外模擬這種刺激作用的一個(gè)方法是使用Flexercell StrainUnit (Flexcell International, Hillsborough, NC)。對于圖 26 所描述的實(shí)驗(yàn)，將h0B-01-Cl-PS-09細(xì)胞接種入膠原蛋白包被的BioFlex I型6孔組織培養(yǎng)板中，并于34°C溫育24小時(shí)。然后在34°C或39°C在無血清培養(yǎng)基中再溫育所述細(xì)胞24小時(shí)，再后使用FX-3000Flexercell Strain Unit 于 37°C施加生理相關(guān)性應(yīng)力(3400 y E，2Hz，7200 個(gè)循環(huán))。應(yīng)力處理之后，溫育所述細(xì)胞4. 5小時(shí)，此時(shí)收集條件培養(yǎng)基并分析其存在的一氧化氮(NO)情況。先前已經(jīng)報(bào)導(dǎo)，對嚙齒動(dòng)物和小雞成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞的體外機(jī)械感受刺激或剪切應(yīng)力刺激NO產(chǎn)生。如圖26所示，h0B-01-Cl-PS-09細(xì)胞的機(jī)械感受刺激(S卩“Flex”)使NO產(chǎn)量增加10-18倍。因此，這些數(shù)據(jù)表明，該細(xì)胞系是研究機(jī)械感受刺激的分子機(jī)制的有效體外模型。其它的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，h0B-01-Cl-PS-09細(xì)胞既可用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染研究，也可用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染研究?？墒褂肨fx-20脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑(Promega,Madison,WI)轉(zhuǎn)染該細(xì)胞系。在所述實(shí)驗(yàn)中，將所述細(xì)胞以不同密度接種入24孔組織培養(yǎng)板中，然后用0. 25 y g/孔的P -半乳糖苷酶和熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染(總DNA = 0. 5 ii g/孔)。在34°C或39°C溫育48小時(shí)后，測定細(xì)胞裂解液的￠-半乳糖苷酶和熒光素酶活性。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證實(shí)，不論是￠-半乳糖苷酶表達(dá)水平，還是熒光素酶表達(dá)水平，都隨細(xì)胞數(shù)增加而增加。而且，當(dāng)為了控制轉(zhuǎn)染效率而將熒光素酶表達(dá)對P -半乳糖苷酶表達(dá)歸一化時(shí)，34°C溫育的細(xì)胞的熒光素酶表達(dá)水平高2-3倍。因?yàn)闊晒馑孛副磉_(dá)處于SV-40啟動(dòng)子的控制之下，所以該觀測結(jié)果與39°C時(shí)tsA 209T-抗原失活一致。因此，因?yàn)檫@些細(xì)胞既是永生細(xì)胞又能夠被轉(zhuǎn)染，所以它們可用于產(chǎn)生人前骨細(xì)胞背景的穩(wěn)定過量表達(dá)細(xì)胞系。實(shí)施例1:分離SFRP使用Shiue 1997 Drug Develop. Res. 41 :142-159 (整體結(jié)合到本文中)描述的RADE (差異表達(dá)快速分析)技術(shù)鑒定hOB SFRP基因片段。三種hOB細(xì)胞系(h0B-03_C5、h0B-03-CE6和h0B-01-Cl)代表三個(gè)不同的分化期(分別為增殖期、成熟期和前骨細(xì)胞)，使用這三種細(xì)胞系分離和鑒定SFRP。如前所述建立并培養(yǎng)hOB細(xì)胞系(Bodine等，19961Bone Miner. Res. 11 :806-819 ；Bodine 等，1996 Endocrinology 137 :4592-4604 ；Bodine等，1997T. Cell.Biochem. 65 :368-387)。這些細(xì)胞用溫度敏感型猿猴病毒(SV) 40大T-抗原永生化，當(dāng)T-抗原變異體有活性時(shí)這些細(xì)胞系在許可溫度(34°C )表現(xiàn)出轉(zhuǎn)化表型。然而，與骨肉瘤細(xì)胞相反(Stein和Lian 1993 Endocrine Rev. 14 :424-442),在T-抗原突變體失活時(shí)hOB細(xì)胞系在非許可溫度(> 37°C )忠實(shí)反映了增殖/分化關(guān)系。將所述細(xì)胞系以約40，000細(xì)胞/cm2接種入150mm培養(yǎng)皿中，并于34°C溫育過夜，其中所用的生長培養(yǎng)基為含有10% (v/v)熱失活胎牛血清(FBS)、1% (v/v)青霉素-鏈霉素和2mM GlutaMAX-1的D-MEM/F-12。第二天，取出培養(yǎng)基，用磷酸緩沖鹽水(PBS)清洗細(xì)胞，向培養(yǎng)皿中加入20ml無血清培養(yǎng)基[無酚紅的D-MEM/F-12(Gibco/BRL)，含有0. 25% (w/v)牛血清白蛋白(BSA，Pentex crystallized, Bayer) > I % (v/v)青霉素-鏈霉素、2mMGlutaMAX-l、50mM 抗壞血酸-2-磷酸酯(Wako)和IOnM甲基萘醌亞硫酸氫鈉(維生素K3)]，將所述培養(yǎng)皿于39°C溫育24小時(shí)。第二天，取出培養(yǎng)基，用20ml含載體(對照)、8nM人甲狀旁腺激素1-34 (PTH)、
