專利名稱：一種含有槲皮苷的藥物組合物及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及槲皮苷在制備用于預(yù)防或治療流行性感冒病毒、腺病毒、金黃色葡萄球菌和/或溶血性鏈球菌等引起的疾病的藥物中的應(yīng)用以及其藥物組合物。

背景技術(shù)：
槲皮苷是槲皮素的結(jié)構(gòu)類似物，其分子結(jié)構(gòu)式為
盡管槲皮素及其衍生物有許多文獻(xiàn)報(bào)道，但是槲皮苷本身的研究卻很少，而且槲皮苷本身的研究基本上都集中于中藥提取物質(zhì)量控制的研究方面。例如，中國專利申請第99120216.3號(hào)公開了槲皮素的制備方法及其在預(yù)防或治療抑郁或焦慮中的應(yīng)用； 中國專利申請99812942.9號(hào)公開了槲皮素和異槲皮素(槲皮素-7-鼠李糖苷)的方法及在化妝品中的應(yīng)用； 中國專利申請第200410099268號(hào)公開了包含槲皮苷、異槲皮苷以及田基黃雙呫噸酮等成分的中藥組合物，用于治療肝臟疾病； 中國專利申請200610118154.6號(hào)公開了槲皮素-7-O-葡萄糖甙在柁木或其制劑質(zhì)量控制中的應(yīng)用； 中國專利申請?zhí)?00610045292.6公開了槲皮素的制備方法及應(yīng)用； 中國專利申請?zhí)?00410062585.6公開了槲皮素衍生物三羥乙基槲皮素在治療或預(yù)防心腦血管或預(yù)防腦卒中疾??； 中國專利申請?zhí)?00580045205.0公開了α-糖基異槲皮苷的新型組合物，該化合物具有抗氧化活性； 中國專利申請?zhí)?00810038858.1公開了蘆丁和異槲皮苷(槲皮素-7-鼠李糖苷)在制備抗炎藥物的應(yīng)用。
然而，槲皮苷對來自哺乳動(dòng)物(特別是人)的流行性感冒病毒和腺病毒，尤其是甲型流行性感冒病毒，特別是新近出現(xiàn)的H1N1型流行性感冒病毒的預(yù)防和治療功效，沒有報(bào)道；對人常見傷口感染的元兇——金黃色葡萄球菌和溶血性鏈球菌的抗菌作用，也沒有報(bào)道。這些病毒和細(xì)菌嚴(yán)重威脅了人類的健康，甚至世界面臨著它們大爆發(fā)的威脅。盡管達(dá)菲等藥物對H1N1型流行性感冒病毒的治療有效，但是其價(jià)格昂貴，在廣大第三世界國家全面推廣使用并不容易。
為此，本發(fā)明人經(jīng)過艱苦努力，制得了含有槲皮苷作為唯一有效成分的藥物組合物，其成本低廉，適合推廣，而且在抗流行性感冒病毒、腺病毒、金黃色葡萄球菌和溶血性鏈球菌等病菌方面有著良好的作用。另外，當(dāng)前公眾和醫(yī)藥監(jiān)管部門對藥物的副作用和不良反應(yīng)日益重視，為此本發(fā)明人特別研究了槲皮苷的安全劑量，令人意外的是，本發(fā)明人經(jīng)過艱苦的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，盡管高劑量的槲皮苷會(huì)帶來較大的用藥安全隱患，但是優(yōu)選出的治療劑量不但能夠在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中起到有效治療的作用，而且遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于可能會(huì)帶來用藥安全隱患的劑量，確保了用藥安全和治療有效性。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于提供槲皮苷作為唯一有效成分以安全、有效的劑量用于預(yù)防和/或治療流行性感冒病毒、腺病毒、金黃色葡萄球菌和/或溶血性鏈球菌引起的疾病，并提供相應(yīng)的藥物組合物和體外施用方法。
本發(fā)明取得的有益效果包括使用單一有效成分，比如中草藥提取物等中的多種有效成分的混合物更容易控制藥物生產(chǎn)質(zhì)量，從而更大程度地保證了用藥安全；安全劑量和有效劑量相適應(yīng)，從而能夠?qū)嶋H用于預(yù)防和/或治療流行性感冒病毒、腺病毒、金黃色葡萄球菌和/或溶血性鏈球菌引起的疾病，并且對哺乳動(dòng)物取得了很好的療效，如在抗流行性感冒病毒的療效上與達(dá)菲相當(dāng)；成本相對相同或相近療效的藥物(如，達(dá)菲)要低得多，因此適合推廣應(yīng)用，尤其適合在第三世界國家推廣；制劑配方可靠，不干擾有效成份活性的發(fā)揮，而且經(jīng)過優(yōu)化的制備方法不易引入雜質(zhì)，更大限度地減少了安全隱患。
