專(zhuān)利名稱(chēng)：神經(jīng)浸潤(rùn)抑制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及神經(jīng)浸潤(rùn)抑制劑。更詳細(xì)而言，本發(fā)明涉及以白介素6(IL-6)抑制劑作為有效成分的神經(jīng)浸潤(rùn)抑制劑。
背景技術(shù)：
白介素6(IL_6)是一種也稱(chēng)作B細(xì)胞刺激因子2 (BSF2)或干擾素β 2的細(xì)胞因子。 IL-6是作為參與B淋巴細(xì)胞類(lèi)細(xì)胞的活化的分化因子被發(fā)現(xiàn)的(非專(zhuān)利文獻(xiàn)1)，之后明確了其是影響各種細(xì)胞的功能的多功能細(xì)胞因子(非專(zhuān)利文獻(xiàn)幻。有報(bào)道稱(chēng)IL-6誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞類(lèi)細(xì)胞的成熟(非專(zhuān)利文獻(xiàn)3)。IL-6在細(xì)胞上經(jīng)由兩種蛋白來(lái)傳遞其生物學(xué)活性。一種蛋白是IL-6所結(jié)合的分子量約SOkD的配體結(jié)合性蛋白的IL-6受體(非專(zhuān)利文獻(xiàn)4、幻。IL-6受體除了以跨膜而在細(xì)胞膜上表達(dá)的膜結(jié)合型受體的形式存在以外，還主要以由其胞外區(qū)構(gòu)成的可溶性IL-6 受體的形式存在。另一種蛋白是參與非配體結(jié)合性的信號(hào)傳遞的分子量約130kD的膜蛋白gpl30。 IL-6和IL-6受體形成IL-6/IL-6受體復(fù)合體，然后與gpl30結(jié)合，從而向細(xì)胞內(nèi)傳遞IL-6 的生物學(xué)活性(非專(zhuān)利文獻(xiàn)6)。目前，大多數(shù)胰腺癌病例仍以不能切除的進(jìn)展?fàn)顟B(tài)被診斷，而在唯一可以期待治愈的切除病例中，大多數(shù)病例往往在術(shù)后早期又復(fù)發(fā)。此外，不能切除、且體力狀態(tài)(PS)或主要臟器功能良好的病例將采用化學(xué)療法，但即使是目前的標(biāo)準(zhǔn)治療，其療效也不充分。例如，即使是位于首選藥位置的鹽酸吉西他濱，其癥狀緩和效果的有效率為23. 8%，存活期間中位數(shù)為5. 7個(gè)月，1年存活率為18% (海外3期臨床試驗(yàn)結(jié)果)。在日本，每年有20000 人被診斷為胰腺癌，死亡人數(shù)達(dá)22，260人(2004年厚生勞動(dòng)省的人口動(dòng)態(tài)調(diào)查)，在癌癥死因中位于第5位。迄今為止，本發(fā)明人等明確了以下事實(shí)神經(jīng)浸潤(rùn)是胰腺癌的特征性浸潤(rùn)方式之一，在胰腺癌中幾乎100%確認(rèn)到神經(jīng)浸潤(rùn)；神經(jīng)浸潤(rùn)是重要的預(yù)后因子；神經(jīng)浸潤(rùn)導(dǎo)致肝細(xì)胞功能異常，與貧血、體力狀態(tài)(PQ下降或營(yíng)養(yǎng)不良等惡病質(zhì)癥狀有關(guān)等。另外，神經(jīng)浸潤(rùn)被認(rèn)為是癌癥性疼痛等的原因，有些報(bào)道稱(chēng)通過(guò)對(duì)神經(jīng)浸潤(rùn)好發(fā)部位進(jìn)行放射線(xiàn)照射或切除位于其上位的神經(jīng)可以使癥狀得到一定程度的控制。但神經(jīng)浸潤(rùn)的機(jī)理以及由神經(jīng)浸潤(rùn)引起的癥狀所表現(xiàn)的機(jī)理尚不明確，因此，現(xiàn)實(shí)狀況是在神經(jīng)浸潤(rùn)的控制以及神經(jīng)浸潤(rùn)所引起的癥狀的控制方面還缺乏經(jīng)驗(yàn)。另一方面，不論癌癥種類(lèi)如何，普遍確認(rèn)到神經(jīng)浸潤(rùn)，在前列腺癌、胃癌、頭頸部癌中，神經(jīng)浸潤(rùn)作為預(yù)后因子被報(bào)道。與本申請(qǐng)的發(fā)明相關(guān)的先行技術(shù)文獻(xiàn)信息如下所示。先行技術(shù)文獻(xiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)非專(zhuān)利文獻(xiàn)1 =Hirano, T.等人，Nature (1986) 324，73-76非專(zhuān)利文獻(xiàn) 2 Akira, S.等人，Adv. in Immunology (1993) 54，1-78
非專(zhuān)利文獻(xiàn)3 :Lotz, Μ.等人，J. Exp. Med. (1988) 167，1253-1258非專(zhuān)利文獻(xiàn)4 :Taga，Τ.等人，J. Exp. Med. (1987) 166，967-981非專(zhuān)利文獻(xiàn)5 :Yamasaki，K.等人，Science (1988) 241，825-828非專(zhuān)利文獻(xiàn)6 :Taga，Τ.等人，Cell (1989) 58，573-58
發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的課題因此，本發(fā)明提供新的神經(jīng)浸潤(rùn)抑制劑。本發(fā)明還提供新的胰腺癌治療藥。解決課題的方法本發(fā)明人等為了解決上述課題進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在胰腺癌的神經(jīng)浸潤(rùn)模型中，通過(guò)抑制IL-6，神經(jīng)浸潤(rùn)得到抑制，從而完成了本發(fā)明。并進(jìn)一步明確了 IL-6受體在人胰腺癌細(xì)胞株中表達(dá)、以及IL-6使胰腺癌細(xì)胞的趨化能力、遷移能力和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)亢進(jìn)，發(fā)現(xiàn)通過(guò)抑制IL-6可以治療胰腺癌。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)通過(guò)對(duì)小鼠神經(jīng)浸潤(rùn)模型給予 IL-6抑制劑，可以抑制人胰腺癌神經(jīng)浸潤(rùn)。S卩，更具體而言，本發(fā)明提供以下[1] [32]。[1]胰腺癌治療藥，其以白介素6(IL_6)抑制劑作為有效成分。[2]細(xì)胞的神經(jīng)浸潤(rùn)抑制劑，其以IL-6抑制劑作為有效成分。[3] [2]所述的抑制劑，其特征在于抑制癌細(xì)胞的神經(jīng)浸潤(rùn)。[4] [3]所述的抑制劑，其特征在于抑制胰腺癌細(xì)胞的神經(jīng)浸潤(rùn)。[5] [2] W]中任一項(xiàng)所述的抑制劑，其特征在于抑制向中樞側(cè)進(jìn)行的神經(jīng)浸潤(rùn)。[6][1] [5]中任一項(xiàng)所述的治療藥或抑制劑，其特征在于IL_6抑制劑是與 IL-6受體結(jié)合的物質(zhì)。[7] [6]所述的治療藥或抑制劑，其特征在于IL_6抑制劑為抗IL_6受體抗體。[8] [7]所述的治療藥或抑制劑，其中，抗IL-6受體抗體為嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。[9]胰腺癌的治療方法，該方法包括將IL-6抑制劑給予對(duì)象的步驟。[10]細(xì)胞的神經(jīng)浸潤(rùn)抑制方法，該方法包括將IL-6抑制劑給予對(duì)象的步驟。[11] [10]所述的方法，其特征在于抑制癌細(xì)胞的神經(jīng)浸潤(rùn)。[12] [11]所述的方法，其特征在于抑制胰腺癌細(xì)胞的神經(jīng)浸潤(rùn)。[13] [10] [12]中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于抑制向中樞側(cè)進(jìn)行的神經(jīng)浸潤(rùn)。[14] [9] [13]中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于IL_6抑制劑是與IL_6受體結(jié)合的物質(zhì)。[15] [14]所述的方法，其特征在于IL_6抑制劑為抗IL_6受體抗體。[16] [15]所述的方法，其中，抗IL-6受體抗體為嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。[17] IL-6抑制劑在制備胰腺癌治療藥中的應(yīng)用。[18] IL-6抑制劑在制備細(xì)胞的神經(jīng)浸潤(rùn)抑制劑中的應(yīng)用。[19] [18]所述的應(yīng)用，其特征在于抑制癌細(xì)胞的神經(jīng)浸潤(rùn)。
[20] [19]所述的應(yīng)用，其特征在于抑制胰腺癌細(xì)胞的神經(jīng)浸潤(rùn)。[21] [18] [20]中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于抑制向中樞側(cè)進(jìn)行的神經(jīng)浸潤(rùn)。[22] [17] [21]中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于IL_6抑制劑是與IL_6受體結(jié)合的物質(zhì)。[23] [22]所述的應(yīng)用，其特征在于IL_6抑制劑為抗IL_6受體抗體。[24] [23]所述的應(yīng)用，其中，抗IL_6受體抗體為嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。[25] IL-6抑制劑，該IL_6抑制劑在治療胰腺癌的方法中使用。[26] IL-6抑制劑，該IL_6抑制劑在用于抑制細(xì)胞的神經(jīng)浸潤(rùn)的方法中使用。[27] [26]所述的IL_6抑制劑，其特征在于抑制癌細(xì)胞的神經(jīng)浸潤(rùn)。[28] [27]所述的IL_6抑制劑，其特征在于抑制胰腺癌細(xì)胞的神經(jīng)浸潤(rùn)。[29] [26] [28]中任一項(xiàng)所述的IL_6抑制劑，其特征在于抑制向中樞側(cè)進(jìn)行的神經(jīng)浸潤(rùn)。[30] [25] [29]中任一項(xiàng)所述的IL-6抑制劑，其特征在于IL_6抑制劑是與 IL-6受體結(jié)合的物質(zhì)。[31] [30]所述的IL-6抑制劑，其特征在于IL_6抑制劑為抗IL-6受體抗體。[32] [31]所述的IL-6抑制劑，其中，抗IL_6受體抗體為嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。


