專利名稱：無血清培養(yǎng)基及cho細(xì)胞中高效表達(dá)促紅素的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動物細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，特別是涉及一種用于CHO細(xì)胞表達(dá)促紅素的無血清培養(yǎng)基以及CHO細(xì)胞中高效表達(dá)促紅素的培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
促紅細(xì)胞生成素(促紅素，Erythropoietin, ΕΡ0)是一種刺激骨髓造血的糖蛋白類激素，最早于1906年被發(fā)現(xiàn)。它主要來源于腎臟(少量來源于肝臟)，由皮質(zhì)管周圍的間質(zhì)細(xì)胞合成。在基因重組技術(shù)誕生之前，EPO主要從貧血患者的尿和綿羊血中提取，得率非常低，且極不穩(wěn)定，理化和生物性質(zhì)難以測定，亦無法大規(guī)模應(yīng)用。應(yīng)用DNA重組技術(shù)將促紅細(xì)胞生成素的基因構(gòu)建到中國倉鼠卵巢細(xì)胞中(CH0細(xì)胞)，形成高效表達(dá)重組人促紅細(xì)胞生成素基因的CHO細(xì)胞，經(jīng)過細(xì)胞擴增培養(yǎng)，更換表達(dá)培養(yǎng)基，收集培養(yǎng)上清，后經(jīng)分離純化可制備得到目的糖蛋白-ΕΡ0。在獲得表達(dá)EPO的CHO細(xì)胞株的情況下，培養(yǎng)基的使用對EPO的表達(dá)量和糖基化穩(wěn)定性具有重要影響。常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)基的EPO表達(dá)量約為4000IU/ ml，并且不同培養(yǎng)基的EPO表達(dá)量不穩(wěn)定，所獲得的EPO的糖基化程度也存在較大差異，不能很好的滿足EPO工業(yè)化生產(chǎn)的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對目前的培養(yǎng)基不能滿足CHO細(xì)胞中高效穩(wěn)定表達(dá)EPO的問題，提供一種可用于提高EPO表達(dá)量和表達(dá)穩(wěn)定性的無血清培養(yǎng)基，以及所述無血清培養(yǎng)基在CHO細(xì)胞高效表達(dá)促紅素中的應(yīng)用。本發(fā)明的另一目的是提供一種采用所述無血清培養(yǎng)基，在CHO細(xì)胞中高效表達(dá)促紅素的培養(yǎng)方法。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案本發(fā)明公開了一種無血清培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加劑，其特征在于所述添加劑包括正丁酸鈉，還包括D-半乳糖、D-甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖中的一種或多種。進(jìn)一步的，所述添加劑還包括D-葡萄糖。更進(jìn)一步的，本發(fā)明中優(yōu)選的添加劑用量為D-半乳糖200_300mg/L，D-甘露糖 200-300mg/L, N-乙酰氨基葡萄糖 200_300mg/L，D-葡萄糖 l_3g/L，正丁酸鈉 l-2mmol/L。所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括份數(shù)比1-3 7-9的DMEM培養(yǎng)基和CHO-S-SFM II培養(yǎng)基， 本發(fā)明中，優(yōu)選的份數(shù)比為1 9。優(yōu)選的，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基由份數(shù)比1-3 7-9的DMEM培養(yǎng)基和CHO-S-SFM II培養(yǎng)基組成，更優(yōu)選的份數(shù)比為1 9。本發(fā)明還公開了一種上述培養(yǎng)基在CHO細(xì)胞高效表達(dá)促紅素中的應(yīng)用。本發(fā)明還公開了一種CHO細(xì)胞中高效表達(dá)促紅素的培養(yǎng)方法，所述培養(yǎng)方法包括對活化后的種子細(xì)胞先采用含血清培養(yǎng)基進(jìn)行含血清培養(yǎng)，然后采用上述的無血清培養(yǎng)基進(jìn)行無血清培養(yǎng)。
