專利名稱：載轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的肌腱內(nèi)固定用復(fù)合材料及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種外科用品的材料，尤其涉及一種修復(fù)肌腱損傷用的復(fù)合材料。
技術(shù)背景在骨科領(lǐng)域，肌腱的損傷是臨床常見的疾病，如外傷性肌腱損傷、自發(fā)性肌腱損傷、腫 瘤或結(jié)核等病變。肌腱損傷后若不給予及時修復(fù)，會造成肢體功能的障礙，因而肌腱損傷后 及時的手術(shù)修復(fù)和功能重建則成為骨外科關(guān)注的焦點(diǎn)。肌腱損傷理想的修復(fù)原則為盡可能的恢復(fù)肌腱膠原纖維的連續(xù)性和生物力學(xué)強(qiáng)度，同時 恢復(fù)其表面光滑，不與周圍組織粘連?，F(xiàn)代外科技術(shù)的發(fā)展使得肌腱損傷修復(fù)取得了很大進(jìn) 展，但在肌腱損傷實(shí)際愈合過程中，修復(fù)后的結(jié)構(gòu)仍無法達(dá)到理想水平，而且粘連不可避免 地發(fā)生，嚴(yán)重影響了患者肌腱生理功能的恢復(fù)。如何改變傳統(tǒng)的肌腱修復(fù)方法、促進(jìn)損傷肌 腱愈合、盡早地進(jìn)行功能鍛煉以及如何有效地防止肌腱粘連，仍是一個世界性的難題。對于如何防止肌腱粘連，國內(nèi)外學(xué)者曾應(yīng)用生物、非生物及藥物等方法，諸如應(yīng)用生物 膜、硬脊膜、筋膜、血管、硅膜、含細(xì)胞因子的生物膜、透明質(zhì)酸鈉、纖維素封閉膠、自體 腱鞘、金箔等物質(zhì)，并進(jìn)行了大量的研究，但迄今尚未取得突破性的進(jìn)展，臨床仍需二次手 術(shù)進(jìn)行肌腱松解。目前還沒有任何資料表明存在一種既能穩(wěn)定肌腱內(nèi)環(huán)境、促進(jìn)損傷肌腱愈合，又能早期 進(jìn)行功能鍛煉并可有效地防止肌腱粘連的修復(fù)方法或材料。隨著醫(yī)用材料學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、 分子生物學(xué)及組織工程學(xué)的發(fā)展，從分子和基因水平對肌腱愈合過程的理解不斷深入。利用 細(xì)胞因子對肌建愈合進(jìn)行調(diào)控，基因治療的介入，組織工程技術(shù)和不可降解材料的應(yīng)用，這 些都為解決肌腱粘連這一難題帶來了希望。通過采用理想的修復(fù)材料，并聯(lián)合應(yīng)用組織工程 技術(shù)與轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將有可能為修復(fù)肌腱損傷提供一種理想的途徑。因此，現(xiàn)階段如何綜合 利用現(xiàn)有技術(shù)手段探尋一種理想的修復(fù)肌腱損傷的材料及方法，對于肌腱損傷的修復(fù)及肌腱 功能的恢復(fù)將具有重要意義。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種生物相容性好、抗拉強(qiáng)度較 強(qiáng)、可塑性好、能穩(wěn)定肌腱內(nèi)環(huán)境和促進(jìn)肌腱損傷愈合、且能有效防止肌腱粘連的載轉(zhuǎn)基因 細(xì)胞的肌腱內(nèi)固定用復(fù)合材料，還提供一種操作簡單、方便、成本較低的載轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的肌腱內(nèi)固定用復(fù)合材料的制備方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提出的技術(shù)方案為一種載轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的肌腱內(nèi)固定用復(fù)合 材料，其特征在于所述復(fù)合材料由外層不可降解的肌腱表面內(nèi)固定聚酯材料層和內(nèi)層藥理 學(xué)上可接受的富含微孔的生物可降解基質(zhì)薄膜材料層復(fù)合而成(本發(fā)明中內(nèi)、外層的區(qū)分是 根據(jù)復(fù)合材料使用過程中距離損傷肌腱的遠(yuǎn)近確定，相應(yīng)的直接接觸損傷肌腱的材料層即可 理解為最內(nèi)層)，所述生物可降解基質(zhì)薄膜材料層是以生物可降解基質(zhì)薄膜為基體材料，所 述基體材料由可增加其親水性和細(xì)胞親和性物質(zhì)進(jìn)行過表面改性處理，經(jīng)表面改性處理后的所述基體材料上接種有轉(zhuǎn)染了促肌腱愈合相關(guān)細(xì)胞因子基因的肌腱細(xì)胞。