圖1是顯示人胰腺癌細(xì)胞株中IL-6 α受體(IL6R)的mRNA表達(dá)量㈧和IL_6 β 受體(gpl30)的mRNA表達(dá)量(B)的圖。圖2是顯示使用人重組IL-6，測(cè)定IL-6對(duì)人胰腺癌細(xì)胞株的增殖能力、趨化能力、 遷移能力的影響的結(jié)果的圖。A和B 顯示通過(guò)經(jīng)時(shí)性計(jì)測(cè)細(xì)胞數(shù)來(lái)測(cè)定細(xì)胞增殖能力的結(jié)果；C 顯示通過(guò)趨化性分析來(lái)測(cè)定趨化能力的結(jié)果；D 顯示通過(guò)傷口愈合分析來(lái)測(cè)定遷移能力的結(jié)果。圖3是顯示使用人重組IL-6 (rhIL6)，利用蛋白質(zhì)印跡法評(píng)價(jià)IL-6對(duì)人胰腺癌細(xì)胞株Capan-I的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的影響的結(jié)果的圖。A 顯示細(xì)胞內(nèi)磷酸化STAT3蛋白表達(dá)、B 顯示細(xì)胞內(nèi)磷酸化Erkl/2蛋白表達(dá)、C 顯示細(xì)胞內(nèi)磷酸化Akt蛋白表達(dá)。圖4是顯示使用人胰腺癌細(xì)胞株的、小鼠神經(jīng)浸潤(rùn)模型的照片和圖。A 顯示4周后的神經(jīng)浸潤(rùn)肉眼圖像，B 顯示經(jīng)時(shí)性浸潤(rùn)距離的圖，C 顯示4周后的神經(jīng)浸潤(rùn)組織圖像。圖5是顯示在神經(jīng)浸潤(rùn)模型和各種神經(jīng)損傷模型中小鼠IL-6表達(dá)分布的照片和圖。A 顯示神經(jīng)浸潤(rùn)模型圖像，B和C 顯示通過(guò)RT-PCR(B)或熒光免疫染色(C)測(cè)定的、 神經(jīng)浸潤(rùn)模型及其他神經(jīng)損傷模型中的小鼠IL-6表達(dá)量。圖6是顯示在神經(jīng)浸潤(rùn)部分胰腺癌細(xì)胞的磷酸化STAT3蛋白表達(dá)的結(jié)果的圖。圖7是顯示由gpl30擊倒(knockdown)產(chǎn)生的神經(jīng)浸潤(rùn)距離抑制效果的圖。圖8是顯示由IL-6R擊倒產(chǎn)生的神經(jīng)浸潤(rùn)距離抑制效果的圖。 圖9是顯示對(duì)小鼠神經(jīng)浸潤(rùn)模型給予JAK抑制劑AG490或抗IL_6受體抗體對(duì)神經(jīng)浸潤(rùn)的影響的圖。A 顯示給予JAK抑制劑AG490時(shí)的經(jīng)時(shí)性浸潤(rùn)距離的圖。DMSO 顯示對(duì)照組、AG490 顯示AG490給藥組。B 顯示給予抗IL-6受體抗體時(shí)的經(jīng)時(shí)性浸潤(rùn)距離的圖。hlgG 顯示對(duì)照組、MRA 顯示抗IL-6受體抗體給藥組。
具體實(shí)施例方式在本發(fā)明中，“IL-6抑制劑”是指阻斷IL-6的信號(hào)傳遞、抑制IL_6的生物學(xué)活性的物質(zhì)。IL-6抑制劑的具體例子有與IL-6結(jié)合的物質(zhì)、與IL-6受體結(jié)合的物質(zhì)、與gpl30 結(jié)合的物質(zhì)等。作為IL-6抑制劑，可以列舉抑制作為IL-6的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)重要的STAT3磷酸化的物質(zhì)、例如AG490等。對(duì)IL-6抑制劑沒(méi)有特別限定，包括抗IL-6抗體、抗IL-6受體抗體、抗gpl30抗體、IL-6修飾體、可溶性IL-6受體修飾體、IL-6部分肽、IL-6受體部分肽、與上述物質(zhì)顯示出同樣的活性的低分子化合物等。作為IL-6抑制劑的優(yōu)選方案，可以列舉IL_6受體抑制劑、特別是抗IL_6受體抗體。對(duì)本發(fā)明中使用的抗體的來(lái)源沒(méi)有特別限定，但優(yōu)選來(lái)自哺乳動(dòng)物，更優(yōu)選來(lái)源于人的抗體。本發(fā)明中使用的抗體，可以利用公知的方法以多克隆或單克隆抗體的形式得到。 作為本發(fā)明中使用的抗體，特別優(yōu)選來(lái)源于哺乳動(dòng)物的單克隆抗體。來(lái)源于哺乳動(dòng)物的單克隆抗體有由雜交瘤產(chǎn)生的單克隆抗體；以及利用基因工程學(xué)方法，通過(guò)攜帶抗體基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主，在所得宿主中產(chǎn)生的單克隆抗體。通常，該抗體通過(guò)與IL-6、IL體、gpl30等結(jié)合，阻斷向細(xì)胞內(nèi)傳遞IL-6的生物學(xué)活性。產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤基本上可以利用公知技術(shù)，如下操作來(lái)制作。S卩，使用 IL-6受體、IL-6、gpl30等作為致敏抗原，按照通常的免疫方法對(duì)其進(jìn)行免疫，再按照通常的細(xì)胞融合法使所得的免疫細(xì)胞與公知的親本細(xì)胞融合，利用通常的篩選方法篩選產(chǎn)生單克隆抗體的細(xì)胞，從而可以制作雜交瘤。具體而言，制作單克隆抗體時(shí)可以如下進(jìn)行。例如，制作抗IL-6受體抗體時(shí)，被用作用于取得抗體的致敏抗原的人IL-6受體使用歐州專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)EP 325474中公開(kāi)的 IL-6受體基因/氨基酸序列、而小鼠IL-6受體使用日本專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)特開(kāi)平3-155795 中公開(kāi)的IL-6受體基因/氨基酸序列，從而得到抗IL-6受體抗體。IL-6受體蛋白有以下兩種在細(xì)胞膜上表達(dá)的IL-6受體蛋白和從細(xì)胞膜上脫離的 IL-6 受體蛋白(可溶性 IL-6 受體)(Yasukawa, K.等人，J. Biochem. (1990) 108， 673-676)。可溶性IL-6受體實(shí)質(zhì)上由與細(xì)胞膜結(jié)合的IL-6受體的胞外區(qū)構(gòu)成，跨膜區(qū)或跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)缺失，這一點(diǎn)不同于膜結(jié)合型IL-6受體。只要IL-6受體蛋白能夠用作制作本發(fā)明中使用的抗IL-6受體抗體的致敏抗原，可以使用任一種IL-6受體。將IL-6受體的基因序列插入到公知的表達(dá)載體系統(tǒng)中，使適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞轉(zhuǎn)化， 之后按照公知方法從其宿主細(xì)胞中或培養(yǎng)上清中純化目標(biāo)IL-6受體蛋白，可以使用該純化IL-6受體蛋白作為致敏抗原。此外，可以使用表達(dá)IL-6受體的細(xì)胞或IL-6受體蛋白與其他蛋白的融合蛋白作為致敏抗原。同樣，使用IL-6作為用于取得抗體的致敏抗原時(shí)，通過(guò)使用Eur. J. Biochem(1987) 168,543-550、J. Immunol. (1988) 140,1534-1541 或 Agr. Biol. Chem. (1990)54,2685-2688中公開(kāi)的IL-6基因/氨基酸序列，從而得到人IL-6。作為取得抗
7gpl30抗體的致敏抗原，可以使用歐州專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)EP 411946中公開(kāi)的gpl30基因/氨
基酸序列。對(duì)用致敏抗原免疫的哺乳動(dòng)物沒(méi)有特別限定，但優(yōu)選考慮其與用于細(xì)胞融合的親本細(xì)胞的適應(yīng)性后再進(jìn)行選擇，通常使用嚙齒類(lèi)動(dòng)物、例如小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠等。用致敏抗原對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫按照公知方法進(jìn)行。例如，作為一般的方法，通過(guò)向哺乳動(dòng)物的腹腔內(nèi)或皮下注射致敏抗原來(lái)進(jìn)行。具體而言，用PBS (磷酸緩沖鹽)或生理鹽水等稀釋致敏抗原至適當(dāng)量并使之懸浮，根據(jù)需要，向所得懸浮物中適量混合通常的佐劑、例如弗氏完全佐劑，乳化后，優(yōu)選每4 21天對(duì)哺乳動(dòng)物給藥數(shù)次。進(jìn)行致敏抗原免疫時(shí)，可以使用適當(dāng)?shù)妮d體。如此地對(duì)哺乳動(dòng)物進(jìn)行免疫，確認(rèn)血清中所需抗體水平升高后，從哺乳動(dòng)物中采集免疫細(xì)胞用于細(xì)胞融合。作為用于細(xì)胞融合的優(yōu)選的免疫細(xì)胞，特別優(yōu)選使用脾細(xì)胞。作為與上述免疫細(xì)胞融合的另一方的親本細(xì)胞的哺乳動(dòng)物的骨髓瘤細(xì)胞，優(yōu)選使用已公知的各種細(xì)胞株、例如 P3X63Ag8. 653 (Kearney, J. F.等人· J. Immunol. (1979) 123， 1548-1550)、P3X63Ag8U. 1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81, 1-7)、NS-I (Kohler. G.禾口 Mi lstein， C. Eur. J. Immunol. (1976) 6，5 11-5 19)、 MPC-Il (Margulies. D. H.等人，Cell (1976) 8，405-415)、SP2/0 (Shulman，Μ.等人， Nature (1978) 276，269-270)、FO (de St. Groth, S. F.等人，J. Immunol. Methods (1980) 35， 1-21)、S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148,313-323)、R210 (Galfre，G.等人， Nature (1979) 277，131-133)等。上述免疫細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的細(xì)胞融合基本上可以按照公知的方法、例如 Milstein 等人的方法(Kohler. G.和 Milstein，C.，Methods Enzymo 1. (1981) 73，3-46)等來(lái)進(jìn)行。更具體而言，例如在細(xì)胞融合促進(jìn)劑的存在下、在通常的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)液中實(shí)施上述細(xì)胞融合。作為融合促進(jìn)劑，例如使用聚乙二醇(PEG)、仙臺(tái)病毒(HVJ)等，為了進(jìn)一步提高融合效率，根據(jù)需要，還可以添加使用二甲基亞砜等輔助劑。關(guān)于免疫細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞的使用比例，例如優(yōu)選使免疫細(xì)胞為骨髓瘤細(xì)胞的 1 10倍。用于上述細(xì)胞融合的培養(yǎng)液例如可以使用適合上述骨髓瘤細(xì)胞株增殖的 RPMI1640培養(yǎng)液、MEM培養(yǎng)液、以及用于該種細(xì)胞培養(yǎng)的常規(guī)培養(yǎng)液。還可以結(jié)合使用胎牛血清(FCQ等血清補(bǔ)充液。細(xì)胞融合可如下進(jìn)行將規(guī)定量的上述免疫細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞在上述培養(yǎng)液中充分混合，通常再以30 60% (w/v)的濃度添加預(yù)先加熱至37°C左右的PEG溶液、例如平均分子量為1000 6000左右的PEG溶液，混合，從而形成目標(biāo)融合細(xì)胞(雜交瘤)。接著，依次添加適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液，離心以除去上清，重復(fù)進(jìn)行該操作，從而可以除去不利于雜交瘤生長(zhǎng)的細(xì)胞融合劑等。該雜交瘤通過(guò)在常規(guī)選擇培養(yǎng)液、例如HAT培養(yǎng)液(含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷的培養(yǎng)液)中培養(yǎng)而進(jìn)行選擇。為了使目標(biāo)雜交瘤以外的細(xì)胞(非融合細(xì)胞) 死亡，使用該HAT培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)足夠的時(shí)間、通常為數(shù)天 數(shù)周。接著，實(shí)施常規(guī)的極限稀釋法，可以進(jìn)行產(chǎn)生目標(biāo)抗體的雜交瘤的篩選和克隆。