IOOnM前列腺素E2 (PGE2)或0.1nM人轉(zhuǎn)化生長因子-P I (TGF-P I)的新鮮無血清培養(yǎng)基于39°C再處理所述細(xì)胞24小時(shí)。PTH、PGE2和TGF-P I是已知的成骨因子(Whitfield和Morley 1995 Trends Pharmaceut. Sc1. 16 :382-386 ;Lee 和 Ma 1997 Bone 21:297-304;Centrella等，1994Endocrine Rev. 15 :27-39)。在處理期之后，用PBS清洗所述培養(yǎng)皿，使用TRIzoI按照生產(chǎn)商(GibcoBRL)的說明由未處理的和處理的細(xì)胞分離總細(xì)胞RNA。然后用分離的RNA樣品如上進(jìn)行RADE ;對受調(diào)節(jié)的基因片段進(jìn)行鑒定、克隆和測序。這些實(shí)驗(yàn)總共鑒定出82個(gè)差異表達(dá)的基因。對RADE獲得的基因片段進(jìn)行BLAST(基本局部序列對比檢索工具)公共數(shù)據(jù)庫檢索；其中一種基因片段與小鼠SFRP-1高度同源。使用以下的引物對在RADE期間鑒定了該基因片段3'末端5' -AAGCTTTTTTTTTTTA-3' (HTllA)(反向引物)和5'末端5' -AAGCTTGATTGCC-3/ (H-APl)(正向引物)，其序列分別示于SEQ IDNO11和SEQ ID NO 12。通過RNA印跡分析證實(shí)與小鼠cDNASFRP-1同源的基因片段的表達(dá)和調(diào)節(jié)。實(shí)施例2 hOB SFRP的特征鑒定圖1概述了 RADE結(jié)果。在增殖期(h0B-03_C5)h0B細(xì)胞系和成熟期(h0B-03_CE6)hOB細(xì)胞系中PGE2強(qiáng)烈上調(diào)hOB SFRP基因片段(箭頭指示)，而在前骨細(xì)胞(h0B-01-Cl)細(xì)胞系中TGF-P I強(qiáng)烈下調(diào)hOB SFRP基因片段。而且，該基因的基礎(chǔ)表達(dá)在前骨細(xì)胞中急劇增加，表明hOB SFRP基因表達(dá)與成骨細(xì)胞分化過程有關(guān)。實(shí)施例3 hOB SFRP基因片段的序列分析對以上實(shí)施例1鑒定的含276個(gè)堿基對(bp)的hOB SFRP基因片段進(jìn)行克隆、測序，再對公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST檢索。檢索顯示，該基因與先前鑒定的兩個(gè)其它c(diǎn)DNA同源。序列比對表明，hOB SFRP基因片段與小鼠SFRP-1基因(GeneBank 登錄號#U88566 ;Rattner 等 1997Proc. Natl. Acad. Sc1. USA 94 :2859-2863)的 3'末端具有 77%的序列同一性。hOB SFRP基因片段還顯示與稱為卷曲相關(guān)蛋白A(FrzA，GeneBank 登錄號#U85945)的相關(guān)牛cDNA 3'末端顯著同源(87%)。另外，hOB SFRP基因片段與至少三種表達(dá)序列標(biāo)記(EST)非常同源，所述三種表達(dá)序列標(biāo)記為人克隆TMOlO (GeneBank 登錄號#U54715)、人CAll腫瘤抑制基因(GeneBank 登錄號#U69122)和人類嬰兒大腦EST (GeneBank 登錄號 #H16753、H16861)。實(shí)施例4 :成骨閔子對hOB SFRP的調(diào)節(jié)作用為了證實(shí)不同的成骨因子(即以上實(shí)施例1中鑒定的DNA片段)調(diào)節(jié)hOB SFRP基因表達(dá)，用PTH、PGE2和TGF- ^ I處理hOB細(xì)胞系；然后分離RNA進(jìn)行RNA雜交。結(jié)果示于圖2-5。如下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將hOB細(xì)胞系接種入150mm培養(yǎng)皿中，如實(shí)施例1所述進(jìn)行處理，不同之處在于使用Oligotex mRNA maxi試劑盒按照生產(chǎn)商(Qiagen)所述由總細(xì)胞RNA中分離polyA+RNA。使用切除的RADE hOB SFRP基因片段、克隆的hOB SFRP基因片段或克隆的全長hOB SFRP cDNA作為32P-標(biāo)記的探針，進(jìn)行RNA印跡分析(如結(jié)合到本文中的Bodine 等，1996,1. Bone. Miner. Res. 11 :806-819 所述)。這些探針中的每一個(gè)在 hOB 細(xì)胞中都檢測到4. 4-4. 6kb的mRNA。將hOB SFRP mRNA的表達(dá)對使用相應(yīng)的32P-DNA探針的甘油醛磷酸脫氫酶(GAPDH)mRNA或P -肌動(dòng)蛋白mRNA歸一化。用IOOnM PGE2處理增殖期的h0B-03-C5細(xì)胞24小時(shí)徹底上調(diào)約4. 6千堿基對(kb)mRNA的表達(dá)(圖2)，證明該基因受PGE2調(diào)節(jié)。當(dāng)克隆的hOB SFRP基因片段用作探針時(shí)，在PGE2處理的細(xì)胞中觀察到約4. 4kb 的優(yōu)勢mRNA，證實(shí)該mRNA實(shí)際上是SFRP基因(圖3)。該mRNA的大小相當(dāng)于人FRP-1/SARP-2 基因轉(zhuǎn)錄物(Finch 等，1997Proc. Natl. Acad. Sc1. USA94 :6770-6775 ；Melkonyan等，1997Proc. Natl. Acad. Sc1. USA 94:13636-13641)。RNA 印跡分析還證實(shí)，用 PGE2 處理成熟期h0B-03-CE6細(xì)胞上調(diào)hOB SFRP mRNA表達(dá)(圖4)。另外，在前骨細(xì)胞h0B_01_Cl細(xì)胞中該基因的基礎(chǔ)表達(dá)升高。在用8nM PTH處理后，該基礎(chǔ)水平表達(dá)抑制35%。而且，PGE2處理成熟期h0B-03-CE6細(xì)胞將SFRP表達(dá)水平提高至前骨細(xì)胞的基礎(chǔ)表達(dá)水平，這暗示PGE2在成骨細(xì)胞中上調(diào)SFRP與細(xì)胞分化增強(qiáng)有關(guān)。最后，用IOOpM TGF-^ I處理前骨細(xì)胞h0B-01-Cl細(xì)胞24小時(shí)對hOB SFRP mRNA的水平產(chǎn)生80%的抑制(圖5)。為證實(shí)hOB SFRP mRNA水平隨著細(xì)胞分化增加而改變，由前成骨細(xì)胞h0B-03-C5細(xì)胞、成熟成骨細(xì)胞h0B-03-CE6細(xì)胞、前骨細(xì)胞h0B-01-Cl細(xì)胞和成熟骨細(xì)胞h0B-05-Tl細(xì)胞中分離總RNA。然后通過TaqMan定量RT-PCR檢測基礎(chǔ)SFRP mRNA水平。當(dāng)與h0B_03_C5細(xì)胞相比時(shí)，h0B-03-CE6細(xì)胞中的基礎(chǔ)SFRP mRNA水平增加約4倍，而h0B_01_Cl細(xì)胞中的基礎(chǔ)SFRP mRNA水平增加約23倍。在另一方面，h0B_05_Tl細(xì)胞中的SFRP mRNA水平下降至約0.5倍。