本發(fā)明的載轉(zhuǎn)基因 細(xì)胞的肌腱內(nèi)固定用復(fù)合材料的外層(即所述的肌腱表面內(nèi)固定聚酯材料層)的厚度一般控 制在微米級到毫米級即可，沒有嚴(yán)格的要求；內(nèi)層(即所述的生物可降解基質(zhì)薄膜材料層) 的厚度一般控制在微米級。上述技術(shù)方案中，所述的肌腱表面內(nèi)固定聚酯材料層是通過研究肌腱生物力學(xué)特性(如 斷裂抗張強(qiáng)度800 2500N)和超微結(jié)構(gòu)(如腱表面納米級的小孔狀結(jié)構(gòu))獲得相關(guān)數(shù)據(jù)后制 備出來，因此制備得到的肌腱表面內(nèi)固定聚酯材料層能在最大程度上符合肌腱力學(xué)特性和生 物學(xué)特性。所述的肌腱表面內(nèi)固定聚酯材料層優(yōu)選是由外層的富含微孔的聚酯材料薄膜和內(nèi) 層的聚酯材料網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)復(fù)合而成。所述聚酯材料薄膜上的孔密度優(yōu)選為1000 5000個/mm2， 單孔的孔徑大小一般為納米級；該聚酯材料薄膜的厚度一般為微米級，而聚酯材料網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) 的厚度可以為毫米級。所述肌腱表面內(nèi)固定聚酯材料層選用的聚酯材料優(yōu)選為聚對苯二甲酸 乙二酯(可外購)。本發(fā)明外層的肌腱表面內(nèi)固定聚酯材料層質(zhì)地柔順、外表面光滑、含大 量微孔(其功能在于允許營養(yǎng)物質(zhì)及代謝產(chǎn)物的交換，但不允許組織的長入)，具有一定的 可塑性、較強(qiáng)的抗拉能力(抗拉強(qiáng)度能達(dá)到800 2500N)及良好的生物相容性，可滿足肌腱 的生物力學(xué)要求，便于縫合固定。上述技術(shù)方案中，所述生物可降解基質(zhì)薄膜材料層的基體材料優(yōu)選為聚羥基乙酸( poliglacolic acid， polyglycolide， PGA)、 聚孚L酸(polylatic acid， polylactide， PLA)或者聚乙交酯-丙交酯(Poly-lactic-glycolicacid， PLGA)制成的富含微孔的生物可 降解基質(zhì)薄膜(例如PGA篩網(wǎng))，該生物可降解基質(zhì)薄膜的孔密度優(yōu)選為1000 5000個/mm2 ，單孔的孔徑大小一般為微米級。所述的生物可降解基質(zhì)薄膜材料層植入體內(nèi)后會在較長時 間內(nèi)降解(與損傷肌腱的修復(fù)過程相匹配)，并被生物體吸收排除體外。上述技術(shù)方案中，所述可增加生物可降解基質(zhì)薄膜親水性和細(xì)胞親和性的物質(zhì)優(yōu)選為多 肽、膠原、卵磷脂中的一種或多種。經(jīng)表面改性處理后，所述生物可降解基質(zhì)薄膜的親水性和細(xì)胞親和性較改性前明顯增強(qiáng)，這將有利于后續(xù)轉(zhuǎn)基因肌腱細(xì)胞的植入。上述技術(shù)方案中，所述的促肌腱愈合相關(guān)細(xì)胞因子為胰島素樣生長因子-I (IGF-I)、 表皮生長因子(EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、血小板源性生長因子(PDGF)或轉(zhuǎn)化生長因子-e (TGE-e)。上述技術(shù)方案中，所述的轉(zhuǎn)染了促肌腱愈合相關(guān)細(xì)胞因子基因的肌腱細(xì)胞可以為轉(zhuǎn)染了 促肌腱愈合相關(guān)細(xì)胞因子基因的兔屈趾肌腱細(xì)胞。所述的轉(zhuǎn)染了促肌腱愈合相關(guān)細(xì)胞因子基 因的肌腱細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)在所述生物可降解基質(zhì)薄膜材料層的降解過程中會持續(xù)存在。本發(fā)明還提供一種載轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的肌腱內(nèi)固定用復(fù)合材料的制備方法，其步驟為先利 用不可降解的聚酯材料制備不可降解的肌腱表面內(nèi)固定聚酯材料復(fù)合物，制備該肌腱表面內(nèi) 固定聚酯材料復(fù)合物時，先制備一富含微孔的聚酯材料薄膜，再制備一聚酯材料網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)， 然后將所述聚酯材料薄膜和聚酯材料網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)復(fù)合疊加得到所述的肌腱表面內(nèi)固定聚酯材料 