除了用抗原對(duì)人以外的動(dòng)物進(jìn)行免疫以得到上述雜交瘤以外，在體外用所需的抗原蛋白或表達(dá)抗原的細(xì)胞致敏人淋巴細(xì)胞，使致敏B淋巴細(xì)胞與人骨髓瘤細(xì)胞例如U266融合，也可以得到與所需的抗原或表達(dá)抗原的細(xì)胞具有結(jié)合活性的所需人抗體(參照日本特公平1-59878)。而且，對(duì)具有完全人抗體基因的所有組成成分(i^pertoire)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物給予抗原或表達(dá)抗原的細(xì)胞，按照上述方法可以獲得所需的人抗體(參照國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào) WO 93/12227,WO 92/03918,WO 94/02602,WO 94/25585,WO 96/34096,WO 96/33735) 如此制作的產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤，可以在常規(guī)培養(yǎng)液中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，還可以在液氮中長(zhǎng)期保存。為了由該雜交瘤獲得單克隆抗體，可以采用以下方法按照常規(guī)方法培養(yǎng)該雜交瘤，以其培養(yǎng)上清的形式得到單克隆抗體的方法；或者，將雜交瘤給予與其具有適合性的哺乳動(dòng)物以使其增殖，以其腹水的形式得到單克隆抗體的方法等。前一種方法適合得到高純度的抗體，而后一種方法適于大量生產(chǎn)抗體。例如，產(chǎn)生抗IL-6受體抗體的雜交瘤的制作可以通過(guò)日本特開(kāi)平3-139293中公開(kāi)的方法來(lái)進(jìn)行?？梢园凑障率龇椒ㄟM(jìn)行將產(chǎn)生PM-I抗體的雜交瘤注入BALB/c小鼠的腹腔內(nèi)得到腹水，從該腹水中純化PM-I抗體的方法；或者，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基、例如含有10% 胎牛血清、5% BM-Condimed Hl (Boehringer Mannheim 制)的 RPMI1640 培養(yǎng)基、雜交瘤 SFM 培養(yǎng)基(GIBC0-BRL制)、PFHM-II培養(yǎng)基(GIBC0-BRL制)等中培養(yǎng)本雜交瘤，從其培養(yǎng)上清中純化PM-I抗體的方法。在本發(fā)明中，作為單克隆抗體，可以使用下述抗體由雜交瘤克隆抗體基因，之后將其插入適當(dāng)?shù)妮d體中，再將其導(dǎo)入宿主中，利用基因重組技術(shù)產(chǎn)生的重組型抗體(例如參照 Borrebaeck C. A. K.禾Π Larrick J. W. THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MCMILLAN PUBLISHERS LTD，1990)。具體而言，從產(chǎn)生目標(biāo)抗體的細(xì)胞、例如雜交瘤中分離編碼抗體可變(V)區(qū)的mRNA。分離mRNA時(shí)，利用公知的方法、例如胍超離心法(Chirgwin，J. Μ.等人， Biochemistry(1979) 18,5294-5299), AGPC ^ (Chomczynski, P.等人，Anal. Biochem. (1987) 162，156-159)等制備總RNA，再使用mRNA純化試劑盒(Pharmacia制)等制備mRNA。 另外，通過(guò)使用QuickPr印mRNA純化試劑盒(Pharmacia制)，可以直接制備mRNA。使用逆轉(zhuǎn)錄酶由所得的mRNA合成抗體V區(qū)的cDNA。cDNA的合成可以使用AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶第一鏈 cDNA 合成試劑盒(AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit)等來(lái)進(jìn)行。進(jìn)行cDNA的合成和增幅時(shí)，可以采用使用5，-Ampli FINDER RACE 試劑盒(Clontech 制)和 PCR 的 5，-RACE 法(Frohman, Μ. A.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1988) 85,8998-9002 ；Belyavsky, Α.等人，Nucleic Acids Res. (1989) 17， 四19-293幻。從所得的PCR產(chǎn)物中純化目標(biāo)DNA片段，將其與載體DNA連接。再由此制作重組載體并導(dǎo)入大腸桿菌等中，選擇菌落，制備所需的重組載體。利用公知的方法、例如脫氧法來(lái)確認(rèn)目標(biāo)DNA的核苷酸序列。得到編碼目標(biāo)抗體V區(qū)的DNA時(shí)，將其與編碼所需抗體恒定區(qū)(C區(qū))的DNA連接， 再將其插入表達(dá)載體中?；蛘撸梢詫⒕幋a抗體V區(qū)的DNA插入含有抗體C區(qū)的DNA的表達(dá)載體中。制備本發(fā)明中使用的抗體時(shí)，按照后述的方式將抗體基因插入表達(dá)載體中，使之在表達(dá)調(diào)節(jié)區(qū)、例如增強(qiáng)子、啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)下表達(dá)。接下來(lái)，利用該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，可以使抗體表達(dá)。在本發(fā)明中，可以使用進(jìn)行人為修飾以降低對(duì)人的異種抗原性等的基因重組型抗體、例如嵌合(Chimeric)抗體、人源化(Humanized)抗體等。這些修飾抗體可以利用已知的方法進(jìn)行制備。關(guān)于嵌合抗體，通過(guò)連接如上操作得到的編碼抗體V區(qū)的DNA和編碼人抗體C區(qū)的DNA，將其插入表達(dá)載體中，再導(dǎo)入宿主中，使產(chǎn)生抗體，從而得到嵌合抗體(參照歐州專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)EP 125023、國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)WO 92-19759)。可以利用該已知方法得到對(duì)本發(fā)明有用的嵌合抗體。人源化抗體也稱(chēng)作重構(gòu)(reshaped)人抗體或人型化抗體，是將人以外的哺乳動(dòng)物、例如小鼠抗體的互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)移植到人抗體的互補(bǔ)性決定區(qū)中而得到的抗體， 其常規(guī)基因重組方法也是已知的(參照歐州專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)EP 125023、國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào) WO 92-19759)。具體而言，利用PCR法由多個(gè)制作成在末端部具有重疊部分的寡核苷酸合成設(shè)計(jì)成連接小鼠抗體的CDR和人抗體的構(gòu)架區(qū)(FR ；framework region)的DNA序列。連接所得的DNA和編碼人抗體C區(qū)的DNA，接著插入到表達(dá)載體中，再將其導(dǎo)入宿主中，使之產(chǎn)生抗體，從而得到人源化抗體(參照歐州專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)EP 239400、國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)WO 92-19759)。經(jīng)由CDR連接的人抗體的FR選擇互補(bǔ)性決定區(qū)形成良好的抗原結(jié)合位點(diǎn)的構(gòu)架區(qū)。根據(jù)需要，可以取代抗體可變區(qū)中的構(gòu)架區(qū)的氨基酸，使重構(gòu)人抗體的互補(bǔ)性決定區(qū)形成適當(dāng)?shù)目乖Y(jié)合位點(diǎn)(Sato, K.等人，Cancer Res. (1993)53,851-856)。嵌合抗體、人源化抗體中通常使用人抗體C區(qū)。人抗體重鏈C區(qū)的例子有CY等， 例如可以使用Cy1、CY2、CY3或CY4。人抗體輕鏈C區(qū)的例子有例如κ或λ。另夕卜， 為了改善抗體或其產(chǎn)生的穩(wěn)定性，可以對(duì)人抗體C區(qū)進(jìn)行修飾。嵌合抗體由來(lái)自人以外的哺乳動(dòng)物的抗體的可變區(qū)和來(lái)自人抗體的C區(qū)構(gòu)成，而人源化抗體由來(lái)自人以外的哺乳動(dòng)物的抗體的互補(bǔ)性決定區(qū)和來(lái)自人抗體的構(gòu)架區(qū)和C 區(qū)構(gòu)成，由于這些抗體在人體內(nèi)的抗原性降低，所以作為用作藥品的抗體是有效的。本發(fā)明所使用的人源化抗體的優(yōu)選的具體例子有人源化PM-I抗體(參照國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)WO 92-19759)。作為獲得人抗體的方法，除之前闡述的方法外，還已知使用人抗體文庫(kù)，通過(guò)淘選獲得人抗體的技術(shù)。例如，還可以利用噬菌體展示法使人抗體的可變區(qū)作為單鏈抗體 (scFv)在噬菌體表面表達(dá)，然后可以選擇與抗原結(jié)合的噬菌體。分析所選擇的噬菌體的基因時(shí)，可以確定編碼與抗原結(jié)合的人抗體可變區(qū)的DNA序列。明確了與抗原結(jié)合的scFv 的DNA序列后，制作包含該序列的適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，可以獲得人抗體。這些方法已經(jīng)眾所周知，可以參考 WO 92/01047、WO 92/20791、WO 93/06213、WO 93/11236、WO 93/19172、WO 95/01438、WO 95/15388。按照上述方式構(gòu)建的抗體基因，可以利用公知的方法使之表達(dá)。使用哺乳類(lèi)細(xì)胞時(shí)，可以利用使常用的有用啟動(dòng)子、所要表達(dá)的抗體基因及其3’側(cè)下游的poly A信號(hào)功能性結(jié)合的DNA或含有該DNA的載體使之表達(dá)。例如，作為啟動(dòng)子/增強(qiáng)子，可以列舉人巨細(xì)胞病毒前期啟動(dòng)子 / 增強(qiáng)子(human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer)。除此之外，作為本發(fā)明中使用的、可用于抗體表達(dá)的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子，可以使用逆轉(zhuǎn)錄病毒、多瘤病毒、腺病毒、猿猴病毒40(SV40)等病毒啟動(dòng)子/增強(qiáng)子或人延伸因子 la (HEFla)等來(lái)自哺乳類(lèi)細(xì)胞的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子。例如，當(dāng)使用SV40啟動(dòng)子/增強(qiáng)子時(shí)，按照Mulligan等人的方法(Mulligan, R. C.等人，Nature (1979) 277，108-114)可以容易地實(shí)施；而當(dāng)使用HEFla啟動(dòng)子/增強(qiáng)子時(shí)，按照 Mizushima 等人的方法(Mizushima, S.和 Nagata，S. Nucleic Acids Res. (1990) 18,5322)可以容易地實(shí)施。