因此，在成骨細(xì)胞譜系的細(xì)胞中，前骨細(xì)胞似乎表達(dá)最高水平的hOB SFRPmRNA o實(shí)施例5 hOB SFRP的表汰動(dòng)力學(xué)如實(shí)施例1所述，將增殖的h0B-03-C5細(xì)胞接種入150mm培養(yǎng)皿中，并用濃度逐漸增加的PGE2處理24小時(shí)或用IOOnM PGE2處理不同時(shí)間長度。用切除的276bp的RADE hOBSFRP基因片段或克隆的1.1kb hOB SFRP基因片段作32P-標(biāo)記探針，對PolyA+RNA進(jìn)行RNA印跡分析。用濃度逐漸增加的PGE2處理增殖期h0B-03-C5細(xì)胞以劑量依賴方式上調(diào)hOBSFRP mRNA表達(dá)，EC5tl約為8nM。同樣，用濃度逐漸增加的PGE2處理成熟h0B_03_CE6細(xì)胞也以劑量依賴方式上調(diào)hOB SFRP mRNA水平，但是該反應(yīng)的PGE2EC5tl比h0B_03_C5細(xì)胞約高10倍。用IOOnM PGE2處理h0B_03_C5細(xì)胞2_24小時(shí)以時(shí)間依賴方式上調(diào)hOB SFRP mRNA表達(dá)。在處理2-4小時(shí)后觀察到SFRP基因表達(dá)明顯增加，在向細(xì)胞培養(yǎng)基加入PGE2后穩(wěn)態(tài)mRNA水平持續(xù)增加長達(dá)24小時(shí)。這些結(jié)果提示，SFRP可能是一種對PGE2處理hOB細(xì)胞延遲響應(yīng)的基因，并暗示其可能處于另一種基因產(chǎn)物的次級控制之下。用成熟h0B-03-CE6細(xì)胞也獲得相似的結(jié)果，不過hOB SFRPmRNA表達(dá)的增加倍數(shù)沒有在h0B_03_C5細(xì)胞中高。以相似的方式將h0B-01-Cl細(xì)胞接種入IOOmm培養(yǎng)皿中，并用濃度逐漸增加的TGF-P I處理24小時(shí)。然后由所述細(xì)胞中分離總RNA，并通過TaqMan定量RT-PCR檢測hOBSFRP mRNA。TGF-P I以劑量依賴方式對SFRP基因表達(dá)產(chǎn)生約70%的抑制，IC50約為4pM。除了 PGE2之外，用白介素(IL)-1P、9_順-視黃酸或全-反-視黃酸處理h0B-03-C5細(xì)胞或h0B-03-CE6細(xì)胞也增加hOB SFRP mRNA水平。另一方面，與TGF-P I 一樣，用PTH、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)-2、胰島素樣生長因子(IGF)-1、17 0-雌二醇(17 P-E2)、維生素D3 (VD3)、地塞米松(Dex)或胎牛血清(FBS)處理各種hOB細(xì)胞系，它們抑制hOBSFRPmRNA表達(dá)。總之，在這些不同因子增加或減少hOB SFRP表達(dá)的能力和它們增強(qiáng)或抑制成 骨細(xì)胞/骨細(xì)胞凋亡的能力之間存在著良好的(雖然不完美)關(guān)聯(lián)(參見例如Manolagas2000 Endocrine Reviews21 :115-137)。實(shí)施例6 hOB SFRP的鉬織分布為了確定hOB SFRP基因表達(dá)的組織分布，如實(shí)施例4所述用切除的RADE hOBSFRP基因片段探測多種人組織poly (A) +RNA的RNA印跡(得自Clonetech)。當(dāng)使用所述RADE片段探測poly (A) +RNA的RNA印跡時(shí)，幾個(gè)組織表達(dá)約4. 4kb的轉(zhuǎn)錄物(圖6)。當(dāng)這些結(jié)果對￠-肌動(dòng)蛋白歸一化時(shí)，SFRP表達(dá)排列如下腎臟>心臟> 胎盤 > 肝臟=骨骼肌=胃=甲狀腺 > 腎上腺=睪丸=子宮=小腸=胰腺=大腦>氣管=脊髓=前列腺=結(jié)腸>脾臟>肺=淋巴結(jié)=骨髓；在胸腺和外周血淋巴細(xì)胞中未觀測到表達(dá)。該表達(dá)模式與人FRP-1/SARP-2基因類似(Finch 等，1997Proc. Natl. Acad. Sc1. USA 94 :6770-6775 ；Melkonyan 等，1997 Proc.Natl.Acad. Sc1. USA 94 :13636-13641)。實(shí)施例7 :SFRP在成骨細(xì)胞細(xì)胞系中的分布除了最初鑒定出SFRP的hOB細(xì)胞系以外，檢測其它的體外人成骨細(xì)胞模型該基因的存在情況。由美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)獲得Sa0S-2人骨肉瘤成骨細(xì)胞樣細(xì)胞，并將其在含10%FBS、1% (v/v)青霉素-鏈霉素和2mM GlutaMAX-1的McCoy 5A改良型培養(yǎng)基中于 37°C進(jìn)行培養(yǎng)。同樣，如前所述(Bodine 等，1996J. Bone. Miner. Res. 11 :806-819,通過引用結(jié)合到本文中)由網(wǎng)狀骨碎片建立正常人成骨細(xì)胞(hOB)的外植塊培養(yǎng)物。然后如實(shí)施例1和4所述將所述細(xì)胞接種入150mm培養(yǎng)皿中并進(jìn)行處理，不同之處在于所述細(xì)胞于37°C而不是39°C進(jìn)行溫育。使用32P-標(biāo)記的克隆的1.1kb hOB SFRP基因片段對polyA+RNA進(jìn)行RNA印跡分析。Sa0S-2細(xì)胞表達(dá)相對低基礎(chǔ)水平的SFRP mRNA,其不受PTH、PGE2或TGF-P I處理的調(diào)節(jié)(圖7)。在這些細(xì)胞中由于表達(dá)水平低而難以量化所述基因的表達(dá)。相反，正常hOB細(xì)胞表達(dá)較高基礎(chǔ)水平的SFRP mRNA，而用IOOnM PGE2處理所述細(xì)胞24小時(shí)似乎輕微上調(diào)所述mRNA的穩(wěn)態(tài)水平(約1. 3倍)。對這些RNA樣品的TaqMan定量RT-PCR分析表明，PGE2在hOB細(xì)胞中上調(diào)SFRP 10倍。由于在骨肉瘤細(xì)胞中的低基礎(chǔ)水平表達(dá)，這些細(xì)胞可能不是令人滿意的研究SFRP基因調(diào)節(jié)的體外模型。因?yàn)樗龌蛟谂囵B(yǎng)的正常人成骨細(xì)胞中表達(dá)并受PGE2調(diào)控，所以本發(fā)明描述的hOB細(xì)胞系已證實(shí)可用于體外成骨細(xì)胞模型。分離自人骨巨細(xì)胞瘤的總RNA的RNA印跡分析和RT-PCT在該組織中未能檢測出hOB SFRP mRNA表達(dá)。這些結(jié)果表明，破骨細(xì)胞樣細(xì)胞可能不表達(dá)所述基因。