復(fù)合物；然后選用藥理學(xué)上可接受的生物可降解基質(zhì)薄膜材料物質(zhì)制成富含微孔的生物可降 解基質(zhì)薄膜，用可增加其親水性和細(xì)胞親和性的物質(zhì)對該生物可降解基質(zhì)薄膜進(jìn)行表面改性 處理，再將轉(zhuǎn)染了促肌腱愈合相關(guān)細(xì)胞因子基因的肌腱細(xì)胞接種于經(jīng)過表面改性后的生物可 降解基質(zhì)薄膜上，得到生物可降解基質(zhì)薄膜材料復(fù)合物；最后將所述生物可降解基質(zhì)薄膜材 料復(fù)合物復(fù)合在所述肌腱表面內(nèi)固定聚酯材料復(fù)合物中的聚酯材料網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)表面，得到本發(fā) 明的載轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的肌腱內(nèi)固定用復(fù)合材料。上述載轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的肌腱內(nèi)固定用復(fù)合材料更具體的制備方法如下(1) 不可降解的肌腱表面內(nèi)固定聚酯材料復(fù)合物的制備首先利用不可降解的聚酯材料(優(yōu)選用聚對苯二甲酸乙二酯)吹膜制成富含微孔的聚酯材料薄膜(微孔的大小與腱表面滑膜小孔的大小一致， 一般為納米級，孔密度建議控制在1000 5000個/mm2)，然后利用所 述的聚酯材料噴制一層力學(xué)強(qiáng)度符合肌腱生物力學(xué)特性(例如抗拉強(qiáng)度滿足800 2500N)的 聚酯材料網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(可以用噴絲機(jī)噴制，通過改變網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的構(gòu)型或噴絲的粗細(xì)或二者同時 進(jìn)行調(diào)整來滿足不同的抗拉強(qiáng)度要求)，再通過常規(guī)的熱壓方法將所述富含微孔的聚酯材料 薄膜復(fù)合在聚酯材料網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上，得到不可降解的肌腱表面內(nèi)固定聚酯材料復(fù)合物；制備該 復(fù)合物時，厚度一般控制在微米級到毫米級即可；(2) 表面改性后的生物可降解基質(zhì)薄膜的制備首先利用溶液澆鑄-粒子瀝濾法將藥理 學(xué)上可接受的生物可降解基質(zhì)薄膜材料物質(zhì)(優(yōu)選聚羥基乙酸、聚乳酸或者聚乙交酯-丙交 酯)制成富含微孔的生物可降解基質(zhì)薄膜，再將該生物可降解基質(zhì)薄膜置于浸漬液中進(jìn)行表 面改性處理，處理完成后取出得到表面改性后的生物可降解基質(zhì)薄膜，無菌條件下凍干備用;所述浸漬液為多肽、膠原、卵磷脂中的一種或多種溶于PBS緩沖液后配制得到，制備該生 物可降解基質(zhì)薄膜時，其厚度一般控制在微米級即可；(3) 轉(zhuǎn)基因肌腱細(xì)胞的制備及接種①肌腱細(xì)胞的分離取動物或自體的肌腱組織， 無菌條件下去除該肌腱組織的外膜，洗滌，以Handerson分步酶消化法分離出肌腱細(xì)胞后接 種于培養(yǎng)瓶中；②肌腱細(xì)胞的培養(yǎng)先進(jìn)行原代培養(yǎng)，培養(yǎng)液為F12培養(yǎng)基加10。/。小牛血清， 再加入青霉素、鏈霉素，并在37'C溫度下培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁且長成單層后，用胰蛋白酶消化 使肌腱細(xì)胞懸浮分布均勻，再進(jìn)行傳代培養(yǎng)；③真核表達(dá)載體的構(gòu)建及基因轉(zhuǎn)染構(gòu)建或選 用一載促肌腱愈合相關(guān)細(xì)胞因子的真核表達(dá)載體(例如pcDNA3. 1(+)- IGF-I)，然后取傳代 培養(yǎng)后獲得的第二代肌腱細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞長滿瓶底約70%時，用轉(zhuǎn)染試劑盒轉(zhuǎn) 染所述的第二代肌腱細(xì)胞；④肌腱細(xì)胞接種將轉(zhuǎn)染了促肌腱愈合相關(guān)細(xì)胞因子基因的肌腱 細(xì)胞接種于所述表面改性后的生物可降解基質(zhì)薄膜上，并在適宜的條件下進(jìn)行培養(yǎng)后得到載 轉(zhuǎn)基因肌腱細(xì)胞和經(jīng)過表面改性的生物可降解基質(zhì)薄膜材料復(fù)合物；所述促肌腱愈合相關(guān)細(xì) 