使用原核細(xì)胞作為宿主時(shí)，有使用細(xì)菌細(xì)胞的產(chǎn)生系統(tǒng)。作為細(xì)菌細(xì)胞，已知有大腸桿菌(E. coli)、枯草桿菌。當(dāng)為大腸桿菌時(shí)，可以使常用的有用啟動(dòng)子、用于抗體分泌的信號(hào)序列、所要表達(dá)的抗體基因功能性結(jié)合而使之表達(dá)。例如，啟動(dòng)子的例子有l(wèi)acZ啟動(dòng)子、araB啟動(dòng)子。使用IacZ啟動(dòng)子時(shí)，可以按照Ward等人的方法(Ward，E. S.等人，Nature (1989) 341， 544-546 ；Ward，Ε. S.等人· FASEB J. (1992)6,2422-2427)進(jìn)行；使用 araB 啟動(dòng)子時(shí)，可以按照 Better 等人的方法(Better, Μ.等人· Science (1988) 240，1041-1043)進(jìn)行。作為用于抗體分泌的信號(hào)序列，當(dāng)其在大腸桿菌的周質(zhì)中產(chǎn)生時(shí)，可以使用pelB 信號(hào)序列(Lei, S. P.等人J.Bacteriol. (1987) 169，4379-4383)。分離周質(zhì)中產(chǎn)生的抗體后，適當(dāng)?shù)刂卣郫B(refold)抗體的構(gòu)造后使用(例如參照WO 96/30394)。作為復(fù)制起點(diǎn)，可以使用來(lái)自SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳頭瘤病毒(BPV)等的復(fù)制起點(diǎn)。并且，為了在宿主細(xì)胞體系中擴(kuò)增基因拷貝數(shù)，表達(dá)載體中可以包含氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)基因、胸腺嘧啶核苷激酶(TK)基因、大腸桿菌黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Ecogpt)基因、二氫葉酸還原酶(dhfr)基因等作為選擇標(biāo)志物?？梢允褂萌我獾漠a(chǎn)生系統(tǒng)以制備本發(fā)明中使用的抗體。用于制備抗體的產(chǎn)生系統(tǒng)有體外(in vitro)和體內(nèi)(in vivo)產(chǎn)生系統(tǒng)。體外產(chǎn)生系統(tǒng)的例子有使用真核細(xì)胞的產(chǎn)生系統(tǒng)和使用原核細(xì)胞的產(chǎn)生系統(tǒng)。使用真核細(xì)胞作為宿主時(shí)，有使用動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞或真菌細(xì)胞的產(chǎn)生系統(tǒng)。作為動(dòng)物細(xì)胞，已知有(1)哺乳類(lèi)細(xì)胞、例如CH0、COS、骨髓瘤、BHK(幼倉(cāng)鼠腎)、HeLa、Vero 等；(2)兩棲類(lèi)細(xì)胞、例如非洲爪蟾卵母細(xì)胞(Xenopus oocytes)；或(3)昆蟲(chóng)細(xì)胞、例如 sf9、sf21、Tn5等。作為植物細(xì)胞，已知有來(lái)源于煙草(Nicotiana tabacum)的細(xì)胞，可以對(duì)其進(jìn)行愈傷組織培養(yǎng)。作為真菌細(xì)胞，已知有酵母，例如酵母菌(Saccharomyces)屬(例如啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))；以及絲狀菌，例如曲霄屬(Aspergillus)(例如黑曲霉(Aspergillus niger)等)。通過(guò)轉(zhuǎn)化將目標(biāo)抗體基因?qū)脒@些細(xì)胞中，之后在體外培養(yǎng)所轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，從而得到抗體?？梢园凑展椒ㄟM(jìn)行培養(yǎng)。例如，可以使用DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM作為培養(yǎng)液，還可以結(jié)合使用胎牛血清(FCQ等血清補(bǔ)充液。此外，通過(guò)將導(dǎo)入有抗體基因的細(xì)胞移入動(dòng)物的腹腔等中，可以在體內(nèi)產(chǎn)生抗體。另一方面，作為體內(nèi)的產(chǎn)生系統(tǒng)，可以列舉使用動(dòng)物的產(chǎn)生系統(tǒng)或使用植物的產(chǎn)生系統(tǒng)。使用動(dòng)物時(shí)，有使用哺乳類(lèi)動(dòng)物、昆蟲(chóng)的產(chǎn)生系統(tǒng)等。作為哺乳類(lèi)動(dòng)物，可以使用山羊、豬、綿羊、小鼠、牛等(Vicki Glaser, SPECTRUMBiotechnology Applications，1993)。作為昆蟲(chóng)，可以使用蠶。使用植物時(shí)，例如可以使用煙草。向這些動(dòng)物或植物中導(dǎo)入抗體基因，使在動(dòng)物或植物的體內(nèi)產(chǎn)生抗體并回收。例如，將抗體基因插入編碼山羊β-酪素這樣的乳汁中固有產(chǎn)生的蛋白的基因的中途，以融合基因的形式進(jìn)行制備。再將攜帶插入有抗體基因的融合基因的DNA片段注入到山羊胚胎(embryo)中，將該胚胎導(dǎo)入雌山羊體內(nèi)。接受了胚胎的山羊生出轉(zhuǎn)基因山羊，從該轉(zhuǎn)基因山羊或其后代產(chǎn)生的乳汁中可以得到所需抗體。為了使轉(zhuǎn)基因山羊產(chǎn)生的含有所需抗體的乳汁量增加，可以對(duì)轉(zhuǎn)基因山羊使用適當(dāng)?shù)募に?bert，K. Μ.等人，Bio/ Technology(1994) 12，699-702)。使用蠶時(shí)，使蠶感染插入有目標(biāo)抗體基因的桿狀病毒，從該蠶的體液中得到所需抗體(Maeda，S.等人，Nature (1985) 315，592-594)。并且，使用煙草時(shí)，將目標(biāo)抗體基因插入到植物表達(dá)用載體例如PM0N530中，再將該載體導(dǎo)入到根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)這樣的細(xì)菌中。用該細(xì)菌感染煙草例如煙草(Nicotiana tabacum)，從該煙草的葉中得到所需抗體(Julian, K. -C. Ma 等人，Eur. J. Immunol. (1994) 24，131-138)。按照上述方式利用體外或體內(nèi)的產(chǎn)生系統(tǒng)產(chǎn)生抗體時(shí)，可以將編碼抗體重鏈(H 鏈)或輕鏈(L鏈)的DNA分別插入表達(dá)載體中，同時(shí)轉(zhuǎn)化宿主；或者，可以將編碼H鏈和L 鏈的DNA插入單一的表達(dá)載體中，用于轉(zhuǎn)化宿主(參照國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)WO 94-11523)。本發(fā)明中使用的抗體，只要能夠適用于本發(fā)明，可以是抗體的片段或其修飾物。例如，作為抗體片段，可以列舉Fab、F(ab’ )2,Fv或用適當(dāng)?shù)慕宇^連接H鏈和L鏈的Fv而形成的單鏈Fv(scFv)。具體而言，用酶例如木瓜蛋白酶、胃蛋白酶處理抗體而生成抗體片段，或者，構(gòu)建編碼這些抗體片段的基因，將其導(dǎo)入表達(dá)載體中，之后使之在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中表達(dá)(例如參照 Co, M. S.等人，J. Immunol. (1994) 152,2968-2976 ；Better, Μ. &Horwitz, Α. H. Methods in Enzymology(1989) 178，476-496 ；Plueckthun, A. &Skerra，Α. Methods in Enzymology(1989) 178,497-515 ；Lamoyi, Ε. , Methods in Enzymology(1989) 121, 652-663 ；Rousseaux, J. 入，Methods in Enzymology (1989) 121,663-66 ；Bird, R. Ε.等人，TIBTECH(1991)9,132-137)。scFv可以通過(guò)連接抗體的H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)而得到。在該scFv中，H鏈V 區(qū)和L鏈V區(qū)經(jīng)由接頭、優(yōu)選肽接頭來(lái)連接(Huston, J. S.等人、Proc. Natl. Acad. ki. U. S. Α. (1988)85,5879-5883)。scFv中的H鏈V區(qū)和L鏈V區(qū)可以來(lái)自作為上述抗體而記載的任一種抗體。作為連接V區(qū)的肽接頭，例如使用包含12-19個(gè)氨基酸殘基的任意的單鏈肽。以編碼上述抗體的H鏈或H鏈V區(qū)的DNA、以及編碼L鏈或L鏈V區(qū)的DNA為模板，使用引物對(duì)通過(guò)PCR法擴(kuò)增編碼這些序列中的所需氨基酸序列的DNA部分，所述引物對(duì)規(guī)定該DNA部分的兩端，然后，將編碼肽接頭部分的DNA和規(guī)定其兩端與各H鏈、L鏈連接的引物對(duì)組合起來(lái)，進(jìn)一步進(jìn)行擴(kuò)增，從而得到編碼scFv的DNA。一旦制作了編碼scFv的DNA，就可以按照常規(guī)方法得到含有這些DNA的表達(dá)載體和通過(guò)該表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主，還可以使用該宿主，按照常規(guī)方法得到scFv。關(guān)于這些抗體的片段，可以進(jìn)行與上述相同的操作，獲得其基因并使之表達(dá)，利用宿主產(chǎn)生這些抗體的片段。本發(fā)明中所說(shuō)的“抗體”還包含這些抗體的片段。作為抗體的修飾物，還可以使用與聚乙二醇(PEG)等各種分子結(jié)合的抗體。本發(fā)明中所說(shuō)的“抗體”還包含這些抗體修飾物。為了得到這樣的抗體修飾物，可以通過(guò)對(duì)所得抗體施行化學(xué)修飾而得到。這些方法在該領(lǐng)域已經(jīng)確立。按照上述方式產(chǎn)生、表達(dá)的抗體可以從細(xì)胞內(nèi)外、宿主中分離出來(lái)，并純化至均勻。本發(fā)明中使用的抗體的分離、純化可以通過(guò)親和層析來(lái)進(jìn)行。作為親和層析中使用的柱，例如有蛋白A柱、蛋白G柱。作為蛋白A柱中使用的載體，例如有HyperD、POROS, SepharoseF. F.等。此外，可以使用普通蛋白中使用的分離、純化方法，對(duì)其沒(méi)有任何限定。例如，可以適當(dāng)選擇、組合上述親和層析以外的層析、濾器、超濾、鹽析、透析等來(lái)分離、純化本發(fā)明中使用的抗體。作為層析，例如有離子交換層析、疏水層析、凝膠過(guò)濾等。 這些層析可適用于HPLC(高效液相色譜法)。此外，可以使用反相HPLC(reverse phase HPLC)。上述所得抗體的濃度測(cè)定可以通過(guò)吸光度的測(cè)定或ELISA等來(lái)進(jìn)行。S卩，通過(guò)測(cè)定吸光度來(lái)測(cè)定抗體濃度時(shí)，用PBS(-)進(jìn)行適當(dāng)稀釋后，測(cè)定280nm的吸光度，以lmg/ml 作為1.350D，算出抗體濃度。通過(guò)ELISA來(lái)測(cè)定抗體濃度時(shí)，可如下測(cè)定。S卩，向96孔板 (Nunc制)中加入100 μ 1用0. IM的碳酸氫鹽緩沖液(ρΗ9· 6)稀釋至1 μ g/ml的山羊抗人 IgG(TAG制)，在4°C下培養(yǎng)一夜，將抗體固化。