專利名稱：轉(zhuǎn)基因細(xì)胞活化改性殼聚糖醫(yī)用敷料及制備方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程、生物組織工程領(lǐng)域，特別是涉及一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞活化改性殼聚 糖醫(yī)用敷料及制備方法及用途。
技術(shù)背景糖尿病現(xiàn)己成為全世界的常見病和多發(fā)病，在發(fā)達(dá)國(guó)家被列為繼心血管疾病及腫瘤之 后的第三大疾病。根據(jù)2006年國(guó)際糖尿病聯(lián)盟統(tǒng)計(jì)數(shù)字顯示，目前全球一億五千萬(wàn)人患有 2型糖尿病，但是其發(fā)病率在各地不一。我茵大約有近3000萬(wàn)糖尿病患者。按目前增長(zhǎng)中 的發(fā)病率來(lái)說(shuō)，糖尿病將于數(shù)十年內(nèi)成為全球最普遍的疾病之一。WHO預(yù)測(cè)到2025年全 球糖尿病患者將達(dá)3.3億，其中有75%糖尿病患者在印度、中國(guó)等發(fā)展中國(guó)家。我國(guó)糖尿 病患者的人數(shù)僅次于印度居世界第二位。糖尿病的危害不但在于其疾病本身，而且在于其 各種急慢性并發(fā)癥，并且糖尿病已成為危及人類生存質(zhì)量的罪魁禍?zhǔn)?。其中，糖尿病足部潰瘍是?dǎo)致糖尿病患者截肢的主要原因。隨著全球糖尿病患者人數(shù) 逐年增加以及人均壽命的延長(zhǎng)，因糖尿病足部難愈性潰瘍而需要截肢的患者不斷增加。在 美國(guó)現(xiàn)有1600萬(wàn)糖尿病患者中，15%的患者可能在其一生中的某個(gè)階段出現(xiàn)足部潰瘍。調(diào) 查表明，糖尿病患者每年足部潰瘍新發(fā)病率在2%-3%。每年大約25%糖尿病患者由于足部 感染而住院治療，且非創(chuàng)傷性下肢截肢患者中至少50%是由糖尿病足部感染造成。由于糖 尿病導(dǎo)致足部潰瘍發(fā)病率高，創(chuàng)面愈合慢，并發(fā)癥多，嚴(yán)重影響著患者的生活質(zhì)量。因此， 早期認(rèn)識(shí)和正確處理該病具有重要臨床意義。近年來(lái)，糖尿病導(dǎo)致的創(chuàng)面愈合障礙一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的重點(diǎn)。其發(fā)生機(jī)制涉及細(xì)胞代謝、免疫功能、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞供氧等多方面。創(chuàng)面愈合這一復(fù)雜過程涉及了以下四個(gè)環(huán)節(jié)穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖及 重新塑型，包括炎癥細(xì)胞、修復(fù)細(xì)胞、細(xì)胞因子及細(xì)胞外基質(zhì)的相互調(diào)節(jié)。在整個(gè)修復(fù)階 段，生長(zhǎng)因子的參與至關(guān)重要。生長(zhǎng)因子是一組具有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、合成作用的蛋 白質(zhì)或多肽的專有名詞。它具有促進(jìn)成纖維細(xì)胞大量增殖、膠原纖維明顯積累及增強(qiáng)創(chuàng)面 抗張力的作用，增加內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的趨化性，使其遷移向受損部位，促進(jìn)成纖維 細(xì)胞產(chǎn)生膠原蛋白；能夠刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞、角質(zhì)化細(xì)胞及成纖維細(xì)胞的增殖分化，加速 血管化和再上皮化；它是炎癥細(xì)胞的有絲分裂原和趨化因子，而后者的聚集、脫粒則是創(chuàng)面修復(fù)的重要始動(dòng)因素；此外，它還可調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)的合成，共同促進(jìn)潰瘍愈合。對(duì)于某些難愈性創(chuàng)面，有學(xué)者認(rèn)為是生長(zhǎng)因子分散在細(xì)胞外基質(zhì)中以及蛋白水解酶活 性增強(qiáng)造成生長(zhǎng)因子不足所致，所以在創(chuàng)面愈合過程中外源性補(bǔ)充某些生長(zhǎng)因子，或通過 增強(qiáng)內(nèi)源性生長(zhǎng)因子的活性，或上調(diào)生長(zhǎng)因子受體的表達(dá)，以達(dá)到主動(dòng)調(diào)控創(chuàng)面愈合的作
用。然而將生長(zhǎng)因子應(yīng)用于創(chuàng)面改變局部微環(huán)境可促進(jìn)創(chuàng)面愈合，但是也存在以下不足 生長(zhǎng)因子半衰期較短；創(chuàng)面局部的蛋白水解酶活性較強(qiáng)，可分解大量生長(zhǎng)因子；局部大劑 量使用生長(zhǎng)因子可能有副作用；生長(zhǎng)因子以乳膏或鹽溶液作為載體會(huì)限制其生物利用度。 為了克服這些不足，必然會(huì)大量重復(fù)使用生長(zhǎng)因子， 一方面造成醫(yī)療資源的浪費(fèi)，另一方 面容易產(chǎn)生耐藥性，從而導(dǎo)致生長(zhǎng)因子不能充分發(fā)揮作用。以血小板衍化生長(zhǎng)因子(PDGF)為代表的生長(zhǎng)因子在創(chuàng)傷修復(fù)的應(yīng)用給糖尿病創(chuàng)面愈 合帶來(lái)了突破性進(jìn)展。PDGF是1974年由Ross等首先發(fā)現(xiàn)的，最初是從血小板中得到的，故 稱為血小板衍化生長(zhǎng)因子。但后來(lái)發(fā)現(xiàn)血小板以外的許多細(xì)胞如內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血 管平滑肌細(xì)胞等都能合成分泌PDGF或PDGF樣生長(zhǎng)因子。PDGF作為一種多功能的細(xì)胞因 子，與傷口愈合關(guān)系密切。在創(chuàng)面組織中，PDGF的含量及其生物活性變化通常會(huì)影響修復(fù) 質(zhì)量和修復(fù)后的組織改建。PDGF是重要的促有絲分裂原，能夠直接作用于成纖維細(xì)胞與角 化細(xì)胞等組織修復(fù)細(xì)胞，縮短細(xì)胞周期，加速細(xì)胞增殖，促進(jìn)傷口愈合。