專利名稱：使用編碼和分泌神經(jīng)保護因子和/或抗血管形成因子的包囊細胞治療眼疾病的制作方法
使用編碼和分泌神經(jīng)保護因子和/或抗血管形成因子的包
囊細胞治療眼疾病本申請涉及編碼和分泌適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)的細胞，例如間充質(zhì)干細胞或間充質(zhì)基質(zhì)細胞或者任何其它適宜細胞。此類眼疾病包括青光眼和其它視神經(jīng)病癥，視網(wǎng)膜病，特別是色素性視網(wǎng)膜炎(RP)，年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)和糖尿病性視網(wǎng)膜病等。本文所用細胞被包囊于(球形)微囊中，所述微囊優(yōu)選包括核芯和至少一個表面層，以防止所治療患者的免疫系統(tǒng)反應(yīng)。本申請還涉及這些(球形)微囊或者本文定義的用于(眼內(nèi))治療眼疾病的此類因子(用于制備(藥物)組合物)以用于治療此類眼疾病的用途。眼疾病或病癥是特別受關(guān)注的，因為這些疾病或病癥可能導(dǎo)致一些患者嚴重的視覺損傷并且甚至失明。在那些眼疾病或病癥中特別關(guān)注的是青光眼和其它視神經(jīng)疾病，以及視網(wǎng)膜病癥。此類視網(wǎng)膜病癥可能尤其包括色素性視網(wǎng)膜炎(RP)、黃斑變 性(MD)、年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD或ARMD)、斑點水腫、特別是歸咎于其它原因的斑點水腫、視網(wǎng)膜血管阻塞、高血壓性視網(wǎng)膜病和糖尿病性視網(wǎng)膜病等。在上文中，色素性視網(wǎng)膜炎(RP)被分類為一組遺傳性眼科病癥。在色素性視網(wǎng)膜炎癥狀的進程中，夜盲癥通常在視野收縮之前數(shù)年甚至數(shù)十年。許多患有色素性視網(wǎng)膜炎的人在他們40多歲或50多歲前不會變成法理上的盲人，并在他們的一生中保留一些視力。其它人會由色素性視網(wǎng)膜炎變成完全失明，在一些患者中可早至童年。色素性視網(wǎng)膜炎是遺傳性視網(wǎng)膜營養(yǎng)障礙的最常見形式之一，所述遺傳性視網(wǎng)膜營養(yǎng)障礙是一組遺傳性病癥，其特征是感光細胞的進行性喪失、光感受器(視桿細胞和圓錐體)和/或視網(wǎng)膜的視網(wǎng)膜色素上皮細胞(RPE)的異常，其可能導(dǎo)致進行性視力喪失。受影響的個體首先會經(jīng)歷不完全的暗適應(yīng)或者夜盲(夜盲癥)，接著是周圍視野的減少(稱為視野收縮)，以及，根據(jù)特定疾病，在疾病過程后期的中心視覺喪失。色素性視網(wǎng)膜炎與進行性聾一起稱為烏謝爾綜合征(Usher syndrome)。作為遺傳性視網(wǎng)膜變性的一種形式，當(dāng)發(fā)生突變時，據(jù)認為有多個基因會引起色素性視網(wǎng)膜炎表型。在1989年，識別了視網(wǎng)膜紫質(zhì)基因的突變體，所述視網(wǎng)膜紫質(zhì)是一種色素，其在在低光線條件下啟動視覺的視覺轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)中起主要作用。從那時起，在此基因中已發(fā)現(xiàn)100多種突變體，占所有視網(wǎng)膜變性類型的15%。這些突變體的大部分是錯義突變體并且通常是遺傳性的。此外，視網(wǎng)膜紫質(zhì)基因編碼光感受器外節(jié)的主要蛋白質(zhì)。研究顯示，在此基因中的突變體負責(zé)約25%的色素性視網(wǎng)膜炎的常染色體形式。此外，自從在1990年首次報道蛋白質(zhì)的管內(nèi)區(qū)域中的Pro23HiS突變體以來，至今已報道有在與色素性視網(wǎng)膜炎有關(guān)的視蛋白質(zhì)基因中多達150種突變體。這些突變體在整個視蛋白質(zhì)基因被發(fā)現(xiàn)，并且沿著蛋白質(zhì)的三個區(qū)域分布(盤內(nèi)(intradiscal)區(qū)、跨膜區(qū)和胞漿區(qū))。除了遺傳因素以外，引起色素性視網(wǎng)膜炎的突變還可能歸因于生物化學(xué)事件例如蛋白質(zhì)錯折疊或者涉及分子伴侶。目前，沒有能完全治愈色素性視網(wǎng)膜炎的現(xiàn)有醫(yī)學(xué)治療療法。即使用維生素A治療代表了最常見的治療法，它可能不可靠地僅僅減少疾病發(fā)展，例如通過每天服用例如15000IU維生素A棕櫚酸酯。其它治療法可能涉及視網(wǎng)膜移植、人工視網(wǎng)膜植入、基因治療、干細胞治療、營養(yǎng)補充等。
其它形式的視網(wǎng)膜病癥可包括黃斑變性(MD)。黃斑變性是一種代表較老成年人 (> 50歲)和高度近視個體的失明的主要原因的醫(yī)學(xué)病癥。黃斑變性(MD)的癥狀通常包括視野中心(斑點)的視力喪失，其原因是在此區(qū)域視網(wǎng)膜損傷。黃斑變性可能使其難以或不可能閱讀或識別面容，盡管殘留有足夠的周邊視覺以容許日常生活的其它活動。MD的診斷可以例如通過熒光素血管造影術(shù)來進行，該方法可識別和定位異常血管過程。此外，光學(xué)相干斷層掃描和其它新開發(fā)的成像技術(shù)可用于診斷和 評價對MD治療的反應(yīng)。MD的一種形式是所謂的年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD或ARMD)。除青光眼和糖尿病性視網(wǎng)膜病以外，它是西方國家中視力損失和失明的最常見原因之一。年齡相關(guān)性黃斑變性的發(fā)生通常與黃斑(提供詳細中央視覺的視網(wǎng)膜中心區(qū)域，稱為視網(wǎng)膜小凹)中的特征性淺黃色沉積物有關(guān)，所述黃斑稱為視網(wǎng)膜色素上皮細胞和下面脈絡(luò)膜之間的脈網(wǎng)膜小疣。具有這些早期變化(稱為年齡相關(guān)性黃斑病)的大多數(shù)人通常無視覺損傷。然而，這些早期變化可相對地經(jīng)常發(fā)展為晚期ADM。當(dāng)脈網(wǎng)膜小疣大并且數(shù)目眾多時而且與黃斑下的色素細胞層中的紊亂關(guān)聯(lián)時該風(fēng)險是相當(dāng)高的。與視深度損失有關(guān)的晚期AMD通常以兩種形式發(fā)生干性和濕性AMD。晚期AMD的“干性”形式，亦稱為中心地理性萎縮(central geographic atrophy)，通常是由視網(wǎng)膜下面的視網(wǎng)膜色素上皮層(和可能的脈絡(luò)膜內(nèi)層) 的萎縮造成的并且通過眼中央部分中光感受器(視桿細胞和圓錐體)喪失而導(dǎo)致視力喪失。可能還有聚集在視網(wǎng)膜和脈絡(luò)膜之間的細胞碎片(稱為脈網(wǎng)膜小疣)。雖然此病癥尚無治療法，含有高劑量抗氧劑、葉黃素和玉米黃素的維生素補充劑已由國家眼科研究所 (National Eye Institute)和其它人所證實可減緩干性黃斑變性的進程，并且在一些患者中，改善了視覺靈敏度。晚期AMD的“濕性”形式亦稱為新生血管性或滲出性AMD，代表了更為嚴重的AMD形式。滲出性年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD) (AMD的濕性形式)典型特征在于眼中異常血管生長，其中有缺陷的血管滲漏液體和血液。其可由于從脈絡(luò)膜毛細血管穿過 Bruch氏膜進入視網(wǎng)膜下間隙的異常血管生長而引起視力喪失，最終導(dǎo)致黃斑下面的血液和蛋白質(zhì)滲漏。如果不治療的話，來自這些血管的出血、滲漏和瘢痕形成最終導(dǎo)致對光感受器的不可逆的損傷、黃斑中的瘢痕形成和相對快速的視力喪失。直到今天，對于AMD特別是對于濕性形式的AMD僅有少數(shù)治療法可用。滲出性年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)目前通常用眼內(nèi)治療法來治療，并且較少用(另外的)激光凝固法。眼內(nèi)治療法包括使用抗血管形成劑，其在直接注入到眼的玻璃體中時可引起異常血管的退化以及視力改善。此類抗血管形成劑，包括有效抑制VEGF的試劑(抗血管內(nèi)皮生長因子)，被用于預(yù)防眼中異常的新生血管的形成，并且能夠使已經(jīng)開始滲漏的血管干涸。不幸的是，這些注射需要兩月一次或一月一次頻繁地反復(fù)進行，并且產(chǎn)生注射相關(guān)風(fēng)險，特別是眼內(nèi)感染的風(fēng)險。這些試劑的實例包括Lucentis 、Avastin (結(jié)構(gòu)上接近于Lucentis ) 和Macugen 。在這些抗血管形成劑中，僅有Lucenti s和Macugen是在2009年一月由FDA-批準的。已發(fā)現(xiàn)Macugen在新生血管性AMD中具有較低的益處，因此目前使用Lucentis 優(yōu)于使用Macugen 。在這種情況下，WO02/067971 A2 (Novartis AG, Basel, Switzerland)公開了治療眼新生血管形成的方法。為此目的，WO 02/067971 A2采用對待治療的患者直接施用編碼內(nèi)皮抑制素的(腺)病毒載體或者施用產(chǎn)生內(nèi)皮抑制素的細胞。然而，細胞的施用會導(dǎo)致待治療患者中不期望的免疫反應(yīng)。WO 02/067971 A2還建議遞送微包囊形式的細胞，然而，并未顯示這些微包囊細胞可以有效地生產(chǎn)、防止不期望的免疫反應(yīng)，并且有效地治療眼新生血管形成或其它眼疾病。WO 02/067971 A2亦未顯示成功地施用此類微包囊細胞給患
者ο其它較常見的視網(wǎng)膜病癥包括視網(wǎng)膜血管閉塞。根據(jù)最近基于群體的研究，年齡 40+的一般群體中約罹患視網(wǎng)膜血管閉塞，大部分是視網(wǎng)膜靜脈閉塞或視網(wǎng)膜動脈閉塞。對于視網(wǎng)膜動脈閉塞，到目前為止尚不能得到循證治療法。動脈閉塞通常只持續(xù)有限的時間，此后動脈重新開放。因此期望有一種治療法，其有助于損傷的視網(wǎng)膜細胞存活直到動脈重新疏通。在視網(wǎng)膜靜脈閉塞的情況下，已經(jīng)進行了視網(wǎng)膜激光凝固和/或藥物眼內(nèi)施用，以減少黃斑水腫并降低眼內(nèi)不需要的新生血管形成的風(fēng)險。此外對于視網(wǎng)膜靜脈閉塞，神經(jīng)保護治療法被證明有助于細胞存活直到周圍癥狀改善。青光眼是一種異源性的疾病組，其特征是視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞及其軸突的損失，導(dǎo)致視神經(jīng)乳頭的檢眼鏡(ophthalmoscopally)典型表象。眼球內(nèi)壓可能升高(例如在所謂的高壓青光眼中)，或者其可以統(tǒng)計學(xué)上正常的(例如在所謂的常壓青光眼中)。根據(jù)相對近期的研究，的眼窩腦脊液壓如經(jīng)終板(trans-lamian)篩狀對抗壓力在一些常壓青光眼患者中可能異常地低。青光眼還可能是慢性的(例如在大多數(shù)開角青光眼中)，或者它們會急性發(fā)作伴有顯著疼痛(例如在一些閉角青光眼中)。青光眼的異質(zhì)性(heterogenitiy) 解釋了為何存在不同的治療方式。其全部都必須降低眼內(nèi)壓。此外，神經(jīng)保護性或者甚至是神經(jīng)再生性治療是必要的，以支撐受損細胞存活或者甚至再生。相當(dāng)多的其它藥劑可大體上用于治療ADM和其它視網(wǎng)膜病癥以及視神經(jīng)病癥。除了為進一步開發(fā)新治療策略的許多實驗性研究以外，已有許多1期、2期和3期研究來檢測此類新藥治療AMD和提及的其它疾病的臨床效果，然而，目前沒有有效的治療法來保護或者更優(yōu)選再生視網(wǎng)膜組織，包括視神經(jīng)，小梁網(wǎng)和/或血管細胞，作為如上文所述的長期治療。盡管用藥劑(例如維生素A和維生素A棕櫚酸酯)治療色素性視網(wǎng)膜炎(RP)以及用藥物(例如Lucentis 和Macugen )治療AMD已顯示出減緩了這些疾病的進程，但是目前尚無有效的治療法，因為所有這些治療策略不能顯示對細胞損失具有保護作用。外科手術(shù)如視網(wǎng)膜移植或人工視網(wǎng)膜植入仍然在早期實驗階段。同樣，有效治療法例如基因治療法以及干細胞治療法、營養(yǎng)補充劑等至今尚未開發(fā)到臨床階段。因此，本發(fā)明的一個目的是為上文所述眼疾病和病癥，特別是視網(wǎng)膜退化所致的眼疾病和病癥提供有效的治療法，所述方法可避免這些問題并且其可提供有效的長期治療而不需要頻繁地反復(fù)施用藥物和/或沒有不期望副作用的風(fēng)險。本發(fā)明的目的是通過所附權(quán)利要求解決的。

本發(fā)明的目的具體通過使用適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的本文所述神的經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者其片段或變體(制備藥物組合物)(眼內(nèi))治療本文定義的眼疾病或病癥來實現(xiàn)，所述眼疾病或病癥優(yōu)選包括視網(wǎng)膜病，特別是色素性視網(wǎng)膜炎(RP)，年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)，糖尿病性視網(wǎng)膜病變，視網(wǎng)膜血管阻塞和視神經(jīng)病。更優(yōu)選地，本發(fā)明的目的是通過使用細胞(制備藥物組合物)(眼內(nèi))治療本文所定義眼疾病來實現(xiàn)，所述細胞例如間充質(zhì)干細胞或者間充質(zhì)基質(zhì)細胞或任何其它細胞(類型)，其可以在本發(fā)明的背景下使用，可以編碼和分泌適用于(眼內(nèi))治療本文所述眼疾病或病癥的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者其片段或變體，所述眼疾病優(yōu)選包括視網(wǎng)膜病，特別是色素性視網(wǎng)膜炎(RP)，年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)，糖尿病性視網(wǎng)膜病變，視網(wǎng)膜血管阻塞和視神經(jīng)病，其中所述細胞被包囊于(球形)微囊中，優(yōu)選防止所治療患者的免疫系統(tǒng)的反應(yīng)。在本發(fā)明上下文中，術(shù)語“編碼…的細胞”通常表示“細胞，其被基因工程化為含有或包含編碼…的核酸”。通過包埋在本文所述(球形)微囊的(球形)核芯中的細胞來施用適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者如本文定義的其片段或變體能夠避免反復(fù)施用此類因子的問題。本文定義的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)可因此通過使含有編碼和表達此因子的核酸的細胞經(jīng)眼內(nèi)施用給患者。此外，由于這些因子從所移植的細胞中分泌，植入此類細胞可確保體內(nèi)更長久地提供這些因子。它們在關(guān)注的部位直接提供這些因子而不需要反復(fù)施用。本領(lǐng)域已知，免疫系統(tǒng)通常會識別外源性細胞并激發(fā)免疫反應(yīng)，以防止此外來物質(zhì)而保護該生物體。因此，這樣能夠表達適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者如本文定義的其片段或變體的細胞的植入可因此導(dǎo)致生物體中的免疫反應(yīng)。這種防御反應(yīng)在治療期間會引起大量的且不希望的副作用，并且可導(dǎo)致嚴重并發(fā)癥或者甚至所治療生物體的死亡。避免該問題的一個策略，其也是在本文中要面對的，是使用自體細胞，即得自患者本身的細胞，它們在遺傳學(xué)上會變?yōu)樗矔r地表達適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和 /或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者如本文定義的其片段或變體。此操作方法優(yōu)選限于所治療的特定患者的細胞。

在本發(fā)明上下文中，術(shù)語“眼疾病”特別地包括視網(wǎng)膜退化所致的眼疾病和病癥，包括，尤其是視網(wǎng)膜病，選自色素性視網(wǎng)膜炎(RP)、黃斑變性(MD)、年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD或ARMD)、視網(wǎng)膜病變、糖尿病性視網(wǎng)膜病變黃斑水腫的由任何其它原因引起的視網(wǎng)膜病，血管內(nèi)皮和周皮細胞異常、視網(wǎng)膜血管阻塞、青光眼，包括小梁網(wǎng)，以及其它視神經(jīng)病，包括小梁網(wǎng)改變，和角膜內(nèi)皮異常等或者與其有關(guān)的任何疾病或病癥。在這種情況下，本發(fā)明上下文中的眼疾病還可以是起因于眼新生血管形成的眼疾病、脈絡(luò)膜新生血管形成、起因于黃斑變性的脈絡(luò)膜新生血管形成、頑固性和復(fù)發(fā)性脈絡(luò)膜新生血管形成、 組織胞漿菌病和病理性近視所致的脈絡(luò)膜新生血管形成、血管樣紋所致的脈絡(luò)膜新生血管形成、前部缺血性視神經(jīng)病、細菌性心內(nèi)膜炎、先天性黃斑變性(Best氏病)，鳥槍彈樣視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜病變，脈絡(luò)膜血管瘤，脈絡(luò)膜痣，脈絡(luò)膜無灌注，脈絡(luò)膜骨瘤，脈絡(luò)膜破裂， 無脈絡(luò)膜，慢性視網(wǎng)膜剝離，視網(wǎng)膜缺損，脈網(wǎng)膜小疣，內(nèi)源性念珠菌屬眼內(nèi)炎，視網(wǎng)膜色素性上皮細胞的外乳頭狀錯構(gòu)瘤，黃點狀眼底，原發(fā)性，黃斑裂洞，惡性黑色素瘤，膜增生性腎小球腎炎(II型)，金屬性眼內(nèi)異物，牽牛花椎間盤綜合征，多發(fā)性消散性白點綜合征(MEWDS)，鋸齒緣處新生血管形成，手術(shù)顯微鏡痛，視神經(jīng)乳頭凹陷，光凝固，斑點狀內(nèi)脈絡(luò)膜病，風(fēng)疹，肉狀瘤病，匐行性或地圖狀脈絡(luò)膜炎，視網(wǎng)膜下液引流，傾斜椎間盤綜合征，弓形蟲性(Taxoplasma)視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜炎，結(jié)核病，或伏格特-小柳-原田三氏綜合征 (Vogt-Koyanagi-Harada syndrome)，糖尿病性視網(wǎng)膜病所致新生血管形成，非糖尿病性視網(wǎng)膜病，靜脈分支閉塞，中央視網(wǎng)膜靜脈閉塞，早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病，虹膜發(fā)紅，新生血管性青光眼，黃斑旁毛細血管擴張癥，鐮狀紅細胞視網(wǎng)膜病，伊爾斯病(Eale’ disease)，視網(wǎng)膜脈管炎，腦視網(wǎng)膜血管瘤病，放射性視網(wǎng)膜病，視網(wǎng)膜冷凍創(chuàng)傷，色素性視網(wǎng)膜炎，視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜缺損，單純皰疹性角膜炎所致角膜新生血管形成，角膜潰瘍，角膜成形術(shù)，翼狀胬肉 (pterigyia)或創(chuàng)傷。本發(fā)明上下文中的眼疾病優(yōu)選不包括眼的腫瘤疾病或者成膠質(zhì)細胞瘤。用于提供上述發(fā)明方案的細胞優(yōu)選被包囊在(球形)微囊中以防止所治療患者的免疫系統(tǒng)反應(yīng)，所述細胞編碼和分泌適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者其片段或變體。在本發(fā)明上下文中，這種(球形)微囊優(yōu)選包括(球形)核芯(即，所述核芯可以是球形的或者不是球形的)以及至少一個表面包裹層，其中 所述(球形)核芯包括或組成為典型交聯(lián)聚合物和細胞(的混合物)，所述細胞例如間充質(zhì)干細胞或間充質(zhì)基質(zhì)細胞或者任何其它細胞(類型)，其可以在本發(fā)明上下文中使用并且編碼和分泌如本文定義的優(yōu)選適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護或抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者其片段或變體；和 所述至少一個表面包裹層包括或組成為典型交聯(lián)聚合物。 優(yōu)選地，所述(球形)微囊不是僅由不具有本文定義的任何表面包裹層的核芯構(gòu)成，因為僅有此表面包裹層優(yōu)選提供這些(球形)微囊施用后例如注射或植入到(宿主器官的)施用位置后的有效免疫屏障。包含本文所用的編碼和分泌神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者其片段或變體的細胞的(球形)微囊通常構(gòu)成一定的粒子大小，本文稱為(球形)微囊總直徑。通常，用于本文的(球形)微囊總直徑可以有相當(dāng)大的變化， 這取決于具體的治療和施用方式。在本發(fā)明上下文中，治療嚴格限于本文定義的眼疾病和病癥。由于所述治療通常是通過使本文所用(球形)微囊局部施用于特定施用位置例如通過注射或植入而發(fā)生的，施用方式可能會限制本文所用(球形)微囊總直徑，例如受注射管的直徑限制。本文所用(球形)微囊總直徑進一步通過(球形)微囊的核芯直徑以及至少一個表面包裹層的厚度來確定，兩種直徑通常至少部分地相互依賴并且當(dāng)然影響(球形) 微囊總直徑。