所述含血清培養(yǎng)基為含有質(zhì)量份數(shù)5% -10%牛血清的DMEM培養(yǎng)基，優(yōu)選的牛血清含量10%。所述含血清培養(yǎng)基還包括0. 5-1 μ mol/L的MTX。所述含血清培養(yǎng)和無血清培養(yǎng)的條件為，溶解氧濃度30% -80%, pH值7. 0-7. 4， 溫度35°C _38°C。需要指出的是，本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，為了保證培養(yǎng)效果，優(yōu)選的細(xì)胞接種密度大于3X 105cells/mL。由于采用以上技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果在于采用本發(fā)明的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法，使得CHO-EPO細(xì)胞能夠高效、穩(wěn)定表達(dá)重組人促紅細(xì)胞生成素蛋白，提高細(xì)胞表達(dá)與目標(biāo)蛋白的糖基化程度，即提高了唾液酸EPO的比重。采用本發(fā)明提供的培養(yǎng)方法每升培養(yǎng)液可獲得高達(dá)LOXIO7IU的重組人促紅細(xì)胞生成素，表達(dá)穩(wěn)定、培養(yǎng)方法簡潔、適合大規(guī)模生產(chǎn)。


圖1是本發(fā)明實施例中細(xì)胞培養(yǎng)流程圖；圖2是本發(fā)明實施例中不同濃度的正丁酸鈉對EPO表達(dá)量的影響結(jié)果；圖3是本發(fā)明實施例中不同濃度MTX對EPO表達(dá)量影響結(jié)果；圖4是本發(fā)明實施例中糖基化試劑對高唾液酸EPO的比重的影響結(jié)果；圖5是本發(fā)明實施例中無血清培養(yǎng)天數(shù)及對應(yīng)的每天的EPO表達(dá)量；圖6是本發(fā)明實施例中無血清培養(yǎng)天數(shù)及對應(yīng)的每天消耗糖量。
具體實施例方式本發(fā)明提供了一種新的可用于提高EPO表達(dá)量和表達(dá)穩(wěn)定性的無血清培養(yǎng)基， 所述無血清培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加劑。所述添加劑包括正丁酸鈉，還包括D-半乳糖、D-甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖中的一種或多種，進(jìn)一步的還包括D型葡萄糖(D-葡萄糖)。所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括一定份數(shù)比例的DMEM培養(yǎng)基和CHO-S-SFM II培養(yǎng)基，本發(fā)明中，優(yōu)選基礎(chǔ)培養(yǎng)基由DMEM培養(yǎng)基和CHO-S-SFM II培養(yǎng)基組成。所述一定份數(shù)比例為 1-3 7-9，優(yōu)選為1 9。進(jìn)一步的，所述添加劑的用量為D-半乳糖200-300mg/L，D-甘露糖200-300mg/L，N-乙酰氨基葡萄糖200_300mg/L，D-葡萄糖l_3g/L，正丁酸鈉l-2mmol/ L0本發(fā)明還提供了上述培養(yǎng)基在CHO細(xì)胞高效表達(dá)促紅素中的應(yīng)用以及培養(yǎng)方法， 包括對活化后的種子細(xì)胞先采用含血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，然后采用上述的培養(yǎng)基進(jìn)行無血清培養(yǎng)。具體培養(yǎng)流程包括種子細(xì)胞活化擴增培養(yǎng)，然后接種到生物反應(yīng)器分別進(jìn)行含血清培養(yǎng)和無血清培養(yǎng)，最后收獲細(xì)胞培養(yǎng)液(圖1)。進(jìn)一步的為了獲得EPO產(chǎn)品，還需要對細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行后續(xù)的分離、純化目標(biāo)蛋白等常規(guī)操作。其中，(1)種子細(xì)胞活化擴增培養(yǎng)細(xì)胞復(fù)蘇，擴增培養(yǎng)，在添加0. 5-1 μ mol/L MTX和10%牛血清的DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行； 然后用胰蛋白酶消化細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，用于接種生物反應(yīng)器。( 含血清培養(yǎng)在添加 0. 5-1 μ mol/L MTX和10%牛血清的DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行，控制培養(yǎng)條件為溶氧30% -80%, pH 值 7.0-7.4，溫度；351 _38°C，優(yōu)選為 36. 8 士0.2 °C。(3)無血清培養(yǎng)用添加 250mg/L D-半乳糖、250mg/L D-甘露糖、250mg/L N-乙酰氨基葡萄糖、l_3g/L葡萄糖和l-2mmol/L