實(shí)施例8 :分離全長hOB SFRP cDNA因?yàn)榈米訰ADE的克隆hOB SFRP基因片段與幾種人類EST相同，所以進(jìn)行EST數(shù)據(jù)庫分析，以便裝配hOB基因的全長cDNA，該分析表明，hOB SFRP實(shí)際上是已知的人類基因FRP-U也叫做分泌型凋亡相關(guān)蛋白-2或SARP-2)。根據(jù)該分析以及小鼠SFRP-1基因與人FRP-1基因和人SARP-2基因明顯同源的觀察結(jié)果(Rattner等，1997Proc. Natl. Acad. Sc1. USA 94 :2859-2863 ;Finch 等，1997 Proc. Natl. Acad. Sc1.USA 94 :6770-6775 ；Melkonyan 等，1997Proc. Natl. Acad. Sc1. USA 94:13636-13641)，設(shè)計(jì)一種基于RT-PCR的策略，以便由人胎盤RNA和PGE2處理的h0B_03_CE6細(xì)胞RNA 獲得全長的1.1kb hOBSFRP cDNA。使用 I ii g 總 RNA、跨越 hFRP-l/SARP-2 編碼區(qū)的引物(正向引物5 ' -GCTGGGGACTGCGCCTTTTGT-3 '，SEQ ID NO 13 ;反向引物:5' -CCTGCCCCCGGGAGAATCACTTA-3 '，SEQ ID NO 14)、35 個(gè)循環(huán)的 PCR 和 Advantage-GCPCR試劑盒(Clonetech)，按照生產(chǎn)商的說明進(jìn)行RT-PCR。為了檢測mRNA的表達(dá)，使用與hFRP-l/hSARP-2編碼區(qū)的堿基501-530特異性雜交的32P-寡核苷酸探針，用RT-PCR產(chǎn)物進(jìn) 行 DNA 印跡分析(參閱 Bodine 等 1997J. Cell. Biochem. 65 :368-387 中關(guān)于 RT-PCR 和 DNA雜交的實(shí)驗(yàn)詳述)。分離全長1.1kb hOB SFRP cDNA，用IOOnM PGE2處理h0B-03_CE6細(xì)胞24小時(shí)使其上調(diào)(圖8)。同樣，分離自PGE2處理的h0B-03-C5細(xì)胞的總RNA的RT-PCR鑒定出2. 2kb的cDNA，其由hFRP_l/SARP_2cDNA的Y -區(qū)橫跨至3'-末端的276bp的RADE片段。將這些cDNA片段克隆入pcDNA3.1(Invitrogen)哺乳動(dòng)物表達(dá)載體(1.1kb cDNA)或 TA(Invitrogen)克隆載體(2. 2kb cDNA)，并測序。hOB SFRP1.1kb (SEQ.1D. NO. 1)和
2.2kb cDNA的序列分析使2. 6kb cDNA的裝配成為可能，所述2. 6kb cDNA包括5'-末端的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和3'-末端的RADE片段。使用1.1kb cDNA對公共數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST檢索顯示，其與人FRP-1/SARP-2基本上相同。SFRP cDNA編碼區(qū)的推斷氨基酸序列示于SEQ.1D. NO. :2。該序列含有的一個(gè)氨基酸與已公開的人SARP-2序列不同174的丙氨酸代替了該位置的脯氨酸(Melkonyan 等，1997 Proc. Natl. Acad. Sc1. USA 94 :13636-13641)。實(shí)施例9 hOB凋亡活件的特征鑒定因?yàn)榭寺〉娜LhOB SFRP基因與人SFRP-1/FRP-1/SARP-2相同，所以研究了該基因在hOB中的生物作用，以確定該基因產(chǎn)物是否調(diào)節(jié)hOB細(xì)胞存活力和Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(圖9-16)。如圖9所示，將hOB細(xì)胞以200，000細(xì)胞/孔接種入6孔培養(yǎng)板中，并于34°C培養(yǎng)。第二天，將一組培養(yǎng)板用PBS清洗,胰蛋白酶消化,如前所述(Bodine等，1996J. BoneMiner. Res. 11 :806-819,通過引用結(jié)合到本文中)用Coulter Multisizer測定基線細(xì)胞數(shù)(和平均細(xì)胞體積)。將另一組培養(yǎng)板置于39°C的非許可溫度，6天后測定細(xì)胞數(shù)(第3天更換培養(yǎng)基)。處于成骨細(xì)胞分化增殖期的h0B-03-C5細(xì)胞于39°C緩慢分裂，6天后細(xì)胞數(shù)增加60-80% ;這種細(xì)胞分裂速率類似于正常hOB細(xì)胞的擴(kuò)增培養(yǎng)(Bodine等，1996Endocrinology 137 :4592-4604)。相反，成熟期h0B-03_CE6細(xì)胞在非許可溫度停止分裂并且細(xì)胞數(shù)保持恒定，而前骨細(xì)胞h0B-01-Cl細(xì)胞在39°C緩慢死亡，使得6天后存活的細(xì)胞少于40 %。如前所述，SARP-2在MCF-7乳癌細(xì)胞中的過量表達(dá)加速了細(xì)胞死亡速率。與此觀測結(jié)果相一致，如圖1、4和5所示，與增殖期h0B-03-C5細(xì)胞系和成熟期h0B-03-CE6細(xì)胞系相比，前骨細(xì)胞h0B-01-Cl細(xì)胞中的基礎(chǔ)SFRP-l/FRP-l/SARP-2mRNA表達(dá)急劇增加。
接下來驗(yàn)證下面的假說SFRP-1/FRP-1/SARP_2基因表達(dá)上調(diào)加速hOB細(xì)胞死亡，而SFRP-1/FRP-1/SARP-2基因表達(dá)下調(diào)抑制細(xì)胞死亡。這些結(jié)果示于圖10。用生長培養(yǎng)基將h0B-03-C5細(xì)胞、h0B-03-CE6細(xì)胞或hOB-Ol-Cl細(xì)胞以200，000細(xì)胞/孔接種入6孔培養(yǎng)板中，并于34 °C過夜培養(yǎng)。第二天，用PBS清洗所述6孔培養(yǎng)板，加入BSA培養(yǎng)基，在存在或不存在IOOnM PGE2 (為了上調(diào)SFRP-1/FRP-1/SARP-2穩(wěn)態(tài)mRNA水平；圖A和B)或