為了治療如本文定義的眼疾病，本申請的發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)，可以使用的 (球形)微囊總直徑(粒子大小)為約120 μ m至約800 μ m,優(yōu)選約120 μ m至約700 μ m，更優(yōu)選總直徑約150 μ m至約650 μ m,再更優(yōu)選總直徑約165 μ m至約600 μ m。特別地，(球形)微囊總直徑(粒子大小)約120 μ m至約300 μ m,更優(yōu)選總直徑約150 μ m至約250 μ m， 再更優(yōu)選總直徑約165 μ m至約225 μ m,最優(yōu)選總直徑約180 μ m至約200 μ m,例如約180、 185、190或200μπι是有利的。構(gòu)成此總直徑的(球形)微囊通常保留于所治療的眼中選擇的注射位置，并且不會遷移到周圍組織中。這樣就可以在治療期間以足夠長的時間在注射位置提供適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者其片段或變體的連續(xù)表達，以提供由這些因子產(chǎn)生的整個范圍的有益效果。在(球形)微囊(或本文定義的(球形)核芯)的上述上下文中，術(shù)語“球形”以其最廣泛的含義理解。球形粒子優(yōu)選理解為具有類似球體的形狀，而該形狀可以是對稱或不對稱的，例如(球形)微囊和/或其核芯可以具有橢球體形狀。在較低優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明使用的所述微囊或核芯可能不是在上述含義內(nèi)的球形，但是可以具有任意的形狀，例如在該微囊的表面上有突出或侵入片段，或者可以呈纖維(特別是空心纖維)或片(特別是扁平或彎曲片)的形式。無論本公開內(nèi)容如何提及“球形”微囊或核芯，“非球形”微囊或核芯同樣是可以提供、制備或使用的。然而，根據(jù)優(yōu)選的實施方案，(球形)微囊是球形微囊或者是橢球形微囊。優(yōu)選地，(球形)微囊不是“非球形”微囊。更優(yōu)選地，(球形)微囊不是呈纖維(特別是空心纖維)或片(特別是扁平或彎曲片)的形式。如本文定義的 ，本文所用(球形)微囊優(yōu)選包括(球形)核芯(即核芯可以是球形的或者不是球形的)，其中所述(球形)核芯包括或組成為交聯(lián)聚合物和細胞(的混合物)，所述細胞例如間充質(zhì)干細胞或間充質(zhì)基質(zhì)細胞或者任何其它細胞(類型)，其可用在本發(fā)明上下文中并且編碼和分泌如本文定義的適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者其片段或變體。在本發(fā)明上下文中，(球形)微囊的(球形)核芯的典型交聯(lián)聚合物形成將可用在本發(fā)明上下文中的細胞包埋在其空腔中的支架結(jié)構(gòu)，所述細胞例如間充質(zhì)干細胞或間充質(zhì)基質(zhì)細胞或者任何其它細胞(類型)。這些細胞可以被單個地或者通常以聚集體形式例如為約10至約10，000個細胞，例如約10至約500，約10至約1，000或約10至約10，000個細胞的聚集細胞(的群)包埋在該支架結(jié)構(gòu)中。優(yōu)選地，(球形)核芯包括交聯(lián)聚合物和本文定義的包埋的細胞的均勻分布。優(yōu)選地，包括支架結(jié)構(gòu)和本文定義的包埋的細胞的核芯是根據(jù)下文所述方法制備的。在這種情況下，當(dāng)為根據(jù)本發(fā)明的應(yīng)用而制備(球形)微囊時，極其關(guān)鍵的是將可用在本發(fā)明上下文中的(球形)微囊的包囊細胞例如間充質(zhì)干細胞或間充質(zhì)基質(zhì)細胞、自體細胞或任何其它細胞(類型)完全地包埋在聚合物基質(zhì)中?？捎迷诒景l(fā)明上下文中的(球形)微囊的包埋的細胞，例如間充質(zhì)干細胞或間充質(zhì)基質(zhì)細胞或者如本文定義的任何其它細胞(類型)可以以約IXlO4至約1X108、1X109 或IXIOki的濃度，優(yōu)選以約1X105、約IX IO6或約IX IO7個細胞/ml交聯(lián)支架聚合物至約5 X IO8個細胞/ml交聯(lián)支架聚合物的濃度(或者甚至約1 X IO9或1 X IO10個細胞/ml交聯(lián)支架聚合物)，更優(yōu)選以約1X105、約IXlO6或約IXlO7個細胞/ml交聯(lián)支架聚合物至 1 X IO8個細胞/ml交聯(lián)支架聚合物的濃度以及最優(yōu)選以約1 X 105、約1 X IO6或約2 X IO7個細胞/ml交聯(lián)支架聚合物至6 X IO7個細胞/ml交聯(lián)支架聚合物的濃度存在于所述核芯中。在本發(fā)明上下文中，根據(jù)本發(fā)明使用的(球形)微囊的核芯通常具有不超過本文定義的(球形)微囊總直徑的直徑(粒子大小)。通常，根據(jù)本發(fā)明使用的(球形)微囊的核芯的直徑為約50 μ m至約220 μ m,優(yōu)選的直徑為約100 μ m至約200 μ m,同樣優(yōu)選的直徑為約115 μ m至約185 μ m，更優(yōu)選的直徑為約130 μ m至約170 μ m，再更優(yōu)選的直徑為約 145 μ m至約 155 μ m,例如約 120、125、130、135、140、145、150 或 155 μ m。特別優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明使用的(球形)微囊的核芯的直徑優(yōu)選比本文定義的(球形)微囊總直徑小約1至約 80 μ m，更優(yōu)選比本文定義的(球形)微囊總直徑小約15至約70 μ m，最優(yōu)選比本文定義的 (球形)微囊總直徑小約30至約60 μ m。換言之，根據(jù)本發(fā)明使用的(球形)微囊的核芯的直徑可具有大小為約50μπκ約60μπκ約70μπκ約80μπκ約90μπκ約100 μ m、約110 μ m、 ^ 120 μ m、^ 125 μ m、^ 130 μ m、^ 135 μ m、^ 140 μ m、^ 145 μ m、^ 150 μ m、^ 155 μ m、 約 160 μ m、約 165 μ m、約 170 μ m、約 175 μ m、約 180 μ m、約 185 μ m、約 190 μ m、約 195 μ m、約 200 μ m、約205 μ m、約210 μ m、約215 μ m，或者甚至約220 μ m，或者可以包括選自上述具體值的任意兩個的任何范圍本文定義的(球形)微囊的核芯包括本文定義的編碼和分泌適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者其片段或變體的細胞?？梢栽诒景l(fā)明上下文中用于所述(球形)核芯的、位于該核芯周圍的此類細胞例如間充質(zhì)干細胞或間充質(zhì)基質(zhì)細胞或者任何其它細胞(類型)或者突出在所述支架結(jié)構(gòu)外的細胞可能引起免疫問題，因為免疫系統(tǒng)會將這些微囊識別為外來組分，并因此這些微囊將會受到免疫系統(tǒng)的攻擊。盡管這些作用可通過降低初始溶液中的細胞濃度來避免，但是本發(fā)明通過增加核芯的細胞部分來改變微囊的效能。核芯中的細胞濃度越高，則所得待移植的微囊的總體積越小，即在注射位置該微囊會更為有效。為了避免當(dāng)使用(球形)微囊的(球形)核芯中高濃度的細胞時的免疫問題，本發(fā)明提供了施用于(球形)核芯上的至少一個表面包裹層。 這種表面包裹層使免疫反應(yīng)不會發(fā)生，即使細胞在非常接近于核芯周圍的位置，因為這些細胞由于作為屏障的表面包裹層的原因而不易接近宿主的免疫系統(tǒng)。這種表面包裹層通常由本文定義的交聯(lián)聚合物構(gòu)成而不含有任何細胞。根據(jù)一個特別優(yōu)選的實施方案，前文定義的(球形)核芯用至少一個或者多于一個的表面包裹層例如1、2、3、4、5、5-10個或更多表面包裹層，更優(yōu)選1、2或3個表面包裹層，最優(yōu)選僅一個表面包裹層包裹。通常，每一表面包裹層構(gòu)成在核芯周圍均勻的厚度。根據(jù)本發(fā)明使用的(球形)微囊的表面包裹層的厚度幾乎可以任意地變化，并且通常范圍為約1至約80 μ m,更優(yōu)選范圍為約15至約70 μ m, 最優(yōu)選范圍為約20至約40 μ m，例如約30 μ m。本文所用(球形)微囊的(球形)核芯(和任選的(球形)微囊的至少一個表面包裹層)包括或組成為交聯(lián)聚合物(的混合物)。在這種情況下，本領(lǐng)域已知并且適用于包囊的任何藥學(xué)可接受的(可交聯(lián)的)聚合物均可用于形成(球形)核芯以及，各自獨立地， 形成根據(jù)本發(fā)明定義的(球形)微囊的至少一個表面包裹層。優(yōu)選地，使用這樣的聚合物， 其一方面在其交聯(lián)狀態(tài)是可滲透的以用于從外面供應(yīng)氧和養(yǎng)分，并且另一方面能夠使通過來自微囊的核芯細胞編碼和分泌的肽擴散進入患者的組織或體液。此外，交聯(lián)聚合物防止身體免疫系統(tǒng)的成分通過基質(zhì)的侵入。例如，可以使用聚合物例如合成、半合成和天然水溶解性(生物)聚合物，例如來自天然的聚合物，例如選擇的蛋白質(zhì)或以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的聚合物(例如膠原、白蛋白等)、聚氨基酸(例如聚-L-賴氨酸、聚-L-谷氨酸等)、多糖及其衍生物(例如羧甲基纖維素、纖維素硫酸酯、瓊脂糖、藻酸鹽包括褐藻的藻酸鹽(例如海帶目 (Laminarales)JjCHg (Ectocarpales)、巖藻目(Fucales)物種的)、角叉藻聚糖、透明質(zhì)酸、肝素和相關(guān)的葡糖氨基硫酸鹽、葡聚糖及其衍生物、殼聚糖及其衍生物)。也可以使用合成聚合物，例如脂肪族聚脂(例如聚乳酸、聚乙醇酸、聚羥基丁酸酯類等)、聚酰胺、聚酐、聚原酸酯、聚磷腈、熱塑性聚氨酯、聚乙烯醇、聚甲基丙烯酸羥乙酯、聚甲基丙烯酸甲酯和聚四氟乙烯等。此外，相應(yīng)地本文可以使用嵌段聚合物，即由兩種或多種前述聚合物組合得到聚合物。此類嵌段聚合物可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)期望的性質(zhì)例如孔徑、交聯(lián)狀態(tài)、毒性、 處置、生物相容性等來選擇。上述聚合物的任一種被定義為在本發(fā)明上下文中的“化學(xué)上不同的聚合物”，即這些聚合物的每一種通常不會與任何其它上述聚合物顯示相同摩爾質(zhì)量和結(jié)構(gòu)。相反，“化學(xué)上相同的聚合物”表示所述聚合物顯示出相同的摩爾質(zhì)量和結(jié)構(gòu)。
最后，上述聚合物的混合物亦包括在本文中，其中包含在此混合物中的聚合物的量可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)期望的性質(zhì)例如上文所述的性質(zhì)來選擇。在此方面，如果所得聚合物混合物的總摩爾質(zhì)量與混合物的單個聚合物的相應(yīng)的摩爾百分數(shù)與另一聚合物混合物相同的話，則聚合物的混合物可以認為是與另一聚合物混合物在化學(xué)上是相同的 (“化學(xué)上相同的聚合物”)。優(yōu)選地，本文所用(球形)微囊的(球形)核芯(和任選的(球形)微囊的至少一個表面包裹層)的交聯(lián)聚合物(的混合物)包括或者組成為藻酸鹽。如果根據(jù)本發(fā)明用作用于形成(球形)核芯和/或至少一個表面包裹層的聚合物，由于其生物相容性和交聯(lián)性質(zhì)，藻酸鹽是特別有利的。根據(jù)化學(xué)上的觀點，藻酸鹽是得自通過兩種酸的雜聚區(qū)分離的 β-D-甘露糖醛酸和α-L-古羅糖醛酸的均聚組的陰離子型多糖。藻酸鹽是水溶性的并且在單價陽離子例如鈉或鉀的存在下形成高粘度溶液。交聯(lián)水不溶性水凝膠是在單一藻酸鹽鏈與二 _、三-或多價陽離子(例如鈣、鋇或聚賴氨酸)相互作用時形成的。優(yōu)選地，純化的藻酸鹽(例如根據(jù)DE 198 36 960，其具體公開內(nèi)容通過引用并入本文)用于包囊，更優(yōu)選在生理鹽水溶液中的藻酸鉀或藻酸鈉。此類藻酸鹽通常具有約20kDa至約10，OOOkDa的摩爾質(zhì)量，更優(yōu)選約IOOkDa至約1，200kDa的摩爾質(zhì)量。用于形成根據(jù)本發(fā)明使用的(球形)微囊的核芯和/或至少一個表面包裹層的藻酸鹽可以以溶液提供，更優(yōu)選以水溶液提供，例如，0.2% (w/v)的所用藻酸鹽的藻酸鹽水溶液的粘度范圍為約2至約50mPa s，更優(yōu)選范圍為約3至約IOmPa S。如果根據(jù)本發(fā)明使用藻酸鹽，則富含α-L-古羅糖醛酸的那些是優(yōu)選的。換言之，含有至少50% α-L-古羅糖醛酸(和低于50% β-D-甘露糖醛酸)的藻酸鹽是優(yōu)選的。更優(yōu)選地，所用的藻酸鹽含有50%至70% α-L-古羅糖醛酸以及30和 50% β-D-甘露糖醛酸。適用于制備根據(jù)本發(fā)明使用的(球形)微囊的藻酸鹽可以通過從某些藻類包括但不限于褐藻類例如海帶目、水云目、巖藻目等以及產(chǎn)生藻酸鹽的其它種類的藻類提取獲得。藻酸鹽可從新鮮藻類材料或干燥材料中根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的制備藻酸鹽的任何方法分離到。 就選擇的聚合物以及選擇的濃度而言，如本文定義的用于制備本文所用(球形) 微囊的(球形)核芯交聯(lián)聚合物以及本文定義的和/或用于制備(球形)微囊的至少一個表面包裹層的交聯(lián)聚合物可以相同或不同。根據(jù)第一實施方案，用于制備(球形)核芯和至少一個表面包裹層的交聯(lián)聚合物可包含相同或不同濃度的化學(xué)上相同的聚合物。優(yōu)選地，存在于(球形)核芯和至少一個表面包裹層中的聚合物使用選自上文定義的任一聚合物的非交聯(lián)聚合物溶液制備。在此聚合物溶液中，非交聯(lián)聚合物通常以約0.1% (w/v)至約8% (w/v)的非交聯(lián)聚合物濃度，更優(yōu)選以約0.1% (w/v)至約4% (w/v)的非交聯(lián)聚合物濃度，再更優(yōu)選以約0.5% (w/v)至約2. 5% (w/v)的非交聯(lián)聚合物濃度以及最優(yōu)選以約(w/v)至約2% (w/v)的非交聯(lián)聚合物濃度存在。如果使用上文公開的藻酸鹽作為用于制備本文所用(球形)微囊的(球形)核芯和本文定義的交聯(lián)聚合物和/或來制備(球形)微囊的至少一個表面包裹層的聚合物，則用于制備(球形)核芯的聚合物溶液的濃度以及用于制備(球形)微囊的至少一個表面包裹層的聚合物溶液的濃度可以相互獨立地選自0. 1至4% (w/v)的非交聯(lián)聚合物濃度，優(yōu)選0.4至2% (w/v)的非交聯(lián)聚合物濃度。兩種溶液的藻酸鹽濃度可以相同?；蛘?， 可以使用不同的藻酸鹽濃度來制備根據(jù)本發(fā)明使用的(球形)微囊的(球形)核芯和至少一個表面包裹層。優(yōu)選地，用于制備(球形)核芯和/或至少一個表面包裹層的非交聯(lián)聚合物包括化學(xué)上相同的聚合物，更優(yōu)選用相同濃度，例如用含有本文定義的聚合物的本文定義的濃度。在這種情況下，術(shù)語“％ (W/V)”是指非交聯(lián)聚合物的濃度并且通?；谝欢康母稍镄问降木酆衔飳酆衔锶芤豪缭谑狗墙宦?lián)聚合物溶解于適宜溶劑中(在交聯(lián)之前)之后的總體積來確定。然而，如果適用的話，上述濃度還可以改為表示為相應(yīng)于“％ V/V”濃度，例如如果使用在標準條件下(室溫、常壓等)以液體聚集狀態(tài)存在的聚合物。根據(jù)第二實施方案，用于制備(球形)核芯和至少一個表面包裹層的交聯(lián)聚合物可包含相同或不同濃度的的化學(xué)上不同的聚合物。從而，對于(球形)核芯和至少一個表面包裹層來說相互獨立地分別選擇如本文定義的濃度和聚合物。此外，聚合物還可以選自本文定義的聚合物，包括例如天然聚合物、合成聚合物以及聚合物的組合，即嵌段聚合物。用于核芯或至少一個表面包裹層的聚合物在性質(zhì)上的不同也可以是由于使用的不同分子量的聚合物和/或由于相同聚合物的不同交聯(lián)等。 在(球形)微囊包含一個以上的表面包裹層時，在至少一個表面包裹層的每一層中的聚合物可以相同或不同，即每一表面包裹層的交聯(lián)聚合物可包含相同或不同濃度的化學(xué)上相同或不同的聚合物，例如，如本文定義的，根據(jù)本發(fā)明使用的(球形)微囊可包含由本文定義的任一聚合物組成的至少一個表面包裹層以及由如本文定義的聚陽離子例如聚氨基酸例如聚-L-賴氨酸、聚-L-谷氨酸等組成的另外的外表面包裹層。同樣，用于不同表面包裹層的聚合物的性質(zhì)的不同可以是由于所用聚合物的分子量不同和/或由于相同聚合物的不同交聯(lián)等。本文所用(球形)微囊的(球形)核芯還包含細胞。此類細胞通常選自干細胞或基質(zhì)細胞，例如間充質(zhì)干細胞或間充質(zhì)基質(zhì)細，或者選自可用在本發(fā)明上下文中的任何其它細胞(類型)，此類細胞編碼和分泌適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者其片段或變體。此類細胞通過可以通過用核酸或者更確切地具有含有編碼適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)的核酸的載體轉(zhuǎn)染細胞獲得，如下文所定義的。適用于本文所用(球形)微囊(球形)核芯的細胞可以選自(未分化的)干細胞， 包括全能的、多向的或多能的干細胞。用于本上下文的干細胞優(yōu)選包含胚胎干細胞或得自外胚層、中胚層或內(nèi)胚層的干細胞，或者成體干細胞例如(人)間充質(zhì)干細胞或間充質(zhì)基質(zhì)細胞(MSC，hMSC)(例如得自人骨髓或者得自脂肪組織的)、造血干細胞、表皮干細胞、神經(jīng)干細胞和未成熟成纖維細胞，包括來自皮膚的成纖維細胞(成肌纖維細胞)等。這些(未分化的)干細胞通常能夠進行對稱的干細胞分裂，即產(chǎn)生相同復(fù)本的細胞分裂。干細胞保持轉(zhuǎn)化成任何細胞類型的能力。此外，干細胞能夠不對稱地分裂，產(chǎn)生干細胞復(fù)本以及不同于干細胞復(fù)本的另一細胞，例如，分化的細胞。適用于本文所用(球形)微囊的(球形)核芯的如本文定義的干細胞特別是間充質(zhì)干細胞或間充質(zhì)基質(zhì)細胞可另外產(chǎn)生支持編碼和分泌適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者其片斷或變體的效果的一組內(nèi)源性營養(yǎng)因子。對于這種間充質(zhì)基質(zhì)細胞的旁分泌細胞保護機制的生物活性因子可以是例如細胞因子GRO、IL-6、IL-8、MCP-I以及生長因子VEGF、⑶NF和神經(jīng)營養(yǎng)因子-3。根據(jù)一個特別優(yōu)選的實施方案，(球形)微囊的(球形)核芯中的細胞因此會分泌內(nèi)源性蛋白質(zhì)或肽作為以治療水平通過膠囊釋放的選自VEGF、IL6、IL8、GDNF, NT3和MCPl等的旁分泌因子。本文所用(球形)微囊的核芯可以替代地含有選自(分化的)細胞的細胞，例如， 可得自以上干細胞或基質(zhì)細胞的，例如，結(jié)締組織族的細胞，例如，(成熟的)成纖維細胞、 軟骨細胞(軟骨細胞)、骨細胞(成骨細胞/骨細胞、破骨細胞)、脂肪細胞(脂細胞)或平滑肌細胞，或者包括淋巴樣祖細胞的血細胞或由其得到的細胞，例如，NK細胞、T-細胞、 B-細胞或樹狀突細胞，或者通常的骨髓樣祖細胞或由其得到的細胞，例如，樹狀突細胞、單核細胞、巨噬細胞、破骨細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、血小板、巨核細胞或紅細胞，或者巨噬細胞，神經(jīng)元細胞包括星形膠質(zhì)細胞、少突神經(jīng)膠質(zhì)細胞等，或者上皮細胞，或者表皮細胞。這些分化的細胞通常能夠進行對稱細胞分裂，即產(chǎn)生分化的母細胞的相同復(fù)本的細胞分裂。此外，在某些情況下，這些分化的細胞能夠不對稱分裂，產(chǎn)生母細胞的相同復(fù)本和不同于該母細胞的另一細胞，即比該母細胞更進一步分化的細胞。或者，在某些情況下，本文定義的分化的細胞能夠例如通過添加選擇性分化因子進一步分化而不需要細胞分裂。此外，根據(jù)本發(fā)明使用的包埋在(球形)微囊的(球形)核芯中的細胞可以是得自待治療患者自身(自體細胞)的細胞，或者可以得自同種異體細胞(例如得自體外培養(yǎng)的建立的細胞系，例如HEK293細胞、hTERT-MSC細胞等)。由于根據(jù)本發(fā)明使用的使(球形) 核芯包埋在(球形)微囊中的表面包裹層中，其容許使用同種異體細胞而不會由待治療患者激發(fā)任何不期望的免疫反應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明使用的包埋在(球形)微囊的(球形)核芯中的細胞還可以是本文定義的(分化的和/或未分化的)細胞類型的組合。根據(jù)本發(fā)明使用的(球形)微囊的(球形)核芯可以含有，例如，人間充質(zhì)干細胞或人間充質(zhì)基質(zhì)細胞，其中這些細胞的一部分可以在體外或體內(nèi) 分化成如本文定義的細胞類型，例如脂肪細胞(適用于移植到脂肪組織) 等。因此，各種細胞類型(例如得自特定的干細胞類型)可以被分配在核芯中，例如分享共有細胞系?？傊?，根據(jù)本發(fā)明使用的適用于制備(球形)微囊的(球形)核芯的細胞可選自未分化的或分化的細胞。根據(jù)一個實施方案，本文定義的未分化的細胞可以是優(yōu)選的。此類未分化的細胞可提供有利的性質(zhì)，例如根據(jù)本發(fā)明使用的(球形)微囊的長效作用，例如延長表達和分泌適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者其片段或變體的能力，例如由于此類未分化的細胞的較久的生存期。