封閉后，添加100μ 1已適當(dāng)稀釋的本發(fā)明中使用的抗體或含有抗體的樣品、或作為標(biāo)準(zhǔn)品的人IgG(CAPPEL制)，在室溫下培養(yǎng)1小時(shí)。清洗后，加入100μ 1經(jīng)5000倍稀釋的堿性磷酸酶標(biāo)記抗人IgG (BIO SOURCE制)， 在室溫下培養(yǎng)1小時(shí)。清洗后，加入底物溶液進(jìn)行培養(yǎng)，之后使用MICR0PLATE READER Model 3550(Bio-Rad制)測(cè)定405nm的吸光度，算出目標(biāo)抗體的濃度。對(duì)抗IL-6抗體的具體例子沒(méi)有特別限定，可以列舉MH166 (Matsuda，Τ.等人， Eur. J. Immunol. (1998) 18，951-956)或SK2抗體(Sato K等人，第21回日本免疫學(xué)會(huì)総會(huì) (第21次日本免疫學(xué)會(huì)總會(huì))、學(xué)術(shù)記錄(1991)21,166)等。對(duì)抗IL-6受體抗體的具體例子沒(méi)有特別限定，可以列舉MR16_1抗體(Tamura， Τ.等人.Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90，11924-11928)、PM-I 抗體(Hirata，Y.等人， J. Immunol. (1989) 143，2900-2906)、AUK12-20 抗體、AUK64-7 抗體或 AUK146-15 抗體(國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)WO 92-19759)等。其中，作為對(duì)抗人IL-6受體的優(yōu)選的單克隆抗體， 可以例示PM-I抗體，而作為對(duì)抗小鼠IL-6受體的優(yōu)選的單克隆抗體，可以列舉MR16-1抗體，但并不限于此。作為人源化抗IL-6受體抗體的優(yōu)選的例子，可以列舉人源化PM-I抗體 (Tocilizumab、MRA)。人源化抗IL-6受體抗體的其他優(yōu)選的例子有W0 2009/041621中記載的抗體。并且，作為抗IL-6受體抗體的其他優(yōu)選方案，可以列舉與人源化PM-I抗體 (Tocilizumab,MRA)所識(shí)別的表位識(shí)別相同表位的抗IL-6受體抗體。對(duì)于抗gpl30抗體的具體例子沒(méi)有特別限定，可以列舉AM64抗體(日本公開(kāi)公報(bào)日本特開(kāi)平3-219894)、4B11抗體、2H4抗體(美國(guó)專(zhuān)利公報(bào)US5571513)、B_P8抗體(日本公開(kāi)公報(bào)日本特開(kāi)平8491199)等。本發(fā)明中使用的IL-6修飾體是與IL-6受體具有結(jié)合活性、且不傳遞IL_6的生物學(xué)活性的物質(zhì)。即，雖然IL-6修飾體和IL-6競(jìng)爭(zhēng)與IL-6受體結(jié)合，但由于IL-6修飾體不傳遞IL-6的生物學(xué)活性，所以其阻斷由IL-6介導(dǎo)的信號(hào)傳遞。
通過(guò)取代IL-6的氨基酸序列的氨基酸殘基來(lái)導(dǎo)入突變，制作IL-6修飾體。用作 IL-6修飾體的基礎(chǔ)的IL-6，雖然對(duì)其來(lái)源沒(méi)有限定，但考慮到抗原性等，優(yōu)選為人IL-6。 具體而言，使用公知的分子模型程序、例如WHATIF (Vriend等人，J. Mol. Graphics (1990)8, 52-56)預(yù)測(cè)IL-6的氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)，再評(píng)價(jià)被取代的氨基酸殘基對(duì)整體的影響，由此進(jìn)行氨基酸取代。確定了適當(dāng)?shù)娜〈被釟埢?，以包含編碼人IL-6基因的核苷酸序列的載體為模板，利用通常進(jìn)行的PCR法導(dǎo)入突變，使氨基酸被取代，從而得到編碼IL-6修飾體的基因。根據(jù)需要，將該基因插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中，按照上述重組型抗體的表達(dá)、產(chǎn)生及純化方法，可以得到IL-6修飾體。IL-6 修飾體的具體例子有Brakenhoff 等人，J. Biol. Chem. (1994)269,86-93 和 Savino 等人，EMBO J. (1994) 13，1357-1367、WO 96-18648、WO 96-17869 中公開(kāi)的 IL-6 修飾體。IL-6受體部分肽是包含在IL-6受體的氨基酸序列中與IL_6和IL_6受體的結(jié)合相關(guān)的區(qū)的一部分或全部的氨基酸序列的肽。這樣的肽通常包含10 80個(gè)、優(yōu)選20 50 個(gè)、更優(yōu)選20 40個(gè)氨基酸殘基。在IL-6受體的氨基酸序列中，特定與IL-6和IL_6受體的結(jié)合相關(guān)的區(qū)，根據(jù)該特定的區(qū)的一部分或全部的氨基酸序列，利用通常已知的方法、例如基因工程學(xué)方法或肽合成法，可以制作IL-6受體部分肽。利用基因工程學(xué)方法制作IL-6受體部分肽時(shí)，將編碼所期望的肽的DNA序列插入表達(dá)載體中，按照上述重組型抗體的表達(dá)、產(chǎn)生及純化方法可以得到IL-6受體部分肽。利用肽合成法制作IL-6受體部分肽時(shí)，可以采用肽合成中通常使用的方法、例如固相合成法或液相合成法。具體而言，可以按照“続醫(yī)薬品O開(kāi)発第14卷《/f K合成(續(xù)醫(yī)藥品的開(kāi)發(fā)第 14卷肽合成)”監(jiān)修矢島治明廣川書(shū)店1991年中記載的方法來(lái)進(jìn)行。作為固相合成法，采用以下方法例如使欲合成的肽的C末端所對(duì)應(yīng)的氨基酸與不溶于有機(jī)溶劑的支撐體結(jié)合， 交替重復(fù)進(jìn)行使α-氨基和側(cè)鏈官能團(tuán)用適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)基保護(hù)起來(lái)的氨基酸按照C末端一N 末端方向依次縮合每1個(gè)氨基酸的反應(yīng)、以及使樹(shù)脂上結(jié)合的氨基酸或肽的α -氨基的該保護(hù)基脫離的反應(yīng)，從而使肽鏈伸長(zhǎng)。根據(jù)所用保護(hù)基的種類(lèi)，固相肽合成法大致分為Boc 法禾口 Fmoc法。如此操作合成目標(biāo)肽后，進(jìn)行脫保護(hù)反應(yīng)和從支撐體上切斷肽鏈的反應(yīng)。在肽鏈的切斷反應(yīng)中，采用Boc法時(shí)，可以使用氟化氫或三氟甲磺酸；采用Fmoc法時(shí)，通?？梢允褂肨FA。在Boc法中，例如在氟化氫中、在茴香醚存在下處理上述保護(hù)肽樹(shù)脂。然后，進(jìn)行保護(hù)基的脫離和從支撐體上切斷肽鏈，回收肽。將其冷凍干燥，從而得到粗肽。而在Fmoc法中，例如可以在TFA中、按照與上述相同的操作進(jìn)行脫保護(hù)反應(yīng)和從支撐體上切斷肽鏈的反應(yīng)。通過(guò)將得到的粗肽應(yīng)用于HPLC，可以分離、純化。洗脫時(shí)，可以使用蛋白純化中通常使用的水-乙腈系溶劑，在最佳條件下進(jìn)行洗脫。分離收集得到的色譜圖的峰所對(duì)應(yīng)的組分，將其冷凍干燥。對(duì)如此純化的肽組分通過(guò)利用光譜分析進(jìn)行的分子量解析、氨基酸組成分析或氨基酸序列解析等進(jìn)行鑒定。本發(fā)明的IL-6抑制劑可用于神經(jīng)浸潤(rùn)的抑制。在本發(fā)明中，“神經(jīng)浸潤(rùn)”是指癌細(xì)胞及其他細(xì)胞侵入神經(jīng)組織中生長(zhǎng)的方式，有時(shí)還伴有組織破壞(破壞性生長(zhǎng))等。本發(fā)明中，作為優(yōu)選的神經(jīng)浸潤(rùn)，可以列舉癌細(xì)胞的神經(jīng)浸潤(rùn)。抑制癌細(xì)胞的浸潤(rùn)時(shí)，對(duì)作為對(duì)象的癌癥種類(lèi)沒(méi)有特別限定，可以是胰腺癌、胃癌、前列腺癌、頭頸部癌、乳癌、肺癌、大腸癌、卵巢癌等任何癌癥種類(lèi)，但優(yōu)選抑制胰腺癌細(xì)胞的浸潤(rùn)。神經(jīng)浸潤(rùn)的抑制可以是抑制向末梢側(cè)進(jìn)行的神經(jīng)浸潤(rùn)，也可以是抑制向中樞側(cè)進(jìn)行的神經(jīng)浸潤(rùn)，但由于胰腺癌細(xì)胞存在對(duì)中樞側(cè)進(jìn)行神經(jīng)浸潤(rùn)的趨勢(shì)，所以?xún)?yōu)選抑制向中樞側(cè)進(jìn)行的神經(jīng)浸潤(rùn)(例如，從神經(jīng)損傷部位向中樞側(cè)進(jìn)行的神經(jīng)浸潤(rùn))。本發(fā)明中，“神經(jīng)浸潤(rùn)的抑制”是指抑制神經(jīng)浸潤(rùn)的發(fā)生、降低神經(jīng)浸潤(rùn)的發(fā)生率、 縮短神經(jīng)浸潤(rùn)距離、延緩神經(jīng)浸潤(rùn)速度等。通過(guò)利用本發(fā)明的IL-6抑制劑抑制神經(jīng)浸潤(rùn)，可以治療、抑制神經(jīng)浸潤(rùn)所伴隨的各種癥狀(例如癌癥性疼痛等疼痛、貧血、體力狀態(tài)(PQ下降、營(yíng)養(yǎng)不良等)。因此，本發(fā)明還包括含有IL-6抑制劑的神經(jīng)浸潤(rùn)所伴隨的各種癥狀的治療藥、抑制劑。本發(fā)明的胰腺癌治療藥可以在胰腺癌的治療和/或預(yù)防中使用。本發(fā)明中，“胰腺癌治療”是指抑制胰腺癌的發(fā)生、降低胰腺癌的發(fā)生率、抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖、縮小胰腺癌組織、改善胰腺癌的癥狀、抑制胰腺癌的轉(zhuǎn)移等。本發(fā)明中使用的IL-6抑制劑的效果例如可以以信號(hào)傳遞抑制活性為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，但并不限于此。IL-6抑制劑的信號(hào)傳遞抑制活性可以利用通常使用的方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。 具體而言，培養(yǎng)IL-6依賴(lài)性人骨髓瘤株(S6B45，KPMM2)、人Lennert T淋巴瘤細(xì)胞株KT3或 IL-6依賴(lài)性細(xì)胞MH60. BSF2,向其中添加IL-6，同時(shí)共存IL-6抑制劑，由此可以測(cè)定IL-6 依賴(lài)性細(xì)胞的3H-胸腺嘧啶核苷攝入。另外，培養(yǎng)作為IL-6受體表達(dá)細(xì)胞的U266，并添加 125I標(biāo)記IL-6，同時(shí)加入IL-6抑制劑，由此測(cè)定與IL-6受體表達(dá)細(xì)胞結(jié)合的125I標(biāo)記IL-6。 在上述測(cè)定系統(tǒng)中，除存在IL-6抑制劑的組以外，還設(shè)置不含IL-6抑制劑的陰性對(duì)照組， 比較兩者所得的結(jié)果，可以評(píng)價(jià)IL-6抑制劑的IL-6抑制活性。本發(fā)明的治療藥或抑制劑的給藥對(duì)象為哺乳動(dòng)物。哺乳動(dòng)物優(yōu)選為人。本發(fā)明的治療藥或抑制劑可以以藥品形式進(jìn)行給藥，可以通過(guò)口服或胃腸外進(jìn)行全身或局部給藥。例如，可以選擇點(diǎn)滴等靜脈內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射、腹腔內(nèi)注射、皮下注射、 栓劑、灌腸劑、口服性腸溶劑等，根據(jù)患者的年齡、癥狀來(lái)選擇適當(dāng)?shù)慕o藥方法。有效給藥量可以在每次、每Ikg體重0. Olmg IOOmg的范圍內(nèi)選擇?；蛘?，可以選擇每名患者1 lOOOmg、優(yōu)選5 50mg的給藥量。