在本發(fā)明中，槲皮苷可以是從植物中提取、純化出來的，也可以是化學(xué)合成的。這兩者在化學(xué)結(jié)構(gòu)上沒有區(qū)別，出于成本的考慮，本發(fā)明優(yōu)選采用從植物中提取、純化出來的槲皮苷。例如，宋亞麗等人在“合歡花中槲皮苷提取工藝的試驗(yàn)研究”一文中，采用甲醇回流提取3次，每次提取8h或者70％甲醇超聲提取三次，每次提取20min的方法提取出高純度的槲皮苷；又如，楊秀利等人在“蕁麻疹槲皮苷提取工藝的研究”一文中，采用70％乙醇80℃提取3h，提取率可達(dá)到211mg/kg，大大降低了槲皮苷的成本。
在本發(fā)明中，藥物、藥物組合物和藥物制劑等名詞可以互換使用，均是指由有藥用作用的有效成份和藥學(xué)上可接受的輔料組成的組合物。本發(fā)明的藥物制劑優(yōu)選為單位劑量形式的制劑(在本文中，簡稱為單位制劑)，如片劑、丸劑、膠囊(包括持續(xù)釋放或延遲釋釋放形式)、粉劑、混懸劑、顆粒劑、酊劑、糖漿劑、乳液劑、懸浮液、針劑等劑型以及各種緩釋劑型，從而適合各種給藥方式，例如口服、非腸道注射、粘膜、肌肉、靜脈內(nèi)、皮下、眼內(nèi)、皮內(nèi)或經(jīng)過皮膚等的給藥形式。優(yōu)選每一單位劑量的制劑(如，一片、一粒、一針等可以一次給藥的制劑)中有效成分的含量是對哺乳動(dòng)物安全并有效的，最優(yōu)選是對成人安全并有效的，由此可以讓醫(yī)生、護(hù)士或者患者自己在給藥時(shí)方便地一次給藥完成。某一有效成分對哺乳動(dòng)物的安全劑量和有效劑量是否能夠相適應(yīng)(如，有效劑量必須大大低于安全劑量的高限才有藥用的可能)通常無法根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)來直接預(yù)測，需要進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等實(shí)驗(yàn)并得出結(jié)果后才能判斷。根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人的等效劑量換算關(guān)系(通常可參見FDA、SFDA等藥品管理機(jī)構(gòu)的指導(dǎo)意見，也可參見“黃繼漢等.藥理試驗(yàn)中動(dòng)物間和動(dòng)物與人體間的等效劑量換算.中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2004 Sep；9(9)1069-1072”)，可從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的劑量推導(dǎo)出成人的劑量，并根據(jù)成人的平均體重來換算出每一單位劑量的制劑中有效成分的含量。
在本發(fā)明中，槲皮苷是藥物中的唯一有效成分，從而可以單獨(dú)作為有效成分來制備藥物，如與藥學(xué)上可接受的輔料組成藥物組合物。盡管有許多中藥組合物或中藥提取物中含有槲皮苷，但是其不是唯一的有效成份，通常還包括含量大到不可忽視甚至超過槲皮苷含量的槲皮素和異槲皮素等潛在的有效成份，這樣含多種潛在有效成分的藥物使得藥物生產(chǎn)更為復(fù)雜，質(zhì)量控制要求更高，因此本發(fā)明不適用這樣的技術(shù)方案，從而簡化了藥物生產(chǎn)和質(zhì)控流程。需要特別指出的是，由于中藥組合物或中藥提取物中潛在的不同的有效成分有可能會(huì)帶來協(xié)同效應(yīng)、疊加效應(yīng)和/或抵消效應(yīng)，甚至不能確定不同的有效成分是否帶來了帶來協(xié)同效應(yīng)、疊加效應(yīng)和/或抵消效應(yīng)，更不清楚各種效應(yīng)的程度，因此當(dāng)前難以根據(jù)中藥組合物或中藥提取物中的含量來推算唯一有效成分的安全劑量和有效劑量，甚至由于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)等實(shí)驗(yàn)成本的高昂，本領(lǐng)域技術(shù)人員在沒有效益預(yù)期的情況下，也不會(huì)貿(mào)然選擇任一個(gè)有效成分去嘗試。