在一個替代實施方案中，本文定義的分化的細胞可優(yōu)選用于制備根據(jù)本發(fā)明使用的(球形)微囊的(球形)核芯，因為它們通常不再會增殖并因此不會在根據(jù)本發(fā)明使用的(球形)微囊的(球形)核芯內(nèi)導(dǎo)致不期望的細胞增殖。細胞的特異性分化可根據(jù)本領(lǐng)域已知方法由本領(lǐng)域技術(shù)人員在體外通過添加選擇性分化因子到前體細胞中來進行。優(yōu)選地，細胞是以這樣的方式分化，即包埋在根據(jù)本發(fā)明使用的(球形)微囊的(球形)核芯中的大多數(shù)細胞(或至少90%，更優(yōu)選至少95%以及最優(yōu)選至少99% )屬于相同細胞類型。特別地，如本文定義的間充質(zhì)干細胞可以在體外分化成例如成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞如脂細胞、神經(jīng)元樣細胞如腦細胞等，并相應(yīng)地應(yīng)用于本文。關(guān)于是未分化的還是分化的細胞用于制備如本文定義的(球形)微囊的(球形)核芯，其可取決于所治療疾病的具體需求，例如患病位置、施用方式、用于植入的所選組織等。適宜細胞的選擇可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員評估這些標準來進行。 此外，適用于制備如本文定義的(球形)微囊的(球形)核芯的細胞可以是永生化或非永生化細胞，優(yōu)選永生化細胞。如果使用永生化細胞，這些細胞優(yōu)選保持它們?nèi)缟衔挠懻摰膶ΨQ和/或不對稱細胞分化的能力。根據(jù)本發(fā)明，當(dāng)細胞超過正常細胞(即非永生化細胞)的2倍生存期時，細胞被定義為永生的。正常二倍體細胞在體外的最大生存期會因細胞類型(例如胎兒對成人細胞)和培養(yǎng)條件而改變。因此，體外培養(yǎng)的正常細胞的最大生存期為大約60-80群體倍增數(shù)。例如，角質(zhì)化細胞可以分化約80次，成纖維細胞在50 次以上，淋巴細胞約20次。正常骨髓基質(zhì)細胞可具有30-40群體倍增數(shù)的最大生存期。優(yōu)選地，用于制備根據(jù)本發(fā)明使用的(球形)微囊的(球形)核芯的細胞系可以連續(xù)生長超過350群體倍增數(shù)，并且可以仍然保留年幼細胞的正常生長速度特征。使用于制備如本文定義的(球形)微囊的(球形)核芯的細胞永生化的方法是本領(lǐng)域公知的，并且因此可在本文中使用(參見例如WO 03/010305或WO 98/66827，其通過引用并入本文)。一種示例性方法(根據(jù)WO 03/010305)包括例如下列的步驟a)根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標準常規(guī)細胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)細胞，例如，干細胞，特別是得自人骨髓(例如(人)間充質(zhì)干細胞(MSC，hMSC))的干細胞；b)用包含人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)基因或其變體的至少一個片斷的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)所述細胞培養(yǎng)物，其方式是bl)培養(yǎng)包裝細胞系(例如PA317細胞、PG13細胞、Phenix等)，其中所述包裝細胞系是其中產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的細胞，b2)構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(例如得自Moloney鼠白血病病毒等)，其中所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包含人末端著絲粒復(fù)本(hTRT)基因或其變體的至少一個片斷，更優(yōu)選hTERT cDNA 片斷，例如得自 pGRN145 (Geron Corporation)的 3452 堿基對 EcoRI 片斷，b3)用所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染所述包裝細胞系，b4)用所述轉(zhuǎn)染的細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)所述包裝細胞系，優(yōu)選通過使細胞與逆轉(zhuǎn)錄病毒載體離心，b5)用步驟b4)的包裝細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)根據(jù)以上步驟a)的培養(yǎng)細胞，所述細胞包含所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。c)獲得永生化細胞系，其中所述永生化細胞系與步驟a)的細胞相比具有基本上相同的特征和性質(zhì)。結(jié)果，得自人端粒亞單位(hTRT)基因的插入的多核苷酸序列可以被轉(zhuǎn)錄并翻譯以產(chǎn)生功能端粒酶。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，由于密碼簡并，許多多核苷酸序列將編碼相同的端粒酶。此外，端粒酶變體被包含在內(nèi)，其具有與野生型端粒酶序列基本相同的序列，并且保留了野生型端粒酶多肽(例如得自野生型端粒酶多肽中氨基酸的保守替換)的功能。包埋在根據(jù)本發(fā)明使用的(球形)微囊的(球形)核芯中的細胞通常被工程化為編碼和分泌或者自然地編碼和分泌適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者如本文定義的其片段或變體。在本發(fā)明上下文中，適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者如本文定義的其片段或變體可以選自顯示神經(jīng)保護和/或抗血管生成作用或者其它對于眼疾病而言的積極效果(例如抗細胞調(diào)亡作用)的本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何蛋白質(zhì)或肽。在這種情況下，術(shù)語“神經(jīng)保護作用，，優(yōu)選是指神經(jīng)系統(tǒng)中的機理，其保護神經(jīng)元避免例如本文定義的疾病所致的編程性細胞死亡或退化。因此，“神經(jīng)保護因子”優(yōu)選是一種化合物，更優(yōu)選肽，其保護神經(jīng)元免于編程性細胞死亡或退化，優(yōu)選通過使用神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的機理，更優(yōu)選在本文定義的眼疾病的情況下。使用如本文定義的適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者其片段或變體，優(yōu)選如本文定義的神經(jīng)保護因子的眼內(nèi)藥物治療的神經(jīng)保護方面，或者更準確地說細胞保護方面可以幾乎對任何侵襲視網(wǎng)膜包括視神經(jīng)(視網(wǎng)膜的延伸)、角膜內(nèi)皮(在進行性角膜內(nèi)皮營養(yǎng)障礙或其它病癥的情況下)和前房角中的小梁網(wǎng)(例如升高的水體液外流阻力的位置，其導(dǎo)致眼內(nèi)壓升高并因此導(dǎo)致高壓青光眼)的病癥都有效果。這種細胞保護治療法的目標在于防止或至少減緩眼功能所需的細胞的損失。所述治療法的神經(jīng)保護方面/作用對于糖尿病性視網(wǎng)膜病可能是特別重要的，因為糖尿病視網(wǎng)膜微血管病所致視網(wǎng)膜細胞損失是糖尿病性視網(wǎng)膜病眼的視覺性能降低的最重要原因。眼內(nèi)細胞保護治療法還可包括角膜內(nèi)皮和毛細管周皮細胞，在試圖為血液流注而保持這些毛細管開放，或者使它們重新開啟以改善到視網(wǎng)膜組織的受損血液供應(yīng)時，它們特別地受糖尿病病程影響。此外，術(shù)語“抗血管形成作用”優(yōu)選是指抑制血管形成即新血管生長的機制。因此， “抗血管形成因子”優(yōu)選是一種化合物，更優(yōu)選肽，其抑制血管形成，例如新血管的生長，優(yōu)選在本文定義的眼疾病的情況下。適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者如本文定義的其片段或變體可以直接被施用，通過如本文定義的載體編碼，或者經(jīng)由包埋在本文所述的(球形)微囊的(球形)核芯中的細胞來施用。如果如本文定義的適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者如本文所定義的其片段或變體經(jīng)由包埋在本文所述的(球形)微囊的(球形)核芯中的細胞來施用，則包埋在(球形)微囊的(球形) 核芯中的細胞通常被轉(zhuǎn)染，然后用編碼此適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者其片段或變體的核酸序列制備(球形)核芯。這種轉(zhuǎn)染能夠使細胞表達并分泌適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、 抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者其片段或變體。根據(jù)一個特別優(yōu)選的實施方案，適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者如本文定義的其片段或變體可選自本文定義的抗血管形成因子或者其片段或變體。優(yōu)選地，所述抗血管形成因子是本文定義的內(nèi)皮抑制素(Endostatin)或者其片段或變體。內(nèi)皮抑制素是天然存在的膠原XVIII 的20-kDa C-末端分解產(chǎn)物。據(jù)報道其用作抗血管形成劑，類似于血管抑制素和血小板反應(yīng)蛋白。內(nèi)皮抑制素是一種廣譜的血管形成抑制劑，并且可干擾生長因子例如堿性成纖維細胞生長因子(bFGF/FGF-2)和血管生長因子(VEGF)的前-血管形成作用。根據(jù)另一優(yōu)選的實施方案，適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者如本文定義的其片段或變體可選自本文定義的神經(jīng)保護因子或者其片段或變體。優(yōu)選地，所述神經(jīng)保護因子可選自本文定義的 GLP-I肽或GLP-I-融合肽或者本文定義的其片段或變體。根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，所述神經(jīng)保護因子可選自GLP-I肽或者本文定義的其片段或變體。神經(jīng)保護(并且優(yōu)選抗細胞凋亡)因子GLP-I位于充分研究的胰高血糖素基因上，其編碼前胰高血糖素原(參見例如White，J. W.等人.，1986NucleiCACid Res. 14(12)4719-4730)。前胰高血糖素原分子作為一種高分子量前體分子是在胰臟α細胞以及空腸和結(jié)腸L細胞中合成的。前胰高血糖素原是一種180氨基酸激素原并且其序列除了胰高血糖素外還含有相關(guān)結(jié)構(gòu)的兩個序列胰高血糖素樣肽-I(GLP-I)和胰高血糖素樣肽-2 (GLP-2)。在前胰高血糖素原分子中，在GLP-I和GLP-2之間是17氨基酸肽序列(或者更確切地說是15氨基酸序列加C-末端RR切割位點)，插入肽2 (ΙΡ2)。ΙΡ2序列(位于前體分子中的GLP-I和GLP-2之間)在體內(nèi)在GLP-I的氨基酸37之后正常進行蛋白質(zhì)水解裂解。根據(jù)細胞以及環(huán)境，前胰高血糖素原組件因此分裂成不同 的肽，包括GLP-I (1-37)，一種未加工形式的37氨基酸肽。通常，此過程發(fā)生在胰臟和腸中。GLP-I (1-37)序列可進一步被蛋白質(zhì)水解處理成活性GLP-I (7-37)，31氨基酸處理形式或其變性產(chǎn)物GLP-I (7-36) 酰胺。因此，名稱GLP-I (7-37)表示所討論的片斷，當(dāng)從母體肽GLP-I的N-末端開始計算時，包含始于(并且包括)編號7至(并且包括)編號37的氨基酸殘基。GLP-I (7-36)、 GLP-I (7-36)酰胺和GLP-I (7-37)的氨基酸序列在式I (SEQ ID NO 25)中給出His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-A Ia-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-X (I)當(dāng)X是NH2時其表示GLP-I (7-36)酰胺，或者當(dāng)X不存在時其表示GLP-I (7-36)， 并且當(dāng)X是Gly-OH時其表示GLP-I (7-37)。GLP-I是一種胃腸激素，并且是最有效的內(nèi)源性促胰島素劑，其作用包括刺激 β-細胞中的腺嘌呤核苷酸環(huán)化酶和蛋白質(zhì)激酶活性。在生理學(xué)上，其與來自上消化道的胃抑制多肽一起發(fā)揮腸降血糖素激素降低血糖水平的作用。相應(yīng)地，對攝食響應(yīng)而分泌的 GLP-I具有多種作用，例如對共同起調(diào)節(jié)血糖作用的胃、肝、胰臟和腦。因此，胰高血糖素樣肽GLP-I (7-36)酰胺及其非酰胺化類似物GLP-I (7-37)由于它們對碳水化合物代謝的有效作用以及其治療糖尿病包括2型糖尿病的有效應(yīng)用而產(chǎn)生相當(dāng)大的興趣。其它神經(jīng)保護性質(zhì)僅顯示于冠心病的治療中。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，GLP-I肽因此可選自任何已知的GLP-I肽序列，例如如本文定義的。在這種情況下，GLP-I肽可由包埋在(球形)微囊的(球形)核芯中的細胞來分泌，所述細胞因此可優(yōu)選在制備(球形)核芯之前用如本文定義的編碼GLP-I肽的核酸序列來轉(zhuǎn)染，使得這些細胞表達并分泌GLP-I肽。優(yōu)選地，本文應(yīng)用的可由包埋在(球形)微囊中的細胞編碼和分泌的GLP-I肽可選自包含(wt) GLP-I的氨基酸7-35的肽以及與此肽具有至少80%、90%、95%或者甚至99%同一性的肽。通常，GLP-I肽可選自(i)包含 (wt)GLP-l的氨基酸1-37的肽，(ii)包含(wt)GLP-l的氨基酸7-35,36或37的肽，(iii) GLP-I (7-36)酰胺以及(iv)與任意這些肽包括修飾的肽具有至少80%、90%、95%或者甚至99%同一性的肽。在這種情況下，“修飾的GLP-I肽”將表示任何GLP-I變體或GLP-I片段，包括組合，例如變體的片段，其保留(wt)GLP-l的生物學(xué)功能。變體和片段歸類為未修飾的GLP-I序列的修飾，例如GLP-I (7-35,36或37)。在本發(fā)明的含義中，任何變體或片段均具有功能，例如能夠發(fā)揮與未修飾的(GLP-I)肽相同或相似的生物活性。術(shù)語“活性”是指(例如一種或多種生物活性包括受體結(jié)合、受體活化、GLP-I的已知的作用的發(fā)揮，例如其能夠減少由局部缺血或氧缺乏引起的損傷以及與現(xiàn)有技術(shù)描述的GLP-I的作用有關(guān)的上文所述心臟組織的可能死亡的活性，其可以在與如本文定義的天然存在的GLP-I肽及其任何片段或變體相同的條件下相比。優(yōu)選地，如本文定義的GLP-I的肽的變體或片段具有 GLP-I (7-35,36或37)的至少25%活性，更優(yōu)選本文定義的GLP-I (7-35,36或37)的至少 50% (生物)活性，再更優(yōu)選60、70、80或90% (生物)活性以及最優(yōu)選至少95或99 % (生物)活性。生物活性可通過標準分析法測定，其優(yōu)選例如使用用于2型糖尿病等的動物模型等來測定作為腸降血糖素激素降低血糖水平的活性。根據(jù)一個特別優(yōu)選的實施方案，如本文定義的可以通過包埋在(球形)微囊的 (球形)核芯中的細胞來編碼的GLP-I肽或GLP-融合肽肽在其N-末端不包括天然存在的本文定義的(天然的)GLP-I (1-37)序列的氨基酸1至6。再更優(yōu)選地，如本文定義的該GLP-I 肽或者下文定義的GLP-融合肽在其N-末端不包括本文定義的天然GLP-I (1-37)序列的天然存在的氨基酸1、2、3、4、5和/或6。該條件優(yōu)選是指如本文定義的GLP-I肽，例如選自包含GLP-I的氨基酸7-35、36或37的肽，GLP-I (7-36)酰胺以及與這些肽的任一個的同一性至少80%、90%、95%或者甚至99%的肽，包括修飾的肽和含有此GLP-I肽的融合GLP-I 融合肽。然而，該條件不排除如本文定義的GLP-I肽或者如本文定義的GLP-I融合肽包含 N-末端(或C-末端)序列修飾或與其融合的其它氨基酸或肽，例如信號肽序列和/或引導(dǎo)肽序列等，然而區(qū)別于wt GLP-I的氨基酸1至6的序列。在另一優(yōu)選實施方案中，連接到其同系物的GLP-I (7-35,36或37)的N-末端的任何氨基酸與天然存在的GLP-I (7-35, 36或37)的6位的氨基酸不一致。根據(jù)另一優(yōu)選的實施方案，(直接)連接到其同系物的 GLP-l(7-35、36或37)的N-末端的任意氨基酸與天然GLP-1，優(yōu)選以其GLP-I的天然順序， 與天然的GLP-I的天然存在的氨基酸6，天然存在的氨基酸5和6，天然存在的氨基酸4、5 和6，天然存在的氨基酸3、4、5和6，天然存在的氨基酸2、3、4、5和6，或者天然存在的氨基酸1、2、3、4、5和6不一致。根據(jù)一個特別優(yōu)選的實施方案，連接到其同系物的GLP-I (7-35, 36或37)的N-末端的任何氨基酸與前胰高血糖素原的序列不一致。天然GLP-1，特別是GLP-I (7-36)，在體內(nèi)經(jīng)受短的半衰期，并因此限制了在一般的治療性治療中的應(yīng)用，在此一般的治療性治療中要嚴格避免頻繁施用，或者需要長期施用。GLP-I在血漿中通過DPP-IV(二肽基肽酶IV)在殘基8和9之間在數(shù)分鐘內(nèi)迅速降解， 產(chǎn)生失活的NH2-末端截短代謝物GLP-I (9-36)。另外，天然GLP-I通常會經(jīng)歷腎臟排泄。這些因素產(chǎn)生了問題，因為對于此肽，GLP-I (7-36)或者NH2-末端截短代謝物GLP-I (9-36)， 在體內(nèi)是活性部分，并且不論其生理效應(yīng)是由天然GLP-I還是其片段發(fā)揮治療應(yīng)用。作為結(jié)果并且由于其在體內(nèi)迅速降解，天然GLP-I或其片段可用作用于短期代謝對照的適宜工具，例如有可能用于急性眼疾病患者的加強監(jiān)護病房。為了避免這種快速降解，已經(jīng)進行了各種嘗試來合成天然存在的GLP-I的穩(wěn)定的 (對抗被DPP-IV降解)類似物(例如GLP-I (7-37))。特別地，第8殘基，其在體內(nèi)是Ala，被另一殘基例如 Gly、Ser 或 Thr 替換(Burcelin, R.等人· (1999)Metabolism 48，252-258)。 GlyS或G8類似物已被廣泛測試，二者作為合成的分子，以及通過基因工程化來分泌突變體多肽的細胞系來產(chǎn)生的(Burcelin, R.，等人.(1999)，Annals of the New York Academy of Sciences 875:277-285)。各種其它修飾已被引入到例如GLP-1 (7-37)中，以增強其體內(nèi)穩(wěn)定性而不會折損其生物活性。這種方法通過使GLP-I的穩(wěn)定來對抗被DPP-IV降解，例如通過另外施用具有 GLP-I肽的DPP-IV抑制劑來防止半衰期短的問題發(fā)生。另外施用具有GLP-I肽的DPP-IV 抑制劑是復(fù)雜的，并且通常不會產(chǎn)生期望的長期治療，因為DPP-IV抑制劑僅在體外系統(tǒng)中有效應(yīng)用。此外，需要GLP-I的患者仍然要在長時間內(nèi)，即與他或她罹患要治療的疾病一樣長的時間內(nèi)，或者更嚴重的是在整個生命期內(nèi)，接受一劑或多劑GLP-I或其類似物或變體。 這意味著，反復(fù)施用藥物變成必需的。然而，施用到眼中可能是痛苦的并且會產(chǎn)生注射相關(guān)的眼內(nèi)感染或者眼內(nèi)結(jié)構(gòu)的機械損傷的風(fēng)險。此外，GLP-I在體內(nèi)相對短的半衰期需要在短間隔內(nèi)再施用藥物。由于這是一種侵入性的過程，GLP-I的劑量應(yīng)由醫(yī)生來施用。它們不能由患者自己施用，因為損傷圓錐形晶狀體(導(dǎo)致白內(nèi)障)或視網(wǎng)膜(導(dǎo)致視網(wǎng)膜剝離) 的風(fēng)險將是高得不可接受的。此外，藥物的反復(fù)眼內(nèi)施用還可能與對圓錐形晶狀體和視網(wǎng)膜的醫(yī)源性損傷的累積風(fēng)險有關(guān)，并且經(jīng)常反復(fù)施用時還與感染的累積風(fēng)險有關(guān)。因此非常期待開發(fā)顯著減少必要的反復(fù)施用的次數(shù)的操作方法和技術(shù)。因此，根據(jù)一個替代實施方案，適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者如本文定義的其片段或變體可以是選自GLP-I融合肽或者本文定義的其片段或變體的神經(jīng)保護因子。本文使用的GLP-I融合肽可以由包埋在本文定義的(球形)微囊的(球形)核芯中的細胞編碼和分泌。在這種情況下，包埋在本文定義的(球形)微囊的(球形)核芯中的細胞通常在制備所述核芯之前用編碼GLP-I融合肽的核酸序列轉(zhuǎn)染，使得這些細胞編碼、表達并分泌GLP-I融合肽。