0.01-1. OnMTGF- 3 I (為了下調(diào) SFRP-1/FRP-1/SARP-2mRNA 水平；圖 C)的情況下于 39 °C進(jìn)行處理。誘導(dǎo)凋亡的常用方法是在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞(Melkonyan等，1997Proc.Natl. Acad. Sc1. USA 94 :13636-13641)， 在這些條件下 h0B-03_C5 細(xì)胞系、h0B-03_CE6 細(xì)胞系和h0B-01-Cl細(xì)胞系都停止分裂并逐漸死亡。然而，當(dāng)用PGE2處理h0B-03-C5細(xì)胞和h0B-03-CE6細(xì)胞時(shí)細(xì)胞死亡速率明顯加快，使得處理6天后存活的細(xì)胞降低超過40%。相反，用TGF-P I處理h0B-01-Cl細(xì)胞以劑量依賴方式增加細(xì)胞存活力約2倍。用PGE2處理所述細(xì)胞不僅加速細(xì)胞死亡，而且將平均細(xì)胞體積顯著降低10-20%。此觀測結(jié)果與已知導(dǎo)致胞質(zhì)小囊泡形成、水丟失和細(xì)胞體積減小的凋亡誘導(dǎo)一致(Mesner和Kaufmann 1997,Advances in Pharmacology, 41 卷,57-88 頁)。與凋亡誘導(dǎo)還一致的是，PGE2 處理h0B-03_C5細(xì)胞導(dǎo)致產(chǎn)生組蛋白相關(guān)性DNA片段。最后，據(jù)流式細(xì)胞儀檢測，用PGE2處理h0B-03-C5細(xì)胞增加結(jié)合所述細(xì)胞的膜聯(lián)蛋白V(凋亡的一種特異性標(biāo)志)(圖11)。實(shí)施例10 :細(xì)朐死亡誘導(dǎo)的逆轉(zhuǎn)在圖12 中用 h0B-03-C5 細(xì)胞和 h0B-03_CE6 細(xì)胞證實(shí)了使用 SFRP-1/FRP-1/SARP-2反義寡核苷酸逆轉(zhuǎn)細(xì)胞死亡。以同圖10描述的實(shí)驗(yàn)類似的方式進(jìn)行這些實(shí)驗(yàn)。但是，對于這些實(shí)驗(yàn)，在存在或不存在人SARP-2的有義(對照)或反義的定向起始位點(diǎn)的硫代磷酸寡核苷酸的情況下，用載體對照(即0. 1%乙醇)或PGE2共處理所述細(xì)胞。結(jié)果以相對于第0天對照(即6孔培養(yǎng)板每孔約200，000細(xì)胞)的百分率或以相對于載體處理對照的百分率表示。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，用SARP-2的反義寡核苷酸共處理hOB細(xì)胞逆轉(zhuǎn)了PGE2加速細(xì)胞死亡速率的能力，而用有義(對照)寡核苷酸共處理對該過程沒有影響。另夕卜，用PGE2和SARP-2的抗肽抗體共處理所述細(xì)胞阻斷了 PGE2誘導(dǎo)hOB細(xì)胞死亡的能力。人SFRP-1/SARP-2的有義和反義寡核苷酸的序列如下有義寡核苷酸5'-GGCATGGGCATCGGGCGC-3' (SEQ ID NO. 15)反義寡核苷酸5'-GCGCCCGATGCCCATGCC-3' (SEQ ID NO. 16)實(shí)施例11 SFRP過量表汰加諫hOB細(xì)胞死亡圖13顯示了使用Coulter細(xì)胞計(jì)數(shù)儀的h0B-01-Cl-PS_09細(xì)胞的細(xì)胞存活力實(shí)驗(yàn)結(jié)果。對于這些實(shí)驗(yàn)，用hOB SFRP cDNA (即SFRP-1/FRP-1/SARP-2)哺乳動(dòng)物表達(dá)質(zhì)?；蚩蛰d體(即pcDNA3.1,得自Invitrogen,Carlsbad,CA)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞。使用標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)(參閱 Ausubel 等，1997 Short Protocols in Molecular Biology,第 3版，Wiley {NewYork})。結(jié)果以第0天對照細(xì)胞的百分率表示。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，hOB細(xì)胞過量表達(dá)SFRP-1/FRP-1/SARP-2加速了細(xì)胞死亡速率，相比之下空載體對該過程沒有影響。分離自空載體(V)或SFRP(S)表達(dá)細(xì)胞的總RNA的RNA印跡放射自顯影表明，hOB細(xì)胞如所預(yù)期的一樣過量表達(dá)SFRP基因。另外，TaqMan定量Rt-PCR分析表明，SFRP過量表達(dá)細(xì)胞表達(dá)的SFRP mRNA比空載體表達(dá)細(xì)胞高5_6倍。為了提高SFRP-1/FRP-1/SARP-2誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡速率，亞克隆并特征鑒定了過量表達(dá)h0B-01-Cl-PS-09 (圖14)。TaqMan定量RT-PCR分析表明，一個(gè)亞克隆(SARP-2克隆#1)表達(dá)的SFRP-l/FRP-l/SARP-2mRNA比pcDNA3.1 (空載體)表達(dá)細(xì)胞高50-60倍。同樣，與空載體表達(dá)細(xì)胞(t1/2 = 120小時(shí))相比，BSA培養(yǎng)基中的SARP-2克隆#1細(xì)胞的死亡速率極大加快(t1/2 = 39. 2小時(shí))。實(shí)施例12 hOB SFRP對Wnt活件的作用為了測定SFRP-1/FRP-1/SARP-2基因表達(dá)上調(diào)是否對Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑產(chǎn)生拮抗，用PGE2處理h0B-03-CE6細(xì)胞，并用P -連環(huán)蛋白單克隆抗體探測產(chǎn)生的細(xì)胞。Wnt蛋白在細(xì)胞中的過量表達(dá)上調(diào)被稱為￠-連環(huán)蛋白的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白(參見綜述Moon等，1997 Cell 88 :725-728 ;Barth 等，1997 Curr. Opin. Cell Biol. 9 :683-690 ；和 Nusse1997Cell 89:321-323)。而且，SFRP-1/FRP-1/SARP-2 在 MCF-7 細(xì)胞中的過量表達(dá)下調(diào)3 -連環(huán)蛋白水平，這與拮抗 fct 活性一致(Melkonyan 等，1997Proc. Natl. Acad. Sc1. USA94 :13636-13641)。