在本發(fā)明中，藥學(xué)上可接受的輔料包括藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑、和/或稀釋劑等，它們與活性成分相容。運(yùn)用藥學(xué)上可接受的輔料制備藥物組合物對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說是公知的，如將槲皮苷和藥學(xué)上可接受的輔料(如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的載體、賦形劑、和/或稀釋劑等)混合在一起，配制成各種制劑，優(yōu)選為固體制劑和液體制劑，如口服制劑或注射制劑。然而，由于本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的載體、賦形劑、和/或稀釋劑數(shù)量眾多，某些載體、賦形劑、和/或稀釋劑甚至可能加速水解掉槲皮苷上的鼠李糖部分等，造成制劑不穩(wěn)定，因此輔料的選擇也需要進(jìn)行摸索，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果來判斷，而無法事先預(yù)測。本發(fā)明的藥學(xué)上可接受的輔料優(yōu)選選自乳糖、微晶纖維素、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮K30、硬脂酸鎂、吐溫80、蔗糖、山梨酸、阿斯巴坦、丙二醇、甘露醇和泊洛沙姆188之一種或多種。經(jīng)過本發(fā)明人的艱苦研究，上述輔料都可以有效地與槲皮苷組成藥物組合物。最優(yōu)選本發(fā)明的藥物自己是按照本發(fā)明的具體實(shí)施方式
制備的，其制備過程也沒有產(chǎn)生影響制劑質(zhì)量的降解雜質(zhì)，例如 可以是槲皮苷口服片劑，其通過以下方法制備 稱取50重量份的槲皮苷、100重量份的乳糖、30重量份的微晶纖維素和10重量份的交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮，充分混合均勻，然后加入20重量份水所對應(yīng)體積的3％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮K30乙醇溶液，制成軟材，過20目篩制粒，45℃鼓風(fēng)干燥，18目篩整粒，最后加入0.5重量份的硬脂酸鎂，混合均勻后壓片； 還可以是槲皮苷口服液，其通過以下方法制備 先將100重量份的槲皮苷和20重量份的吐溫80混合均勻后，加入到8000重量份的水中溶解(任選是加熱溶解)，然后加入100重量份的蔗糖、10重量份的山梨酸和1重量份的阿斯巴坦，調(diào)節(jié)pH值至4～6，最后加水定容至10000重量份水所對應(yīng)的體積，混勻均勻后分裝； 還可以是槲皮苷液體注射劑，其通過以下方法制備 稱取20重量份的槲皮苷，加入50％(V/V)丙二醇溶液4000重量份水所對應(yīng)的體積，溶解(任選是加熱溶解)，然后加入活性炭并于70℃下攪拌15min，過0.45μm濾膜過濾以去除活性炭，然后加入50％(V/V)丙二醇溶液定容至5000重量份水所對應(yīng)的體積，混勻均勻后分裝； 也可以是槲皮苷注射用凍干劑，其通過以下方法制備 稱取5重量份的泊洛沙姆188，加入到2500重量份的注射用水中溶解，然后加入20重量份的甘露醇，溶解后，再加入20重量份的槲皮苷，完全溶解(任選是加熱溶解)后，加入活性炭并于60℃下攪拌15min，過濾以去除活性炭，然后冷至室溫，用注射用水定容至3000重量份水所對應(yīng)的體積，混勻均勻后分裝并放入冷凍干燥機(jī)中進(jìn)行冷凍干燥，其中冷凍干燥的條件為預(yù)冷凍4h，板層溫度為-40℃，制品溫度為-20℃，開啟真空泵開始升華，升華階段制品溫度控制在-15℃，待水線到底后，制品溫度緩緩升至35℃，板層溫度為40℃，保溫6小時(shí)。
具體而言，在第一方面，本發(fā)明提供了槲皮苷單獨(dú)作為有效成分在制備用于預(yù)防或治療流行性感冒病毒和/或腺病毒引起的疾病的藥物中的應(yīng)用。