如本文定義的GLP-I融合肽具有至少兩個組件，例如組件(I)和(II)，組件(I)和 (III)，或者組件(I)、(II)和(III)，顯示出如本文定義的GLP-I的生物活性，并且同時，通常通過C-末端延伸賦予GLP-I融合肽的組件(I)穩(wěn)定性。如本文定義的GLP-I融合肽的組件(I)通常含有如上文定義的GLP-I肽的序列，優(yōu)選與SEQ ID NO=I具有至少80%，更優(yōu)選至少85%并且再更優(yōu)選至少90%序列同一性的序列。SEQ ID NO 1表示GLP-I (7_37) 的天然氨基酸序列(31個氨基酸長度)，其在哺乳動物中嚴格保守的。根據(jù)一個特別優(yōu)選的實施方案，如本文定義的GLP-I融合肽的組件(I)含有與SEQ ID NO :1相同的序列，或者缺少SEQ ID NO 1的氨基酸36和/或37的序列。GLP-I融合肽的組件(II)，其可由包埋在如本文定義的(球形)微囊的(球形)核芯中的細胞來編碼和分泌，(或者更為普遍的包括融合肽的片段或變體的任何GLP-I肽)， 通常含有具有至少9個氨基酸的肽序列。GLP-I融合肽通常在其組件(II)中具有9至30， 優(yōu)選9至20，最優(yōu)選9至15個氨基酸的序列長度。一般而言，與較長的序列相比，組件(II) 中的較短的序列由于它們對GLP受體優(yōu)良的結(jié)合活性而優(yōu)選。組件(II)的序列，盡管不是必須的，可優(yōu)選是中性的，或者可在PH7時具有負電荷。GLP-I融合肽的組件(II)還可在其序列中含有至少一個脯氨酸殘基。脯氨酸殘基是形成四聚體氨基酸序列的β-翻轉(zhuǎn)內(nèi)的共有氨基酸。因此，GLP-I融合肽的組件(II)可形成翻轉(zhuǎn)樣結(jié)構(gòu)。翻轉(zhuǎn)結(jié)構(gòu)是一種典型的蛋白質(zhì)或肽的二級結(jié)構(gòu)組件。其通常通過四個氨基酸的伸展來形成，其使肽或蛋白質(zhì)的主鏈方向的方向反向。如果存在于GLP-I融合肽中，則脯氨酸殘基通常位于GLP-I融合肽的組件(II)中出現(xiàn)的四聚體翻轉(zhuǎn)序列基序的2或3位，優(yōu)選位于2位。GLP-I融合肽的組件(II)，其可通過包埋在如本文定義的(球形)微囊的(球形) 核芯中的細胞編碼和分泌，(或者更為普遍地，包括融合肽的片段或變體的任何GLP-I肽) 可含有選自下列的序列基序VAIA、IAEE, PEEV, AEEV, EELG, AAAA, AAVA, AALG, DFPE, AADX, AXDX和XADX，其中X表示任何氨基酸(天然存在的或者修飾的非天然氨基酸)。這些四聚體基序可以位于組件(II)的序列中的任何地方。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明融合肽組件(II)是通過選自AA、XA、AX、RR、RX和XR的其N-末端序列基序連接到組件⑴ 的C-末端的肽序列，其中X表示任何氨基酸(天然存在的或修飾的非天然氨基酸)?？赏ㄟ^包埋在如本文定義的(球形)微囊的(球形)核芯中的細胞編碼和分泌的作為GLP-I融合肽的組件(II)特別優(yōu)選的是含有相應(yīng)于人或鼠IP-2的部分序列的序列 SEQ ID NO 48 =X1X1DFPX2X2X3X4的肽序列，其中各個X1通常相互獨立地選自任何天然存在的氨基酸，優(yōu)選精氨酸(R)或丙氨酸(A)，更優(yōu)選丙氨酸(A)，或者可以不存在；其中各個&通常相互獨立地選自天冬氨酸(D)或谷氨酸(E)，并且其中各個X3和X4通常相互獨立地選自任何天然存在的氨基酸，優(yōu)選丙氨酸(A)、甘氨酸(G)、異亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蘇氨酸(T) 或纈氨酸(V)。X4也可以不存在?？赏ㄟ^包埋在如本文定義的(球形)微囊的(球形)核芯中的細胞編碼和分泌的作為GLP-I融合肽的組件(II)再更優(yōu)選的是含有根據(jù)SEQ ID NO 22 (RRDFPEEVAI)、SEQ ID NO :27(DFPEEVAI)、SEQ ID NO 28 (RDFPEEVA)或 SEQ ID NO :29 (RRDFPEEV)、SEQ ID NO: 30 (AADFPEEVAI)、SEQ ID NO 31 (ADFPEEVA)或 SEQ ID NO 32 (AADFPEEV)的序列的肽序列 (全部肽序列以單字母代碼給出)，或者是與SEQ ID NO :22、27、28、29、30、31或32具有至少80%序列同一性的序列。SEQ ID N0:22是全長IP-2(插入肽2)序列的部分序列，其含有 15個氨基酸長的全長IP-2序列的10個N-末端氨基酸。IP-2是本文所用組件(II)的優(yōu)選實例。相應(yīng)地，本文定義的GLP-I融合肽的組件(II)中含有的其它更強烈優(yōu)選的序列是 IP-2的更長的部分氨基酸序列，例如存在于人中的14個N-末端氨基酸序列(SEQ ID N0 23 (RRDFPEEVAIVEEL))或其鼠復(fù)本(SEQ ID NO :24 (RRDFPEEVAIAEEL))，或者序列(SEQ ID NO 33 (AADFPEEVAIVEEL))或(SEQ ID NO :34 (AADFPEEVAIAEEL))，或者與 SEQ ID NO :23、 24、33或34具有至少80%序列同一性的序列。作為包含在GLP-I融合肽的組件(II)中的元件最最優(yōu)選的是具有天然存在的IP-2序列的全部15個氨基酸的全長IP-2序列(SEQ ID NO 2 (RRDFPEEVAIVEELG)，人，或者 SEQ ID NO 3 (RRDFPEEVAIAEELG)，鼠，或者 SEQ ID NO 35 (AADFPEEVAIVEELG)，或者 SEQ ID NO 36 (AADFPEEVAIAEELG))，或者與 SEQ ID NO :2、3、 35或36具有至少80%序列同一性的序列。在本發(fā)明范圍內(nèi)還有IP2的全部哺乳動物亞型 (哺乳動物中IP2的天然變體)?？梢蕴峁┌ㄔ诮M件(II)中的序列的一個以上的復(fù)本， 例如IP2的2個、3個或更多個復(fù)本或者IP2的片段或變體。相應(yīng)地，通過包埋在本文定義的(球形)微囊的(球形)核芯中的細胞編碼和分泌的GLP-I融合肽優(yōu)選含有、包含或組成為序列SEQ ID NO 8 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAA KEFIAWLVKGRGRRDFPEEVAIAEELG)，即無任何連接子序列通過其C-末端連接到鼠IP2的 GLP-I (7-37)；或者序列 SEQ ID NO 12 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFPEEVAIV EELG)，即無任何連接子序列通過其C-末端連接到人IP2的GLP-I (7-37)；或者序列SEQ ID NO 37 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGAADFPEEVAIAEELG),即無任何連接子序列通過其 C-末端連接到 IP2 的 GLP-I (7-37)；或者序列 SEQ ID NO 38 (HAEGTFTSDVSSYLEG QAAKEFIAWLVKGRGAADFPEEVAIVEELG)，即無任何連接子序列通過其C-末端連接到IP2的 GLP-I (7-37)；或者序列 SEQ ID NO 39 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFAEEVAIAE ELG)，SEQ ID NO 40(HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDAAAAVAIAEELG), SEQ ID NO: 41(HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGAADAAAAVAIAAALG), SEQ ID NO. 42(HAEGTFTSDVSS YLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFP), SEQ ID NO 43 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFPEE VA), SEQ ID NO 44(HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFPEEVAIAEELGRRHAC), SEQ ID NO 45 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFAEEVAIVEELG),SEQ ID NO 46(HAEGTFTSDV SSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDAAAAVAIVEELG), SEQ ID NO 47 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWL VKGRGAADAAAAVAIVAALG)或者 SEQ ID NO 48 (HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGRRDFPEE VAIVEELGRRHAC)，即無任何連接子序列通過其C-末端連接到IP2序列的特定類似物或其變體的GLP-I (7-37)。與SEQ ID NO :8、12以及37至48具有至少80%序列同一性的其變體或片段同樣可用于本文。本文中優(yōu)選的GLPl-融合肽還包括序列SEQ ID N0:13、14、19和 20。不受任何理論的束縛，本發(fā)明的發(fā)明人斷定，GLP-1(7_35、36或37)的不穩(wěn)定性， 例如如果在體內(nèi)通過包埋在植入的根據(jù)本發(fā)明使用的(球形)微囊的(球形)核芯中的細胞分泌進入患者外圍組織，原因在于其未保護的3-維結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)酶可分解GLP-I (7-35、 36或37)肽并在體內(nèi)迅速消除其生理活性。通過使肽序列連接到GLP-l(7-35、36或37)的 C-末端，其結(jié)構(gòu)獲得針對酶降解的穩(wěn)定性。如果另外的C-末端肽序列(包含在根據(jù)本發(fā)明的融合肽的組件(II)中的)向后折疊，例如由于存在通過其一級結(jié)構(gòu)并給組件(II)提供剛性而形成的翻轉(zhuǎn)結(jié)構(gòu)元件，則可以增加這種穩(wěn)定性的獲得。由于其優(yōu)選包含翻轉(zhuǎn)結(jié)構(gòu)元件的C-末端肽延伸，發(fā)現(xiàn)如本文定義的GLP-I融合肽改善了對DPP-IV失活的抵抗力。所述C-末端肽在作用于其靶細胞中的受體之前不會從GLP-l(7-35、36或37)序列分解，或者其在體內(nèi)經(jīng)酶分解而形成GLP-I (7-35,36或37)。與在GLP-I受體的位置結(jié)合的 GLP-I肽的確切形式無關(guān)，如本文定義的GLP-I肽發(fā)揮其作為有效的神經(jīng)保護化合物的功能。GLP-I肽序列被認為由于形成β-翻轉(zhuǎn)元件的一級結(jié)構(gòu)而適合于如本文定義的GLP-I 融合肽的組件(II)，所述GLP-I肽序列可容易地通過適當(dāng)?shù)睦绶止夤舛确?，例如圓二色譜法，或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法來識別。可通過包埋在如本文定義的(球形)微囊的(球形)核芯中的細胞編碼和分泌的 GLP-I融合肽的組件(II)和組件(I)可以直接連接或者通過連接子序列連接。優(yōu)選地，兩組件相互直接連接。在它們通過連接子(或者間隔區(qū))連接的情況下，所述連接子優(yōu)選是肽連接子。所述肽連接子通常具有1-10個氨基酸，優(yōu)選1-5，再更優(yōu)選1-3個氨基酸的長度，在某些情況下所述連接子序列可能甚至更長，包含11-50個氨基酸。所述肽連接子可以由不同的(天然存在的)氨基酸序列組成。優(yōu)選地，所述肽連接子將在連接的組件之間引入一些結(jié)構(gòu)柔性。結(jié)構(gòu)柔性是例如通過具有在連接子序列內(nèi)含有不同的甘氨酸或脯氨酸殘基，優(yōu)選至少30%，更優(yōu)選至少40%并且再更優(yōu)選至少60%脯氨酸和甘氨酸殘基的肽連接子來實現(xiàn)的。與特定序列無關(guān)，肽連接子可優(yōu)選是免疫學(xué)上無活性的?？赏ㄟ^包埋在如本文定義的(球形)微囊的(球形)核芯中的細胞編碼和分泌的GLP-I融合肽可以另外含有組件(III)。通常，組件(III)包含至少四個氨基酸殘基，優(yōu)選至少10個另外的氨基酸殘基，更優(yōu)選至少20個或者最優(yōu)選至少30個。就功能而言，組件(III)將進一步增強本文定義的GLP-I肽的穩(wěn)定性。期望組件(III)不干擾GLP-I融合肽的生物學(xué)功能，其大約與GLP-I (7-37)的生物活性相當(dāng)。通常而言，如本文定義的組件 (I)的任何C-末端延伸，不論它是如本文定義的組件(II)、組件(III)還是組件(II)和 (III)的組合，均會增強組件(I)的穩(wěn)定性，所述組件(I)即如上文定義的GLP-I肽，例如 GLP-I (7-35,36或37)或本文定義的其片段或變體。優(yōu)選地，如本文定義的GLP-I融合肽的組件(III)包含任意哺乳動物組織的GLP-2 的同種型的N-末端序列的至少4個，優(yōu)選至少10個，更優(yōu)選至少20個另外的氨基酸殘基 (在哺乳動物中GLP-2的其它天然存在的變體)，例如顯示于SEQ ID NO :4和5中的鼠或人同種型。GLP-2出現(xiàn)在胰高血糖素原中，并且還與碳水化合物代謝有關(guān)。在本發(fā)明的情況下， 術(shù)語“GLP-2肽”優(yōu)選是指GLP-2 (1_33、34、或35)，而“修飾的GLP-2肽”將表示任何GLP-2 片段或變體，或者GLP-2(l-33、34或35)的片段或變體。變體或片段歸類為未修飾的序列例如GLP-2(l-33、34或35)的變體。由于具有包括在組件(I)中的生物活性序列(GLP-1 肽)，組件(III)還可包含GLP-2的天然存在形式的變體或片段。另選地，組件(III)還可包含GLP-I (7-37)的(N-末端)序列的至少4個，優(yōu)選至少10個，更優(yōu)選至少20個另外的氨基酸殘基，相應(yīng)地包括全部哺乳動物同種型或者一如本文公開的一其全部功能片段或變體。通常而言，組件(III)可含有GLP-I肽或修飾的GLP-I肽的任何形式，其公開于本文中適用于GLP-I融合肽的組件(I)。在進一步備選方案中，組件(III)還可含有GLP-I (7-37) 和GLP-2的嵌合形式。嵌合形式可通過使GLP-I (7-37)和GLP-2 (或者片段或變體)相互偶聯(lián)并且通過隨后將作為組件(III)的嵌合形式引入到GLP-I融合肽中來制備。優(yōu)選地， 嵌合形式由GLP-I (7-37)的部分序列和GLP-2的部分序列連接在一起組成。例如，嵌合形式可包括GLP-I的N-末端5-30氨基酸以及GLP-2的C-末端5_30氨基酸，或者相反， 例如GLP-I (7-37)的氨基酸7或8至22、23、24、25、26、27或28以及GLP-2的從位置15、 16、17、18、19、20、21、22、23或24到例如C-末端的氨基酸序列。如果分別地包含GLP-2或 GLP-I (7-37)的天然存在形式的修飾作為組件(III)，則組件(III)優(yōu)選分別含有SEQ ID NO :1、4或5的序列，或者具有與SEQ ID NO :1、4或5的任一個至少80%序列同一性的序列。在另一實施方案中，可由包埋在如本文定義的(球形)微囊的(球形)核芯中的細胞編碼和分泌的GLP-I融合肽的組件(III)可含有多個序列，如上文針對組件(I)、(II) 或(III)所述的。例如組件(III)可含有GLP-I (7-37)和/或GLP-2的至少2個，優(yōu)選2、 3或4個復(fù)本，或者與SEQ ID NO :1、4或5具有至少80%序列同一性的序列的至少2個復(fù)本。此外，組件(III)可含有如上文公開的GLP-I (7-37)或GLP-2的嵌合形式的一個以上的復(fù)本，例如與GLP-I (7-37)和/或GLP-2或者與至少80%序列同一性的其變體一起最終形成嵌合體形式的組合。由包埋在如本文定義的(球形)微囊的(球形)核芯中的細胞編碼和分泌的GLP-I融合肽還可包含2個或更多個，優(yōu)選2個組件(III)，其例如可以(1)通過其N-末端連接到組件(I)或(II)的C-末端，和(2)通過其C-末端經(jīng)連接子或直接地連接到組件⑴的N-末端。如果提供2個組件(III)，它們可以相同或不同。根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，可由包埋在如本文定義的(球形)微囊的(球形)核芯中的細胞編碼和分泌的GLP-I融合肽可以包含以上組件(I)、(II)和(III)。含有全部這些組件的具體實施方案優(yōu)選選自SEQ ID NO 6 (N-GLP-1 (7-37) -IP2 (鼠)-RR-GLP-I (7-37 )-C，在本文亦稱為鼠 CMl)，SEQ ID NO :7(N-GLP-l(7-37)-IP2(鼠)-RR-GLP2-C，在本文亦稱為鼠 CM2)，SEQ ID NO 10 (N-GLP-1 (7-37) -IP2 (人)-RR-GLP-I (7-37) -C,亦稱為人 CMl)， 以及 SEQ ID NO 11 (N-GLP-1 (7-37) -IP2 (人)-RR-GLP-2-C)，在本文亦稱為人 CM2)，或者與 SEQ ID NO :6、7、10或11或者其片段或變體具有至少80%序列同一性的序列。在前述序列中，術(shù)語“N”和“C”表示這些融合肽的N-和C-末端。全部的序列SEQ ID N0:6、7、10和11 在IP2(組件(II))的C-末端含有RR-連接子(2個精氨酸殘基)，其還可另選被放棄。在根據(jù)SEQ ID N0:6、7、10或11的每一個實施方案中的組件(I)是GLP-I (7_37)，而(在連接到組件(II)的C-末端的這些實施方案中的每一個中的)組件(III)是GLP-I (7-37)或者GLP-2。在這種情況下優(yōu)選的GLPl-融合肽可進一步包含序列SEQ ID NO :15、16、17、18 和26。在本發(fā)明另一優(yōu)選的實施方案中，可由包埋在如本文定義的(球形)微囊的(球形)核芯中的細胞編碼和分泌的GLP-I融合肽除了組件(I)外還含有組件(III)(無本文定義的任何組件(II))，其連接到組件(I)的C-末端和/或組件(I)的N-末端。優(yōu)選地， 組件(III)位于組件(I)的C-末端。與組件(III)是連接到組件(I)的N-末端(通過其 C-末端)還是連接到組件(I)的C-末端(通過其N-末端)無關(guān)，偶聯(lián)可以是直接的或者間接地經(jīng)由連接子序列連接。關(guān)于連接子序列，其是指用作連接GLP-I融合肽的組件(I) 和組件(II)的連接子的GLP-I融合肽的以上公開內(nèi)容。在本發(fā)明的一個另外優(yōu)選的實施方案中，可由包埋在如本文定義的(球形)微囊的(球形)核芯中的細胞編碼和分泌的GLP-I融合肽除了組件(I)和(II)外還含有組件 (III)，其連接到組件(II)的C-末端和/或連接到組件(I)的N-末端。優(yōu)選地，組件(III) 位于組件(II)的C-末端。與組件(III)是連接到組件(I)的N-末端(通過其C-末端) 還是連接到組件(II)的C-末端(通過其N-末端)無關(guān)，偶聯(lián)可以是直接的者間接地經(jīng)由連接子序列連接。關(guān)于連接子序列，其還是指用作連接GLP-I融合肽的組件(I)和組件
(II)的連接子的GLP-I融合肽的以上公開內(nèi)容。可由包埋在根據(jù)本發(fā)明使用的(球形)微囊的(球形)核芯中的細胞編碼和分泌的GLP-I融合肽，除了融合蛋白質(zhì)的組件的上述組合的任一種(即組件(I)和(II)，組件(I)和(III)或者組件(I)、(II)和(III))外，可進一步包括載體蛋白質(zhì)，特別是轉(zhuǎn)鐵蛋白或白蛋白，作為組件(IV)。這樣的組件(IV)可直接地或者使用本文定義的連接子連接到GLP-I融合蛋白質(zhì)的組件的上述組合的任一種即組件⑴和/或(II)，組件⑴和/或