因此，如實(shí)施例1所述平板接種h0B_03_CE6細(xì)胞并用PGE2處理，例外之處在于提取總細(xì)胞蛋白并如前所述(Bodine等，1996Endocrinology 137 :4592-4604 ； Melkonyan 等，1997Proc. Natl. Acad. Sc1. USA 94 :13636-13641)使用抗所述蛋白的單克隆抗體(Transduction Laboratories)對P -連環(huán)蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。與上調(diào)SFRP-1/FRP-1/SARP-2穩(wěn)態(tài)mRNA水平相一致，用IOOnM PGE2處理h0B-03_CE6細(xì)胞24小時(shí)下調(diào)3 -連環(huán)蛋白水平，表明拮抗fct活性(圖15)。另外，將SFRP-l/FRP-l/SARP-2cDNA共轉(zhuǎn)染A h0B-01-Cl-PS-09細(xì)胞或h0B-02-Cl-PS-02細(xì)胞下調(diào)TCF-熒光素酶表達(dá)，TCF-熒光素酶表達(dá)是檢測fct信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性和P -連環(huán)蛋白核活性的可靠依據(jù)(圖16)(例如Bafico等，1999 J. Biol. Chem. 274 :16180-16187)。人和大鼠的 SFRP-1/FRP-1/SARP-2 以及人Frzb-1/FrzB/Fritz都抑制hOB細(xì)胞的TCF-熒光素酶活性?？偠灾?，這些觀測結(jié)果表明，fct蛋白延長了人成骨細(xì)胞的體外壽命，而SFRP-1/FRP-1/SARP-2對Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的拮抗促進(jìn)成骨細(xì)胞死亡。因此，SFRP-1/FRP-1/SARP-2功能抑制劑可增強(qiáng)成骨細(xì)胞/前骨細(xì)胞存活，并因此增強(qiáng)體內(nèi)骨形成。我們使用幾種鑒定hOB細(xì)胞Wnt表達(dá)的方法(例如RT-PCR、基因芯片分析和cDNA克隆)證實(shí)，這些細(xì)胞系在不同程度上表達(dá)fct-2B/13、-3、-4、-5A和-11。這些Wnt中的任一種或全部都可能參與延長hOB細(xì)胞生命。Wnt-2B/13也稱作Wnt_x。實(shí)施例13 hOB SFRP在合成代謝藥物篩詵方法中的應(yīng)用設(shè)計(jì)了一種使用SFRP篩選骨合成代謝藥物的新型模式。如圖17所示意，該篩選模式使用hOB細(xì)胞和SFRP-1/FRP-1/SARP-2鑒定能夠防止或延緩成骨細(xì)胞死亡的化合物。這樣的化合物對SFRP-1/FRP-1/SARP-2加速hOB細(xì)胞死亡的能力起阻斷作用。這些化合物結(jié)合SFRP-1/FRP-1/SARP-2，并防止其結(jié)合Wnt蛋白，或者它們可結(jié)合Wnt并防止其結(jié)合SFRP-1/FRP-1/SARP-2。如果SFRP-1/FRP-1/SARP-2具有與Wnt結(jié)合無關(guān)的活性(例如結(jié)合細(xì)胞表面受體)，那么這些化合物同樣也可以起防止這種fct無關(guān)型功能的作用。對于圖17示意的篩選模式的初始測定，將化合物與hOB細(xì)胞系和SFRP-1/FRP-1/SARP-2溫育。該測定可使用純化的或部分純化的SFRP-1/FRP- 1/SARP-2蛋白，或包含SFRP-1/FRP-1/SARP-2的條件培養(yǎng)基或細(xì)胞提取物。hOB細(xì)胞系可以是一個(gè)天然表達(dá)高基礎(chǔ)水平SFRP-1/FRP-1/SARP-2的細(xì)胞系(例如h0B-01-Cl細(xì)胞)、瞬時(shí)或穩(wěn)定過量表達(dá)SFRP-1/FRP-1/SARP-2的細(xì)胞系(例如h0B-01-Cl-PS_09細(xì)胞)或者以條件方式穩(wěn)定或天然表達(dá)SFRP-1/FRP-1/SARP-2的細(xì)胞系(例如PGE2處理的h0B_03_C5細(xì)胞)。作為對hOB細(xì)胞死亡的檢測，可使用定量細(xì)胞數(shù)的測定(例如MTT或MTS染色轉(zhuǎn)換或CyQuantDNA熒光)或定量凋亡的測定(例如DNA片段化或膜聯(lián)蛋白V結(jié)合)。CyQuant試劑盒購自MolecularProbes(Eugene, OR)。圖18描述了一個(gè)SFRP-1/FRP-1/SARP-2抑制劑高通量篩選測定(HTS)的實(shí)例。對于該測定，將空載體(pcDNA3.1)或穩(wěn)定過量表達(dá)SFRP-1/FRP-1/SARP-2(SARP-2#1)的h0B-01-Cl-PS-09細(xì)胞以5000細(xì)胞/孔接種入使用生長培養(yǎng)基的96孔平板中。于34°C短暫溫育6小時(shí)后，用PBS清洗各孔，并在BSA培養(yǎng)基中于39°C溫育3天。在溫育結(jié)束時(shí)，再用PBS清洗各孔，然后使用CyQuant DNA熒光測定(Molecular Probes)測定DNA含量。當(dāng)與空載體細(xì)胞相比時(shí)，SARP-2過量表達(dá)細(xì)胞于39°C死亡得更快，使得3天后，僅有20-30%的細(xì)胞仍存活。相反，50-60%的空載體細(xì)胞在溫育中存活。當(dāng)用針對SFRP-1/FRP-1/SARP-2的氨基酸217-231產(chǎn)生的抗肽抗血清(AS)處理SARP-2過量表達(dá)細(xì)胞時(shí)，50-60%的細(xì)胞在3天后存活。這表明，抑制SFRP-1/FRP-1/SARP-2蛋白功能防止其加速hOB細(xì)胞死亡。作為