優(yōu)選在本發(fā)明的第一方面中，藥物是口服型藥物或注射型藥物，即是口服制劑或注射制劑。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷，其中每單位制劑中的槲皮苷的含量不超過200mg，優(yōu)選含量是1～150mg，更優(yōu)選含量是5～100mg，更優(yōu)選含量是10～50mg，最優(yōu)選含量是10～30mg，如10mg、15mg、20mg、25mg、或30mg。按制劑類型來細(xì)分，優(yōu)選每單位口服制劑中的槲皮苷的含量是5～100mg，更優(yōu)選含量是10～50mg，如10mg、20mg、30mg、或50mg；優(yōu)選每單位注射制劑中的槲皮苷的含量是5～50mg，更優(yōu)選含量是10～30mg，如15mg、20mg、或25mg。
優(yōu)選在本發(fā)明的第一方面中，流行性感冒病毒是哺乳動(dòng)物流行性感冒病毒，優(yōu)選是人、豬、牛、羊、狗、貓或鼠的流行性感冒病毒，最優(yōu)選是人流行性感冒病毒。也優(yōu)選在本發(fā)明的第一方面中，流行性感冒病毒是甲型流行性感冒病毒或A/WS/33流行性感冒病毒，尤其是H1N1型流行性感冒病毒。在本發(fā)明的具體實(shí)施方式
中，盡管槲皮苷針對H1N1型流行性感冒病毒的效果較達(dá)菲稍弱，但是考慮到槲皮苷的成本，其應(yīng)用的前景非常廣闊；更令人意想不到的是，槲皮苷針對A/WS/33流行性感冒病毒的效果還大大優(yōu)于達(dá)菲。另外，優(yōu)選在本發(fā)明的第一方面中，腺病毒是3型腺病毒。
在第二方面，本發(fā)明提供了槲皮苷單獨(dú)作為有效成分在制備用于預(yù)防或治療金黃色葡萄球菌和/或溶血性鏈球菌引起的疾病的藥物中的應(yīng)用。
優(yōu)選在本發(fā)明的第二方面中，藥物是口服型藥物或注射型藥物，即是口服制劑或注射制劑。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷，其中每單位制劑中的槲皮苷的含量不超過200mg，優(yōu)選含量是1～150mg，更優(yōu)選含量是5～100mg，更優(yōu)選含量是10～50mg，最優(yōu)選含量是10～30mg，如10mg、15mg、20mg、25mg、或30mg。按制劑類型來細(xì)分，優(yōu)選每單位口服制劑中的槲皮苷的含量是5～100mg，更優(yōu)選含量是10～50mg，如10mg、20mg、30mg、或50mg；優(yōu)選每單位注射制劑中的槲皮苷的含量是5～50mg，更優(yōu)選含量是10～30mg，如15mg、20mg、或25mg。
優(yōu)選在本發(fā)明的第二方面中，疾病是感染，如敗血癥。金黃色葡萄球菌和/或溶血性鏈球菌(優(yōu)選是乙型溶血性鏈球菌)是造成多種感染(如，外傷感染、手術(shù)感染等)的病原體，而根據(jù)本發(fā)明具體實(shí)施方式
的實(shí)驗(yàn)，槲皮苷單獨(dú)作為有效成分就可以有效治療感染上述細(xì)菌的小鼠。
在第三方面，本發(fā)明提供了抗病毒和/或抗菌的藥物組合物，其由槲皮苷和藥學(xué)上可接受的輔料組成。優(yōu)選所述藥物組合物抗流行性感冒病毒、腺病毒、抗金黃色葡萄球菌、和/或抗溶血性鏈球菌，例如可以抗甲型流行性感冒病毒(如，H1N1型流行性感冒病毒)、A/WS/33流行性感冒病毒、和/或乙型溶血性鏈球菌。
優(yōu)選在本發(fā)明的第三方面中，藥物組合物是口服制劑或注射制劑。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷，其中每單位制劑中的槲皮苷的含量不超過200mg，優(yōu)選含量是1～150mg，更優(yōu)選含量是5～100mg，更優(yōu)選含量是10～50mg，最優(yōu)選含量是10～30mg，如10mg、15mg、20mg、25mg、或30mg。按制劑類型來細(xì)分，優(yōu)選每單位口服制劑中的槲皮苷的含量是5～100mg，更優(yōu)選含量是10～50mg，如10mg、20mg、30mg、或50mg；優(yōu)選每單位注射制劑中的槲皮苷的含量是5～50mg，更優(yōu)選含量是10～30mg，如15mg、20mg、或25mg。最優(yōu)選，本發(fā)明第三方面的藥物組合物是如本發(fā)明的具體實(shí)施方式
之任一制備的，尤其是槲皮苷口服液或槲皮苷注射用凍干劑。