關(guān)于優(yōu)選的給藥量、給藥方法，例如當(dāng)為抗IL-6受體抗體時(shí)，血中存在的游離抗體的程度的量為有效給藥量，具體例子有下述方法每Ikg體重、1 個(gè)月G周)給予0. 5mg 40mg、優(yōu)選Img 20mg，分1次 數(shù)次、例如按照2次/周、1次 /周、1次/2周、1次/4周等給藥時(shí)間表，通過(guò)點(diǎn)滴等靜脈內(nèi)注射、皮下注射等方法進(jìn)行給藥等。還可以邊觀察患者的狀態(tài)和血液檢查值的動(dòng)向，邊由2次/周或1次/周延長(zhǎng)給藥間隔至1次/2周、1次/3周、1次/4周等，以調(diào)整給藥時(shí)間表。在本發(fā)明的治療藥或抑制劑中，可以添加保存劑或穩(wěn)定劑等制劑上可接受的載體。制劑上可接受的載體是指可以與上述藥物一同給藥的材料。作為制劑上可接受的材料，可以列舉例如滅菌水或生理鹽水、穩(wěn)定劑、賦形劑、緩沖劑、防腐劑、表面活性劑、螯合劑(EDTA等)、粘合劑等。本發(fā)明中，作為表面活性劑，可以列舉非離子表面活性劑，典型例子有例如脫水山梨糖醇單辛酸酯、脫水山梨糖醇單月桂酸酯、脫水山梨糖醇單棕櫚酸酯等脫水山梨糖醇脂肪酸酯；單辛酸甘油酯、單肉豆蔻酸甘油酯、單硬脂酸甘油酯等脂肪酸甘油酯；單硬脂酸十聚甘油酯、二硬脂酸十聚甘油酯、單亞油酸十聚甘油酯等脂肪酸聚甘油酯；聚氧乙烯脫水山梨糖醇單月桂酸酯、聚氧乙烯脫水山梨糖醇單油酸酯、聚氧乙烯脫水山梨糖醇單硬脂酸酯、聚氧乙烯脫水山梨糖醇單棕櫚酸酯、聚氧乙烯脫水山梨糖醇三油酸酯、聚氧乙烯脫水山梨糖醇三硬脂酸酯等聚氧乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯；聚氧乙烯山梨糖醇四硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇四油酸酯等聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯；聚氧乙烯甘油單硬脂酸酯等聚氧乙烯甘油脂肪酸酯；聚乙二醇二硬脂酸酯等聚乙二醇脂肪酸酯；聚氧乙烯月桂醚等聚氧乙烯烷基醚；聚氧乙烯聚氧丙烯二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯丙醚、聚氧乙烯聚氧丙烯鯨蠟醚等聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚；聚氧乙烯壬基苯基醚等聚氧乙烯烷基苯基醚；聚氧乙烯蓖麻油、 聚氧乙烯硬化蓖麻油(聚氧乙烯氫化蓖麻油)等聚氧乙烯硬化蓖麻油；聚氧乙烯山梨糖醇蜂蠟等聚氧乙烯蜂蠟衍生物；聚氧乙烯羊毛脂等聚氧乙烯羊毛脂衍生物；聚氧乙烯硬脂酸酰胺等聚氧乙烯脂肪酸酰胺等具有HLB 6 18的非離子表面活性劑等。作為表面活性劑，還可以列舉陰離子表面活性劑，典型例子有例如十六烷基硫酸鈉、十二烷基硫酸鈉、油烯基硫酸鈉等具有碳原子數(shù)為10 18的烷基的烷基硫酸鹽；聚氧乙烯十二烷基硫酸鈉等氧化乙烯的平均加成摩爾數(shù)為2 4、烷基的碳原子數(shù)為10 18的聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽；月桂基磺基琥珀酸酯鈉等烷基的碳原子數(shù)為8 18的烷基磺基琥珀酸酯鹽；天然類(lèi)的表面活性劑、例如卵磷脂、甘油磷脂；神經(jīng)鞘磷脂等鞘磷脂；碳原子數(shù)為12 18的脂肪酸的蔗糖脂肪酸酯等。在本發(fā)明的藥物中，可以組合添加1種或2種以上的上述表面活性劑。本發(fā)明的制劑中使用的優(yōu)選的表面活性劑為聚山梨酯(Polysorbate) 20、40、60或80等聚氧乙烯脫水山梨糖醇脂肪酸酯，特別優(yōu)選聚山梨酯20和80。此外，還優(yōu)選泊洛沙姆(poloxamer) (Pluronic F_68 (注冊(cè)商標(biāo))等)所代表的聚氧乙烯聚氧丙烯二醇。表面活性劑的添加量根據(jù)所用表面活性劑的種類(lèi)而不同，當(dāng)為聚山梨酯20或聚山梨酯80時(shí)，其添加量通常為0. 001 100mg/mL，優(yōu)選為0. 003 50mg/mL，進(jìn)一步優(yōu)選為 0.005 2mg/mL。在本發(fā)明中，作為緩沖劑，可以列舉磷酸、枸櫞酸緩沖液、乙酸、蘋(píng)果酸、酒石酸、 琥珀酸、乳酸、磷酸鉀、葡萄糖酸、癸酸、脫氧膽酸、水楊酸、三乙醇胺、富馬酸等、其他有機(jī)酸等、或碳酸緩沖液、Tris緩沖液、組氨酸緩沖液、咪唑緩沖液等。通過(guò)將本發(fā)明的藥物溶解于溶液制劑領(lǐng)域中公知的水性緩沖液中，可以制備溶液制劑。緩沖液的濃度通常為1 500mM，優(yōu)選為5 IOOmM,進(jìn)一步優(yōu)選為10 20mM。本發(fā)明的藥物可以含有其他低分子量的多肽、血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白等蛋白、氨基酸、多糖和單糖等糖類(lèi)或碳水化合物、糖醇。在本發(fā)明中，作為氨基酸，可以列舉堿性氨基酸、例如精氨酸、賴(lài)氨酸、組氨酸、鳥(niǎo)氨酸等、或這些氨基酸的無(wú)機(jī)鹽(優(yōu)選鹽酸鹽、磷酸鹽的形式、即磷酸氨基酸)。使用游離氨基酸時(shí)，優(yōu)選的PH值通過(guò)添加適當(dāng)?shù)纳砩峡山邮艿木彌_物質(zhì)、例如無(wú)機(jī)酸、特別是鹽酸、 磷酸、硫酸、乙酸、甲酸或它們的鹽來(lái)調(diào)節(jié)。此時(shí)，使用磷酸鹽可以得到特別穩(wěn)定的冷凍干燥物，因此特別有利。制備物中實(shí)質(zhì)上不含有機(jī)酸、例如蘋(píng)果酸、酒石酸、枸櫞酸、琥珀酸、富馬酸等時(shí)或不存在對(duì)應(yīng)的陰離子(蘋(píng)果酸離子、酒石酸離子、枸櫞酸離子、琥珀酸離子、富馬酸離子等)時(shí)，特別有利。優(yōu)選的氨基酸為精氨酸、賴(lài)氨酸、組氨酸或鳥(niǎo)氨酸。并且，還可以使用酸性氨基酸、例如谷氨酸和天冬氨酸、及其鹽的形式(優(yōu)選鈉鹽)；或中性氨基酸、例如異亮氨酸、亮氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸或丙氨酸；或芳族氨基酸、例如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、或衍生物的N-乙酰色氨酸。本發(fā)明中，作為多糖和單糖等糖類(lèi)或碳水化合物，可以列舉例如葡聚糖、葡萄糖、 果糖、乳糖、木糖、甘露糖、麥芽糖、蔗糖、海藻糖、蜜三糖等。本發(fā)明中，作為糖醇，可以列舉例如甘露醇、山梨醇、肌醇等。將本發(fā)明的藥物制成注射用水溶液時(shí)，可以將其與例如生理鹽水、含葡萄糖或其他輔助藥(例如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化鈉)的等滲溶液混合。該水溶液還可以與適當(dāng)?shù)闹軇?例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇、PEG等)、非離子性表面活性劑 (聚山梨酯80、HC0-50)等)結(jié)合使用。根據(jù)需要，可以進(jìn)一步含有稀釋劑、助溶劑、pH調(diào)節(jié)劑、緩解劑(soothing agent)、 含硫還原劑、抗氧劑等。本發(fā)明中，作為含硫還原劑，可以列舉例如N-乙酰半胱氨酸、N-乙酰高半胱氨酸、硫辛酸、硫二甘醇、硫代乙醇胺、硫代甘油、硫代山梨醇、巰基乙酸及其鹽、硫代硫酸鈉、 谷胱甘肽、以及碳原子數(shù)為1 7的硫代鏈烷酸等具有巰基的含硫還原劑等。本發(fā)明中，作為抗氧劑，可以列舉例如異抗壞血酸、二丁基羥基甲苯、丁基羥基茴香醚、α -生育酚、醋酸生育酚、L-抗壞血酸及其鹽、L-抗壞血酸棕櫚酸酯、L-抗壞血酸硬脂酸酯、亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉、沒(méi)食子酸三戊酯、沒(méi)食子酸丙酯或乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)、 焦磷酸鈉、偏磷酸鈉等螯合劑。根據(jù)需要，還可以將藥物封入微囊(羥甲基纖維素、明膠、聚[甲基丙烯酸甲酯]等的微囊)中，或者制成膠體藥物傳遞系統(tǒng)(脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳、納米顆粒和納米囊等)(參照 “Remington，s Pharmaceutical Science 16th edition”，Oslo Ed., 1980等)。并且，將藥物制成緩釋制劑的方法也是公知的，可應(yīng)用于本發(fā)明(Langer等人， J. Biomed. Mater. Res. 1981,15 :167-277 ；Langer, Chem. Tech. 1982,12 :98-105 ；美國(guó)專(zhuān)利第 3，773，919 號(hào)；歐州專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)(EP)第 58，481 號(hào)；Sidman 等人，Biopolymers 1983， 22 :547-556 ；EP 第 133，988 號(hào))。所使用的制劑上可接受的載體，根據(jù)劑型從上述載體中適當(dāng)或組合選擇，但并不限于這些。本發(fā)明涉及在對(duì)象中抑制神經(jīng)浸潤(rùn)的方法，該方法包括對(duì)發(fā)生神經(jīng)浸潤(rùn)的對(duì)象或有可能發(fā)病的對(duì)象給予IL-6抑制劑的步驟。本發(fā)明還涉及在對(duì)象中治療和/或預(yù)防胰腺癌的方法，該方法包括對(duì)患有胰腺癌的對(duì)象或有可能患病的對(duì)象給予IL-6抑制劑的步驟。本發(fā)明中，“對(duì)象”是指給予本發(fā)明的治療藥或抑制劑的生物體、該生物體體內(nèi)的一部分。對(duì)生物體沒(méi)有特別限定，包括動(dòng)物(例如人、家畜動(dòng)物種類(lèi)、野生動(dòng)物)。對(duì)“生物體體內(nèi)的一部分”沒(méi)有特別限定，可以?xún)?yōu)選列舉疾病部位等。本發(fā)明中，“給藥”包括口服給藥或胃腸外給藥。作為口服給藥，可以列舉以口服制劑的形式進(jìn)行的給藥；作為口服制劑，可以選擇顆粒劑、散劑、片劑、膠囊劑、溶液劑、乳劑或懸浮劑等劑型。
作為胃腸外給藥，可以列舉以注射劑的形式進(jìn)行的給藥，注射劑的例子有皮下注射劑、肌肉注射劑或腹腔內(nèi)注射劑等。通過(guò)利用基因療法將應(yīng)該給予的含有寡核苷酸的基因?qū)肷矬w內(nèi)，可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法的效果。還可以將本發(fā)明的藥物對(duì)欲實(shí)施處置的部位進(jìn)行局部給藥。例如，還可以通過(guò)手術(shù)中的局部注入、插管的使用、或本發(fā)明的編碼肽的DNA靶向基因傳遞進(jìn)行給藥。實(shí)踐本發(fā)明的方法時(shí)，可以將本發(fā)明的藥物與至少一種其他藥物(例如其他神經(jīng)浸潤(rùn)抑制劑或其他胰腺癌治療藥)一起作為藥學(xué)組合物的一部分進(jìn)行給藥。在一個(gè)方案中，本發(fā)明的藥物和其他藥物實(shí)質(zhì)上可以同時(shí)給藥。需要說(shuō)明的是，本說(shuō)明書(shū)中引用的所有先行技術(shù)文獻(xiàn)均作為參照而納入本說(shuō)明書(shū)中。實(shí)施例利用實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限于此。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以進(jìn)行各種變更、修飾，這些變更、修飾也包含在本發(fā)明中?！床牧虾头椒ā?細(xì)胞)從American Type Culture Collection (ATCC)購(gòu)入人胰腺癌細(xì)胞株 Capan-1、 BxPC-3,按照ATCC推薦的操作指南，使用可以維持37度、5% CO2的條件的恒溫槽進(jìn)行培養(yǎng)和傳代。(細(xì)胞數(shù)計(jì)測(cè))從培養(yǎng)皿中采集細(xì)胞，使用臺(tái)盼藍(lán)和血細(xì)胞計(jì)測(cè)盤(pán)計(jì)測(cè)活細(xì)胞。(趨化性分析)