對照的免疫前血清對SARP-2過量表達(dá)細(xì)胞沒有作用，而無論是免疫前血清還是免疫血清對空載體表達(dá)細(xì)胞都沒有作用。然后，將阻斷SFRP-1/FRP-1/SARP-2誘導(dǎo)的hOB細(xì)胞死亡的化合物進(jìn)行另外的體外測定中。這些測定檢測這些化合物以SFRP-1/FRP-1/SARP-2依賴性或非依賴性方式阻斷hOB細(xì)胞死亡的能力，而且還就這些作用測定這些化合物的能力和效力。設(shè)計(jì)另外的測定，以檢測這些化合物對這些作用的細(xì)胞選擇性(例如，使用MCF-7細(xì)胞或其它細(xì)胞)以及這些化合物對 SFRP-1/FRP-1/SARP-2 與 SFRP/SARP 家族其它成員(例如 FrzB/Fritz、SARP_1或SARP-3)的特異性。其它的測定也可以用于檢測這些化合物是否調(diào)節(jié)涉及凋亡(例如caspase活性)或Wnt活性(例如TCF-熒光素酶測定的P -連環(huán)蛋白水平和功能)的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件。最后，則將在這些體外測定中具有合適活性的化合物用于骨形成、骨質(zhì)減少或骨質(zhì)疏松的各種動(dòng)物模型(例如切除卵巢的大鼠或小鼠)。人們認(rèn)為抑制成骨細(xì)胞/骨細(xì)胞凋亡的化合物是骨合成代謝藥物，其延長這些細(xì)胞的生命，并因此增加合成和礦化的骨基質(zhì)量和/或保持骨的完整性。顯然，可以不同于前述說明和實(shí)施例具體描述的方式來實(shí)施本發(fā)明。按照以上指導(dǎo)可對本發(fā)明進(jìn)行各種修改和變化，它們因此屬于所附權(quán)利要求書的范圍。實(shí)施例14 =SFRP-1基因敲除小鼠的創(chuàng)津和使用如實(shí)施例13所述，抑制成骨細(xì)胞/骨細(xì)胞凋亡的化合物是令人信服的骨合成代謝藥物，其延長這些細(xì)胞的生命，并因此增加合成和礦化的骨基質(zhì)的量和/或保持骨的完整性。為了驗(yàn)證這種假說并測定SFRP-1/FRP-1/SARP-2是否影響骨骼，制備SFRP-1陰性(SFRPneg)小鼠(參見 Wattler 等，1999，BioTechniques 26:1150-1160)。由小鼠中去除SFRP-1/FRP-1/SARP-2基因類似于用藥物抑制其功能，這個(gè)方法允許我們證實(shí)該基因/蛋白為骨質(zhì)疏松的潛在藥物靶。如圖19所概述，通過用￠-半乳糖苷酶報(bào)道基因/新霉素藥物抗性基因表達(dá)盒取代小鼠SFRP-1基因的外顯子1，產(chǎn)生SFRP-1基因敲除小鼠。如圖20所示，分離自雌性或雄性小鼠腎臟(16-18周齡)的poly A+RNA的RNA印跡分析顯示，SFRP-1mRNA(4. 4kb)在野生型(WT)對照小鼠中高水平表達(dá)，但在基因敲除(KO)小鼠中基因表達(dá)完全消失。
如圖21所示，使用微型計(jì)算機(jī)X射線斷層顯象(HiiCT0-CT)特征鑒定雄性和雌性野生型對照(+/+)和基因敲除(-/_)小鼠的遠(yuǎn)端股骨的小梁骨結(jié)構(gòu)(關(guān)于該技術(shù)的綜述，參見 Genant 等，1999Bone 25 :149-152 和 Odgaard 1997 Bone 20:315-328)。在 20 周齡雄性小鼠中(圖A)，-/-小鼠與+/+對照小鼠相比，小梁骨體積(BV/TV)高出31%，小梁厚度(Tb. Th.)增加8%。在26-27周齡雌性小鼠中(圖B)，-/-小鼠與+/+對照小鼠相比，小梁接合密度(Conn. Den.)增加91%，小梁數(shù)(Tb. N.)增加16%，而小梁間距(Tb. Sp.)降低16%。因此，支持我們假說的這些結(jié)果證明，小鼠缺失SFRP-1基因?qū)е滦×汗切纬蓞?shù)提高(P.J. Meunier 1995骨組織形態(tài)學(xué)，載于骨質(zhì)疏松病因?qū)W、診斷和治療，第二版，B. L. Riggs 和 L J. MeltonIII 編著，Lippincott-Raven, Philadelphia,第 299-318 頁)。CPCH0963369D 說明書的核苷酸和氨基酸序列表_ 〈110〉美國家用產(chǎn)品公司(American Home Products Corporation)<120>應(yīng)用分泌型卷曲相關(guān)蛋白的藥用組合物和方法<140>PCT/US00/25035<141)2000-09-13<150)09/394,832<151>1999-09-13<160>2<170>PatentIn Ver. 2.1<210>1<211>2602<212>DNA〈213〉人(Homo sapiens)<400>1gatctgctgg ggactgcgcc ttttgtcccc ggaggtccct ggaagtttgc ggcgggacgc 60gcgcggggag gcggcggagg cagccccgac gtcgcggaga acagggcgca gagccggcat 120gggcatcggg cgcagcgagg ggggccgccg cggggcagcc ctgggcgtgc tgctggcgct 180gggcgcggcg cttctggccg tgggctcggc cagcgagtac gactacgtga gcttccagtc 240ggacatcggc ccgtaccaga gcgggcgctt ctacaccaag ccacctcagt gcgtggacat 300ccccgcggac ctgcggctgt gccacaacgt gggctacaag aagatggtgc tgcccaacct 360gctggagcac gagaccatgg cggaggtgaa gcagcaggcc agcagctggg tgcccctgct 420caacaagaac tgccacgccg gcacccaggt cttcctctgc tcgctcttcg cgcccgtctg 480cctggaccgg cccatctacc cgtgtcgctg gctctgcgag gccgtgcgcg actcgtgcga 540gccggtcatg cagttcttcg gcttctactg gcccgagatg cttaagtgtg acaagttccc 600cgagggggac gtctgcatcg ccatgacgcc gcccaatgcc accgaagcct ccaagcccca 660aggcacaacg gtgtgtcctc cctgtgacaa cgagttgaaa tctgaggcca tcattgaaca 720tctctgtgcc agcgagtttg cactgaggat gaaaataaaa gaagtgaaaa aagaaaatgg 780cgacaagaag attgtcccca agaagaagaa gcccctgaag ttggggccca tcaagaagaa 840ggacctgaag aagcttgtgc tgtacctgaa gaatggggct gactgtccct gccaccagct 900
權(quán)利要求
1.一種調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物成骨活性的藥用組合物，該藥用組合物包含至少一種以下組分 (i)分泌型卷曲相關(guān)蛋白(SFRP)或其調(diào)節(jié)作用部分；(ii)所述蛋白或其部分形成的抗體； (iii)編碼Q)或Qi)的核酸；以及(iv) (iii)中任何一種核酸的反義核酸。