在第四方面，本發(fā)明提供了制備本發(fā)明第三方面的藥物組合物的方法，其包括將槲皮苷和藥學(xué)上可接受的輔料混合在一起的步驟。優(yōu)選其中，藥學(xué)上可接受的輔料優(yōu)選選自乳糖、微晶纖維素、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮K30、硬脂酸鎂、吐溫80、蔗糖、山梨酸、阿斯巴坦、丙二醇、甘露醇和泊洛沙姆188之一種或多種。
優(yōu)選在本發(fā)明的第四方面中，所述方法包括，將重量為每單位制劑中的槲皮苷的含量的N倍的槲皮苷和藥學(xué)上可接受的輔料混合在一起，將混合產(chǎn)物封裝成N份，其中N是正整數(shù)。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果判斷，其中每單位制劑中的槲皮苷的含量不超過200mg，優(yōu)選含量是1～150mg，更優(yōu)選含量是5～100mg，更優(yōu)選含量是10～50mg，最優(yōu)選含量是10～30mg，如10mg、15mg、20mg、25mg、或30mg。按制劑類型來細(xì)分，優(yōu)選每單位口服制劑中的槲皮苷的含量是5～100mg，更優(yōu)選含量是10～50mg，如10mg、20mg、30mg、或50mg；優(yōu)選每單位注射制劑中的槲皮苷的含量是5～50mg，更優(yōu)選含量是10～30mg，如15mg、20mg、或25mg。最優(yōu)選，本發(fā)明第四方面的方法是本發(fā)明的具體實(shí)施方式
之任一。
在第五方面，本發(fā)明提供了在體外抗病毒或殺菌的方法，其包括，在疑似存在流行性感冒病毒、腺病毒、金黃色葡萄球菌、和/或溶血性鏈球菌的非體內(nèi)地方施放濃度為0.1～5mg/mL的槲皮苷溶液，優(yōu)選濃度為0.5～3mg/mL，更優(yōu)選濃度為1mg/mL。優(yōu)選本發(fā)明第五方面的方法包括，在疑似存在流行性感冒病毒(如甲型流行性感冒病毒，優(yōu)選如H1N1型流行性感冒病毒等)的非體內(nèi)地方施放濃度為0.1～5mg/mL的槲皮苷溶液，優(yōu)選濃度為0.5～3mg/mL，更優(yōu)選濃度為1mg/mL。根據(jù)本發(fā)明具體實(shí)施方式
的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以上濃度可以在體外有效抑制流行性感冒病毒。
為了便于理解，以下將通過具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行描述。需要特別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限制。另外，本發(fā)明引用了現(xiàn)有文獻(xiàn)，它們?nèi)考{入本文參考，就好像它們在本文中全部重復(fù)敘述過一樣。



圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中槲皮苷注射用凍干劑的凍干曲線圖。
圖2為本發(fā)明實(shí)施例2中槲皮苷片抗病毒(流感A/WS/33病毒)活性試驗(yàn)圖。

具體實(shí)施例方式 實(shí)施例1槲皮苷藥物制劑的制備和安全性測試 1.1槲皮苷口服片劑的制備 處方槲皮苷 50g 乳糖 100g 微晶纖維素 30g 交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮 10g 3％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮K30乙醇溶液20ml 硬脂酸鎂 0.5g 制成1000片 具體制備方法稱取處方量的槲皮苷和輔料，將之充分混合均勻，加入3％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮K30乙醇溶液制成軟材，20目篩制粒，45℃鼓風(fēng)干燥，18目篩整粒，加入處方量的硬脂酸鎂，混合均勻，壓片，包薄膜衣，即得。
1.2槲皮苷口服液的制備 處方槲皮苷 100g 吐溫80 20g 蔗糖 100g 山梨酸 10g 阿斯巴坦 1g 加水 10000ml 制成1000支 具體制備方法先將處方量的槲皮苷和吐溫80混合均勻后，加入到8000ml水中，加熱至溶解，加入處方量的蔗糖、阿斯巴坦、山梨酸，調(diào)節(jié)pH值4～6，加水至10000ml，混勻，分裝，滅菌即得。