(III)或者組件⑴、(II)和/或(III)的N-和/或C-末端。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，如本文定義的可通過包埋在本文所用(球形) 微囊(球形)核芯中的細胞編碼和分泌的GLP-I (融合)肽含有作為組件(I)和/或(III) 的修飾的GLP-I肽，其包括下式II的氨基酸序列Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaal6-Ser-Xaal8-Xaal9-Xaa20-Gl u-Xaa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xaa36_Xaa37,其中Xaa7 是 L-組氨酸；Xaa8 是 Ala、Gly、Val、Leu、lie 或 Lys，而 Gly 是特別優(yōu)選的；Xaal6 是 Val 或 Leu ；Xaal8 是 Ser、Lys 或 Arg ；Xaal9 是 Tyr 或 Gln ；Xaa20 是 Leu 或Met ；Xaa22 是 Gly 或 Glu ；Xaa23 是 Gln、Glu、Lys 或 Arg ；Xaa25 是 Ala 或 Val ；Xaa26 是 Lys> Glu 或 Arg ；Xaa27 是 Glu 或 Leu ；Xaa30 是 Ala、Glu 或 Arg ；Xaa33 是 Val 或 Lys ；Xaa34 是 Lys, Glu、Asn 或 Arg ；Xaa35 是 Gly ；Xaa36 是 Arg、Gly 或 Lys 或者酰胺或者不存在；Xaa37 是Gly、Ala、Glu、Pr0、LyS、酰胺或者是不存在，其中，如果在治療如本文定義的眼疾病時，如本文定義的GLP-I (融合)肽通過包埋在本文所用(球形)微囊(球形)核芯中的細胞編碼和分泌以施用于有需要的患者，則優(yōu)選選擇這些氨基酸，或者其中Xaa7是L-組氨酸、D-組氨酸、脫氨基_組氨酸、2-氨基-組氨酸、3-羥基-組氨酸、高組氨酸、N-乙?；?組氨酸、 α -氟甲基_組氨酸、α -甲基-組氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸或4_吡啶基丙氨酸；Xaa8 是 Ala、Gly、Val、Leu、Ile、LyS、Aib、(1_ 氨基環(huán)丙基)羧酸、(1_ 氨基環(huán)丁基) 羧酸、(1-氨基環(huán)戊基)羧酸、(1-氨基環(huán)己基)羧酸、(1-氨基環(huán)庚基)羧酸或(ι-氨基環(huán)辛基)羧酸，而Gly是特別優(yōu)選的；Xaal6是Val或Leu ；Xaal8是Ser,Lys或Arg ；Xaal9是 Tyr 或 Gln ；Xaa20 是 Leu 或 Met ；Xaa22 是 Gly、Glu 或 Aib ；Xaa23 是 Gin、Glu、Lys 或 Arg ； Xaa25 是 Ala 或 Val ；Xaa26 是 Lys> Glu 或 Arg ；Xaa27 是 Glu 或 Leu ；Xaa30 是 Ala、Glu 或 Arg ；Xaa33 是 Val 或 Lys ；Xaa34 是 Lys、Glu、Asn 或 Arg ；Xaa35 是 Gly 或 Aib ；Xaa36 是 Arg、 Gly或Lys或者酰胺或者不存在；Xaa37是Gly、Ala、Glu、Pro、Lys、酰胺或者是不存在，其中如果如本文定義的GLP-I (融合)肽在治療如本文定義的眼疾病時是直接提供給有需要的患者，則優(yōu)選選擇這些氨基酸。在本發(fā)明的再另一個具體的實施方案中，如本文定義的且如通過包埋在本文所用 (球形)微囊(球形)核芯中的細胞編碼和分泌的GLP-I (融合)肽的組件(I)和/或(III) 含有包括下式III的氨基酸序列的修飾的GLP-I肽Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaal8-Tyr-Leu-Glu-Xaa22 -Xaa23-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37,其中Xaa7 是 L-組氨酸；Xaa8 是 Ala、Gly、Val、Leu、lie、Lys, ；Xaal8 是 Ser、Lys 或 Arg ；Xaa22 是 Gly 或 Glu ；Xaa23 是 Gln、Glu、Lys 或 Arg ；Xaa26 是 Lys、Glu 或 Arg ；Xaa30 是 Ala、Glu 或 Arg ；Xaa34 是 Lys、Glu 或 Arg ；Xaa35 是 Gly ；Xaa36 是 Arg 或 Lys、酰胺或者是不存在；Xaa37是Gly、Ala、Glu或Lys、酰胺或者是不存在，其中，如果在治療如本文定義的眼疾病時，如本文定義的GLP-I (融合)肽通過包埋在本文所用(球形)微囊(球形)核芯中的細胞編碼和分泌以施用于有需要的患者，則優(yōu)選選擇這些氨基酸，或者其中Xaa7是 L-組氨酸、D-組氨酸、脫氨基-組氨酸、2-氨基-組氨酸、-羥基-組氨酸、高組氨酸、N-乙?；?組氨酸、α-氟甲基-組氨酸、α-甲基-組氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸或4-吡啶基丙氨酸；Xaa8是Ala、Gly、Val、Leu、Ile、LyS、Aib、(1_氨基環(huán)丙基)羧酸、 (1-氨基環(huán)丁基)羧酸、(ι-氨基環(huán)戊基)羧酸、(ι-氨基環(huán)己基)羧酸、(ι-氨基環(huán)庚基) 羧酸或(1-氨基環(huán)辛基)羧酸；Xaal8是Ser、Lys或Arg ；Xaa22是Gly、Glu或Aib ；Xaa23 是 Gln、Glu、Lys 或 Arg ；Xaa26 是 Lys、Glu 或 Arg ；Xaa30 是 Ala、Glu 或 Arg ；Xaa34 是 Lys> Glu或Arg ；Xaa35是Gly或Aib ；Xaa36是Arg或Lys、酰胺或者是不存在；Xaa37是Gly、 Ala、Glu或Lys、酰胺或者是不存在，其中，如果在治療如本文定義的眼疾病時，如本文定義的GLP-I (融合)肽直接提供給有需要的患者，則優(yōu)選選擇這些氨基酸。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，使用GLP-I (融合)肽，其可以通過包埋在本文所用(球形)微囊(球形)核芯中的細胞編碼和分泌，其中組件(I)和/或(III)含有修飾的(修飾的)GLP-I 肽，其選自 GLP-I (7-35)、GLP-I (7-36)、GLP-I (7-36)-酰胺、GLP-I (7-37) 或其變體、類似物或衍生物。還優(yōu)選的是在其組件(I)和/或(III)中包含修飾的GLP-I肽的GLP-I (融合)肽，所述修飾的GLP-I肽在8位具有Aib殘基，或者在所述GLP-I肽的7位具有氨基酸殘基，在治療如本文定義的眼疾病時，如果如本文定義的GLP-I (融合)肽直接提供給有需要的患者，則所述氨基酸殘基優(yōu)選選自D-組氨酸、脫氨基_組氨酸、2-氨基-組氨酸、羥基-組氨酸、高組氨酸、N-乙?；?組氨酸、α-氟甲基-組氨酸、α-甲基-組氨酸、3-吡啶基丙氨酸、2-吡啶基丙氨酸和4-吡啶基丙氨酸。在另一特別優(yōu)選的實施方案中，使用GLP-I (融合)肽，其可以通過包埋在本文所用(球形)微囊(球形)核芯中的細胞編碼和分泌，其中如本文由式II和III定義的 GLP-I (融合)肽的組件⑴和/或(III)的兩個實施方案可以與對于GLP-I (融合)肽的以上給出的公開內(nèi)容組合。換言之，通式II和III可以例如與對于組件(II)、連接子、制備方法等的以上給出的公開內(nèi)容組合。如本文定義的GLP-I肽或GLP-I融合肽，優(yōu)選如上文定義的GLP-I融合肽的組件(I)，以及它們的片段和變體優(yōu)選被保護以對抗上文所述的蛋白質(zhì)水解分解，更優(yōu)選對抗 DPP-IV。相應(yīng)地，如本文定義的這樣的GLP-I肽或GLP-I融合肽以及它們的片段和變體，特別是GLP-I融合肽，可含有抗DPP-IV的GLP-I的序列，例如GLP-1 (7-35,36或37)(在GLP-1 融合肽作為組件⑴和/或(III)的一部分的情況下)。在這種情況下，肽對二肽基氨基肽酶IV的降解的抗性可以例如通過以下降解分析法來測定在合適緩沖液中在ρΗ 7-8(緩沖劑，不是白蛋白)下使多份的肽在37°C下與一份純化二肽基氨基肽酶IV培養(yǎng)4-22小時。通過添加三氟乙酸終止酶反應(yīng)，再使肽降解產(chǎn)物分離并使用HPLC或LC-MS分析來定量。進行此分析的一種方法是將混合物施加到Zorbax300SB-C18 (30nm孔，5 μ m顆粒)150 X 2. Imm 柱中，并以0. 5ml/min流量洗脫，使用乙腈在0. 三氟乙酸中的線性梯度(0% -100%乙腈，經(jīng)30min)。肽和其降解產(chǎn)物可以通過它們在214nm(肽鏈)或280nm(芳族氨基酸)的吸收來監(jiān)測，并通過它們的峰面積的積分來定量。降解模式可通過使用LC-MS來測定，其中可以測定分離峰的MS譜。在給定時間處完整/降解化合物百分數(shù)用于評估肽DPP-IV穩(wěn)定性。在上文中，當(dāng)在給定時間基于完整化合物百分數(shù)其比GLP-I (7-37)的未修飾肽序列穩(wěn)定10倍時，如本文定義的GLP-I肽或GLP-I融合肽，優(yōu)選如上文定義的GLP-I融合肽的組件(I)及其片段和/或變體被定義為DPP-IV穩(wěn)定的。因此，DPP-IV穩(wěn)定的GLP-I肽或GLP-I融合肽，優(yōu)選如上文定義的GLP-I融合肽的組件(I)，優(yōu)選比例如GLP-I (7-37)穩(wěn)定至少10倍，更優(yōu)選至少20倍?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法來評價穩(wěn)定性，例如將DPP-IV添加到待測肽溶液中并通過測定肽的例如經(jīng)歷一段時間的降解(參見上文)， 通過例如分光法、蛋白質(zhì)印跡分析法和抗體篩選法等測定。并行地，GLP-I肽或GLP-I融合肽，優(yōu)選如上文定義的GLP-I融合肽的組件⑴及其片段和/或變體被定義為一種化合物，其通過例如與其天然受體(GLP-1受體)結(jié)合而發(fā)揮GLP-I (7-37)的效用。優(yōu)選地，如本文定義的GLP-I (融合)肽或GLP-I融合肽及其片段和/或變體具有與GLP-I受體的結(jié)合親和力，其相當(dāng)于天然存在的GLP-I肽的結(jié)合親和力的至少10%，優(yōu)選至少50%。結(jié)合親和力可通過任何合適的方法測定，例如表面等離子體共振等。此外，優(yōu)選的是如本文定義的GLP-I (融合)肽或GLP-I融合肽及其片段和/或變
26體通過其與它的向細胞傳遞信號的細胞外受體結(jié)合而引起細胞內(nèi)cAMP的形成。根據(jù)另一優(yōu)選的實施方案，如本文定義的適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)，或者GLP-I融合肽的單一組件，特別是組件(I)、(II)和(III)和/或如上文所述的整個GLP-I融合肽可選自這些肽或蛋白質(zhì)序列的修飾的形式。各種修飾的形式，特別是上文所述整個GLP-I融合肽的修飾的形式，可以通過包埋在本文所用(球形)微囊(球形)核芯中的細胞編碼和分泌，或者可以直接用于眼疾病的治療。這些修飾的形式公開于下文，并且更詳細地描述，并且包含例如適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的以上神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者GLP-I融合肽的單一組件特別是組件(I)、(II)和(III)和/或上文所述整個GLP-I融合肽的片段、變體等。在這種情況下，這些肽或蛋白質(zhì)的片段和/或變體可以與其天然肽或蛋白質(zhì)在天然的、非-修飾的氨基酸序列的整個長度上具有至少40 %、50 %、 60%,70%,80%,優(yōu)選至少90%，更優(yōu)選至少95%以及最優(yōu)選至少99%的序列同一性。這同樣可以適用于各自的(編碼的)核酸序列。如本文定義的術(shù)語“序列同一性“通常是指序列比較如下。為了確定兩個氨基酸序列的同一性百分數(shù)，可以將所述序列為最佳比較的目的而對齊(例如可以在第一氨基酸序列的序列中引入空位)。然后可以比較在相應(yīng)氨基酸位置處的氨基酸。當(dāng)在第一序列中的一個位置被與第二序列中相應(yīng)位置處的相同氨基酸占據(jù)時，則所述分子在此位置相同。 兩個序列之間的同一性百分數(shù)是由兩個序列共享的相同位置的數(shù)量的函數(shù)，例如當(dāng)提及特定的肽與確定長度的參比多肽具有特定的同一性百分數(shù)時，所述同一性百分數(shù)是相對于所述參比肽的。因此，與100個氨基酸長的參比多肽相同50%的肽可以是一個50個氨基酸多肽，其與參比多肽的50個氨基酸長的部分完全相同。其還可以是100個氨基酸長度的多肽，在它的整個長度上與參比多肽有50%相同。當(dāng)然，其它多肽將符合相同標準。兩個序列的同一性百分數(shù)的這種確定可使用數(shù)學(xué)算法來完成。用于比較兩個序列的數(shù)學(xué)算法的優(yōu)選的、非限制性的實例是Karlin等人(1993)，PNAS USA，90 :5873_5877的算法。將這種算法引入NBLAST程序，所述程序可用于識別與本發(fā)明的氨基酸序列具有期望同一性的序列。為了獲得比較目的的空位比對，可以使用如Altschul等人(1997)，Nucleic Acids Res, 25 3389-3402中所述的Gapped BLAST。當(dāng)使用BLAST和Gapped BLAST程序時，可以使用各個程序的缺省參數(shù)(例如，NBLAST)。所述序列可進一步使用Genetic Computing Group's GAP (總體對齊程序)的第9版本，使用缺省(BL0SUM62)矩陣(值_4至+11)進行比對，其中空位打開罰分為-12 (對于空位的第一零值)而空格延伸罰分為_4(在空位中每一另外的連續(xù)零值)。對齊之后，通過將匹配的數(shù)表示為所要求保護的序列中的氨基酸數(shù)的百分數(shù)來計算同一性百分數(shù)。兩個氨基酸序列的同一性百分數(shù)的所述測定方法可以相應(yīng)地適用于核酸序列。在本發(fā)明的情況下，適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的抗血管形成因子、神經(jīng)保護因子、任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)的“片段”，GLP-I融合肽的單一組件特別是組件(I)、 (II)或(III)等的片段，和/或上文所述整個GLP-I融合肽的片段通常是指這些肽或蛋白質(zhì)的任一片段。通常，這樣的片段包括一個短肽，其保留了期望的生物活性，特別是天然肽或蛋白質(zhì)的期望的生物活性，例如如本文定義的抗血管形成因子、神經(jīng)保護因子、其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)的期望的生物活性，單個組件(I)、(II)或(III)等的期望的生物活性，和/或上文所述整個GLP-I融合肽的期望的生物活性，就其氨基酸序列(或其編碼的核酸序列)而言，與天然肽或蛋白質(zhì)的氨基酸序列(或其編碼的核酸序列)相比所述片段是在 N-末端、C-末端和/或序列內(nèi)截短的。這種截短可因此發(fā)生于氨基酸水平或者相應(yīng)地發(fā)生于核酸水平上。對于例如適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/ 或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者其片段或變體，生物功能性片段可以容易地通過從肽分子的任一端除去氨基酸(在肽或氨基酸水平上)并針對如本文定義的其生物學(xué)性質(zhì)測試所得肽或蛋白質(zhì)來鑒別。可替代地，用于一次從天然肽或蛋白質(zhì)的N-末端和/或C-末端除去一個或多個氨基酸的蛋白酶可以用于確定保留期望的生物活性的片段。最后，片段可能是由于在肽末端處的氨基酸和/或位于肽序列內(nèi)的氨基酸的剔除。此外，適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)的“變體”，GLP-I融合肽的單一組件特別是組件(I)、(II)或(III)等的變體，和/或上文所述整個GLP-I融合肽的變體優(yōu)選包含蛋白序列或其編碼核酸序列(或其片段)，其中天然蛋白質(zhì)或肽序列的氨基酸被交換。從而，可以產(chǎn)生適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)(的變體)， GLP-I融合肽的單一組件特別是組件(I)、(II)或(III)等(的變體)，和/或上文所述整個GLP-I融合肽(的變體)，其具有與在一種或多種突變體中的天然蛋白質(zhì)或肽序列不同的氨基酸序列，所述突變體例如一種或多種取代的、插入的和/或剔除的氨基酸。優(yōu)選地，與適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的全長的天然神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)，GLP-I融合肽的單一組件特別是組件(I)、(II)或(III)等，和/或上文所述整個GLP-I融合肽相比，這些變體具有大致相同或改善的生物活性。如本文定義的這種變體可以通過編碼所合成的變體的DNA序列中的突變來制備。剔除、插入和取代的任意組合也可包含于適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)的變體，GLP-I融合肽的單一組件特別是組件(I)、(II)或(III) 等的變體，和/或上文所述整個GLP-I融合肽的變體中，條件是最終獲得的變體具有期望的生物活性。顯然，在編碼變體肽的DNA中制備的突變體必須不改變讀碼框并且優(yōu)選不會產(chǎn)生可產(chǎn)生二級mRNA結(jié)構(gòu)的互補區(qū)域。相應(yīng)地，與適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的天然的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)，GLP-I融合肽的單一組件特別是組件(I)、(II)或(III) 等，和/或上文所述整個GLP-I融合肽相比，適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子的變體、抗血管形成因子的變體或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)的變體，GLP-I融合肽的單一組件特別是組件(I)、(II)或(III)等的變體，和/或上文所述整個GLP-I融合肽的變體，也可以含有側(cè)面連接氨基酸序列的N-/或C-末端或者甚至兩個末端的另外的氨基酸殘基。例如，這樣的變體可包含含有側(cè)面連接GLP-I肽或GLP-I融合肽的氨基酸序列的N-/ 或C-末端或者甚至兩個末端的另外的氨基酸殘基的如本文定義的GLP-I肽或GLP-I融合肽。只要得到的GLP-I肽或GLP-I融合肽保留它對于蛋白酶的耐受性或穩(wěn)定性以及其發(fā)揮如本文定義的能力，人們就可以通過常規(guī)實驗法確定任何此類側(cè)面連接殘基是否影響核芯肽的基本性質(zhì)，例如通過其對于GLP-I已知的有益效果。術(shù)語“基本組成為”，當(dāng)指如本文定義的具體的GLP-I肽時，是指可以存在不影響具體GLP-I肽的基本性質(zhì)的另外的側(cè)面連接殘基。這一術(shù)語通常不理解為在該具體序列中的取代、缺失或添加。
適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)的“變體”，GLP-I融合肽的單一組件特別是組件(I)、(II)或(III)等的 “變體”，和/或上文所述整個GLP-I融合肽的“變體”，還可以指與其天然序列相比包含保守氨基酸取代的分子。來源于相同類型的氨基酸相互交換的取代稱為保守取代。特別地，這些是具有脂肪族側(cè)鏈、帶正電荷或負荷的側(cè)鏈、在側(cè)鏈中為芳香基團的氨基酸，或者是其側(cè)鏈可以進入氫橋的氨基酸例如具有羥基功能的側(cè)鏈的氨基酸。這意味著，例如具有極性側(cè)鏈的氨基酸被另一具有類似極性側(cè)鏈的氨基酸取代，或者例如，特征為疏水側(cè)鏈的氨基酸被另一具有類似疏水側(cè)鏈的氨基酸取代。插入和取代是可能的，特別是在對三維結(jié)構(gòu)不引起修飾或者不會影響結(jié)合區(qū)域的那些序列位置。通過插入或缺失對三維結(jié)構(gòu)修飾可以容易地例如使用 CD 譜(圓二色譜)來確定(Urry，1985，Absorption，Circular Dichroism and ORD of Polypeptides,在 Modern Physical Methods in Biochemistry 中，Neuberger 等人·(編)，Elsevier, Amsterdam)。適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)的變體，GLP-I融合肽的單一組件特別是組件(I)、(II)或(III)等的變體， 和/或上文所述整個GLP-I融合肽的變體，因此還可以指基本上與適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的整個神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)，GLP-I融合肽的單一組件特別是組件(I)、(II)或(III)等，和/或上文所述整個GLP-I融合肽或其片段相似的分子。此類變體肽可以使用本領(lǐng)域公知的方法方便地制備。當(dāng)然，這樣的變體具有適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的天然抗血管形成因子、神經(jīng)保護因子、其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)，GLP-I融合肽的單一組件特別是組件(I)、(II)或(III)等，和/或上文所述整個 GLP-I融合肽所已知的類似的有益作用。所述有益作用是，例如對于GLP-1，象相應(yīng)天然存在的GLP-I肽那樣，其大幅度減小由局部缺血或缺氧引起的損傷以及心臟組織的可能死亡的活性?？梢园谶m用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)的變體，GLP-I融合肽的單一組件特別是組件(I)、(II)或 (III)等的變體，和/或上文所述整個GLP-I融合肽的變體中的保守氨基酸取代的類型，可以基于不同種屬的同源蛋白質(zhì)/肽之間的氨基酸變化的頻率分析?；谶@樣的分析，保守取代可以在本文中定義為在以下5組之一內(nèi)的交換I.小的、脂肪族的、非極性的或弱極性的殘基:Ala, Ser, Thr，Pro, Gly ；II.極性的、帶負電荷的殘基及其酰胺Asp，Asn, Glu, Gln ；III.極性的、帶正電荷的殘基His，Arg，Lys ；IV.大的、脂肪族的非極性殘基:Met, Leu, lie, Val, Cys ；V.大的芳香族殘基:Phe, Try, Trp0在前述組內(nèi)，以下取代基被認為是“高度保守的”:Asp/Glu、His/Arg/Lys, Phe/ Tyr/Ti^Met/Leu/Ile/Val。半-保守取代定義為在以上組(I)-(IV)的兩個之間交換，它們限于包含以上(I)、(II)和(III)的超級組(A)，或者限于包含以上(IV)和(V)的超級組(B)。取代不限于遺傳編碼的或者甚至天然存在的氨基酸。在上述含義中同源氨基酸殘基的優(yōu)選組的優(yōu)選的保守氨基酸取代特別地包括，但不限于體酸