4正丁酸鈉的無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，控制培養(yǎng)條件為溶氧30% -80%, pH值7. 0-7. 4， 溫度35 °C -38°C，優(yōu)選為36. 8 士 0. 2°C。所述無血清培養(yǎng)基即上述本發(fā)明所述的DMEM培養(yǎng)基和CHO-S-SFM II培養(yǎng)基組合而成的培養(yǎng)基。所述種子細(xì)胞為構(gòu)建了促紅細(xì)胞生成素基因的EPO表達(dá)的CHO細(xì)胞，可以通過商業(yè)途徑獲得，一般通過商業(yè)途徑獲得的EPO表達(dá)CHO 細(xì)胞經(jīng)過篩選和保存處理，需要經(jīng)過活化等步驟才能用于后續(xù)操作。下面通過具體實施例并結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。以下實施例僅僅對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說明，不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。實施例1按照培養(yǎng)流程，將種子細(xì)胞活化擴增培養(yǎng)，然后用胰蛋白酶消化細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，接種，在不含MTX的10 %牛血清DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行含血清培養(yǎng)后，將細(xì)胞分別于含Ommol/L正丁酸鈉、0. 5mmol/L正丁酸鈉、1. Ommol/L正丁酸鈉和2. Ommol/L無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述無血清培養(yǎng)基包括份數(shù)比1 9的DMEM培養(yǎng)基和CHO-S-SFM II培養(yǎng)基。 36. 8士2°C培養(yǎng)48小時后收集上清，分別測定培養(yǎng)上清的EPO表達(dá)量。結(jié)果顯示，l-2mmol/ L的正丁酸鈉，既能穩(wěn)定單位細(xì)胞EPO的表達(dá)量，對細(xì)胞的生長也沒有明顯的影響。結(jié)果見圖2。實施例2按照培養(yǎng)流程，將種子細(xì)胞活化擴增培養(yǎng)，然后用胰蛋白酶消化細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，接種，將細(xì)胞分別于添加0ymol/L、0. 5ymol/L和Ιμπιο /L MTX的10%牛血清DMEM 培養(yǎng)基中進(jìn)行含血清培養(yǎng)后，分別加入含1. Ommol/L正丁酸鈉的無血清培養(yǎng)基中進(jìn)行無血清培養(yǎng)，所述無血清培養(yǎng)基包括份數(shù)比為1 9的DMEM培養(yǎng)基和CHO-S-SFM II培養(yǎng)基。 36. 8士2°C培養(yǎng)48小時后收集上清，分別測定培養(yǎng)上清EPO表達(dá)量。結(jié)果顯示，培養(yǎng)基中添加0. 5-1 μ mol/L MTX，既能穩(wěn)定單位細(xì)胞EPO的表達(dá)量，對細(xì)胞的生長也沒有明顯的影響。 結(jié)果見圖3。實施例3按照培養(yǎng)流程，將種子細(xì)胞活化擴增培養(yǎng)，然后用胰蛋白酶消化細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，接種，并在1 μ mol/L MTX的10%牛血清DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行含血清培養(yǎng)后，將細(xì)胞分別于不含糖基化試劑和含D-半乳糖250mg/L、D-甘露糖250mg/L、N_乙酰氨基葡萄糖250mg/ L的糖基化試劑的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述無血清培養(yǎng)基包括份數(shù)比1 9的DMEM培養(yǎng)基和CHO-S-SFM II培養(yǎng)基。36. 8士2°C培養(yǎng)48小時后收集上清，分別測定培養(yǎng)上清的EPO 表達(dá)量。結(jié)果顯示，糖基化試劑能增加培養(yǎng)上清中唾液酸EPO的比重。IEF+Western-blot 結(jié)果見圖4。實施例4按照培養(yǎng)流程，將種子細(xì)胞活化擴增培養(yǎng)，然后用胰蛋白酶消化細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，接種到5L的NBS生物反應(yīng)器，在1 μ mol/L MTX的10%牛血清DMEM培養(yǎng)基中進(jìn)行含血清培養(yǎng)后，在添加D-半乳糖250mg/L、D-甘露糖250mg/L、N_乙酰氨基葡萄糖250mg/L、D_葡萄糖l_3g和1. Ommol/L正丁酸鈉的無血清培養(yǎng)基中將培養(yǎng)。所述無血清培養(yǎng)基包括份數(shù)比1 9的DMEM培養(yǎng)基和CHO-S-SFM II培養(yǎng)基。36. 8士2°C培養(yǎng)至14天，細(xì)胞收獲液約 60L，EPO 表達(dá)量為 10388IU/mL，收獲 6. 2X108IU ΕΡ0。每日 EPO 最高表達(dá) 12878IU/mL，最低表達(dá)4797IU/mL。EPO表達(dá)量和細(xì)胞生長狀況見圖5和圖6。