1.3槲皮苷液體注射劑的制備 處方槲皮苷20g 活性炭1g 50％丙二醇加至5000ml 制成1000支 具體制備方法 稱取處方量的槲皮苷，加入50％丙二醇4000ml，加熱至60℃攪拌溶解，加入1g活性炭，70℃下攪拌15min，0.45μm濾膜過濾，冷至室溫，加入50％丙二醇稀釋至刻度，攪勻，灌封，每支2ml，流通蒸汽100℃滅菌30min，燈檢，即得。
1.4槲皮苷注射用凍干劑的制備 處方槲皮苷 20g 甘露醇 20g 泊洛沙姆188 5g 活性炭 1.5g 注射用水 加至3000ml 制成 1000支 具體制備方法 稱取處方量的泊洛沙姆188，加入到2500ml注射用水中，攪拌溶解，加入處方量的甘露醇，攪拌溶解后，再加入處方量的槲皮苷，加熱至60℃，攪拌至完全溶解，加入1.5g活性炭，60℃下攪拌15min，過濾，冷至室溫，注射用水加至3000ml。分裝，每支3ml，放入冷凍干燥機(jī)中，進(jìn)行冷凍干燥(凍干曲線如圖1所示)，進(jìn)箱后，預(yù)冷凍4h，板層溫度為-40℃，制品溫度為-20℃，開啟真空泵開始升華，升華階段制品溫度控制在-15℃(制品共熔點(diǎn)約在-6℃)，待水線到底后，制品溫度緩緩升至35℃，板層溫度為40℃，保溫6小時(shí)，壓塞，軋蓋。
1.5注射用槲皮苷的安全性檢測 1)急性毒性試驗(yàn) 按照國家食品監(jiān)督管理局藥品審評中心的中藥、天然藥物急性毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則，以實(shí)施例1.4方法制備的制劑對小鼠進(jìn)行安全性檢測，發(fā)現(xiàn)小鼠靜脈注射的LD50830mg/kg(以槲皮苷計(jì))。
2)溶血、全身過敏刺激試驗(yàn) 將實(shí)施例1.4方法制備的制劑以生理鹽水配成1％(g/ml)(以槲皮苷計(jì))的濃度，豚鼠以1ml/只腹腔注射給藥，隔日一次，連續(xù)三次，給藥后第14天及21天以2ml/只靜脈注射給藥進(jìn)行攻擊性試驗(yàn)，結(jié)果未見豚鼠有明顯的全身過敏反應(yīng)；溶血試驗(yàn)結(jié)果表明該藥無溶血現(xiàn)象發(fā)生。將實(shí)施例1.4方法制備的制劑以生理鹽水配成1％(g/ml)(以槲皮苷計(jì))的濃度，以1ml/kg兔耳緣靜脈滴注給藥每天一次，連續(xù)7天，給藥后對注射部位進(jìn)行肉眼觀察及病理學(xué)切片檢查，檢查結(jié)果表明該劑量槲皮苷對血管無明顯的刺激作用。
實(shí)施例2槲皮苷的藥效學(xué)試驗(yàn) 1、試驗(yàn)材料 1.1動(dòng)物ICR品系小鼠，♀

各半，體重18-22g，質(zhì)量合格證陜醫(yī)動(dòng)字200-006號(hào)；新西蘭大白兔，♀

兼用，體重2-2.5g，合格證為SCXK(陜)2009-001號(hào)，購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
1.2受試藥物 試驗(yàn)藥品實(shí)施例1.2方法制備的槲皮苷口服液(以槲皮苷計(jì)10mg/ml) 陽性藥環(huán)磷酰胺(CTX)注射干粉，200mg/支。上海華聯(lián)制藥有限公司，批號(hào)091020。
乳糖紅霉素注射液。西安利君制藥公司，批號(hào)20090410 病毒唑注射液 規(guī)格0.1g/支。鄭州永和制藥有限公司，批號(hào)0910056 達(dá)菲規(guī)格75mg宜昌長江藥業(yè)有限公司(四川)批號(hào)091221 (一)體外抗流感病毒(FM1株)作用結(jié)果 對甲型流感病毒FM1株的抑制作用 設(shè)受試藥物槲皮苷口服液梯度濃度實(shí)驗(yàn)組、陽性藥物對照組、病毒對照組和正常對照組。A組測定藥液對病毒的最小直接滅活濃度 用Hank’s液將流感病毒FM1株病毒液稀釋為2000血凝單位/ml，分別與各梯度稀釋的槲皮苷口服液或?qū)φ账幰?2mg/ml病毒唑)等體積混合，室溫作用4h；用Hank’s液將作用液稀釋50倍后接種雞胚尿囊腔，0.2ml/胚，每一作用液平行接種6個(gè)雞胚。病毒對照組接種40血凝單位/ml FM1病毒液0.2ml/胚。37℃孵育72h，收獲雞胚尿囊液，用血球凝集試驗(yàn)測定FM1滴度。與病毒對照組比較，能明顯降低病毒滴度的最小藥物濃度為對病毒的最小直接滅活濃度。