隨殘
Ser Arg Leu Pro Thr Ala Val Gly Ile Phe Tyr Cys His Gln Asn Lys Asp Glu Met
Ser,Thr,Gly,Asn
Arg, Gin, Lys, Glu, His
He, Phe, Tyr, Met, Val, Leu
Gly, Ala5(Thr), Pro
Pro, Ser, Ala, Gly, His, Gin, Thr
Gly, Thr5Pro, Ala
Met, Tyr, Phe, He, Leu, Val
Ala, (Thr), Pro, Ser, Gly
Met, Tyr, Phe, Val, Leu, lie
Trp, Met, T^r, He, Val, Leu, Phe
Trp, Met, Phe, lie, Val, Leu, Tyr
Ser, Thr, Cys
Glu, Lys, Gin, Thr, Arg, His
Glu, Lys, Asn, His, (Thr), Arg, Gln
Gin, Asp, Ser, Asn
Glu, Gin, His, Arg, Lys
Glu, Asn, Asp
Asp, Lys, Asn, Gin, His, Arg, GIu
Phe, He, Val, Leu, Met
TrpTrp 此外，適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)的變體，GLP-I融合肽的單一組件特別是組件(I)、(II)或(III)等的變體，和/或上文所述整個GLP-I融合肽的變體，還可含有氨基酸取代，例如意圖是改善溶解度(用親水氨基酸取代疏水氨基酸)。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，可由如本文定義的包埋在(球形)微囊的(球形) 核芯中的細胞編碼和分泌的如本文定義的GLP-I肽或GLP-I融合肽包括GLP-I肽(出現(xiàn)在 GLP-I融合肽的組件⑴和/或(III)中)，所述GLP-I肽的特征為在GLP-I肽的位置7、8、 11、12、16、22、23、24、25、27、30、33、34、35、36或37有一個或多個取代。例如，對于以下名稱，[Arg34-GLP-1 (7-37)]表示其中在34位天然存在的賴氨酸被精氨酸取代的GLP-I類似物。具體地，如本文定義的GLP-I肽或者GLP-I融合肽的組件⑴和/或(III) 與 GLP-I (7-35、36、37 或 38)的變體相應(yīng)，包括例如 Thrl6-Lysl8-GLP_1 (7-37)， 以及 Lysl8-GLP-1(7-37)、Arg34_GLP_l(7-37)、Lys38-Arg26-GLP_1(7-38) -OH、 Lys36-Arg26-GLP-1 (7-36) , Arg26，34-Lys38-GLP-1(7_38)、Arg26, 34-Lys38-GLP-l (7-38)、Arg26, 34-Lys38-GLP_l (7-38)、Arg26, 34-Lys38-GLP-l (7-38)、 Arg26, 34-Lys38-GLP-l (7-38)、Arg26-Lys38-GLP-1 (7-38)、Arg26-Lys38-GLP-1 (7-38)、 Arg34-Lys38-GLP-1 (7-38)、Ala37-Lys38-GLP_1 (7-38)和 Lys37_GLP_l (7-37)。更一般來講，本文所述的任何GLP-I變體(特別是根據(jù)式II或III)可以通過在38位添加Lys殘基而被修飾。如果如上文所述的GLP-I肽或GLP-I融合肽在眼疾病的治療中直接施，則如本文定義的的GLP-I肽或者GLP-I融合肽的組件(I)和/或(III)可另外與GLP-I (7_35，36，37 或 38)的變體包括 Gln9-GLP-1 (7-37)、D-Gln9-GLP_1 (7-37)、乙酰基-Lys9-GLP_1 (7-37)相應(yīng)。在本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的實施方案中，如本文定義的GLP-I肽或GLP-I融合肽(就組件⑴或(III)而言)是/含有(修飾的)GLP-I肽，其選自GLP-I (7-35)、 GLP-I (7-36)、GLP-I (7-36)-酰胺、GLP-I (7-37)或者其片段或變體。適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)，和/或如上文所述的GLP-I融合肽或者其片段或變體，在由包埋在(球形)微囊的(球形)核芯中的細胞編碼和分泌的情況下，可以為體外對照目的而從表達它的細胞中(并因此從微囊中)分離，例如使用常規(guī)分離技術(shù)。因此細胞可以在適宜的條件下例如包括載體和營養(yǎng)物，在體外生長，分泌的蛋白質(zhì)，即適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)，和/或如上文所述的GLP-I 融合肽或者其片段或變體，在由包埋在(球形)微囊的(球形)核芯中的細胞編碼和分泌的情況下，從細胞外培養(yǎng)基中回收。用于轉(zhuǎn)染到細胞中的基因工程化的(載體)序列因此優(yōu)選包括信號(肽)序列(參見下文)，其允許如本文定義的神經(jīng)保護因子或抗血管形成因子的分泌(參見下文)。在這種情況下，適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)，和/或如上文所述的GLP-I融合肽或者其片段或變體，在由包埋在(球形)微囊的(球形)核芯中的細胞編碼和分泌的情況下，可以自然地內(nèi)源性地與信號序列融合，或者可以通過基因工程方法在引入到細胞中的編碼核酸序列轉(zhuǎn)染之后與信號序列融合。在一種替代方案中，編碼這些肽的基因工程化的基因序列不
31包括此類信號肽序列，從而細胞內(nèi)表達的肽通常將不會被分泌，并且可以通過涉及細胞溶解的過程從細胞中回收。在此類方法中，編碼的序列可包括純化標簽，其能夠從培養(yǎng)基中有效提取產(chǎn)物肽；標簽可以被分解以釋放分離的本文定義的神經(jīng)保護或抗血管形成因子。然而，這一替代方案通常與根據(jù)本發(fā)明使用的(球形)微囊的細胞無關(guān)，所述細胞被植入到患者中并需要體內(nèi)將表達和分泌的如本文定義的神經(jīng)保護或抗血管形成因子遞送至周圍組織中。根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)，和/或如上文所述的GLP-I融合肽或者其片段或變體，在由包埋在(球形)微囊的(球形)核芯中的細胞編碼和分泌的情況下，可以由載體編碼，其中此載體通常是適用于此目的的載體。更優(yōu)選地，如果此載體序列例如在降解時從細胞中被釋放，則此載體不是病毒載體，優(yōu)選不是腺病毒載體，以避免任何由于病毒序列所致的副作用。如果未另外說明，任何上述實施方案和特征可相互組合。如上文所述的，適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)，和/或如上文所述的GLP-I融合肽或者其片段或變體，可通過包埋在(球形)微囊的(球形)核芯中的細胞編碼和分泌。根據(jù)一個進一步特別優(yōu)選的實施方案，包埋在(球形)微囊的(球形)核芯中的細胞可以被進一步修飾或基因工程化為另外分泌選自抗細胞凋亡因子、生長因子、VEGF和促紅細胞生成素(EPO)、抗血小板因子、抗凝血因子、抗凝血藥、抗血管形成因子或任何其它因子的因子，例如適用于(眼內(nèi)) 治療眼疾病的蛋白質(zhì)或蛋白樣物質(zhì)，例如多肽如睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)、神經(jīng)膠質(zhì)衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(⑶NF)、神經(jīng)生長因子(NGF)、腦衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、NT3、營養(yǎng)素(nurturin)、成纖維細胞生長因子(FGF)、ATF、凝血酶敏感素的片段、其變體等，例如FGF 類,例如酸性 FGF (aFGF)、堿性 FGF (bFGF)、FGF-I 和 FGF-2。根據(jù)一個具體的實施方案，編碼和分泌適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)的或者如本文定義的其片段或變體的包埋在(球形)微囊的(球形)核芯中的細胞可以被基因工程化為另外分泌促紅細胞生成素(EPO)。促紅細胞生成素(也稱為ΕΡ0、紅細胞生成素(印oetin)或普羅克里特 (procrit))是一種以多種形式出現(xiàn)的大約34，000道爾頓分子量的酸性糖蛋白激素，包括 α、β、ω等。促紅細胞生成素刺激紅血細胞生成。其產(chǎn)生于腎中并刺激在骨髓和其它地方中的定型的紅細胞前體的分裂和分化。通常，當(dāng)身體在健康狀態(tài)下，促紅細胞生成素以非常低的濃度存在于血漿中，其中組織從存在數(shù)量的紅細胞中接受充足的氧合作用。這種正常的低濃度足以刺激通過老化而正常喪失的紅血細胞的置換。當(dāng)循環(huán)中血細胞的氧運輸減少時，循環(huán)中的促紅細胞生成素的量在例如缺氧的條件下增加。缺氧可以由通過出血而大量失血、紅細胞過量接觸輻射而破壞、因高海拔或長時間意識不清導(dǎo)致氧攝取減少、或者各種形式的貧血或局部缺血而引起。在應(yīng)對組織經(jīng)歷缺氧負荷時，促紅細胞生成素會通過刺激骨髓中原始前體細胞轉(zhuǎn)變成前成紅細胞而增加紅血細胞產(chǎn)生，所述前成紅細胞接著發(fā)育成熟，合成血紅蛋白并以紅血細胞的形式釋放到循環(huán)中。當(dāng)循環(huán)中的紅血細胞數(shù)大于正常組織氧需求的需要時，循環(huán)中的促紅細胞生成素降低。促紅細胞生成素可通過包埋在(球形)微囊中的細胞以一定濃度和一定持續(xù)時間表達(或者可以被提供)，所述濃度或持續(xù)時間不會誘發(fā)紅血細胞形成或者另外地，增加受試者中的血細胞比容，例如在約IpM至低于1000 μ M之間，包括低于900 μ Μ、低于700 μ Μ、低于500 μ Μ、低于300 μ Μ、低于100 μ M或低于50μΜ。在其它實施方案中，促紅細胞生成素是以受試者體重的函數(shù)施用。促紅細胞生成素通常以約lU/kg至10，000U/kg受試者體重的濃度提供，包括低于7，500U/kg、5，000U/kg、 2500U/kg、1000U/kg、750U/kg、500U/kg、250Ug/kg、100Ug/kg、50U/kg、2OT/kg、10U/kg、5U/ kg或lU/kg。在這種情況下，促紅細胞生成素血清濃度正常地在5-50mU/ml的范圍內(nèi)。對于罹患如本文定義的眼疾病或病癥的患者，優(yōu)選罹患如本文定義的視網(wǎng)膜病或與其相關(guān)的其它病情的患者，促紅細胞生成素優(yōu)選地以50-100U/kg的濃度提供，這取決于癥狀、體重、 性別、動物種類等。通常假定優(yōu)選維持血濃度在約l-100mU/ml間的治療選項。根據(jù)另外一個具體實施方案，編碼和分泌適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者如本文定義的其片段或變體的包埋在(球形)微囊的核芯中的細胞可以被基因工程化為另外分泌VEGF。根據(jù)另一具體實施方案，編碼和分泌適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、 抗血管形成因子、任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)和/或如上文所述的GLP-I融合肽或者如本文定義的其片段或變體的包埋在(球形)微囊的核芯中的細胞可以被基因工程化為另外分泌抗細胞凋亡因子。此類因子可包括但不限于APC(具有半胱天冬酶募集域的細胞凋亡抑制劑)、Bcl-2、Bcl-xL、Che-l/AATF、叢生蛋白、胰島素、Mcl-l、NF-kB-依賴性抗細胞凋亡因子、血清素、生存素等。此外，作為針對本領(lǐng)域已知的細胞凋亡因子的抑制因子并因此被認為是抗細胞凋亡因子的任何因子因此被包括在內(nèi)。此類因子優(yōu)選被核酸編碼并通過編碼和分泌適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子、任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)和/或如上文所述的GLP-I融合肽或者其片段或變體的細胞分泌。在這種情況下，這種抗細胞凋亡因子可以直接針對下列細胞凋亡因子或細胞凋亡相關(guān)蛋白質(zhì)的至少一個，包括 AIF，Apaf 例如 Apaf-I、Apaf-2、Apaf-3，oderAP0-2 (L)，AP0-3 (L)，凋亡酶，Bad, Bak, Bax, Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-xs,bik, CAD,鈣蛋白酶，半胱天冬酶例如半胱天冬酶_1，半胱天冬酶_2，半胱天冬酶_3，半胱天冬酶-4，半胱天冬酶-5，半胱天冬酶-6，半胱天冬酶-7，半胱天冬酶_8，半胱天冬酶_9，半胱天冬酶-10，半胱天冬酶-11，ced-3，ced-9, c-Jun, c-Myc, crm Α,細胞紅素 C，CdRl，DcRl，DD, DED, DISC, DNA-PKcs, DR3, DR4, DR5, FADD/M0RT-1，F(xiàn)AK, Fas (Fas-配體 CD95/fas (受體))，F(xiàn)LICE/MACH, FLIP,胞襯蛋白，fos, G-肌動蛋白，Gas-2, 凝膠溶素,粒酶 A/B，I CAD, ICE, JNK，核纖層蛋白 A/B，MAP, MCL-I, Mdm-2, MEKK-I, M0RT-1, NEDD, NF-KB, NuMa, p53，PAK-2，PARP，穿孔蛋白，PITSLRE, PKC δ，pRb，早老素，prICE，RAIDD, Ras, RIP，鞘磷脂酶，來自單純性皰疹的胸腺嘧啶核苷激酶(thymidinkinase), TRADD, TRAF2, TRAIL-Rl, TRAIL-R2, TRAIL-R3，轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶等。包埋在根據(jù)本發(fā)明使用的(球形)微囊的(球形)核芯中的細胞，其編碼和分泌適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者其片段或變體例如內(nèi)皮抑制素、GLP-I肽或者如本文定義的GLP-I融合肽， 可以進一步編碼和分泌另外的因子，例如本文定義的抗細胞凋亡劑VEGF等。為了這些目的，如本文定義的神經(jīng)保護因子或抗血管形成因子或其片段或變體以及其它任選的因子由至少一個核酸序列編碼，所述核酸序列通常在制備(球形)微囊的(球形)核芯之前轉(zhuǎn)染到細胞中。這些核酸序列可以天然地存在于細胞中或者可以通過細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)在制備(球形)微囊之前引入細胞中。根據(jù)本發(fā)明，可以使用任何合適的核酸序列。
根據(jù)一個實施方案，編碼適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者其片段或變體如內(nèi)皮抑制素、GLP-I肽或者如本文定義的GLP-I融合肽以及如本文定義的任選的另外的因子如抗細胞凋亡劑、VEGF 等的核酸序列可選自任何核酸，更優(yōu)選選自適合于編碼(至少一種)肽或蛋白質(zhì)的任何核酸，即編碼核酸，例如編碼DNA，例如選自基因組DNA、cDNA、DNA寡核苷酸，或者編碼RNA，例如選自(短)RNA寡核苷酸、信使RNA (mRNA)等。在本發(fā)明的情況下，mRNA通常是一種RNA， 其由若干結(jié)構(gòu)元件組成，例如任選的5’ -UTR區(qū)域，位于編碼區(qū)之前的上游位置的核糖體結(jié)合位點，任選的3’-UTR區(qū)域，其可在是聚-A尾(和/或聚-C-尾)之前。mRNA可以以單-、 二-或者甚至多順反子RNA的形式出現(xiàn)，即攜帶一種、兩種或多種如上文所述的蛋白質(zhì)或肽的編碼序列的RNA。二 -或者甚至多順反子mRNA形式的這種編碼序列可以通過至少一個 IRES序列來分離。所述至少一個核酸序列還可以是核糖體RNA (rRNA)、轉(zhuǎn)移RNA (tRNA)或病毒RNA(vRNA)。此外，所述至少一個核酸序列可以是環(huán)狀或線性核酸，優(yōu)選線性核酸。此外， 所述至少一個核酸序列可以是單鏈或雙鏈核酸序列(由于兩個單鏈核酸的非共價連接，其也可以視為是上述含義范圍內(nèi)的核酸)或者部分雙鏈或部分單鏈核酸，其至少部分地自我互補(這些部分雙鏈或部分單鏈核酸兩者通常由較長的和較短的單鏈核酸形成，或者由兩個長度大約相等的單鏈核酸形成，其中一個單鏈核酸與另一單鏈核酸部分互補，并且二者因此在此區(qū)域形成雙鏈核酸，即部分雙鏈或部分單鏈核酸)。由于遺傳密碼的簡并，多個核酸序列可編碼適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的這種神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者其片段或變體例如內(nèi)皮抑制素、GLP-I肽或者如本文定義的GLP-I融合肽以及本文定義的任選的另外的因子例如抗細胞凋亡劑、VEGF等。根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案，如本文定義的用于轉(zhuǎn)染細胞的核酸序列可包含如上文定義的任何核酸序列，優(yōu)選如本文定義的適用于轉(zhuǎn)染細胞的核酸序列，其可編碼(a)適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和 /或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者其片段或變體例如內(nèi)皮抑制素或GLP-I肽，特別是整個GLP-I氨基酸序列(GLP-1 (1-37)或者功能性GLP-I (7-35,36或37)(變體)序列或者任何其它GLP-I肽，包括如本文定義的GLP-I融合肽，編碼(b)任選根據(jù)(a)的GLP-I序列的N-末端處的蛋白質(zhì)酶分解序列，以及任選編碼(b)上游區(qū)的信號肽序列，以及(c)任選編碼如上文所述的其它因子。優(yōu)選地，該信號(肽)序列是選自下文定義的序列。相應(yīng)地，所得到的氨基酸序列可由信號肽序列、任選的蛋白質(zhì)酶分解序列以及生物學(xué)有效的因子，即適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者其片段或變體，例如內(nèi)皮抑制素、GLP-I肽或本文定義的GLP-I融合肽 (和任選的本文定義的其它因子，例如抗細胞凋亡劑、VEGF等)(從N-至C-末端)組成。 從而，信號肽序列和蛋白質(zhì)酶分解序列優(yōu)選地是與宿主細胞(中天然存在的序列)是異源性的，并且在GLP-I (5-37,6-37或7_37)及其如上文定義的變體的情況下優(yōu)選不同于以上條件的定義范圍內(nèi)的天然GLP-I的氨基酸1至6。如本文定義的核酸序列可以包含在載體中。相應(yīng)地，包埋在根據(jù)本發(fā)明使用的 (球形)微囊的(球形)核芯中的細胞可以含有包含如本文之前定義的核酸的載體。此載體可用于轉(zhuǎn)染如本文定義的細胞以制備根據(jù)本發(fā)明使用的(球形)微囊。通常，此載體，特別是表達載體含有至少一個如本文定義的核酸序列，編碼元件(a)和任選的如上文所述的(b)和/或(C)，并且必要時，本文所述的另外的元件，例如適用于直接表達編碼元件(a)和任選的如上文所述的(b)和/或(c)以及任選的編碼其它因子例如抗細胞凋亡因子、VEGF 等的元件。本文使用的一類載體利用DNA元件，所述DNA元件提供得自動物病毒(例如牛乳頭狀瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒或SV40等)的自主復(fù)制的染色體外質(zhì)粒。本文使用的第二類載體依賴于使期望的基因序列整合到宿主細胞染色體中。適合于在將細胞包埋在根據(jù)本發(fā)明使用的(球形)微囊的(球形)核芯之前轉(zhuǎn)染細胞的此類載體通常通過將至少一個核酸序列編碼元件(a)和任選的如上文所述的(b) 和/或(c)例如適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者如本文定義的其片段或變體如內(nèi)皮抑制素、GLP-I肽或如本文定義的GLP-I融合肽以及任選的如本文定義的其它因子插入到適宜的(空)載體中來制備。這樣的適合的(空)載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且綜述于例如“Cloning Vectors" (Eds. Pouwels P. H.