胞因子優(yōu)選為胰島素樣生長因子-I、表皮生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、血小板源性生長因子或轉(zhuǎn)化生長因子-e;(4) 構(gòu)建載轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的肌腱內(nèi)固定用復(fù)合材料使用纖維蛋白膠將所述生物可降解 基質(zhì)薄膜材料復(fù)合物復(fù)合在所述肌腱表面內(nèi)固定聚酯材料復(fù)合物中的聚酯材料網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)表面 上，得到本發(fā)明的載轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的肌腱內(nèi)固定用復(fù)合材料。將得到的載轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的肌腱內(nèi) 固定用復(fù)合材料放置在二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)放置，定時更換培養(yǎng)液，以保證細(xì)胞營養(yǎng)。上述的載轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的肌腱內(nèi)固定用復(fù)合材料可用于修復(fù)損傷的肌腱，具體的修復(fù)方法 為首先，通過環(huán)裹包繞法用本發(fā)明的載轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的肌腱內(nèi)固定用復(fù)合材料將肌腱斷端縫 接處覆蓋(覆蓋范圍以肌腱斷端為中心，包括肌腱斷端及斷端兩側(cè)的正常肌腱)，并用滌綸 縫線固定，術(shù)中也可根據(jù)肌腱的具體情況將載轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的肌腱內(nèi)固定用復(fù)合材料修剪成帶 狀或條索狀并用滌綸縫線固定至肌腱斷端縫接處。固定材料除可以使用不可降解的滌綸縫線 ，還可使用鎖扣夾。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于 一方面，本發(fā)明的肌腱內(nèi)固定用復(fù)合材料上含大 量微孔，允許營養(yǎng)物質(zhì)及代謝產(chǎn)物的交換，但不允許組織的長入，因而可以穩(wěn)定肌腱的內(nèi)環(huán) 境；另一方面，本發(fā)明的肌腱內(nèi)固定用復(fù)合材料上含有大量轉(zhuǎn)基因肌腱細(xì)胞，這種轉(zhuǎn)基因肌 腱細(xì)胞可以持續(xù)、高效的分泌促肌腱愈合的細(xì)胞因子，可以促進(jìn)損傷肌腱愈合。本發(fā)明的肌 腱內(nèi)固定用復(fù)合材料不僅具有良好的生物相容性、較強(qiáng)的抗拉強(qiáng)度和一定的可塑性，而且使 用其修復(fù)損傷的肌腱后既能穩(wěn)定肌腱的內(nèi)環(huán)境、促進(jìn)損傷肌腱愈合，又能在縫合處理后的肌腱斷端無張力的情況下，允許損傷肌腱早期持續(xù)地進(jìn)行功能鍛煉，有效的防止肌腱粘連；在 肌腱斷端縫接處再行內(nèi)固定，可以增加肌腱斷端的抗拉能力，這樣早期進(jìn)行功能鍛煉不會使 肌腱斷裂，而且肌腱早期活動可以減輕甚至防止粘連。此外，本發(fā)明的肌腱內(nèi)固定用復(fù)合材 料的制備方法也相對簡單，操作方便，成本較低，能夠廣泛應(yīng)用于臨床肌腱損傷的修復(fù)。而 使用本發(fā)明肌腱內(nèi)固定用復(fù)合材料的修復(fù)方法也非常容易操作，便于在修復(fù)手術(shù)中進(jìn)行推廣 和應(yīng)用。


圖l為本發(fā)明實(shí)施例的載轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的肌腱內(nèi)固定用復(fù)合材料的層狀結(jié)構(gòu)示意圖。 圖例說明
1、 肌腱表面內(nèi)固定聚酯材料層
11、 聚對苯二甲酸乙二酯薄膜
12、 聚對苯二甲酸乙二酯網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)
2、 生物可降解基質(zhì)薄膜材料層
21、 生物可降解基質(zhì)薄膜
22、 轉(zhuǎn)染了IGF-I基因的肌腱細(xì)胞
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例