PDGF加速細(xì)胞增 殖的機(jī)制可能與PDGF作為啟動(dòng)因子誘導(dǎo)處于接觸抑制狀態(tài)的細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期有關(guān)。一個(gè) 靜止細(xì)胞(GO期細(xì)胞)進(jìn)入細(xì)胞周期，必須經(jīng)過啟動(dòng)和推進(jìn)兩個(gè)階段。在啟動(dòng)因子如PDGF、 堿性成纖維細(xì)胞與角化細(xì)胞生長(zhǎng)因子等作用下，有關(guān)的啟動(dòng)基因進(jìn)行表達(dá)，為細(xì)胞進(jìn)入S 期積累物質(zhì)和能量，然后在推動(dòng)因子如表皮生長(zhǎng)因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子和胰島素樣生長(zhǎng)因子 一l等的作用下，細(xì)胞很快進(jìn)入S期，加速細(xì)胞增殖。PDGF與推動(dòng)因子的協(xié)同作用在體內(nèi)和 體外都已被證實(shí)。PDGF還可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞與角化細(xì)胞分泌胰島素樣生長(zhǎng)因子一1，間接 促進(jìn)細(xì)胞增殖。另外，PDGF能夠促進(jìn)纖維連接蛋白、聚葡萄糖胺和膠原等細(xì)胞外基質(zhì)的合成和分泌，影響創(chuàng)面修復(fù)后組織的改建。迄今為止，PDGF是唯一的于三期臨床上證明有效且被美國(guó)食品及藥品管理局(FDA) 批準(zhǔn)并已成功上市的生長(zhǎng)因子。Becaplermin即人重組血小板源生長(zhǎng)因子(PDGF—BB)由 美國(guó)Chiron公司采用重組DNA技術(shù)在酵母菌中表達(dá)生產(chǎn)(U.S. License No.l 106，Emeryville, CA 94608); Ortho-McNeil制藥公司成功將有效活性成分為Becaplermin的Regranex推向市 場(chǎng)(U.S. License No.ll96， San German, Puerto Rico 00683)，用來(lái)治療皮下深層有充足血管 供應(yīng)的糖尿病足部神經(jīng)性潰瘍。Regmnex是一種羧甲基纖維素型軟膏，為無(wú)色或淡粉色， lg含100ug Becaplermin,目前有2 g， 7.5 g和15 g三種規(guī)格包裝，限于外用。軟膏制劑是 目前唯一的PDGF劑型。中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?6198773.1公開了一種含生長(zhǎng)因子的凝膠制劑，生長(zhǎng)因子是PDGF， 凝膠基質(zhì)為纖維素聚合物，及可用的帶電荷化學(xué)物質(zhì)，選自包括賴氨酸、精氨酸、組氨酸、 魚精蛋白、丙氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、絲氨酸、天冬氨酸、色氨酸、氨基胍、鋅和鎂的組 合，其中組合物為粘度在室溫下約1000—500, OOOcps范圍內(nèi)的水性凝膠。北京金賽獅生物制藥技術(shù)開發(fā)有限公司申請(qǐng)的兩件專利，申請(qǐng)?zhí)柗謩e為02153958.8: 重組血小板源生長(zhǎng)因子水凝膠制劑的制備方法；02153957.X:重組血小板源生長(zhǎng)因子的水 凝膠制劑。它們也是PDGF的凝膠制劑，發(fā)明涉及的rhPDGF-BB，是采取通用的基因工程 技術(shù)，構(gòu)建重組人的水凝膠PDGF-BB菌株，擴(kuò)大培養(yǎng)，發(fā)酵、純化，得到蛋白質(zhì)純度大
于97%、蛋白質(zhì)含量為lmg/ml的rhPDGF-BB藥液樣品。水凝膠基質(zhì)為卡伯姆，添加一定 量的pH調(diào)節(jié)劑、等滲劑、穩(wěn)定劑以及防腐劑等。最近的研究表明，細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)是由大分子構(gòu)成的錯(cuò)綜復(fù) 雜的網(wǎng)絡(luò)，不僅靜態(tài)地發(fā)揮支持、連接、保水、保護(hù)等物理作用，為細(xì)胞的生存及活動(dòng)提 供適宜的場(chǎng)所，而且動(dòng)態(tài)地對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生全方位影響，通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)影響細(xì)胞的形狀、 代謝、功能、遷移、增殖和分化。在生命演繹過程中廣泛存在于多種組織與器官中，細(xì)胞 外基質(zhì)處于不斷的更新過程中，并且在組織修復(fù)過程中細(xì)胞外基質(zhì)更是重要的支撐結(jié)構(gòu)。 研究表明，細(xì)胞外基質(zhì)在傷口愈合中是必需的。體表慢性難愈合創(chuàng)面的發(fā)生機(jī)制的研究包括組織修復(fù)細(xì)胞支架改變、修復(fù)細(xì)胞過度凋 亡、生長(zhǎng)因子與靶細(xì)胞受體間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)"失偶聯(lián)"以及多種因子間網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)"失控"。以往突 出強(qiáng)調(diào)生長(zhǎng)因子促進(jìn)潰瘍愈合，而事實(shí)上細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)潰瘍的愈合所起的作用更大，因此， 對(duì)于潰瘍的研究，單純研究生長(zhǎng)因子是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，應(yīng)該結(jié)合細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行研究。細(xì)胞支架選用殼聚糖衍生物水凝膠的原因在于殼聚糖資源豐富、價(jià)格便宜且具有良好 的生物相容性和生物降解性，降解產(chǎn)物一般對(duì)人體無(wú)毒副作用，在體內(nèi)不積蓄，無(wú)免疫原 性等眾多優(yōu)點(diǎn)，運(yùn)用于潰瘍治療還表現(xiàn)出抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，加快潰瘍愈合的優(yōu)勢(shì)。