2.按照權(quán)利要求1的藥用組合物，其中所述SFRP得自人成骨細(xì)胞。
3.按照權(quán)利要求1的藥用組合物，其中所述成骨活性是調(diào)節(jié)骨生長。
4.按照權(quán)利要求1的藥用組合物，其中所述成骨活性是調(diào)節(jié)骨密度。
5.按照權(quán)利要求1-3的藥用組合物，其中所述SFRP具有SEDIDNO 2顯示的氨基酸序
6. 一種治療哺乳動(dòng)物骨疾病的方法，該方法包括給予權(quán)利要求1-5的藥用組合物的步列。驟。
7.權(quán)利要求6的治療骨疾病的方法，其中所述疾病包括(a)骨形成疾??；(b)骨吸收疾病和(C)骨密度疾病。
8.權(quán)利要求6的方法，其中所述疾病為退行性骨疾病。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述退行性骨疾病選自神經(jīng)退行性疾病、肌退行性疾病和骨退行性疾病。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述骨退行性疾病選自骨質(zhì)減少、骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松。
11.權(quán)利要求6的方法，其中所述哺乳動(dòng)物為人。
12.一種鑒定調(diào)節(jié)SFRP活性的受試化合物的方法，所述化合物調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物的成骨活性，所述方法包括(a)在含所述受試化合物的測試介質(zhì)中溫育含SFRP的樣品；(b)測定 SFRP活性，其中相對于單獨(dú)SFRP活性增加表明所述化合物為SFRP激活劑，而活性降低表明所述化合物為SFRP抑制劑。
13.—種調(diào)節(jié)Wnt-介導(dǎo)的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法，該方法包括使所述細(xì)胞與權(quán)利要求 1-5的SFRP接觸，其中所述Wnt活性受到調(diào)節(jié)。
14.權(quán)利要求13的調(diào)節(jié)Wnt-介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法，其中所述SFRP具有SEQID NO 2顯示的氨基酸序列。
15.一種促進(jìn)骨細(xì)胞培養(yǎng)物骨形成或骨修復(fù)的方法，該方法包括由骨培養(yǎng)物中分離所述細(xì)胞，引入表達(dá)編碼具有SEQ ID NO :2顯示的氨基酸序列的SFRP的核苷酸序列的反義序列的重組構(gòu)建物，再將所述細(xì)胞返回到所述骨培養(yǎng)物中。
16.—種多核苷酸探針,它能夠與具有SEQ ID NO :1顯不的核酸序列的多核苷酸雜交。
17.—種檢測得自哺乳動(dòng)物宿主的樣品中的SFRP多核苷酸的診斷方法，該方法包括使用權(quán)利要求16的探針檢測所述樣品中是否存在SFRP。
18.權(quán)利要求1的藥用組合物，其中所述組合物包含可接受的載體或稀釋劑。
19.一種調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物成骨活性的組合物，該組合物包括至少一種針對分泌型卷曲相關(guān)蛋白(SFRP)或其調(diào)節(jié)作用部分的抗體。
20.權(quán)利要求19的藥用組合物，其中所述組合物包含可接受的載體或稀釋劑。
21.權(quán)利要求19的藥用組合物，其中所述抗體針對SFRP蛋白的至少8個(gè)連續(xù)氨基酸。
22.權(quán)利要求19的藥用組合物，其中所述抗體針對SFRP蛋白的至少10個(gè)連續(xù)氨基酸。
23.權(quán)利要求19的藥用組合物，其中所述抗體針對SEQID NO 2的SFRP蛋白的至少氨基酸217-231。
24.按照權(quán)利要求1-4和18-21的藥用組合物，其中所述SFRP具有通過表達(dá)SEQID NO 1顯示的多核苷酸序列獲得的氨基酸序列。
25.一種鑒定調(diào)節(jié)SFRP活性的受試化合物的方法，所述化合物調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物成骨活性，所述方法包括(a)比較樣品對SFRPneg動(dòng)物的活性和沒有所述樣品的活性，其中SFRP相關(guān)性活性升高和降低說明所述化合物是SFRP活性的調(diào)節(jié)劑。
26.一種表達(dá)猿猴病毒40大T蛋白抗原的溫度敏感型突變體的永生化人成骨(hOB)細(xì)胞，其中當(dāng)所述T-抗原突變體有活性時(shí)，所述細(xì)胞在約34°C下增殖，但在超過約37°C的溫度下不增殖。
27.權(quán)利要求26的hOB細(xì)胞，它表達(dá)編碼多核苷酸的核苷酸序列，所述多核苷酸編碼 SFRP或其片段。
28.權(quán)利要求26的hOB細(xì)胞，其中所述hOB為h0B-01-Cl-PS_09細(xì)胞或其后代， h0B-01-Cl-PS-09細(xì)胞保藏于美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Manassas, Va，保藏號為PTA-785。
29.—種包含權(quán)利要求26的hOB細(xì)胞的純系細(xì)胞群。
全文摘要
公開了用于調(diào)節(jié)SFRP(分泌型卷曲相關(guān)蛋白)的哺乳動(dòng)物成骨活性的藥用組合物和方法。SFRP是Wnt的分泌型受體，Wnt是已知調(diào)節(jié)基本生物過程(例如組織極性、胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生)的重要多肽生長因子。在人成骨細(xì)胞中分離出SFRP，并鑒定為SFRP-1(也稱作SARP-2)，證實(shí)其在HOB細(xì)胞中以調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞/前骨細(xì)胞生命的差異選擇方式受成骨因子調(diào)節(jié)。
文檔編號A61K38/00GK102988957SQ20091020847
公開日2013年3月27日 申請日期2000年9月13日 優(yōu)先權(quán)日1999年9月13日
發(fā)明者P·V·N·波蒂尼 申請人:惠氏公司