將底面帶有8 μ m的孔的細(xì)胞培養(yǎng)小室(BD Falcon)插入M個(gè)孔中，以細(xì)胞培養(yǎng)小室作為上室，以孔作為下室。向下室中注入600 μ 1用非血清培養(yǎng)液和人重組IL-6 (hrIL6) (R&D systems)制備的 0、1、10、100ng/ml 的 hrIL6 溶媒，向上室中注入 100 μ 1 2Χ106 個(gè) / ml的細(xì)胞懸浮液。培養(yǎng)M小時(shí)后，計(jì)測(cè)通過(guò)孔的細(xì)胞數(shù)。各組測(cè)定12次，再除以hrIL6為 0ng/ml時(shí)通過(guò)孔的平均細(xì)胞數(shù)，記錄所得的數(shù)值，作為校正值。(傷口愈合分析)向M個(gè)孔中分別注入Iml 3X IO5個(gè)/ml的細(xì)胞懸浮液，培養(yǎng)M小時(shí)。換成非血清培養(yǎng)基，再培養(yǎng)M小時(shí)，之后用玻璃棒蹭掉孔的中央部分，制作帶狀的無(wú)細(xì)胞區(qū)，計(jì)測(cè)其寬度，交換培養(yǎng)基，使hrIL6溶媒達(dá)到0、l、10、100ng/ml。培養(yǎng)M小時(shí)后，測(cè)定無(wú)細(xì)胞區(qū)的寬度變化。各組測(cè)定12次，再除以hrIL6為Ong/ml時(shí)的平均變化長(zhǎng)度，記錄所得的數(shù)值， 作為校正值。(抗體)蛋白質(zhì)印跡法中使用的一次抗體為抗磷酸化STAT3抗體(Santa Cruz)、抗 STAT3 抗體(Santa Cruz)、抗磷酸化 Erkl/2 抗體(Cell Signaling)、抗 Erkl/2 抗體(Cell Signaling)、抗磷酸化Akt抗體(Cell Signaling)、抗Akt抗體(Cell Signaling)、抗Actin 抗體(Santa Cruz)。熒光免疫染色中使用的一次抗體為抗S100抗體(DAKO)、抗小鼠IL-6 抗體(Santa Cruz)，核染色使用DRAQ5 (AXXORA)。免疫染色中使用抗磷酸化STAT3抗體 (Santa Cruz)。
(蛋白質(zhì)印跡法)使用裂解緩沖液(20mMHepes-NaOH ρΗ7· 0、0· 5% NP-40、15%甘油、300mM NaCl, ImM EDTAUOmM NaF)制作細(xì)胞溶解液。使用BCA蛋白測(cè)定試劑盒(PIERCE)測(cè)定蛋白濃度后，使含有20mg蛋白的細(xì)胞溶解液在7. 5%或12%的丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳，之后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯薄膜(Millipore)上。向薄膜上添加抗體，使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑 (Enhanced Chemiluminescence Reagent) (Amersham Biosciences)將蛋白表達(dá)圖像化。(磷酸化STAT3免疫染色及其評(píng)價(jià)方法)使用微波在IOmM的枸櫞酸緩沖液中進(jìn)行95°C、10分鐘的加熱處理以激活抗原，顯色時(shí)使用DAB。作為檢體，使用從經(jīng)過(guò)4周的26只小鼠神經(jīng)浸潤(rùn)模型中采集的沈根坐骨神經(jīng)。以神經(jīng)浸潤(rùn)部的中樞側(cè)頂端和末梢側(cè)頂端作為目標(biāo)區(qū)，使用40倍的物鏡計(jì)測(cè)每個(gè)視野的癌細(xì)胞數(shù)和磷酸化STAT3陽(yáng)性癌細(xì)胞數(shù)，通過(guò)下式算出標(biāo)記指數(shù)(磷酸化STAT3陽(yáng)性癌細(xì)胞數(shù))/(癌細(xì)胞數(shù))。(神經(jīng)浸潤(rùn)模型)所用小鼠為6周齡、雄性重度免疫功能不全小鼠(SCID小鼠)。按50mg/kg向小鼠腹腔內(nèi)給予巴比妥，進(jìn)行麻醉，露出左坐骨神經(jīng)，使用微量注射器和30G針向坐骨神經(jīng)內(nèi)直接注入2.5μ1 1.0Χ104個(gè)/μ 1的癌細(xì)胞懸浮液。采集在評(píng)價(jià)時(shí)期注入了癌細(xì)胞的坐骨神經(jīng)，制作組織標(biāo)本時(shí)，在4%低聚甲醛中、于4°C下靜置一晝夜，以固定坐骨神經(jīng)。將已固定的上述坐骨神經(jīng)切成3 μ m的厚度，進(jìn)行蘇木素-伊紅染色或免疫染色，以測(cè)定神經(jīng)浸潤(rùn)距離。測(cè)定神經(jīng)浸潤(rùn)距離時(shí)，使用沿神經(jīng)長(zhǎng)軸方向薄切的切片和物鏡測(cè)微計(jì)(三啓)，計(jì)測(cè)全腫瘤范圍的長(zhǎng)軸。提取組織中的mRNA時(shí)，使用立即用Multi-Beads blocker (安井器械)破碎所采集的組織而得到的檢體。(RNA 提取和實(shí)時(shí) RT-PCR)使用TRIzol (Life Technologies)，從自培養(yǎng)皿中采集的細(xì)胞團(tuán)塊(cell pellet)或破碎的組織斷片中采集總RNA。使用Exkript RT試劑試劑盒(Takara-bio) 和 Takara PCR Thermal Cycler Dice (Takara-bio)，按照 Takara-bio 社推薦的操作指南，由 IX 103ng 的總 RNA 合成 cDNA。使用 Smart Cycler II System(Cepheid)、SYBR RT-PCR試劑盒(Takara-bio)進(jìn)行實(shí)時(shí)RT-PCR。引物使用分別特異性擴(kuò)增人IL_6 α受體(IL6R)、人 IL-6 β 受體(gpl30)、人 GAPDH、小鼠 IL-6、小鼠 EGF、小鼠 GAPDH 的 cDNA 的引物。引物序列如下。人IL6R 正向tgagctcagatatcgggctgaac(SEQ ID N0:1)、反向 cgtcgtggatgacacagtgatg(SEQ ID NO 2) ； Agpl30 gaagcaagtgggatcacctatgaa(SEQ ID NO :3)、反向 ctgtagccttgagtatgggatgga(SEQ ID NO :4)；人 GAPDH :正 ( gcaccgtcaaggctgagaac (SEQ ID NO :5)、 反 ( atggtggtgaagacgccagt (SEQ ID NO 6)；小鼠 IL-6:正向 ccacttcacaagtcggaggctta(SEQ ID NO :7)、反向 gcaagtgcatcatcgttgttcatac (SEQ ID NO :8)；小鼠 EGF :正向 catcatggtggtggctgtctg(SEQ ID NO :9)、反向 cacttccgcttggctcatca(SEQ ID NO :10)；小鼠 GAPDH:正向 aaatggtgaaggtcggtgtg (SEQ ID NO 11)tgaaggggtcgttgatgg (SEQ ID NO :12) ^lJM Takara-bio社推薦的方法進(jìn)行定量。(mRNA 擊倒)在mRNA表達(dá)的擊倒中，使用Ambion社制作的siRNA。所用siRNA為人IL6R siRNA、人 gpl30 siRNA,Negative Control#l siRNA。在 3. 5cm 的培養(yǎng)皿中播撒 2 X IO5 個(gè)癌細(xì)胞， 培養(yǎng)48小時(shí)后，加入20 μ M的siRNA禾Π 8 μ 1 DharmaFECT轉(zhuǎn)染試劑4 (Dharmacon)。24小時(shí)后采集細(xì)胞，將其用于mRNA表達(dá)分析或神經(jīng)浸潤(rùn)模型。(統(tǒng)計(jì)分析)分析軟件使用STATVIEW 5. O。平均值之差的檢驗(yàn)使用student-t雙側(cè)檢驗(yàn)。圖中的誤差棒按照顯示標(biāo)準(zhǔn)偏差的方式制作。[實(shí)施例1]利用實(shí)時(shí)RT-PCR研究人胰腺癌細(xì)胞株中的IL-6a受體(IL6R)和IL-6 β受體 (gpl30)的細(xì)胞內(nèi)mRNA表達(dá)。在人胰腺癌細(xì)胞株中，確認(rèn)到IL6R mRNA(圖1A)和gpl30 mRNA(圖IB)的明確表達(dá)。[實(shí)施例2]使用人重組IL-6，通過(guò)細(xì)胞數(shù)的經(jīng)時(shí)性計(jì)測(cè)(圖2A和B)、趨化性分析(圖2C)、傷口愈合分析(圖2D)研究IL-6對(duì)人胰腺癌細(xì)胞株的增殖能力、趨化能力、遷移能力的影響。 明確了 IL-6雖然對(duì)胰腺癌細(xì)胞株的細(xì)胞增殖沒(méi)有影響，但使趨化能力和遷移能力亢進(jìn)。[實(shí)施例3]使用人重組IL-6 (rhIL6)，對(duì)于磷酸化STAT3 (pSTAT3)(圖3A)、磷酸化 Erkl/2(pErkl/2)(圖3B)、磷酸化Akt (pAkt)(圖3C)，利用蛋白質(zhì)印跡法評(píng)價(jià)IL-6對(duì)人胰腺癌細(xì)胞株Capan-I的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的影響。在添加rhIL6 15分鐘后，確認(rèn)到細(xì)胞內(nèi)的磷酸化STAT3蛋白表達(dá)明顯亢進(jìn)，而在添加rhIL6 1小時(shí)后，確認(rèn)到磷酸化Erkl/2蛋白表達(dá)明顯亢進(jìn)。沒(méi)有確認(rèn)到對(duì)磷酸化Akt表達(dá)的影響。[實(shí)施例4]胰腺癌的重要浸潤(rùn)方式為神經(jīng)浸潤(rùn)距離。制作可以重現(xiàn)神經(jīng)浸潤(rùn)、并且可以計(jì)測(cè)神經(jīng)浸潤(rùn)距離的小鼠神經(jīng)浸潤(rùn)模型，這在研究控制胰腺癌的重要的腫瘤浸潤(rùn)方式的治療方法上至關(guān)重要。通過(guò)向免疫功能不全小鼠的坐骨神經(jīng)內(nèi)直接注入人胰腺癌細(xì)胞株Capan-1， 制作神經(jīng)浸潤(rùn)模型。肉眼可見(jiàn)神經(jīng)浸潤(rùn)部的表面不平整、且明顯大于正常神經(jīng)(圖4A)。1 周后，組織學(xué)的神經(jīng)浸潤(rùn)距離明顯長(zhǎng)于注入時(shí)Capan-I神經(jīng)內(nèi)擴(kuò)散距離，該距離隨時(shí)間而增大(圖4B)。另外，神經(jīng)浸潤(rùn)從注入部向中樞側(cè)進(jìn)展(圖4C)，這與人胰腺癌神經(jīng)浸潤(rùn)是相同的特征。[實(shí)施例5]據(jù)報(bào)道，人胰腺癌神經(jīng)浸潤(rùn)損傷腫瘤周?chē)纳窠?jīng)組織。已經(jīng)明確神經(jīng)損傷使 IL-6表達(dá)在損傷部位的末梢側(cè)的神經(jīng)組織中亢進(jìn)。為了研究神經(jīng)浸潤(rùn)引起的神經(jīng)組織的 IL-6表達(dá)動(dòng)態(tài)，使用神經(jīng)浸潤(rùn)模型，通過(guò)實(shí)時(shí)RT-PCR法分別評(píng)價(jià)在神經(jīng)浸潤(rùn)中樞側(cè)和末梢側(cè)的神經(jīng)組織內(nèi)(圖5B)表達(dá)的小鼠IL-6(mIL6)mRNA。雖然mIL6在神經(jīng)浸潤(rùn)中樞側(cè)高度表達(dá)，但在其他神經(jīng)損傷模型中沒(méi)有確認(rèn)到該趨勢(shì)(圖5B)。通過(guò)熒光免疫染色確認(rèn)mIL6 蛋白表達(dá)時(shí)，與作為khwarm細(xì)胞的標(biāo)志物的SlOO陽(yáng)性細(xì)胞區(qū)一致，確認(rèn)到IL6陽(yáng)性顆粒 (圖5C)。明確了 在神經(jīng)浸潤(rùn)模型中，mIL6分泌細(xì)胞之一是khwarm細(xì)胞。雖然EGF是在神經(jīng)損傷中高度表達(dá)的分子，但小鼠EGF(mEGF)mRNA表達(dá)動(dòng)態(tài)不同于mIL6，沒(méi)有確認(rèn)到其在中樞側(cè)高度表達(dá)的趨勢(shì)。該結(jié)果暗示IL-6與神經(jīng)浸潤(rùn)部位的腫瘤-神經(jīng)相互作用密切相關(guān)。