然而殼聚 糖本身不能形成水凝膠，只有經(jīng)過修飾改性后才能成膠。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)，提供一種良好的親水性、保濕性、透氣性和柔韌性以 及良好的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞活化改性殼聚糖醫(yī)用敷料。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞活化改性殼聚糖醫(yī)用敷料的制備方法。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞活化改性殼聚糖醫(yī)用敷料在制備治療糖尿 病潰瘍藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下-一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞活化改性殼聚糖醫(yī)用敷料，用下述方法制成(1)將巰基化殼聚糖以15-25 mg/mL比例加入細(xì)胞完全培養(yǎng)基溶液，制成培養(yǎng)基；(2)將轉(zhuǎn)染血小板衍化生長(zhǎng)因 子基因的皮膚成纖維細(xì)胞或角質(zhì)化細(xì)胞以4xlO、4xlO"mL的濃度接種于步驟(1)制成的 培養(yǎng)基中，以10-15轉(zhuǎn)/分旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)2-5天。所述巰基化殼聚糖的分子量為20-1000 KDa。所述巰基化殼聚糖優(yōu)選N-乙酰-L-半胱氨酸改性殼聚糖或2,3 — 二巰基丁二酸改性殼聚 糖，還可以選用其它的，如巰基乙酸改性殼聚糖、硫代乙酸醇改性殼聚糖等。 所述N-乙酰-L-半胱氨酸改性殼聚糖由下述方法制成(1) 將殼聚糖、l-羥基苯并三唑以h l-8的摩爾比分散于水中，使殼聚糖的質(zhì)量百分濃 度為1%-3%，攪拌直至形成透明溶液；(2) 以殼聚糖與N-乙酰-L-半胱氨酸按質(zhì)量比為1: 0.5-10的比例，向上述溶液中加入 N-乙酰-L-半胱氨酸，后逐滴加入與殼聚糖等質(zhì)量的l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳 酰二亞胺配制的水溶液中，調(diào)節(jié)pH為4-6，于15-25'C下攪拌2-4 h; (3)取出反應(yīng)液，在8-15 。C避光條件下于2-4天內(nèi)用含2 nmol/L EDTA的5 mmol/L鹽 酸水溶液透析2-4次，用含1 g/L NaCl的5 mmol/L鹽酸水溶液透析2-5次，再用1 mmol/L鹽酸水溶液透析2-5次制成。 所述2，3 — 二巰基丁'二酸改性殼聚糖由下述方法制成(1) 將殼聚糖、l-羥基苯并三啤以l: 1-8的摩爾比分散于水中，使殼聚糖的質(zhì)量百分濃 度為1%-3%，攪拌直至形成透明溶液；(2) 以殼聚糖與2,3 — 二巰基丁二酸按質(zhì)量比為1: 0.5-10的比例，向上述溶液中加入2,3 一二巰基丁二酸，后逐滴加入與殼聚糖等質(zhì)量的l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰 二亞胺配制的水溶液中，調(diào)節(jié)pH為4-6，于15-25'C下攪拌2-4 h;(3) 取出反應(yīng)液，在8-15 。C避光條件下于2-4天內(nèi)用含2 pmol/L EDTA的5 mmol/L鹽 酸水溶液透析2-4次，用含1 g/L NaCl的5 mmol/L鹽酸水溶液透析2-5次，再用1 mmol/L鹽酸水溶液透析2-5次制成。所述l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺水溶液的配制是將l-乙基-(3-二甲基氨 基丙基)碳酰二亞胺加入水中完全溶解即可。一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞活化改性殼聚糖醫(yī)用敷料的制備方法，包括如下步驟(1)將分子量 為20-1000 KDa的巰基化殼聚糖以15-25 mg/mL比例加入細(xì)胞完全培養(yǎng)基溶液，制成培養(yǎng) 基；(2)將轉(zhuǎn)染血小板衍化生長(zhǎng)因子基因的皮膚成纖維細(xì)胞或角質(zhì)化細(xì)胞以4X 104 -4X 105 mg/mL的濃度接種于步驟(1)制成的培養(yǎng)基中，以10-15轉(zhuǎn)/分旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)2-5天。所述巰基化殼聚糖為N-乙酰-L-半胱氨酸改性殼聚糖或2，3 — 二巰基丁二酸改性殼聚 糖，還可以選用其它的，如巰基乙酸改性殼聚糖、硫代乙酸醇改性殼聚糖等。所述N-乙酰-L-半胱氨酸改性殼聚糖由下述方法制成(1) 將殼聚糖、l-羥基苯并三唑以l: l-8的摩爾比分散于水中，使殼聚糖的質(zhì)量百分濃度 為1%-3%，攪拌直至形成透明溶液；(2) 以殼聚糖與N-乙酰-L-半胱氨酸按質(zhì)量比為1: 0.5-10的比例，向上述溶液中加入N-乙酰-L-半胱氨酸，后逐滴加入與殼聚糖等質(zhì)量的l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺 配制的水溶液中，調(diào)節(jié)pH為4-6，于15-25'C下攪拌2-4 h;(3) 取出反應(yīng)液，在8-15 。C避光條件下于2-4天內(nèi)用含2 toiol/LEDTA的5 mmol/L鹽酸 水溶液透析2-4次，用含1 g/LNaCl的5 mmol/L鹽酸水溶液透析2-5次，再用1 mmol/L鹽 酸水溶液透析2~5次制成。所述2.3 — 二巰基丁二酸改性殼聚糖由下述方法制成(1) 將殼聚糖、l-羥基苯并三唑以l: l-8的摩爾比分散于水中，使殼聚糖的質(zhì)量百分濃度 為1% 3%，攪拌直至形成透明溶液；(2) 以殼聚糖與2,3 — 二巰基丁二酸按質(zhì)量比為1: 0.5-10的比例，向上述溶液中加入2,3 一二巰基丁二酸，后逐滴加入的與殼聚糖等質(zhì)量的l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞 胺配制的水溶液中，調(diào)節(jié)pH為4-6，于15-25'C下攪拌2-4 h;(3) 取出反應(yīng)液，在8-15 。C避光條件下于2-4天內(nèi)用含2 Wnol/LEDTA的5 mmol/L鹽酸