B組測定藥液對病毒在雞胚內(nèi)增殖的最小抑制濃度 用Hank’s液將流感病毒FM1株病毒液稀釋為40血凝單位/ml，接種雞胚尿囊腔，0.2ml/胚。2小時(shí)后，將不同梯度稀釋的槲皮苷口服液或?qū)φ账幰?2mg/ml病毒唑)再接種于已接種過病毒的雞胚尿囊腔，0.2ml/胚，同一濃度藥液平行接種6個(gè)雞胚。病毒對照組接種Hank’s液。37℃孵育72h，收獲雞胚尿囊液，用血球凝集試驗(yàn)測定FM1滴度。與病毒對照組比較，能明顯降低病毒滴度的最小藥物濃度為對病毒增殖的最小抑制濃度。
C組測定藥液對病毒在雞胚內(nèi)增殖的最小有效預(yù)防濃度 先將各梯度稀釋的槲皮苷口服液或?qū)φ账幰?2mg/ml病毒唑)接種于雞胚尿囊腔，0.2ml/胚，同一濃度藥液平行接種6個(gè)雞胚。病毒對照組接種Hank’s液。37℃孵育12小時(shí)后，接種40血凝單位/ml FM1病毒液，0.2ml/胚。37℃孵育72h，收獲雞胚尿囊液，用血球凝集試驗(yàn)測定FM1滴度。與病毒對照組比較，能明顯降低病毒滴度的最小藥物濃度為對病毒增殖的最小有效預(yù)防濃度。
試驗(yàn)結(jié)果 (1)藥物對雞胚的最大無毒濃度 接種藥物后每日觀察雞胚發(fā)育存活情況，24h內(nèi)死亡屬于非特異性死亡。72h后取胚觀察。正常對照組雞胚全部存活，發(fā)育良好。每胚接種0.2ml槲皮苷濃度為10mg/ml實(shí)驗(yàn)組中雞胚死亡，胚體小，并有明顯出血斑點(diǎn)，表明該藥液濃度對雞胚有毒性作用。每胚接種0.2ml槲皮苷的濃度為5mg/ml以及以下各濃度組中的雞胚發(fā)育正常。
槲皮苷口服液對9日齡雞胚的最大無毒濃度為1mg/胚(以槲皮苷計(jì))。
(2)對甲型流感病毒FM1株的抑制作用見表1。

*P＜0.05vs病毒對照組 表1槲皮苷口服液對流感病毒FM1株的作用 從表1可以看出，槲皮苷片對流感病毒FM1的最小直接滅活濃度、對FM1在雞胚內(nèi)增殖的最小抑制濃度以及對FM1在雞胚內(nèi)增殖的最小有效預(yù)防濃度均為0.5mg/ml。
(二)體外抗病毒(A/WS/33病毒)活性試驗(yàn) 按照國家食品藥品監(jiān)管理局藥品審評中心中的中藥、天然藥物一般藥理學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則，以達(dá)菲為對照，進(jìn)行體外抗病毒測試，試驗(yàn)結(jié)果見附圖2。結(jié)果表明，槲皮苷和達(dá)菲濃度在濃度為100μg/ml時(shí)抗病毒(流感A/WS/33病毒)活性分別為85％和60％，在濃度為10μg/ml時(shí)抗病毒活性分別為68％和49％。
(三)體外結(jié)合H1N1膜蛋白的試驗(yàn)結(jié)果 將實(shí)施例1.2方法制備的槲皮苷口服液與達(dá)菲不同濃度體外結(jié)合H1N1膜蛋白的試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2槲皮苷口服液結(jié)合結(jié)合H1N1膜蛋白的試驗(yàn)結(jié)果 試驗(yàn)結(jié)果表明槲皮苷對甲型H1N1病毒有明顯的抑制作用，效果較達(dá)菲稍弱。
(四)體內(nèi)抗病毒實(shí)驗(yàn)報(bào)告 實(shí)驗(yàn)病毒株甲型流行性感冒病毒鼠肺適應(yīng)株(RNA病毒)FM1株、3型腺病毒(DNA病毒)株可購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京病毒研究所。
實(shí)驗(yàn)方法及結(jié)果參照《衛(wèi)生部藥政局新藥臨床前研究指導(dǎo)》中“體內(nèi)抗病毒試驗(yàn)原則”和《中藥藥理研究方法學(xué)》，以ICR小鼠為實(shí)試驗(yàn)動(dòng)物，采用孫氏綜合法測定槲皮苷對甲型流行性感冒病毒FM1株、3型腺病毒標(biāo)準(zhǔn)株感染小鼠的半數(shù)保護(hù)量，計(jì)算其95％可信限。結(jié)果如下 槲皮苷對甲型流感病毒FM1株感染小鼠的ED50及其95％可信限見表3，對3型腺病毒標(biāo)準(zhǔn)株感染小鼠的ED50及其95％可信限見表4。


表3對甲型流感病毒FM1株感染小鼠體內(nèi)保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果