[實(shí)施例6]利用免疫染色研究IL-6的重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)即磷酸化STAT3 (pSTAT3)蛋白在胰腺癌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)，磷酸化STAT3表達(dá)在神經(jīng)浸潤(rùn)中樞方向亢進(jìn)(圖6)。該結(jié)果是與在神經(jīng)浸潤(rùn)中樞側(cè)的神經(jīng)組織中IL-6表達(dá)的亢進(jìn)分布一致。[實(shí)施例7]在IL-6的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)中，必需有g(shù)pl30的介在。使用用siRNA擊倒了胰腺癌細(xì)胞的gpl30 mRNA表達(dá)的胰腺癌細(xì)胞株制作神經(jīng)浸潤(rùn)模型時(shí)，神經(jīng)浸潤(rùn)距離得到抑制(圖 7)。該結(jié)果表明由gpl30介導(dǎo)的信號(hào)對(duì)于神經(jīng)浸潤(rùn)是重要的，所述gpl30包含來(lái)自IL-6 的 gpl30。[實(shí)施例8]在IL-6的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)中，必需有IL-6受體(IL6R)的介在。使用用siRNA擊倒了胰腺癌細(xì)胞的IL6R mRNA表達(dá)的胰腺癌細(xì)胞株制作神經(jīng)浸潤(rùn)模型時(shí)，神經(jīng)浸潤(rùn)距離得到抑制(圖8)。該結(jié)果表明由IL-6介導(dǎo)的信號(hào)對(duì)于神經(jīng)浸潤(rùn)是重要的。[實(shí)施例9]接下來(lái)，對(duì)小鼠神經(jīng)浸潤(rùn)模型給予JAK抑制劑或抗IL-6受體抗體，確認(rèn)這些抑制劑對(duì)神經(jīng)浸潤(rùn)的影響。(對(duì)小鼠神經(jīng)浸潤(rùn)模型給予JAK抑制劑的實(shí)驗(yàn))將抑制STAT3磷酸化的JAK抑制劑AG490 (CALBI0CHEM)溶于DMSO中，之后用生理鹽水進(jìn)行稀釋?zhuān)苽銬MSO的AG490液。從制作神經(jīng)浸潤(rùn)模型2天后起，向小鼠腹腔內(nèi)連日給予0. 5mgAG490，從制作模型起2周后采集注入有癌細(xì)胞的坐骨神經(jīng)，測(cè)定神經(jīng)浸潤(rùn)距離。對(duì)照組則按照同樣的方法給予DMSO液。AG490組和DMSO組中所用小鼠數(shù)均為 7 O
‘Z、O(對(duì)小鼠神經(jīng)浸潤(rùn)模型給予抗IL-6受體抗體的實(shí)驗(yàn))
將抑制人IL-6受體的抗IL-6受體抗體(中外制藥、tocilizumab)溶于生理鹽水中，從制作模型ι周后起，按5 μ g/g、每周2次對(duì)小鼠神經(jīng)浸潤(rùn)模型給予抗IL-6抗體抑制抗體。從制作模型起3周后采集注入有癌細(xì)胞的坐骨神經(jīng)，測(cè)定神經(jīng)浸潤(rùn)距離。對(duì)照組則按照同樣的方法以5 μ g/g給予溶解在生理鹽水中的人IgG(Sigma)?？笽L-6受體抗體組中所用小鼠數(shù)為6只，對(duì)照組中所用小鼠數(shù)為4只。(統(tǒng)計(jì)分析)分析軟件使用STATVIEW 5. 0。平均值之差的檢驗(yàn)使用student-t雙側(cè)檢驗(yàn)。圖中的誤差棒按照顯示標(biāo)準(zhǔn)偏差的方式制作。從注入癌細(xì)胞2天后起連續(xù)12天腹腔內(nèi)給予對(duì)于IL-6的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)重要的 STAT3磷酸化的JAK(Janus Kinase)抑制劑AG490時(shí)，明確了神經(jīng)浸潤(rùn)得到抑制(圖9A)。 該結(jié)果表明IL-6下游的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)即JAK-STAT對(duì)神經(jīng)浸潤(rùn)是重要的。另外，為了發(fā)揮人IL-6的抑制作用，從注入癌細(xì)胞1周后起每周2次、連續(xù)2周給予抗人IL-6受體抗體時(shí)，明確了神經(jīng)浸潤(rùn)得到抑制(圖9B)。由該結(jié)果認(rèn)為人胰腺癌神經(jīng)浸潤(rùn)被抗人IL-6受體抗體抑制。產(chǎn)業(yè)實(shí)用性本發(fā)明顯示通過(guò)給予抗IL-6受體抗體，在胰腺癌中可以抑制神經(jīng)浸潤(rùn)。進(jìn)一步
21顯示通過(guò)給予抗IL-6受體抗體，可以治療胰腺癌。
權(quán)利要求
1.胰腺癌治療藥，其以白介素6抑制劑、即IL-6抑制劑作為有效成分。
2.細(xì)胞的神經(jīng)浸潤(rùn)抑制劑，其以IL-6抑制劑作為有效成分。
3.權(quán)利要求2所述的抑制劑，其特征在于抑制癌細(xì)胞的神經(jīng)浸潤(rùn)。
4.權(quán)利要求3所述的抑制劑，其特征在于抑制胰腺癌細(xì)胞的神經(jīng)浸潤(rùn)。
5.權(quán)利要求2 4中任一項(xiàng)所述的抑制劑，其特征在于抑制向中樞側(cè)進(jìn)行的神經(jīng)浸潤(rùn)。
6.權(quán)利要求1 5中任一項(xiàng)所述的治療藥或抑制劑，其特征在于IL-6抑制劑是與 IL-6受體結(jié)合的物質(zhì)。
7.權(quán)利要求6所述的治療藥或抑制劑，其特征在于IL-6抑制劑為抗IL-6受體抗體。
8.權(quán)利要求7所述的治療藥或抑制劑，其中，抗IL-6受體抗體為嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。
9.胰腺癌的治療方法，該方法包括將IL-6抑制劑給予對(duì)象的步驟。
10.細(xì)胞的神經(jīng)浸潤(rùn)抑制方法，該方法包括將IL-6抑制劑給予對(duì)象的步驟。
11.權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于抑制癌細(xì)胞的神經(jīng)浸潤(rùn)。
12.權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于抑制胰腺癌細(xì)胞的神經(jīng)浸潤(rùn)。
13.權(quán)利要求10 12中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于抑制向中樞側(cè)進(jìn)行的神經(jīng)浸潤(rùn)。
14.權(quán)利要求9 13中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于IL-6抑制劑是與IL-6受體結(jié)合的物質(zhì)。
15.權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于IL-6抑制劑為抗IL-6受體抗體。
16.權(quán)利要求15所述的方法，其中，抗IL-6受體抗體為嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。
17.IL-6抑制劑在制備胰腺癌治療藥中的應(yīng)用。
18.IL-6抑制劑在制備細(xì)胞的神經(jīng)浸潤(rùn)抑制劑中的應(yīng)用。
19.權(quán)利要求18所述的應(yīng)用，其特征在于抑制癌細(xì)胞的神經(jīng)浸潤(rùn)。
20.權(quán)利要求19所述的應(yīng)用，其特征在于抑制胰腺癌細(xì)胞的神經(jīng)浸潤(rùn)。
21.權(quán)利要求18 20中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于抑制向中樞側(cè)進(jìn)行的神經(jīng)浸 潤(rùn)。
22.權(quán)利要求17 21中任一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其特征在于IL-6抑制劑是與IL-6受體結(jié)合的物質(zhì)。
23.權(quán)利要求22所述的應(yīng)用，其特征在于IL-6抑制劑為抗IL-6受體抗體。
24.權(quán)利要求23所述的應(yīng)用，其中，抗IL-6受體抗體為嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。
25.IL-6抑制劑，該IL-6抑制劑在治療胰腺癌的方法中使用。
26.IL-6抑制劑，該IL-6抑制劑在用于抑制細(xì)胞的神經(jīng)浸潤(rùn)的方法中使用。
27.權(quán)利要求沈所述的IL-6抑制劑，其特征在于抑制癌細(xì)胞的神經(jīng)浸潤(rùn)。
28.權(quán)利要求27所述的IL-6抑制劑，其特征在于抑制胰腺癌細(xì)胞的神經(jīng)浸潤(rùn)。
29.權(quán)利要求沈 觀中任一項(xiàng)所述的IL-6抑制劑，其特征在于抑制向中樞側(cè)進(jìn)行的神經(jīng)浸潤(rùn)。
30.權(quán)利要求25 四中任一項(xiàng)所述的IL-6抑制劑，其特征在于IL-6抑制劑是與 IL-6受體結(jié)合的物質(zhì)。
31.權(quán)利要求30所述的IL-6抑制劑，其特征在于IL-6抑制劑為抗IL-6受體抗體。
32.權(quán)利要求31所述的IL-6抑制劑，其中，抗IL-6受體抗體為嵌合抗體、人源化抗體或人抗體。
全文摘要
本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)在胰腺癌的神經(jīng)浸潤(rùn)模型中，通過(guò)抑制IL-6，神經(jīng)浸潤(rùn)得到抑制，從而完成了本發(fā)明。進(jìn)一步明確了IL-6受體在人胰腺癌細(xì)胞株中表達(dá)、以及IL-6使胰腺癌細(xì)胞的趨化能力、遷移能力和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)亢進(jìn)，發(fā)現(xiàn)通過(guò)抑制IL-6可以治療胰腺癌。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)通過(guò)對(duì)小鼠神經(jīng)浸潤(rùn)模型給予IL-6抑制劑，可以抑制人胰腺癌神經(jīng)浸潤(rùn)。
文檔編號(hào)A61K45/00GK102256623SQ200980131148
公開(kāi)日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2009年6月5日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月5日
發(fā)明者光永修一, 落合淳志 申請(qǐng)人:中外制藥株式會(huì)社, 獨(dú)立行政法人國(guó)立癌癥研究中心