水溶液透析2-4次，用含1 g/L NaCl的5 mmol/L鹽酸水溶液透析2~5次，再用1 mmol/L 鹽酸水溶液透析2 5次制成。所述l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺水溶液的配制是將l-乙基-(3-二甲基氨 基丙基)碳酰二亞胺加入水中完全溶解即可。一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞活化改性殼聚糖醫(yī)用敷料在制備治療糖尿病潰瘍藥物中的應(yīng)用。 用該方法制備的水凝膠輔料用于治療各種皮膚創(chuàng)傷與潰瘍，尤其是糖尿病足神經(jīng)性潰 瘍的再生與修復(fù)。 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)1. 細(xì)胞支架選用具有抗菌性的天然高分子材料——?dú)ぞ厶峭ㄟ^巰基化改性后使其在水 溶液狀態(tài)形成雙硫鍵實(shí)現(xiàn)自然膠聯(lián)而形成凝膠，該凝膠具有優(yōu)越的親水性、保濕性、透氣 性和柔韌性以及良好的生物活性等功能，能最大程度地滿足現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)敷料的要求。2. —種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞活化改性殼聚糖醫(yī)用敷料中種子細(xì)胞通過基因重組技術(shù)，實(shí)現(xiàn)局部 PDGF-BB生長(zhǎng)因子高表達(dá)、強(qiáng)分泌，與復(fù)合細(xì)胞外基質(zhì)共同調(diào)控潰瘍微環(huán)境，達(dá)到修復(fù)重 建的功能。


圖l為各組間不同時(shí)間愈合率的比較。
具體實(shí)施方式
下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。一.本發(fā)明涉及水凝膠的設(shè)計(jì)與優(yōu)化，通過殼聚糖引入巰基，實(shí)現(xiàn)水凝膠制備，分別 測(cè)定巰基穩(wěn)定性以及溶脹性能并對(duì)其進(jìn)行物理化學(xué)性質(zhì)表征。將以下所得溶液狀材料，使 用0.22 nm濾器過濾達(dá)到無(wú)菌狀態(tài)，分裝置于2-8 'C備用。 實(shí)施例lN-乙酰-L-半胱氨酸改性殼聚糖的制備(1) 將殼聚糖、1-羥基苯并三唑以1: 4的摩爾比分散于水中，使殼聚糖的質(zhì)量百分濃度 為2%，攪拌直至形成透明溶液；(2) 以殼聚糖與N-乙酰-L-半胱氨酸按質(zhì)量比為1: 5的比例，向上述溶液中加入N-乙酰 -L-半胱氨酸，后逐滴加入與殼聚糖等質(zhì)量的l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺配制 的水溶液中，調(diào)節(jié)pH為5，于2(TC下攪拌3h;(3) 取出反應(yīng)液，在10 。C避光條件下于3天內(nèi)用含2 nmol/L EDTA的5 mmol/L鹽酸水溶 液透析3次，用含1 g/L NaCl的5 mmol/L鹽酸水溶液透析3次，再用1 mmol/L鹽酸水溶 液透析3次制成。實(shí)施例2N-乙酰-L-半胱氨酸改性殼聚糖的制備(1) 將殼聚糖、1-羥基苯并三唑以1: 1的摩爾比分散于水中，使殼聚糖的質(zhì)量百分濃度 為1%，攪拌直至形成透明溶液；(2) 以殼聚糖與N-乙酰-L-半胱氨酸按質(zhì)量比為1: 0.5的比例，向上述溶液中加入N-乙?！狶-半胱氨酸，后逐滴加入與殼聚糖等質(zhì)量的l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺配制 的水溶液中，調(diào)節(jié)pH為4，于15'C下攪拌4h; (3)取出反應(yīng)液，在8 'C避光條件下于4天內(nèi)用含2 pmol/L EDTA的5 mmol/L鹽酸水溶 液透析4次，用含1 g/L'NaCI的5 mmol/L鹽酸水溶液透析5次，再用1 mmol/L鹽酸水溶 液透析5次制成。 實(shí)施例3N-乙酰-L-半胱氨酸改性殼聚糖的制備(1) 將殼聚糖、1-羥基苯并三唑以1: 8的摩爾比分散于水中，使殼聚糖的質(zhì)量百分濃度 為3%,攪拌直至形成透明溶液；(2) 以殼聚糖與N-乙酰-L-半胱氨酸按質(zhì)量比為1: IO的比例，向上述溶液中加入N-乙酰 丄-半胱氨酸，后逐滴加入與殼聚糖等質(zhì)量的l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺配制 的水溶液中，調(diào)節(jié)pH為6，于25。C下攪拌2h;(3) 取出反應(yīng)液，在15 。C避光條件下于2天內(nèi)用含2 pmol/LEDTA的5 mmol/L鹽酸水溶 液透析2次，用含1 g/L NaCl的5 mmol/L鹽酸水溶液透析2次，再用1 mmol/L鹽酸水溶 液透析2次制成。實(shí)施例4N-乙酰-L-半胱氨酸改性殼聚糖的制備將500 mg殼聚糖加入100 mg的N-乙酰-L-半胱氨酸，待完全溶解后，逐滴加入4 ml EDAC水溶液，用lmol/LNaOH調(diào)節(jié)pH至5并保持恒定，室溫下攪拌3 h。取出反應(yīng)液， 在10 'C避光條件下于3 d內(nèi)用含0.2% EDTA的5 mmol/L鹽酸溶液透析一次，用含1%NaCl 的5 mmol/L鹽酸溶液透析兩次，再用1 mmol/L鹽酸溶液透析兩次。 實(shí)施例6巰基乙酸改性殼聚糖的制備稱取2.5g殼聚糖，加入47.5 g水配成濃度為5 %的殼聚糖溶液。滴加2.5g巰基乙酸，混 合均勻后測(cè)定pH值。加入1.12mLEDAC后于常溫下攪拌反應(yīng)3h。取出混合溶液，在10 °C 避光條件下在3d時(shí)間內(nèi)用5mmol/L的鹽酸溶液透析一次，5mmolPL鹽酸/1 %NaCl混合溶 液透析兩次，再用lmmol/L鹽酸溶液透析兩次。 實(shí)施例7硫代乙酸醇改性殼聚糖的制備稱取0.8072g硫代乙酸醇，配成8ml溶液，加入4ml乙酸酐，充分?jǐn)嚢杈鶆蚝?，加兩?濃硫酸，放于恒溫振蕩器中振蕩3h,放置過夜，用水或氨水洗至中性。 實(shí)施例82.3 — 二巰基丁二酸改性殼聚糖的制備(1) 將殼聚糖、1-羥基苯并三哇以1: 4的摩爾比分散于水中，使殼聚糖的質(zhì)量百分濃度 為2%，攪拌直至形成透明溶液；(2) 以殼聚糖與2，3 —二巰基丁二酸按質(zhì)量比為1: 5的比例，向上述溶液中加入2,3 — 二 巰基丁二酸，后逐滴加入與殼聚糖等質(zhì)量的l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺配制 的水溶液中，調(diào)節(jié)pH為5，于20'C下攪拌3h;(3)取出反應(yīng)液，在10 。