表4對3型腺病毒標(biāo)準(zhǔn)株感染小鼠體內(nèi)保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，槲皮苷口服液對甲型流行性感冒病毒FM1株、3型腺病毒標(biāo)準(zhǔn)株感染的小鼠有明顯的保護(hù)作用，可以用于呼吸道病毒感染的預(yù)防和治療。
(五)體內(nèi)抗菌實(shí)驗(yàn)報(bào)告 實(shí)驗(yàn)菌株金黃色葡萄球菌ATCC25925株、乙型溶血性鏈球菌32210株凍干菌株均可購自中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京藥品生物制品研究所。
實(shí)驗(yàn)方法參照《衛(wèi)生部藥政局新藥臨床前研究指導(dǎo)》中“體內(nèi)抗菌試驗(yàn)原則”和《中藥藥理研究方法學(xué)》，以ICR小鼠為試驗(yàn)動(dòng)物，采用孫氏綜合法測定槲皮苷口服液對金黃色葡萄球菌和乙型溶血性鏈球菌感染ICR小鼠的半數(shù)保護(hù)量，計(jì)算其95％可信限。結(jié)果見表5、表6。

表5對金黃色葡萄球菌ATCC25925株感染小鼠體內(nèi)保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果
表6對乙型溶血性鏈球菌32210株感染小鼠體內(nèi)保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果 結(jié)果表明，槲皮苷口服液對金黃色葡萄球菌感染小鼠的ED50為1.9539mg/kg，95％可信限為1.2071～3.1627mg/kg。對乙型溶血性鏈球菌感染小鼠的ED50為1.1616mg/kg，95％可信限為1.5951～3.9183mg/kg。
權(quán)利要求
1.槲皮苷單獨(dú)作為有效成分在制備用于預(yù)防或治療流行性感冒病毒、和/或腺病毒引起的疾病的藥物中的應(yīng)用。
2.權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中流行性感冒病毒是甲型流行性感冒病毒，如H1N1型流行性感冒病毒。
3.槲皮苷單獨(dú)作為有效成分在制備用于預(yù)防或治療金黃色葡萄球菌、和/或溶血性鏈球菌引起的疾病的藥物中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其中所述疾病是敗血癥。
5.權(quán)利要求1或3所述的應(yīng)用，其中藥物是口服型藥物或注射型藥物，其劑型優(yōu)選是口服片劑、口服液、液體注射劑或注射用凍干劑。
6.抗病毒和/或抗菌的藥物組合物，其由槲皮苷和藥學(xué)上可接受的輔料組成。
7.權(quán)利要求6所述的藥物組合物，其抗流行性感冒病毒、腺病毒、抗金黃色葡萄球菌和/或抗溶血性鏈球菌。
8.權(quán)利要求6或7所述的藥物組合物，其為口服制劑或注射制劑，如口服片劑、口服液、液體注射劑或注射用凍干劑。
9.權(quán)利要求8所述的藥物組合物，其中每單位制劑中的槲皮苷的含量不超過200mg，優(yōu)選含量是1～150mg，更優(yōu)選含量是5～100mg，更優(yōu)選含量是10～50mg，最優(yōu)選含量是10～30mg，如10mg、15mg、20mg、25mg或30mg。
10.在體外抗病毒或殺菌的方法，其包括，在疑似存在流行性感冒病毒、腺病毒、金黃色葡萄球菌、和/或溶血性鏈球菌的非體內(nèi)地方施放濃度為0.1～5mg/mL的槲皮苷溶液，優(yōu)選濃度為0.5～3mg/mL，更優(yōu)選濃度為1mg/mL。
全文摘要
本發(fā)明提供了槲皮苷在制備用于預(yù)防或治療流行性感冒病毒、腺病毒、金黃色葡萄球菌、和/或溶血性鏈球菌等引起的疾病的藥物中的應(yīng)用以及其藥物組合物，該藥物組合物抗流行性感冒病毒的活性與達(dá)菲(奧司他韋)相當(dāng)。
文檔編號(hào)A61P31/16GK101797266SQ20101015195
公開日2010年8月11日 申請日期2010年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月21日
發(fā)明者張登科 申請人:張登科