等人· Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985，ISBN O 444 904018)中。適合的(空)載體還將包括本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何載體，例如質(zhì)粒， 噬菌體，病毒例如SV40、CMV、桿狀病毒(Baculo virus)、腺病毒(Adeno virus)、辛德畢斯病毒(Sindbis virus)、轉(zhuǎn)位子、IS-元件、噬粒、噬菌粒、粘粒、線狀或環(huán)狀DNA。為了整合到哺乳動物細胞中，通常使用線狀DNA。優(yōu)選地，用于本發(fā)明的載體類型與具體宿主細胞要求相符。本發(fā)明的核酸序列和載體可以插入其中的適宜的商業(yè)上可用的表達載體包括PSP0RT、 pBluescriptllSK、桿狀病毒表達載體pBlueBac和原核生物表達載體pcDNAII，所有這些均可得自 Invitrogen Corp. , San Diego, CA0適用于在將細胞包埋在根據(jù)本發(fā)明使用的(球形)微囊的(球形)核芯之前轉(zhuǎn)染細胞的如本文定義的載體，通常將如上文定義的核酸序列與其它調(diào)控元件組合，所述調(diào)控元件例如控制編碼的氨基酸序列的表達。這樣的調(diào)控元件例如是1)對身體的組織或區(qū)域特異性的；幻構(gòu)成性的；幻葡萄糖響應(yīng)性的；和/或4)可誘導(dǎo)的/或調(diào)節(jié)的。本文的調(diào)控元件優(yōu)選選自調(diào)節(jié)序列和復(fù)制起始區(qū)(如果載體是自主復(fù)制的)。本發(fā)明范圍內(nèi)的調(diào)節(jié)序列是對轉(zhuǎn)錄的表達和/或編碼核酸序列的翻譯有影響的本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何組件。 調(diào)節(jié)序列除了啟動子序列之外還包括所謂的增強子序列，其可由于RNA聚合酶和DNA之間相互作用增強而導(dǎo)致表達增加。本發(fā)明載體的其它調(diào)節(jié)序列是轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和翻譯起始信號， 所謂的“終止子序列”等或其部分序列。通常，任何天然存在的啟動子可以包含在適用于轉(zhuǎn)染可用于制備本文所用(球形)微囊細胞的表達載體中。這種啟動子可選自任何真核、原核、病毒、細菌、植物、人或動物例如哺乳動物的啟動子。合適的啟動子包括，例如，細胞巨化病毒啟動子、IacZ啟動子、gal 10 啟動子禾口 AcMNPV 多面體啟動子、諸如 cos-、tac-、trp-、tet-、trp—tet—、lpp-、 lac-、lpp-lac-、laclq-、T7_、T5_、T3_、gal-、trc-、ara-、SV40-、SP6、I-PR-或 I-PL-啟動子的啟動子，有利地是在革蘭氏陰性菌中發(fā)現(xiàn)的。此外，啟動子可得自革蘭氏陽性啟動子例如amy和SP02，酵母啟動子，例如ADCl、MFa、AC、P_60、CYCl、GAPDH或哺乳動物啟動子例如細胞巨化病毒(CMV)啟動子，包括哺乳動物肌肉肌酸激酶(MCK)啟動子、哺乳動物結(jié)合蛋白啟動子、哺乳動物肌鈣蛋白I(TNNI2)啟動子或哺乳動物骨骼α-actin(ASKA)啟動子的肌肉特異性啟動子，或者肝型丙酮酸鹽啟動子，特別是運行(-183至+1 或(-96至 +12) (Thompson，等人· J Biol Chem, (1991). 266 :8679-82. ；Cuif，等人·，Mol Cell Biol,CN 102438647 A
說明書
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(1992) · 12 =4852-61)的片段；斑點 14 啟動子(S14，-290 至 +18) (Jump,等人·，J. Biol Chem, (1990) · 265 :3474-8)；乙?；?CoA 羧化酶(0 ‘ Callaghan,等人·，J. Biol Chem, (2001) · 276 16033-9)；脂肪酸合酶(-600 至 +65) (Rufo,等人·，J Biol Chem, (2001) · 28 28)；和葡萄糖-6-磷酸酶(大鼠和人)(Schmoll，等人·，F(xiàn)EBS Left, (1996). 383 :63-6 ； Argaud,等人·，Diabetes, (1996). 45 :1563-71)，或者來自 CaM-Kinasell、巢蛋白、L7、 BDNF、NF、MBP、NSE、β -球蛋白、GFAP、GAP43、酪氨酸羥化酶、紅藻氨酸-受體-亞基1、谷氨酸-受體-亞基B的啟動子，或人泛激素啟動子B(ubiB人)、人鐵蛋白H啟動子(FerH)等。 特別優(yōu)選的啟動子是來源于人或哺乳動物的。最后，可以有利地使用合成的啟動子。包含在一種本發(fā)明載體中的啟動子序列還可以為體外控制目的而誘導(dǎo)，以容許表達的調(diào)節(jié)(例如在生長培養(yǎng)基中存在或缺乏營養(yǎng)素或其它誘導(dǎo)物)。一個實例是得自λ噬菌體plac5 的lac操縱子，其可通過IPTG誘導(dǎo)。最后，如本文定義的啟動子可以與如上文定義的核酸序列連接，例如編碼適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者其片段或變體，例如內(nèi)皮抑制素、GLP-I肽或如本文定義的GLP-I融合肽和任選的如本文定義的另外的因子例如抗細胞凋亡劑、VEGF等的，使得所述啟動子位于編碼核酸序列的GLP-I的5’ “上游”。優(yōu)選地，使用人啟動子，例如人泛激素啟動子B (人ubiB)或者人鐵蛋白H啟動子(FerH)。用于由上文定義的核酸序列編碼的肽的上調(diào)節(jié)表達的增強子序列優(yōu)選是本文定義的載體或表達載體的另一組成。這樣的增強子序列通常位于該載體的非編碼的3’區(qū)域。 用于如本文定義的載體的增強子序列可以得自任何真核、原核、病毒、細菌、植物、人或動物例如哺乳動物宿主，優(yōu)選與相應(yīng)的本文定義的啟動子結(jié)合。本發(fā)明中最有用的增強子元件是葡萄糖響應(yīng)性、胰島素響應(yīng)性和/或肝特異性的那些。增強子元件可包括CMV增強子(例如，與泛激素啟動子(Cubi)連接的)；一種或多種葡萄糖響應(yīng)性元件，包括肝臟丙酮酸激酶 (L-PK)啟動子(-172至-14 的葡萄糖響應(yīng)性元件(GlRE)；以及具有增強的響應(yīng)性的修飾的形式(Cuif 等人·，同上；Lou,等人·，J. Biol Chem, (1999) · 274 :28385-94)；具有輔助 L3 盒(-172 至-126)的 P-PK 的 GlRE (Diaz Guerra，等人·，Mol Cell Biol, (1993). 13 7725-33 ；具有輔助L3盒的響應(yīng)性增強的GlRE的修飾的形式；S14(_1448至-142 的碳水化合物響應(yīng)性元件(ChoRE)，以及在較低葡萄糖濃度時活化的變體(Shih and Towle, J Biol Chem, (1994) · 269 :9380-7 ;Shih，等人·，J Biol Chem, (1995) · 270 :21991-7 ；以及 Kaytor，等人.，J Biol Chem, (1997). 272 :7525-31 ；具有 S14 (-1467 至-1422)的鄰近附屬因子位置的ChoRE [等人.，同上]；醛縮酶(+1916至+2329) (Gregori等人..，J Biol Chem, (1998) · 273 :25237-43 ；Sabourin,等人·，J. BiolChem, (1996) · 271 :3469-73 ；和脂肪酸合成酶(-7382至-6970) (Rufo,等人.，同上.)，更優(yōu)選胰島素響應(yīng)性元件例如葡萄糖_6_磷酸酶胰島素響應(yīng)性元件(-780至-722) [Ayala等人·，Diabetes, (1999). 48 :1885-9 ；和肝臟特異性增強子元件，例如凝血酶原(940至-860) [Chow等人·，J Biol Chem, (1991)266 18927-33;和 α-1-小球蛋白(-2945 至-2539) [Rouet 等人.，Biochem J, (1998). 334 577-84)，肌肉特異性增強子例如哺乳動物MCK增強子、哺乳動物DES增強子和脊椎動物肌鈣蛋白IIRE(TNI IRE，下文稱為FI拙)增強子。最后，還可以包括SV40增強子序列。增強子元件可進一步與如本文定義的啟動子一起使用，用于由如本文定義的核酸序列編碼的肽的上調(diào)節(jié)表達，例如，這樣的啟動子/增強子組合包括例如細胞巨化病毒(CMV)啟動子和CMV增強子，與泛激素啟動子(Cubi)連接的CMV增強子，組肝特異性增強子元件組，其包括與它們的相應(yīng)的啟動子組合使用的人血清白蛋白[HSA]增強子、人凝血酶原[HPrT]增強子、α -1小球蛋白[Α1ΜΒ]增強子和基因內(nèi)醛縮酶增強子，或者與選自CMV 啟動子或HSA啟動子的啟動子組合使用的HSA增強子，選自與CMV啟動子組合使用的人凝血酶原[HPrT]和α-1小球蛋白[Α1ΜΒ]的增強子元件，選自與α-1-抗胰蛋白酶啟動子組合使用的人凝血酶原[HPrT]和α-l小球蛋白[Α1ΜΒ]的增強子元件等。此外，適用于轉(zhuǎn)染可用作根據(jù)本發(fā)明使用的(球形)微囊的組成的細胞的如本文定義的載體可含有轉(zhuǎn)錄和/或翻譯信號，優(yōu)選由適當(dāng)?shù)乃拗髯R別的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯信號，例如轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和翻譯起始信號。轉(zhuǎn)錄和/或翻譯信號可得自任何真核、原核、病毒、細菌、植物，優(yōu)選人或動物，例如哺乳動物宿主，優(yōu)選與本文定義的相應(yīng)啟動子相關(guān)。因此可以使用許多種不同的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)序列，這在宿主細胞識別與編碼本文所定義的肽相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)和翻譯起始信號的程度上取決于宿主的性質(zhì)，如上文定義的肽例如適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者如本文定義的其片段或變體，例如內(nèi)皮抑制素、GLP-I肽或如本文定義的GLP-I融合肽，和任選的本文定義的另外的因子的核酸序列。與編碼核酸序列的天然存在的GLP-I鄰近的5’ 區(qū)域可以被保持，并用于本發(fā)明載體中的轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)。這一區(qū)域通常會包括與轉(zhuǎn)錄和翻譯的啟動有關(guān)的那些序列，例如TATA盒、帽化序列、CAAT序列等。特別地，這一區(qū)域?qū)⒂兄辽偌s150個堿基對長度，更特別地，約200bp，很少超過約1至21Λ。可以選擇能夠控制表達或活化的適用于如本文定義的載體的轉(zhuǎn)錄啟動調(diào)節(jié)信號， 使得可以調(diào)節(jié)編碼如上文定義的肽例如適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者如本文定義的其片段或變體，例如內(nèi)皮抑制素、GLP-I肽或GLP-I融合肽以及任選的如本文定義的另外的因子的核酸序列的表達。一種這樣的可控調(diào)節(jié)技術(shù)是使用溫度敏感的調(diào)節(jié)信號，以便通過改變溫度來抑制或啟動表達。另一種可控調(diào)節(jié)技術(shù)是使用對某些化學(xué)物質(zhì)敏感的調(diào)節(jié)信號。這些方法優(yōu)選是在體外操作中使用，例如當(dāng)制備必需的構(gòu)造時。此外，本文可使用轉(zhuǎn)錄啟動調(diào)節(jié)信號，其容許在體內(nèi)控制表達的抑制或活化，而沒有任何其它來自細胞外的方式，例如在包囊細胞中獲得瞬時表達。這樣的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯信號包括，例如轉(zhuǎn)錄終止調(diào)節(jié)序列如終止信號和多腺苷酸化區(qū)域。此外，轉(zhuǎn)錄終止調(diào)節(jié)序列可以位于含有編碼如上文定義的肽例如適用于 (眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者如本文定義的其片段或變體，例如內(nèi)皮抑制素、GLP-I肽或如本文定義的GLP-I融合肽和任選的本文定義的另外的因子的核酸序列的如本文定義的載體的非編碼3’區(qū)域。合適的終止序列可包括例如牛生長激素、SV40、IacZ, EFl α和AcMNPV多面體多腺苷酸化信號。適用于轉(zhuǎn)染可用于制備根據(jù)本發(fā)明使用的(球形)微囊的細胞的表達載體，還可以包括其它序列以用于最佳地表達編碼如上文定義的肽例如適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者如本文定義的其片段或變體例如內(nèi)皮抑制素、GLP-I肽或如本文定義的GLP-I融合肽和任選的本文定義的另外的因子的核酸序列。這樣的序列包括編碼信號(肽)序列的那些，即其編碼為分泌的蛋白質(zhì)進入或穿過膜提供通道的位于N-末端的肽序列；其為表達產(chǎn)物提供穩(wěn)定性；以及限制性酶識別序列，其為被限制性內(nèi)切核酸酶分解提供位置。所有這些物質(zhì)均是本領(lǐng)域已知的并且是商業(yè)可得的(參見，例如，0kayama(1983)，Mol. Cell. Biol.，3 :280)。如本文定義的，“信號序列”是一種信號(肽)序列，其通常包括位于一上述關(guān)于 GLP-I的氨基酸1至6的條件定義范圍內(nèi)的一表達的適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者如本文定義的其片段或變體或者其它要分泌即穿過細胞膜的因子的N-末端的約8至30個氨基酸。這樣的信號(肽) 序列可包括通常與野生型GLP-I前體蛋白質(zhì)相關(guān)的信號(肽)序列(即，全長胰高血糖素原前體分子的信號(肽)序列)以及通常不與其相關(guān)的信號(肽)序列，即與野生型GLP-I 前體蛋白質(zhì)是異源性的。如本文定義的“信號(肽)序列”可以例如是信號肽序列或引導(dǎo)序列(例如分泌信號(和引導(dǎo))序列)。此外，如本文定義的信號(肽)序列優(yōu)選提供由蛋白酶例如信號序列蛋白酶分解前體肽。在通過蛋白酶從前體肽分解信號序列時，產(chǎn)生了例如適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的生物活性神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者如本文定義的其片段或變體例如內(nèi)皮抑制素、GLP-I肽或如本文定義的GLP-I融合肽以及任選的如本文定義的另外的因子。這樣的信號(肽)序列通常包含編碼由用于分解的蛋白質(zhì)酶識別的分解位點的區(qū)域?；蛘撸幋a由用于分解的蛋白質(zhì)酶識別的分解位點的區(qū)域可以被引入到信號(肽)序列中。此外，編碼由用于分解的蛋白質(zhì)酶識別的分解位點的另外的(一種或多種)序列可以被加入到信號(肽)序列中?？梢杂扇绫疚亩x的載體編碼的信號(肽)序列的實例包括得自分泌的蛋白質(zhì)例如GLP-I或除GLP-I以外的如細胞因子、凝固因子、免疫球蛋白、分泌酶或激素(包括腦下垂體腺嘌呤核苷酸環(huán)化酶活化的多肽(PACAP)/胰高血糖素超家族)和血清蛋白質(zhì)的信號 (肽)序列。例如，如本文定義的信號(肽)序列可得自分泌的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)例如基質(zhì)降解酶引導(dǎo)序列，得自分泌的人堿性磷酸酶(SEAP)、艾塞那肽原(pro-exendin)例如艾塞那肽原-4(pr0exendin-4)引導(dǎo)序列、毒蜥素原(pro-helodermin)、前葡萄糖依賴性促胰島素多肽(GIP)、前胰島素樣生長因子(IGFl)、前胰高血糖素原、α-1抗胰蛋白酶、胰島素樣生長因子1、人因子IX、人淋巴細胞毒素A (Genbank登記號ΒΑΑ00064)或人叢生蛋白 (Genbank登記號ΑΑΡ88927)。如本文定義的信號(肽)序列的具體實例是包括用于通過信號肽酶、弗林蛋白酶或其它激素原轉(zhuǎn)化酶(例如，PC3)前體分解的信號編碼區(qū)域。例如，通過弗林蛋白酶(亦已知為PACE，參見美國專利No. 5，460，950)、其它枯草桿菌蛋白酶(包括 PC2、PC1/PC3、PACE4、PC4、PC5/PC6、LPC/PC7IPC8/SPC7 和 SKI-1 ；Nakayama, Biochem. J.，327 :625-635(1997))；腸激酶(參見美國專利No. 5，270，181)或糜蛋白酶分解的信號可以被引入到本文定義的信號(肽)序列中。這些文獻的各自的公開內(nèi)容通過引用并入本文。弗林蛋白酶是一種普遍存在的表達的蛋白酶，其位于轉(zhuǎn)運高爾基氏體中并在分泌前處理蛋白質(zhì)前體。弗林蛋白酶在其共有識別序列Arg-X-Lys-Arg或Arg-X-Arg-Arg、(Lys/ Arg) -Arg-X- (Lys/Arg) -Arg 和 Arg-X-X-Arg，例如 Arg-Gln-Lys-Arg 的 COOH-末端處分解。 這些氨基酸序列是通過蛋白質(zhì)酶弗林蛋白酶前體分解的信號。因此，異源性信號序列亦可由信號序列編輯的共有序列(例如，由由信號肽酶分解的分泌的蛋白質(zhì)編輯的共有序列) 合成得到。除了如本文定義的調(diào)節(jié)序列外，如本文定義的自主復(fù)制載體通常包含復(fù)制起始區(qū)。合適的復(fù)制起始區(qū)包括，但不限于，例如ColEl、pSC101、SV40、pMPI(ori pMPI)和M13 復(fù)制起始區(qū)等。
優(yōu)選地，適用于表達如上文定義的肽例如適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者如本文定義的其片段或變體例如內(nèi)皮抑制素、GLP-I肽或如本文定義的GLP-I融合肽和任選的如本文定義的另外的因子的如本文定義的載體可以另外地(被基因工程化為)包含自殺基因。在本發(fā)明的情況下，“自殺基因”在施用特定物質(zhì)時，優(yōu)選能夠通過殺滅包含在(球形)微囊的(球形) 核芯中的自殺基因包裹細胞來終止本文所用的(球形)微囊的治療。換言之，適用于本發(fā)明的自殺基因可通過施用外源性活性劑來活化，所述外源性活性劑通常不會存在于人或動物體內(nèi)。在此情況下，典型地自殺基因引發(fā)引起細胞發(fā)生細胞凋亡事件的級聯(lián)。另選地，適用于本發(fā)明的自殺基因可代謝施用的外源性非毒性前藥，所述前藥通常不會存在于人或動物體內(nèi)。外源性非毒性前藥的代謝優(yōu)選使前藥對細胞具有毒性。自殺基因可以包含在相同的載體上，所述載體編碼適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/ 或其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者如本文定義的其片段或變體例如內(nèi)皮抑制素、GLP-I肽或如本文定義的GLP-I融合肽，或者另選地包含在第二載體上。此外，自殺基因可通過任何種類的控制和調(diào)控元件來調(diào)節(jié)，例如本文提及的作為表達載體的組分的控制和調(diào)控元件例如啟動子、增強子等，或者通過它們的天然存在的控制和調(diào)控元件來調(diào)節(jié)。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明選擇自殺基因，其允許任何上述控制機理，例如選自下列的自殺基因胞嘧啶脫氨基酶(⑶)、尿嘧啶磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(UPRTase)、HSV胸苷激酶(HSV-Tk)、可通過添加四環(huán)素誘發(fā)的自殺基因例如細菌Tet阻遏蛋白(TetR)等。作為一個具體的實例，可以使用胞嘧啶脫氨基酶(CD)。胞嘧啶脫氨基酶(CD)通常存在于各種有機體中，并且能夠使5-氟胞嘧啶 (5-FC)轉(zhuǎn)化成5-氟尿嘧啶(5-FU)，其是一種常用的化學(xué)治療劑。5-氟尿嘧啶(5-FU)對有機體有高毒性，而其前藥5-氟胞嘧啶(5-FC)對細胞無毒性。5-氟尿嘧啶(5-FU)隨后通過細胞激酶而被磷酸化，并且能夠消除細胞RNA合成。因此，前藥5-氟胞嘧啶(5-FC)是一種用于誘導(dǎo)特異性細胞自殺的優(yōu)良工具。此外，5-氟-dUMP作為抗葉酸劑并抑制胸苷酸合成酶，所述胸苷酸合成酶在脫氧核糖核甘酸的從頭合成路徑中催化dUMP甲基化成dTMP。因此，可以實現(xiàn)在細胞中抑制DNA合成。還優(yōu)選地，可以使用HSV-I胸苷激酶(ATP 胸苷_5_磷酸轉(zhuǎn)移酶，(HSVltk))及其相應(yīng)的前藥更昔洛韋(GCV)。鳥苷類似物GCV被特異性地磷酸化并抑制DNA合成的延伸，由此導(dǎo)致細胞自殺。