C避光條件下于3天內(nèi)用含2 pmol/L EDTA的5 mmol/L鹽酸水溶 液透析3次，用含1 g/L'NaCl的5 mmol/L鹽酸水溶液透析3次，再用1 mmol/L鹽酸水溶 液透析3次制成。 實(shí)施例92.3 — 二巰基丁二酸改性殼聚糖的制備(1) 將殼聚糖、1-羥基苯并三唑以1: 1的摩爾比分散于水中，使殼聚糖的質(zhì)量百分濃度 為1%，攪拌直至形成透明溶液；(2) 以殼聚糖與2,3 — 二巰基丁二酸按質(zhì)量比為1: 0.5的比例，向上述溶液中加入2,3 — 二巰基丁二酸，后逐滴加入與殼聚糖等質(zhì)量的l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺配 制的水溶液中，調(diào)節(jié)pH為4，于15'C下攪拌4h;(3) 取出反應(yīng)液，在8 'C避光條件下于2天內(nèi)用含2 pmol/L EDTA的5 mmol/L鹽酸水溶 液透析2次，用含1 g/L NaCl的5 mmol/L鹽酸水溶液透析2次，再用1 mmol/L鹽酸水溶 液透析2次制成。實(shí)施例102.3 — 二巰基丁二酸改性殼聚糖的制備(1) 將殼聚糖、1-羥基苯并三唑以1: 8的摩爾比分散于水中，使殼聚糖的質(zhì)量百分濃度 為3%，攪拌直至形成透明溶液；(2) 以殼聚糖與2,3 — 二巰基丁二酸按質(zhì)量比為1: 10的比例，向上述溶液中加入2，3 — 二 巰基丁二酸，后逐滴加入與殼聚糖等質(zhì)量的l-乙基-(3-二甲基氨基丙基")碳酰二亞胺配制 的水溶液中，調(diào)節(jié)pH為6，于25'C下攪拌2h;(3) 取出反應(yīng)液，在15 。C避光條件下于4天內(nèi)用含2 pmol/L EDTA的5 mmol/L鹽酸水溶 液透析4次，用含1 g/L NaCl的5 mmol/L鹽酸水溶液透析5次，再用1 mmol/L鹽酸水溶 液透析5次制成。本發(fā)明在殼聚糖分子結(jié)構(gòu)中成功引入巰基后，在溶液狀態(tài)下即能氧化形成二硫鍵，后 者相互膠聯(lián)，結(jié)果形成網(wǎng)絡(luò)互穿的水凝膠。二、組織工程化種子細(xì)胞的修飾處理 實(shí)施例11種子細(xì)胞的修飾血小板衍化生長(zhǎng)因子(PDGF-BB)基因修飾皮膚成纖維細(xì)胞或角質(zhì)化細(xì)胞以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞提取的總RNA為模板，合成cDNA序列，普通PCR擴(kuò)增目的基因片段， 連入pMD-19 T載體，進(jìn)行雙酶切處理并將其產(chǎn)物與含有綠色熒光蛋白且能獨(dú)立表達(dá)的 pSELECT-GFPzeo-mcs載體經(jīng)T4連接酶相連接，成功構(gòu)建PDGF-BB基因的真核表達(dá)載體重組子 pSELECT-GFPzeo-mcs/PDGF-BB。進(jìn)一步運(yùn)用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染技術(shù)將PDGF-BB基因?qū)肫つw成 纖維細(xì)胞或角質(zhì)化細(xì)胞，以實(shí)現(xiàn)PDGF-BB基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)。三、 微重力條件下旋轉(zhuǎn)共培養(yǎng)水凝膠/細(xì)胞三維復(fù)合物 實(shí)施例12一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞活化改性殼聚糖醫(yī)用敷料，用下述方法制成(1)將實(shí)施例1制備的分子量為100 KDa N-乙酰-L-半胱氨酸改性殼聚糖以20 mg/mL 比例加入細(xì)胞完全培養(yǎng)基溶液，制成培養(yǎng)基；(2)將轉(zhuǎn)染血小板衍化生長(zhǎng)因子基因的皮膚 成纖維細(xì)胞以4xlO"mL的濃度接種于步驟(1)制成的培養(yǎng)基中，以10轉(zhuǎn)/分旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)3 天。(可以用2.3 — 二巰基丁二酸改性殼聚糖或巰基乙酸改性殼聚糖、硫代乙酸醇改性殼聚 糖替代本實(shí)施例中的N-乙酰-L-半胱氨酸改性殼聚糖，成為新的實(shí)施例) 實(shí)施例13一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞活化改rf殼聚糖醫(yī)用敷料，用下述方法制成(1)將實(shí)施例2制備的分子量為20 KDaN-乙酰-L-半胱氨酸改性殼聚糖以15 mg/mL比 例加入細(xì)胞完全培養(yǎng)基溶液，制成培養(yǎng)基；(2)將轉(zhuǎn)染血小板衍化生長(zhǎng)因子基因的皮膚成 纖維細(xì)胞以4xl04 /mL的濃度接種于步驟(1)制成的培養(yǎng)基中，以10轉(zhuǎn)/分旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)5 天。(可以用2.3 — 二巰基丁二酸改性殼聚糖或巰基乙酸改性殼聚糖、硫代乙酸醇改性殼聚 糖替代本實(shí)施例中的N-乙酰-L-半胱氨酸改性殼聚糖，成為新的實(shí)施例) 實(shí)施例14一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞活化改性殼聚糖醫(yī)用敷料，用下述方法制成 (1)將實(shí)施例3制備的分子量為1000 KDa N-乙酰-L-半胱氨酸改性殼聚糖以25 mg/mL比例加入細(xì)胞完全培養(yǎng)基溶液，制成培養(yǎng)基；(2)將轉(zhuǎn)染血小板衍化生長(zhǎng)因子基因的角質(zhì) 化細(xì)胞以4xl()S/mL的濃度接種于步驟(1)制成的培養(yǎng)基中，以15轉(zhuǎn)/分旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)2天。(可以用2.3 — 二巰基丁二酸改性殼聚糖或巰基乙酸改性殼聚糖、硫代乙酸醇改性殼聚糖替 代本實(shí)施例中的N-乙酰-L-半胱氨酸改性殼聚糖，成為新的實(shí)施例)四、 一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞活化改性殼聚糖醫(yī)用敷料(水凝膠/細(xì)胞三維復(fù)合物)治療糖尿病 潰瘍動(dòng)物模型。