以上內(nèi)容是結(jié)合具體的實施方式對本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
1.一種無血清培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加劑，其特征在于所述添加劑包括正丁酸鈉，還包括D-半乳糖、D-甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖中的一種或多種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的無血清培養(yǎng)基，其特征在于所述添加劑還包括D-葡萄糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的無血清培養(yǎng)基，其特征在于所述添加劑的用量為D-半乳糖 200-300mg/L, D-甘露糖 200_300mg/L，N-乙酰氨基葡萄糖 200_300mg/L，D-葡萄糖 l_3g/ L，正丁酸鈉 l-2mmol/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的無血清培養(yǎng)基，其特征在于所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基包括份數(shù)比1-3 7-9的DMEM培養(yǎng)基和CHO-S-SFM II培養(yǎng)基。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的無血清培養(yǎng)基，其特征在于所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基由份數(shù)比 1-3 7-9的DMEM培養(yǎng)基和CHO-S-SFM II培養(yǎng)基組成。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的無血清培養(yǎng)基在CHO細(xì)胞高效表達(dá)促紅素中的應(yīng)用。
7.—種CHO細(xì)胞中高效表達(dá)促紅素的培養(yǎng)方法，其特征在于所述培養(yǎng)方法包括對活化后的種子細(xì)胞先采用含血清培養(yǎng)基進(jìn)行含血清培養(yǎng)，然后采用權(quán)利要求1-5任一項所述的無血清培養(yǎng)基進(jìn)行無血清培養(yǎng)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述含血清培養(yǎng)和無血清培養(yǎng)的條件為，溶解氧濃度30% -80%，pH值7. 0-7. 4，溫度-38 °C。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述含血清培養(yǎng)基為含有質(zhì)量份數(shù)5% -10%牛血清的DMEM培養(yǎng)基。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的培養(yǎng)方法，其特征在于所述DMEM培養(yǎng)基還含有 0. 5-1 μ mol/L 的 MTX。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于CHO細(xì)胞表達(dá)促紅素的無血清培養(yǎng)基以及CHO細(xì)胞中高效表達(dá)促紅素的培養(yǎng)方法。所述無血清培養(yǎng)基中含有添加劑D-葡萄糖和正丁酸鈉，還含有添加劑D-半乳糖、D-甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖中的一種或多種。所述培養(yǎng)方法包括對活化后的種子細(xì)胞先采用含血清培養(yǎng)基進(jìn)行含血清培養(yǎng)，然后采用所述的無血清培養(yǎng)基進(jìn)行無血清培養(yǎng)。采用本發(fā)明的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法，能夠獲得高效、穩(wěn)定表達(dá)的重組人促紅細(xì)胞生成素蛋白，并且提高了促紅細(xì)胞生成素的糖基化程度，即提高了EPO唾液酸的比重。采用本發(fā)明提供的培養(yǎng)方法每升培養(yǎng)液可獲得高達(dá)1.0×107IU的重組人促紅細(xì)胞生成素，表達(dá)穩(wěn)定、培養(yǎng)方法簡潔、適合大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號C12R1/91GK102268402SQ201110192509
公開日2011年12月7日 申請日期2011年7月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月11日
發(fā)明者劉樂連, 吳園園, 吳建祥, 張滌平, 張自強, 曲和之, 盛光陽, 黃俊龍 申請人:深圳賽保爾生物藥業(yè)有限公司