如圖1所示， 一種呈帶狀的載轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的肌腱內(nèi)固定用復(fù)合材料，該復(fù)合材料是由外 層的不可降解的肌腱表面內(nèi)固定聚酯材料層l和內(nèi)層的藥理學(xué)上可接受的富含微孔的生物可 降解基質(zhì)薄膜材料層2復(fù)合而成。不可降解的肌腱表面內(nèi)固定聚酯材料層l又是由內(nèi)、外兩層 結(jié)構(gòu)復(fù)合而成，其外層是用聚對苯二甲酸乙二酯制成的富含微孔的聚對苯二甲酸乙二酯薄膜 11 (該薄膜上均布有納米級小孔，孔密度4500個/mm2，孔徑約為O. 6nm，厚度為20ym)，其 內(nèi)層是用聚對苯二甲酸乙二酯制成的聚對苯二甲酸乙二酯網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)12 (厚度為l.lmm)。生 物可降解基質(zhì)薄膜材料層2的基體材料為生物可降解基質(zhì)薄膜21 (本實(shí)施例選用的是PGA篩網(wǎng) ，篩網(wǎng)上均布有微米級小孔)，該P(yáng)GA篩網(wǎng)由膠原(Boehringer Mannheim公司生產(chǎn)的I型膠 原)進(jìn)行過表面改性處理，經(jīng)表面改性處理后的PGA篩網(wǎng)的內(nèi)表面上接種有轉(zhuǎn)染了IGF-I基因 的肌腱細(xì)胞22。
本實(shí)施例的載轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的肌腱內(nèi)固定用復(fù)合材料的構(gòu)建步驟如下
(1 )不可降解的肌腱表面內(nèi)固定聚酯材料復(fù)合物的制備 首先利用原料聚對苯二甲酸乙二酯吹膜制成富含微孔的聚對苯二甲酸乙二酯薄膜ll (該薄膜上均布有納米級小孔，孔密度4500個/mi/，孔徑約為0.6nm，厚度為20ym)，然后利用 噴絲機(jī)噴制一層力學(xué)強(qiáng)度符合肌腱生物力學(xué)特性的聚對苯二甲酸乙二酯網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)12 (抗拉強(qiáng) 度為900N，厚度為l.lmm)，再通過常規(guī)的熱壓方法將聚對苯二甲酸乙二酯薄膜ll復(fù)合在聚 對苯二甲酸乙二酯網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)12上，得到不可降解的肌腱表面內(nèi)固定聚酯材料復(fù)合物；(2) 表面改性后的生物可降解基質(zhì)薄膜的制備 本實(shí)施例的生物可降解基質(zhì)薄膜材料層2的基體材料直接選用美國Tyco Healthcare公司生產(chǎn)的PGA篩網(wǎng)(美國Tyco Healthcare公司生產(chǎn)，DEXONMESH , #8，其上均布有微米級小 孔)，用以增加基體材料親水性和細(xì)胞親和性的物質(zhì)選用Boehringer Mannheim公司生產(chǎn)的 I型膠原，用PBS緩沖液配制得到濃度為P/。的I型膠原溶液，然后將該P(yáng)GA篩網(wǎng)置于I型膠原溶 液中進(jìn)行表面改性處理，浸漬時間為30min，取出得到表面改性后的生物可降解基質(zhì)薄膜， 無菌條件下凍干備用；(3) 轉(zhuǎn)基因肌腱細(xì)胞的制備及接種① 肌腱細(xì)胞的分離取出兔的屈趾肌腱，無菌條件下用剪刀去除該肌腱的外膜組織， Hank's液(晶美生物技術(shù)公司，上海)洗滌3次，再以Handerson分步酶消化法分離出肌腱 細(xì)胞并接種于培養(yǎng)瓶中；Handerson分步酶消化法分離肌腱細(xì)胞的具體步驟包括1)將整段肌腱加O. 25%胰蛋白 酶，37。C溫度下恒溫孵育30min后，棄上清液；2)將余下腱段剪碎成2mi/大小的碎塊，再加 入O. 1%的膠原酶，37。C溫度下恒溫孵育90min; 3)再加入含小牛血清的F12培養(yǎng)基(Sigma 公司，美國)終止消化，1200r/min的轉(zhuǎn)速下離心5min; 4)棄上清液，加入F12培養(yǎng)基充分 混勻，接種于培養(yǎng)瓶中；② 肌腱細(xì)胞的培養(yǎng)先進(jìn)行原代培養(yǎng)，培養(yǎng)液為F12培養(yǎng)基加10。/。小牛血清(晶美生物技 術(shù)公司，上海)，再加入青霉素(100u/ml)和鏈霉素(100ug/ml);在37。C、 5%C02、飽和 適度的條件下培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁且長成單層后，用0.25%胰蛋白酶(Sigma公司，美國)消 化，使細(xì)胞懸浮分布均勻，再進(jìn)行傳代培養(yǎng)；③ 真核表達(dá)載體pcDNA3. 