實(shí)施例15實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用遺傳性糖尿病(db/db汰鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)l周，實(shí)驗(yàn)當(dāng)日禁食，麻醉?xiàng)l件下 背部?jī)裘?，面積9cmx8cm，待消毒后用特制打孔器在背部脊柱兩側(cè)共切割4個(gè)圓形創(chuàng)面， 直徑2cm，深至皮下，止血后，隨機(jī)分為4組(1)模型對(duì)照組；(2)藥物(RegranexGel') 治療組；(3)水凝膠治療組；(4) 一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞活化改性殼聚糖醫(yī)用敷料組(水凝膠/細(xì) 胞三維復(fù)合物治療組)。單籠喂養(yǎng)，每周更換水凝膠敷料2次，直至傷口愈合。(見圖l)圖l 中，A組 一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞活化改性殼聚糖醫(yī)用敷料組(水凝膠/細(xì)胞三維復(fù)合物組)；B組 藥物((RegranexGd')治療組；C組水凝膠治療組；D組模型對(duì)照組。治療后l、 3、 7、 14、 21d向潰瘍內(nèi)滴注等滲鹽水至液面與創(chuàng)緣皮膚相平為止，并作記 錄；治療后l、 3、 7、 14、 21d用透明膜覆蓋創(chuàng)面，沿邊緣畫線，剪膜，置分析天平稱取質(zhì) 量并換算成面積，再轉(zhuǎn)換為再上皮化速率。再上皮化速率=(原始創(chuàng)面面積一未愈創(chuàng)面面積)
/原始創(chuàng)面面積><100% (詳見表l);通過數(shù)碼照相、計(jì)算機(jī)儲(chǔ)存、分析、比較觀察創(chuàng)面組 織顏色、形態(tài)以及生長(zhǎng)速度的變化。表1不同時(shí)間創(chuàng)面愈合率的比較(^ ± ^ )3天(％ )7天(％)14天(％)21天(％)本發(fā)明醫(yī)用敷料 組 模型對(duì)照組41.89±13.973.71±6.5992.71±1.9597.61±1.4556.37土5.0761.39±8.284.34±2.7189.8U2.91分別在治療l、 3、 7、 14、 21d處死3只動(dòng)物，每組創(chuàng)面留取12個(gè)標(biāo)本，置入4%中性多 聚甲醛溶液中固定lh，用磷酸鹽緩沖液洗脫3次，脫水透明后，石蠟包埋組織，切片，HE 染色。通過光鏡觀察炎性細(xì)胞(中性粒細(xì)胞、吞噬細(xì)胞等)形態(tài)、浸潤(rùn)情況與成纖維細(xì)胞、 血管內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量變化，從組織及細(xì)胞水平觀察其病變特點(diǎn)。通過電子 顯微鏡觀察肉芽組織中細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。通過對(duì)本發(fā)明提供的一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞活化改性殼聚糖醫(yī)用敷料(水凝膠/細(xì)胞三維復(fù)合 物)進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，本發(fā)明提供的一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞活化改性殼聚糖醫(yī)用敷料與 RegmnexGel對(duì)糖尿病大鼠皮膚潰瘍相比，明顯加快潰瘍的修復(fù)，且成本較低。本發(fā)明應(yīng)用微重力三維組織細(xì)胞旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)系統(tǒng)(the rotary cell culture system ， RCCS)， 對(duì)大鼠皮膚成纖維細(xì)胞與角質(zhì)化細(xì)胞進(jìn)行微重力三維組織培養(yǎng)，微重力三維組織細(xì)胞旋轉(zhuǎn) 培養(yǎng)系統(tǒng)的目的是建立動(dòng)物細(xì)胞的三維培養(yǎng)體系。細(xì)胞與培養(yǎng)液在容器內(nèi)經(jīng)過旋轉(zhuǎn)，重力 向量被持續(xù)隨機(jī)化，細(xì)胞以一個(gè)終速度連續(xù)自由落體的方式懸浮于培養(yǎng)基中，從而處于一 種模擬自由落體狀態(tài)，在一定程度上類似于微重力環(huán)境。在微重力條件下培養(yǎng)細(xì)胞可產(chǎn)生 低剪切力、低渦流，減少培養(yǎng)液對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的機(jī)械損傷，并可增加細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)的傳遞作用， 加速代謝產(chǎn)物的排除，從而有利于細(xì)胞的增殖與分化。另外，微重力旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)還可以避免 氣泡的產(chǎn)生，可以通過濾膜來(lái)完成氣體交換，使氣體、營(yíng)養(yǎng)成分和代謝廢物能最佳擴(kuò)散， 這些優(yōu)勢(shì)是靜止培養(yǎng)方法無(wú)法達(dá)到的。本發(fā)明成功培養(yǎng)出一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞活化改性殼聚糖 醫(yī)用敷料，能夠有效實(shí)現(xiàn)生長(zhǎng)因子和細(xì)胞外基質(zhì)共同作用于潰瘍面以促進(jìn)其修復(fù)。本發(fā)明通過基因重組技術(shù)將含有PDGF-BB基因的重組子轉(zhuǎn)染入皮膚成纖維細(xì)胞或角 質(zhì)化細(xì)胞，與含有巰基的殼聚糖高分子水凝膠材料在RCCS中共同培養(yǎng)成三維復(fù)合物，用 于治療糖尿病潰瘍動(dòng)物模型，實(shí)現(xiàn)持續(xù)恒定地合成及分泌生長(zhǎng)因子，從而達(dá)到高效合理地 使用生長(zhǎng)因子的目的，并與細(xì)胞外基質(zhì)共同作用，有效影響組織修復(fù)的自然過程，縮短創(chuàng) 面愈合時(shí)間，促進(jìn)難愈性潰瘍的愈合并有效改善創(chuàng)面愈合后的功能及外觀。本發(fā)明提供的一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞活化改性殼聚糖醫(yī)用敷料，充分發(fā)揮水凝膠在潰瘍病治 療中的優(yōu)勢(shì)，表現(xiàn)在該水凝膠具有良好的屏障功能，對(duì)水和氣體具有雙向通透性；且能 有效抵御細(xì)菌入侵，防止外界感染；使創(chuàng)面始終處于濕潤(rùn)的微環(huán)境中，不僅有利于傷口的 愈合，而且可以浸潤(rùn)暴露在外的末梢神經(jīng)，減輕患者的疼痛；該水凝膠能有效吸收傷口分 泌物，避免粘連；水凝膠具有良好的柔軟性、可塑性和粘附性，與皮膚潰瘍面有較好的接 觸性能；種子細(xì)胞通過凝膠層進(jìn)行持續(xù)釋放生長(zhǎng)因子的作用，與細(xì)胞外基質(zhì)共同發(fā)揮治療 作用；該水凝膠通過殼聚糖巰基化實(shí)現(xiàn)自身交聯(lián)，具有良好的生物相容性，且可生物降解， 不會(huì)造成排異反應(yīng)和傷口的感染；其外觀呈透明狀，有利于對(duì)傷口愈合情況的觀察；操作方便，對(duì)創(chuàng)面處理結(jié)果滿意等等。通過對(duì)本發(fā)明提供的一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞活化改性殼聚糖醫(yī)用敷料的物理化學(xué)性質(zhì)表征、所含種子細(xì)胞的功能測(cè)定以及進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)模型潰瘍愈合速率、新生血管數(shù)目、PDGF-BB及其受體基因表達(dá)、細(xì)胞外基質(zhì)等含量，研究結(jié)果表明一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞活化改性殼聚糖醫(yī)用敷料可達(dá)到加速組織自然修復(fù)的過程，有效縮短創(chuàng)面愈合時(shí)間，促進(jìn)難愈性潰瘍的愈合并能有效改善創(chuàng)面愈合后的功能和外觀，性價(jià)比優(yōu)于目前唯一被美國(guó)FDA批準(zhǔn)并上市治療糖尿病足潰瘍的Regranex Gel。一、細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基組成成分成分(mg/L):氯化鈣…200; L-絲氨酸…42;九水硝酸鐵---0.1; L-蘇氨酸—-95;氯化鉀---400; L-色氨酸…16;無(wú)水硫酸鎂—-97.67; L-酪氨酸…72;氯化鈉一6400; L-纈氨酸…94; 無(wú)水磷酸二氫鈉…108.7; D-葡萄糖…1000; L-精氨酸鹽酸鹽…84;丙酮酸鈉…110; L-胱氨酸鹽酸鹽--63;酚紅---15; L-谷氨酰胺---584; D-泛酸鈣…4;甘氨酸…30;氯化膽堿一4; L-組氨酸鹽酸鹽…42;葉酸…4; L-異亮氨酸…105; i-肌醇一7.2; L-亮氨酸—-105; 煙酰胺—-4; L-賴氨酸鹽酸鹽—-146;鹽酸吡哆醛…4; L-蛋氨酸---30;核黃素…0.4; L-苯丙氨酸…66;鹽酸硫胺一產(chǎn)品指標(biāo)外觀粉紅色固體粉末、溶解性、完全溶解，溶液澄明。pH值(1)力QNaHC03 7.50 8.10 (2)不加NaHC03 6.00 6.60水分(o/o): S5.0滲透壓(mOsm/kgH20): (1)力tl NaHC03 300 332; (2)不加NaHC03 238 263 細(xì)菌內(nèi)毒素(EU/ml)S10 微生物檢查(CFU/g)^1000貯藏2 °C-8 'C冷藏，干燥,密封，避光貯藏。規(guī)格1L/包有效期二年配制方法J(1) 將一袋培養(yǎng)基全部倒入一容器中，用少量注射用水將袋內(nèi)殘留培養(yǎng)基洗下，并入容器 后加注射用水(水溫20 °C-30 °C)到950mL，輕微攪拌溶解；(2) 加入3.7g碳酸氫鈉；(3) 輕微攪拌溶解，加注射用水至1L;(4) 用1 mol/L氫氧化鈉溶液或1 mol/L鹽酸溶液調(diào)pH至所需值；(5) 用0.2 nm濾膜正壓過濾除菌；(6) 溶液應(yīng)在2 °C-8 'C下避光保存。 二、細(xì)胞完全培養(yǎng)基配制方法(1) 取過濾后的基礎(chǔ)培養(yǎng)基88.5ml;(2) 加入胎牛血清10ml;(3) 加入谷氨酰胺lml;(4) 加入混勻的青霉素及鏈霉素(雙抗)溶液0.5ml;(5) 混勻，調(diào)節(jié)pH值至7.2-7.4，在2 。C-8 。C下避光保存。
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞活化改性殼聚糖醫(yī)用敷料，其特征是用下述方法制成(1)將巰基化殼聚糖以15-25mg/mL比例加入細(xì)胞完全培養(yǎng)基溶液，制成培養(yǎng)基；(2)將轉(zhuǎn)染血小板衍化生長(zhǎng)因子基因的皮膚成纖維細(xì)胞或角質(zhì)化細(xì)胞以4×104-4×105/mL的濃度接種于步驟(1)制成的培養(yǎng)基中，以10-15轉(zhuǎn)/分旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)2-5天。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞活化改性殼聚糖醫(yī)用敷料，其特征是所述巰基化 殼聚糖的分子量為20-1000 KDa。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞活化改性殼聚糖醫(yī)用敷料，其特征是所述巰基化 殼聚糖為N-乙酰-L-半胱氨酸改性殼聚糖或2， 3 — 二巰基丁二酸改性殼聚糖。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞活化改性殼聚糖醫(yī)用敷料，其特征是所述N-乙 酰-L-半胱氨酸改性殼聚糖由下述方法制成(1) 將殼聚糖、1-羥基苯并三唑以l: l-8的摩爾比分散于水中，使殼聚糖的質(zhì)量百分濃 度為1% 3%，攪拌直至形成透明溶液；(2) 以殼聚糖與N-乙酰-L-半胱氨酸按質(zhì)量比為1: 0.5-IO的比例，向上述溶液中加入 N-乙酰-L-半胱氨酸，后逐滴加入與殼聚糖等質(zhì)量的l-乙基-(3-二甲基氨基丙基) 碳酰二亞胺配制的水溶液中，調(diào)節(jié)pH為4-6，于15-25 。C下攪拌2-4 h;(3) 取出反應(yīng)液，在8-15 。