1 (+)-IGF-I的構(gòu)建及基因轉(zhuǎn)染選用已構(gòu)建好的真核表達(dá)載體 pcDNA3. 1(+)- IGF-I (該真核表達(dá)載體可外購)，然后取上述傳代培養(yǎng)后得到的第二代肌腱 細(xì)胞接種于25ml的培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞長滿瓶底約70%時，用Lipopolyamine轉(zhuǎn)染試劑盒(購自 Promega公司)并根據(jù)其操作說明轉(zhuǎn)染所述的第二代肌腱細(xì)胞；④ 肌腱細(xì)胞接種取轉(zhuǎn)染了IGF-I基因的肌腱細(xì)胞，消化離心，用不含小牛血清的F-12 培養(yǎng)基制成4. OX 1(^/ml的細(xì)胞懸液，將該細(xì)胞懸液接種到已制備的表面改性后的生物可降解基質(zhì)薄膜的內(nèi)表面，得到載轉(zhuǎn)基因肌腱細(xì)胞和經(jīng)過表面改性的生物可降解基質(zhì)薄膜材料復(fù) 合物；再將該生物可降解基質(zhì)薄膜材料復(fù)合物放置在二氧化碳培養(yǎng)箱(Forma公司，美國) 內(nèi)培養(yǎng)4 h，然后加入含10%小牛血清的完全培養(yǎng)液適量，繼續(xù)置于二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)， 以后定時更換培養(yǎng)液，以保證肌腱細(xì)胞營養(yǎng)；
(4)構(gòu)建載轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的肌腱內(nèi)固定用復(fù)合材料
使用纖維蛋白膠將上述制得的載轉(zhuǎn)基因肌腱細(xì)胞和經(jīng)過表面改性的生物可降解基質(zhì)薄膜 材料復(fù)合物復(fù)合在已制備的肌腱表面內(nèi)固定聚酯材料復(fù)合物的內(nèi)表面上(即聚對苯二甲酸乙 二酯網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上)，得到載轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的肌腱內(nèi)固定用復(fù)合材料。將構(gòu)建得到的載轉(zhuǎn)基因細(xì) 胞的肌腱內(nèi)固定用復(fù)合材料放置在二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)，定時更換培養(yǎng)液，以保證細(xì)胞營養(yǎng)。
將本實(shí)施例制備得到的載轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的肌腱內(nèi)固定用復(fù)合材料修復(fù)損傷肌腱，具體的修 復(fù)方法為用環(huán)裹包繞法將肌腱斷端縫接處覆蓋，并用滌綸縫線固定。
本實(shí)施例制備得到的載轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的肌腱內(nèi)固定用復(fù)合材料，其外層不可降解的肌腱表 面內(nèi)固定聚酯材料層l的質(zhì)地較柔順，外表面較光滑且含大量微孔，具有一定的可塑性、較 強(qiáng)的抗拉能力和良好的生物相容性，便于縫合固定，可滿足肌腱的生物力學(xué)要求；其內(nèi)層藥 理學(xué)上可接受的富含微孔的生物可降解基質(zhì)薄膜材料層2植入體內(nèi)后，在八周左右的時間內(nèi) 降解(與損傷肌腱的修復(fù)過程相匹配)，并被機(jī)體吸收排除體外。
載轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的肌腱內(nèi)固定用復(fù)合材料修復(fù)損傷的肌腱后，能夠很好地穩(wěn)定肌腱的內(nèi)環(huán) 境，促進(jìn)損傷肌腱愈合，而且能早期進(jìn)行功能鍛煉并可有效的防止肌腱粘連。
權(quán)利要求
1.一種載轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的肌腱內(nèi)固定用復(fù)合材料，其特征在于所述復(fù)合材料由外層不可降解的肌腱表面內(nèi)固定聚酯材料層和內(nèi)層藥理學(xué)上可接受的富含微孔的生物可降解基質(zhì)薄膜材料層復(fù)合而成，所述生物可降解基質(zhì)薄膜材料層是以生物可降解基質(zhì)薄膜作為基體材料，所述基體材料由可增加其親水性和細(xì)胞親和性的物質(zhì)進(jìn)行過表面改性處理，經(jīng)表面改性處理后的所述基體材料上接種有轉(zhuǎn)染了促肌腱愈合相關(guān)細(xì)胞因子基因的肌腱細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的肌腱內(nèi)固定用復(fù)合材料，其特征在于所述 肌腱表面內(nèi)固定聚酯材料層是由外層的富含微孔的聚酯材料薄膜和內(nèi)層的聚酯材料網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) 復(fù)合而成；所述聚酯材料薄膜上的微孔的密度為1000 5000個/1^2，微孔的孔徑大小為納米級。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的肌腱內(nèi)固定用復(fù)合材料，其特征在于 所述肌腱表面內(nèi)固定聚酯材料層所選用的聚酯材料為聚對苯二甲酸乙二酯。
4.根據(jù)權(quán)利要求l所述的肌腱內(nèi)固定用復(fù)合材料，其特征在于所述生物可降解基質(zhì)薄膜材料層的基體材料為聚羥基乙酸、聚乳酸或者聚乙交酯-丙交酯制成的富含微孔的薄膜，該富含微孔的薄膜的孔密度為1000 5000個/^2，單孔的孔徑大小為微米級。
5.根據(jù)權(quán)利要求l所述的肌腱內(nèi)固定用復(fù)合材料，其特征在于所述可增加生物可降解基質(zhì)薄膜親水性和細(xì)胞親和性的物質(zhì)為多肽、膠原、卵磷脂中的一種或多 種。
6.根據(jù)權(quán)利要求l所述的肌腱內(nèi)固定用復(fù)合材料，其特征在于所述的促肌腱愈合相關(guān)細(xì)胞因子為胰島素樣生長因子-I、表皮生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因 子、血小板源性生長因子或轉(zhuǎn)化生長因子-e 。
7.一種載轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的肌腱內(nèi)固定用復(fù)合材料的制備方法，其步驟 為先利用不可降解的聚酯材料制備不可降解的肌腱表面內(nèi)固定聚酯材料復(fù)合物，制備該肌腱表面內(nèi)固定聚酯材料復(fù)合物時，先制備一富含微孔的聚酯材料薄膜，再制備一聚酯材料網(wǎng) 狀結(jié)構(gòu)，然后將所述聚酯材料薄膜和聚酯材料網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)復(fù)合疊加得到所述的肌腱表面內(nèi)固定 聚酯材料復(fù)合物；然后選用藥理學(xué)上可接受的生物可降解基質(zhì)薄膜材料物質(zhì)制成富含微孔的 生物可降解基質(zhì)薄膜，用可增加其親水性和細(xì)胞親和性的物質(zhì)對該生物可降解基質(zhì)薄膜進(jìn)行 表面改性處理，再將轉(zhuǎn)染了促肌腱愈合相關(guān)細(xì)胞因子基因的肌腱細(xì)胞接種于經(jīng)過表面改性后 的生物可降解基質(zhì)薄膜上，得到生物可降解基質(zhì)薄膜材料復(fù)合物；最后將所述生物可降解基 質(zhì)薄膜材料復(fù)合物復(fù)合在所述肌腱表面內(nèi)固定聚酯材料復(fù)合物中的聚酯材料網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)表面， 得到本發(fā)明的載轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的肌腱內(nèi)固定用復(fù)合材料。
8 根據(jù)權(quán)利要求7所述的載轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的肌腱內(nèi)固定用復(fù)合材料的制 備方法，其特征在于具體包括以下步驟(1) 不可降解的肌腱表面內(nèi)固定聚酯材料復(fù)合物的制備首先利用不可降解的聚酯材 料吹膜制成富含微孔的聚酯材料薄膜，然后利用所述的聚酯材料噴絲制得一層力學(xué)強(qiáng)度符合 肌腱生物力學(xué)特性的聚酯材料網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，再通過熱壓把所述富含微孔的聚酯材料薄膜復(fù)合在 聚酯材料網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)上，得到不可降解的肌腱表面內(nèi)固定聚酯材料復(fù)合物；(2) 表面改性后的生物可降解基質(zhì)薄膜的制備首先利用溶液澆鑄-粒子瀝濾法將藥 理學(xué)上可接受的生物可降解基質(zhì)薄膜材料物質(zhì)制成富含微孔的生物可降解基質(zhì)薄膜，再將該 生物可降解基質(zhì)薄膜置于浸漬液中進(jìn)行表面改性處理，處理完成后取出得到表面改性后的生 