C避光條件下于2-4天內(nèi)用含2 Mmol/L EDTA的5 mmol/L鹽 酸水溶液透析2-4次，用含1 g/L NaCl的5 mmol/L鹽酸水溶液透析2-5次，再用 1 mmol/L鹽酸水溶液透析2-5次制成。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞活化改性殼聚糖醫(yī)用敷料，其特征是所述2，3 — 二巰基丁二酸改性殼聚糖由下述方法制成(1) 將殼聚糖、l-羥基苯并三唑以l: 1-8的摩爾比分散于水中，使殼聚糖的質(zhì)量百分濃 度為1% 3%，攪拌直至形成透明溶液；(2) 以殼聚糖與2，3 — 二巰基丁二酸按質(zhì)量比為1: 0.5-10的比例，向上述溶液中加入 2,3 — 二巰基丁二酸，后逐滴加入與殼聚糖等質(zhì)量的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基) 碳酰二亞胺配制的水溶液中，調(diào)節(jié)pH為4-6，于15-25 'C下攪拌2-4 h;(3) 取出反應(yīng)液，在8-15 。C避光條件下于2-4天內(nèi)用含2 Mmol/L EDTA的5 mmol/L鹽 酸水溶液透析2-4次，用含1 g/L NaCl的5 mmol/L鹽酸水溶液透析2 5次，再用 1 mmol/L鹽酸水溶液透析2-5次制成。
6. —種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞活化改性殼聚糖醫(yī)用敷料的制備方法，其特征是包括如下步驟(l)將 分子量為20-1000 KDa的巰基化殼聚糖以15-25 mg/raL比例加入細(xì)胞完全培養(yǎng)基溶液， 制成培養(yǎng)基；(2)將轉(zhuǎn)染血小板衍化生長(zhǎng)因子基因的皮膚成纖維細(xì)胞或角質(zhì)化細(xì)胞以 4X 104-4X 105 /mL的濃度接種于步驟(1)制成的培養(yǎng)基中，以10-15轉(zhuǎn)/分旋轉(zhuǎn)培養(yǎng) 2-5天。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞活化改性殼聚糖醫(yī)用敷料的制備方法，其特征是所述巰基化殼聚糖為N-乙酰-L-半胱氨寧改性殼聚糖或2，3 — 二巰基丁二酸改性殼聚糖。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞活化改性殼聚糖醫(yī)用敷料的制備方法，其特征是 所述N-乙酰-L-半胱氨酸改性殼聚糖由下述方法制成(1) 將殼聚糖、1-羥基苯并三唑以1: 1-8的摩爾比分散于水中，使殼聚糖的質(zhì)量百分濃 度為1% 3%，攪拌直至形成透明溶液；(2) 以殼聚糖與N-乙酰-L-半胱氨酸按質(zhì)量比為1: 0.5-IO的比例，向上述溶液中加入N-乙酰-L-半胱氨酸，后逐滴加入與殼聚糖等質(zhì)量的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞 胺配制的水溶液中，調(diào)節(jié)pH為4-6，于15-25 'C下攪拌2-4 h;(3) 取出反應(yīng)液，在8-15 。C避光條件下于2-4天內(nèi)用含2 Mmol/L EDTA的5 mraol/L鹽 酸水溶液透析2-4次，用含1 g/L NaCl的5 mmol/L鹽酸水溶液透析2-5次，再用1國(guó)ol/L 鹽酸水溶液透析2-5次制成。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞活化改性殼聚糖醫(yī)用敷料的制備方法，其特征是 所述2. 3 — 二巰基丁二酸改性殼聚糖由下述方法制成(1) 將殼聚糖、1-羥基苯并三唑以1: 1-8的摩爾比分散于水中，使殼聚糖的質(zhì)量百分濃 度為1%-3%，攪拌直至形成透明溶液；(2) 以殼聚糖與2, 3—二巰基丁二酸按質(zhì)量比為1: 0. 5-10的比例，向上述溶液中加入2， 3 一二巰基丁二酸，后逐滴加入與殼聚糖等質(zhì)量的1-乙基_ (3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞 胺配制的水溶液中，調(diào)節(jié)pH為4-6，于15-25 'C下攪拌2-4 h;(3) 取出反應(yīng)液，在8-15 。C避光條件下于2-4天內(nèi)用含2 Mraol/L EDTA的5 mmol/L鹽 酸水溶液透析2-4次，用含1 g/L NaCl的5 mraol/L鹽酸水溶液透析2-5次，再用1 mraol/L 鹽酸水溶液透析2-5次制成。
10. 權(quán)利要求1-5之一的一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞活化改性殼聚糖醫(yī)用敷料在制備治療糖尿病潰瘍 藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞活化改性殼聚糖醫(yī)用敷料及制備方法及用途，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞活化改性殼聚糖醫(yī)用敷料用下述方法制成(1)將巰基化殼聚糖以15-25mg/mL比例加入細(xì)胞完全培養(yǎng)基溶液，制成培養(yǎng)基；(2)將轉(zhuǎn)染血小板衍化生長(zhǎng)因子基因的皮膚成纖維細(xì)胞或角質(zhì)化細(xì)胞以4×10⁴-4×10⁵/mL的濃度接種于步驟(1)制成的培養(yǎng)基中旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)；本發(fā)明選用具有優(yōu)越的親水性、保濕性、透氣性和柔韌性的凝膠為細(xì)胞支架，能滿足現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)敷料的要求，本發(fā)明醫(yī)用敷料中的種子細(xì)胞通過基因重組技術(shù)，實(shí)現(xiàn)局部PDGF-BB生長(zhǎng)因子高表達(dá)、強(qiáng)分泌，與復(fù)合細(xì)胞外基質(zhì)共同調(diào)控潰瘍微環(huán)境，達(dá)到修復(fù)重建的效果。
文檔編號(hào)A61L15/28GK101125216SQ200710058738
公開日2008年2月20日 申請(qǐng)日期2007年8月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月14日
發(fā)明者于德民, 衛(wèi)麗君, 丹 宋, 張新歌, 張紹敏, 李蘭英, 李朝興, 毋中明, 鑫 王, 超 鄭 申請(qǐng)人:天津醫(yī)科大學(xué)代謝病醫(yī)院