物可降解基質(zhì)薄膜，無菌條件下凍干備用；所述浸漬液為多肽、膠原、卵磷脂中的一種或多 種溶于PBS緩沖液后配制得到；(3) 轉(zhuǎn)基因肌腱細(xì)胞的制備及接種取動物或自體的肌腱組織，去外膜，洗滌，然后 以Handerson分步酶消化法分離出肌腱細(xì)胞后接種于培養(yǎng)瓶中進(jìn)行原代培養(yǎng)，培養(yǎng)液為F12培 養(yǎng)基加小牛血清，再加入青霉素、鏈霉素在37'C溫度下培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁且長成單層后，用 胰蛋白酶消化使肌腱細(xì)胞懸浮分布均勻，再進(jìn)行傳代培養(yǎng)；構(gòu)建或選用一載促肌腱愈合相關(guān) 細(xì)胞因子的真核表達(dá)載體，然后取傳代培養(yǎng)后獲得的第二代肌腱細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)， 再利用轉(zhuǎn)染試劑盒轉(zhuǎn)染所述的第二代肌腱細(xì)胞；最后將轉(zhuǎn)染了促肌腱愈合相關(guān)細(xì)胞因子基因 的肌腱細(xì)胞接種于所述表面改性后的生物可降解基質(zhì)薄膜上，進(jìn)行培養(yǎng)后得到載轉(zhuǎn)基因肌腱 細(xì)胞和經(jīng)過表面改性的生物可降解基質(zhì)薄膜材料復(fù)合物；(4) 構(gòu)建載轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的肌腱內(nèi)固定用復(fù)合材料使用纖維蛋白膠將所述生物可降解 基質(zhì)薄膜材料復(fù)合物復(fù)合在所述肌腱表面內(nèi)固定聚酯材料復(fù)合物中的聚酯材料網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)表面 上，得到載轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的肌腱內(nèi)固定用復(fù)合材料。
9 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的載轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的肌腱內(nèi)固定用復(fù)合材料 的制備方法，其特征在于所述聚酯材料為聚對苯二甲酸乙二酯，所述聚酯材料薄膜上微孔 的孔徑為納米級，微孔密度為1000 5000個/1^2。
10 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的載轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的肌腱內(nèi)固定用復(fù)合材料 的制備方法，其特征在于所述藥理學(xué)上可接受的生物可降解基質(zhì)薄膜材料物質(zhì)為聚羥基乙 酸、聚乳酸或者聚乙交酯-丙交酯；所述促肌腱愈合相關(guān)細(xì)胞因子為胰島素樣生長因子-I、表皮生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、血小板源性生長因子或轉(zhuǎn)化生長因子-e 。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種載轉(zhuǎn)基因細(xì)胞的肌腱內(nèi)固定用復(fù)合材料，該復(fù)合材料由外層不可降解的肌腱表面內(nèi)固定聚酯材料層和內(nèi)層藥理學(xué)上可接受的富含微孔的生物可降解基質(zhì)薄膜材料層復(fù)合而成，其中內(nèi)層是以生物可降解基質(zhì)薄膜為基體材料，該基體材料由可增加其親水性和細(xì)胞親和性的物質(zhì)進(jìn)行表面改性處理后，其上還接種有轉(zhuǎn)染了促肌腱愈合相關(guān)細(xì)胞因子基因的肌腱細(xì)胞。該復(fù)合材料的制備包括先制備不可降解的肌腱表面內(nèi)固定聚酯材料復(fù)合物和表面改性后的生物可降解基質(zhì)薄膜，再制備轉(zhuǎn)基因肌腱細(xì)胞并將其接種到生物可降解基質(zhì)薄膜上，最后經(jīng)復(fù)合得到本發(fā)明的復(fù)合材料。本發(fā)明制備的復(fù)合材料生物相容性好，抗拉強(qiáng)度較強(qiáng)，能穩(wěn)定肌腱內(nèi)環(huán)境和促進(jìn)肌腱損傷愈合。
文檔編號A61L27/56GK101574542SQ20091030351
公開日2009年11月11日 申請日期2009年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月22日
發(fā)明者張朝躍 申請人:張朝躍