在這種情況下，HSV-I胸苷激酶在細胞內(nèi)將非毒性前藥更昔洛韋轉(zhuǎn)化成毒性產(chǎn)物，從而在不希望的細胞增殖的情況下使轉(zhuǎn)染的細胞破壞。因此，給用含有退化細胞的GLP-I CellBeads 治療的患者全身施用更昔洛韋會導(dǎo)致轉(zhuǎn)染的細胞破壞。如本文定義的載體，或者另選地，編碼適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者如本文定義的其片段或變體例如內(nèi)皮抑制素、GLP-I肽或如本文定義的GLP-I融合肽和任選的如本文定義的另外的因子的裸核酸到用于制備如本文定義的(球形)微囊的合適細胞中的轉(zhuǎn)染可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何方法來實現(xiàn)(參見例如Maniatis等人.Q001)Molecular Cloning =A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)。 如果載體被轉(zhuǎn)染到如本文定義的合適細胞中，則載體優(yōu)選以攜帶GLP-I肽編碼核酸的質(zhì)粒DNA的形式存在。質(zhì)粒DNA優(yōu)選是環(huán)狀質(zhì)粒DNA。適宜的轉(zhuǎn)染方法包括，但不限于，例如電穿孔技術(shù)，包括改良的電穿孔技術(shù)(例如核轉(zhuǎn)染)、磷酸鈣技術(shù)例如磷酸鈣共沉淀方法、DEAE-葡聚糖法、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法例如傳遞-介導(dǎo)的脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法等。優(yōu)選地，以攜帶如本文定義的載體使用改良的電穿孔技術(shù)(例如核轉(zhuǎn)染)來進行轉(zhuǎn)染。如本文定義的載體，或者另選地，編碼適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者如本文定義的其片段或變體例如內(nèi)皮抑制素、GLP-I肽或如本文定義的GLP-I融合肽和任選的如本文定義的另外的因子的核酸可以進一步被復(fù)雜化，例如用至少一種合成聚合物或天然聚合物例如聚氨基酸轉(zhuǎn)染，或者可以與其共軛。至少一種聚合物成分可以共價偶聯(lián)到如本文定義的載體，或者另選地共價偶聯(lián)到編碼適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者如本文定義的其片段或變體的核酸。在本發(fā)明含義中 “共軛”表示“化學(xué)偶聯(lián)”。“化學(xué)偶聯(lián)”欲意表示通過共價或非共價鍵合偶聯(lián)。雖然也可以使用共價鍵合，然而對于轉(zhuǎn)染目的而言優(yōu)選非共價鍵合。從而，可以通過沒有共價連接的復(fù)合體使聚合物成分連接到融合肽，例如通過氫鍵或者靜電性、疏水性等相互作用。(為轉(zhuǎn)染目的)用于偶聯(lián)如本文定義的載體或者另選地偶聯(lián)編碼適用于(眼內(nèi)) 治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者如本文定義的其片段或變體的核酸的本文所用聚合物可以是生理學(xué)可接受的聚合物，其包括溶解于水溶液或者懸浮液并且在以藥學(xué)有效量施用該融合肽時對哺乳動物無負面影響例如副作用的聚合物。對根據(jù)本發(fā)明使用的生理學(xué)可接受的聚合物無特別的限制。所述聚合物可以是合成性質(zhì)的或者可以是天然存在的聚合物(例如蛋白質(zhì))。更一般地，與如本文定義的載體或者另選地編碼適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者如本文定義的其片段或變體的核酸一起使用的合成聚合物優(yōu)選選自烯烴二醇類，例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)、乙二醇和丙二醇的共聚物、聚氧乙烯化多元醇、聚烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚羥基烷基甲基丙烯酰胺、聚羥基烷基甲基丙烯酸酯例如聚羥基乙烯甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、多糖、聚([α]_羥基酸)、聚乙烯醇、聚膦腈、聚噁唑啉、聚N-丙烯?；鶈徇?、聚乙烯基乙基醚、聚乙烯縮醛、聚乳酸羥基乙酸、聚乳酸、脂質(zhì)聚合物、殼多糖、透明質(zhì)酸、聚氨酯 (polyurethyne)、聚唾液酸、三醋酸纖維素、硝酸纖維素以及前述任意的組合。本發(fā)明還提供了一種制備根據(jù)本發(fā)明使用的(球形)微囊的方法。這些(球形) 微囊優(yōu)選根據(jù)兩個或多個方法步驟來制備。根據(jù)方法步驟1)，如上文所述制備核芯。根據(jù)方法步驟幻，通過一個或多個表面包裹層將根據(jù)方法步驟1)制備的核芯包裹。其它任選的步驟可包括重復(fù)方法步驟幻以制備另外的表面包裹層。優(yōu)選地，對于每一個這樣的另外的表面包裹層進行與方法步驟幻相同的步驟。其它任選的步驟可包括在制備球形微囊后洗滌的步驟。通常，上文公開的核芯根據(jù)用于制備根據(jù)本發(fā)明使用的(球形)微囊的方法步驟 1)制備。這樣的核芯由交聯(lián)聚合物以及編碼和分泌適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者如本文定義的其片段或變體例如內(nèi)皮抑制素、GLP-I肽或如本文定義的GLP-I融合肽和任選的如本文定義的另外的因子的細胞組成，所述細胞已根據(jù)上文公開的方法轉(zhuǎn)染。根據(jù)方法步驟1)，通常優(yōu)選以如本文為(球形)核芯定義的濃度例如IXlO5至多6X107細胞/ml聚合物溶液來制備聚合物的可溶解形式例如藻酸鹽的可溶解形式(例如在生理鹽水溶液中的藻酸鉀或藻酸鈉)以及上文定義的細胞的混合物(混懸液)。作為一種典型的技術(shù)，同基因細胞/聚合物混懸液(例如細胞/藻酸鹽混懸液)可通過空氣注射噴嘴來壓縮，所述噴嘴由三個通道組成，它們環(huán)繞一個共同中心以三個同心環(huán)同軸設(shè)置內(nèi)部通道、中間通道和外部通道(氣圈)。用于內(nèi)部通道的優(yōu)選的中空針具有 50 μ m至最多2，000 μ m的內(nèi)徑。中間通道通常具有60 μ m至4，000 μ m的內(nèi)徑，而外部通道 (氣圈)優(yōu)選具有IOOym至5，000μπι的內(nèi)徑。僅僅內(nèi)部通道和外部通道(氣圈)被用于方法步驟1)，以制備根據(jù)本發(fā)明使用的(球形)微囊的核芯。因此，僅僅由兩個通道(內(nèi)部通道和外部通道)組成的噴嘴亦可用于方法步驟1)。通常，如果使用具有三個通道的空氣注射噴嘴，則中間通道沒有物料流過。細胞/聚合物溶液的混懸液通常以 ομ Ι/min至 5ml/min的速度壓縮通過內(nèi)部通道，在通道出口處產(chǎn)生液滴，液滴因外部通道(氣圈)提供的具有典型的0. 51/min至101/min的速度的空氣流而掉落。含有細胞和未交聯(lián)聚合物溶液的液滴落到含交聯(lián)劑的溶液(沉淀浴)中，其通常位于空氣注射噴嘴出口下面約4cm至約60cm的距離。液滴在下落期間優(yōu)選變圓，從而得到基本呈球狀的幾何形狀。交聯(lián)劑引起聚合物的離子化交聯(lián)，且最初形成的球狀(水不溶性)微囊的核芯具有如本文定義的(球形)核芯的直徑。(球形)微囊的核芯的直徑取決于用于方法步驟1)的所選擇的通道的大小和幾何形狀。如果藻酸鹽用作聚合物，則含有交聯(lián)劑的溶液(沉淀浴)優(yōu)選由二價陽離子例如鈣或鋇離子(5-100mM)或者其它二價或多價陽離子組成。此外，沉淀浴優(yōu)選含有緩沖物質(zhì)(例如ImM-IOmM的組氨酸)和氯化鈉(例如290m0smol 士 50m0smol)。如果使用除藻酸鹽以外的其它聚合物，則本文可以使用本領(lǐng)域已知的其它適宜的交聯(lián)劑和緩沖劑。方法步驟1)提供由交聯(lián)聚合物和本文定義的細胞組成的(球形)微囊的核芯。在方法步驟1)之后，任選的方法步驟可包括洗滌步驟。例如，根據(jù)本發(fā)明使用的(球形)微囊的核芯用生理鹽水溶液或者任何其它合適的洗滌溶液洗滌，并且如果適用的話，使所述核芯在硫酸鈉溶液中培養(yǎng)，優(yōu)選在根據(jù)US 6，592，886的硫酸鈉溶液中培養(yǎng)，其公開內(nèi)容通過引用并入本文。從沉淀浴和/或洗滌浴中分離根據(jù)本發(fā)明使用的(球形)微囊的核芯通常使用離心或者任何其它合適的方法來進行。根據(jù)方法步驟幻，由方法步驟1)制備的根據(jù)本發(fā)明使用的(球形)微囊的核芯由基本為交聯(lián)聚合物的表面包裹層包裹。相應(yīng)地，將步驟1)制備的(球形)微囊的核芯加至上文公開的不包含細胞的含有未交聯(lián)聚合物的聚合物溶液中。優(yōu)選地，所述聚合物以其未交聯(lián)形式以本文定義的濃度提供。通常，將含有聚合物溶液和(球形)微囊的核芯的混合物以例如15μ Ι/min至2ml/min，優(yōu)選10 μ 1/min至5ml/min的速度壓縮通過上述空氣注射噴嘴的內(nèi)部通道。同時，使沒有細胞的純未交聯(lián)聚合物溶液，優(yōu)選包含約0. 至約4% (w/v)聚合物的溶液，例如無任何細胞的藻酸鹽溶液，以通常的15μ Ι/min至aiil/min，優(yōu)選 10 μ 1/min至5ml/min的速度壓縮通過中間通道。從而，在中間通道的末端形成含有核芯和未聚合聚合物的表面的微滴。這些微滴由于通過外部通道(氣圈)提供的通常具有0.51/ min至101/min的速度的空氣流而掉落。(球形)微囊的核芯的聚合物濃度、加入了(球形) 微囊的核芯的聚合物溶液以及表面包裹層的聚合物濃度可以不同(參見上文)。含有(球形)微囊的核芯的微滴(根據(jù)方法步驟2制備)落入含有本文定義的交聯(lián)劑(沉淀浴)的溶液中。在下落過程中，微滴優(yōu)選變圓至大約球體幾何形式。交聯(lián)劑產(chǎn)生類似于方法步驟 1)的聚合物的離子交聯(lián)鍵。從而，形成具有本文定義的直徑的水不溶性(球形)微囊，更優(yōu)選(球形)微囊總體直徑(粒徑)約100 μ m至約200 μ m,更優(yōu)選總體直徑約115 μ m至約 185 μ m,再更優(yōu)選總體直徑約130 μ m至約170 μ m,最優(yōu)選總體直徑約145 μ m至約155 μ m， 例如約150 μ m。方法步驟2)獲得的(球形)微囊的總體直徑取決于用于本文的所選擇的通道的大小和幾何形狀。為了制備如本文定義的具有一個以上表面包裹層的(球形)微囊， 即含有如本文定義的核芯以及2、3、4、5、5-10個或更多個表面包裹層的(球形)微囊，方法步驟2)可以根據(jù)需要經(jīng)常重復(fù)。這些其它的表面包裹層在上述直徑范圍內(nèi)定義。在方法步驟2、之后，可以接著進行一個或多個本文定義的任選的洗滌步驟。根據(jù)另一個方面，本發(fā)明還提供了治療動物優(yōu)選哺乳動物的眼疾病的方法。這種治療方法可因此用于人醫(yī)學(xué)或獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。在本發(fā)明的情況下，術(shù)語哺乳動物通常包括任何動物和人，優(yōu)選選自但不限于人和(哺乳)(非人)動物，包括例如豬、山羊、牛、豬、狗、 貓、驢、猴、猿或嚙齒類動物包括小鼠、侖鼠和兔、奶牛、兔、綿羊、獅子、美洲虎、豹、大鼠、豬、 水牛、狗、懶猴、侖鼠、豚鼠、扁角鹿、馬、貓、小鼠、豹貓、藪貓等。這種治療通常通過給有需要的患者施用如本文定義的(球形)微囊來進行的，特別是通過施用如本文定義的編碼和分泌適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者如本文定義的其片段或變體例如內(nèi)皮抑制素、GLP-I肽、GLP-I融合肽等或者其片段或變體的細胞，例如間充質(zhì)干細胞或間充質(zhì)基質(zhì)細胞或者可在本發(fā)明的情況下使用的任何其它細胞(類型)，其中這些細胞被包囊于如本文定義的(球形)微囊中以防止所治療患者的免疫系統(tǒng)反應(yīng)。此外，這種治療可通過施用包含如本文定義的(球形)微囊的(藥物)組合物特別是如本文定義的編碼和分泌適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者如本文定義的其片段或變體例如內(nèi)皮抑制素、GLP-I肽、GLP-I融合肽等或者其片段或變體的細胞例如間充質(zhì)干細胞或間充質(zhì)基質(zhì)細胞或可用在本發(fā)明上下文中的任何其它細胞(類型)來進行，其中這些細胞被包囊于如本文定義的(球形)微囊中以防止所治療患者的免疫系統(tǒng)反應(yīng)。優(yōu)選地， (球形)微囊以及它用于本發(fā)明方法的所有組分，例如核芯或表面包裹層的聚合物基質(zhì)的聚合物等是如本文定義的。此外，這種治療還可通過直接施用適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者其片段或變體例如內(nèi)皮抑制素、GLP-I肽或GLP-I融合肽來進行，其全部如本文定義。上述根據(jù)本發(fā)明的治療方法可用于人和獸醫(yī)目的。本文定義的治療方法優(yōu)選包括眼疾病特別是視網(wǎng)膜退化所致眼疾病和病癥的治療或預(yù)防，除此之外還包括視網(wǎng)膜病，選自色素性視網(wǎng)膜炎(RP)、黃斑變性(MD)、年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD或ARMD)、其它原因引起的斑點水腫、視網(wǎng)膜血管阻塞、糖尿病性視網(wǎng)膜病，青光眼和其它視神經(jīng)病等，以及與其相關(guān)的病情的治療或預(yù)防。使用如本文定義的(球形)微囊或者包含這些(球形)微囊)或適用于(眼內(nèi)) 治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者其片段或變體例如內(nèi)皮抑制素、GLP-I肽或如本文定義的GLP-I融合肽的(藥物)組合物治療或預(yù)防眼疾病或病癥或與其相關(guān)的疾病優(yōu)選會產(chǎn)生上文所述適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者其片段或變體例如內(nèi)皮抑制素、GLP-I肽、GLP-I融合肽等的有益效果。例如，GLP-I的有益效果是已知的， 例如由于其DPP-IV蛋白質(zhì)酶穩(wěn)定性而沒有反復(fù)施用GLP-I肽的需求和/或沒有對抗例如植入的GLP-I表達同種異體細胞的不希望的免疫反應(yīng)的風(fēng)險，其強烈地減小由局部缺血或缺氧引起的損傷和心臟組織的可能死亡的活性，。內(nèi)皮抑制素、膠原XVIII的分解產(chǎn)物的已知有益效果包括其顯著減少血管形成的能力。此外，如本文定義的(球形)微囊或者適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者如本文定義的其片段或變體例如內(nèi)皮抑制素、GLP-I肽、GLP-I融合肽等或者其片段或變體的細胞的“安全和有效量”將在給藥醫(yī)生的知識和經(jīng)驗范圍內(nèi)，隨待治療的特定眼疾病或病癥以及待治療患者的年齡和身體狀態(tài)、病情的嚴重性、治療的持續(xù)時間、伴隨治療的性質(zhì)、所用的具體的藥學(xué)可接受的載體和類似因素而變化。如本文定義的，眼疾病或與這樣的眼疾病有關(guān)的任何疾病或病情的治療或預(yù)防的方法包括給有需要的患者施用如本文定義的(球形)微囊，或者施用包含所述(球形)微囊的(藥物)組合物，或者施用適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者本文定義的其片段或變體例如內(nèi)皮抑制素、 GLP-I肽或GLP-I融合肽?！坝行枰幕颊摺蓖ǔＪ莿游铮瑑?yōu)選哺乳動物。更優(yōu)選地，“有需要的患者”選自但不限于，人類和動物，包括例如豬、山羊、牛、豬、狗、貓、驢、猴、猿或嚙齒類動物包括小鼠、侖鼠和兔。在上文治療方法的情況中的施用通常是通過施用“安全和有效”量的活性劑例如 (球形)微囊，即編碼和分泌適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或如本文定義的任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)例如內(nèi)皮抑制素、GLP-I肽、GLP-I融合肽等或者其片段或變體的如本文定義的(球形)微囊的細胞或者適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者本文定義的其片段或變體例如內(nèi)皮抑制素、GLP-I肽或GLP-I融合肽來進行的。如本文使用的， “安全和有效量”是指如上文定義的活性劑的量，其足以顯著誘發(fā)本文提及的眼疾病或病癥積極改變。然而，同時，“安全和有效量”小到足以避免嚴重的副作用，即在利益和風(fēng)險之間容許有明確的關(guān)聯(lián)性。這些限制的確定通常是在明確的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)。在本發(fā)明的情況下，表述“安全和有效量”優(yōu)選表示適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者其片段或變體例如內(nèi)皮抑制素、GLP-I肽或如本文定義的GLP-I融合肽的量，或者表示編碼和分泌如本文定義的適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)例如內(nèi)皮抑制素、GLP-I肽、GLP-I融合肽等或者其片段或變體的如本文定義的(球形)微囊的細胞的量，其適用于發(fā)揮本文定義的神經(jīng)保護和/或抗血管形成因子或者其片段或變體的已知的有益效果。在上文中，編碼和分泌如本文定義的適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、 抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)例如內(nèi)皮抑制素、GLP-I肽、GLP-I 融合肽等或者其片段或變體的如本文定義的(球形)微囊的細胞，通常以約0.2yg/天/ ml (球形)微囊的濃度分泌如本文定義的例如GLP-I肽和/或內(nèi)皮抑制素。因此，劑量范圍可以例如是適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的分泌的生物活性的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者如本文定義的其片段或變體例如GLP-I肽和/ 或內(nèi)皮抑制素，為每天約0. 01 μ g至20mg的范圍(甚至還考慮I-IOOmg的更高量的范圍)， 例如每天約0. 01 μ g至IOmg的范圍，優(yōu)選每天0. 01 μ g至5mg的范圍，并且再更優(yōu)選每天約0. 01 μ g至Img的范圍，以及最優(yōu)選每天約0. 01 μ g至500 μ g的范圍。如果適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者其片段或變體例如內(nèi)皮抑制素、GLP-I肽或如本文定義的GLP-I融合肽在沒有細胞情況下直接施用，這也是可適用的。在上文治療方法的情況中的施用通常是通過提供包囊在如本文定義的(球形)微囊中的細胞，或者如本文定義的(球形)微囊，或者含有這種(球形)微囊的(藥物)組合物，或者適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者其片段或變體例如內(nèi)皮抑制素、GLP-I肽或如本文定義的GLP-I融合肽，給待治療患者的特定施用位置來進行的。這樣的特定施用位置通常是眼，例如眼內(nèi)施用，優(yōu)選待治療患者的眼的受侵襲區(qū)域，更特別地是特定的組織或區(qū)域，例如視網(wǎng)膜、虹膜， 更優(yōu)選地，離虹膜2-3mm，例如在結(jié)膜和鞏膜被輕微擾亂之后，在眼的玻璃體腔中。相當(dāng)重要的是認識到眼中的玻璃體腔可以用作用于治療眼內(nèi)疾病的藥物貯庫。由于眼是身體體積的 10000分之一，如果不是施用到眼內(nèi)的話，則藥物必須以10000倍高的劑量全身給藥以在理論上在需要起效的位置即視網(wǎng)膜或其它眼內(nèi)結(jié)構(gòu)中達到相同濃度。這將會產(chǎn)生全身副作用的巨大風(fēng)險。例如，眼內(nèi)給予較小劑量的25mg的結(jié)晶甾體(去炎松)是全身給予1/4千克的等效劑量。這樣的劑量相當(dāng)于患者存活劑量。此外，直接眼內(nèi)施用藥物避免血-視網(wǎng)膜屏障的問題，這一問題限制藥物在視網(wǎng)膜組織中的利用率，盡管其可通過視網(wǎng)膜血管輸送。 然而，由于視網(wǎng)膜血管壁中相對緊密的連接，藥物通常不能完全離開血管并滲透進入視網(wǎng)膜組織。在這種情況下，同樣非常重要的是，藥物的反復(fù)眼內(nèi)施用還可能伴有晶狀體和視網(wǎng)膜的醫(yī)源性損傷的累積風(fēng)險，并且當(dāng)太頻繁地反復(fù)施用時會伴有感染的累積風(fēng)險。因此，非常希望開發(fā)如根據(jù)本發(fā)明完成的可顯著減少必要的反復(fù)施用的次數(shù)的操作法和技術(shù)。產(chǎn)生藥物的細胞植入到眼中，被保護這些細胞避免被免疫攻擊的結(jié)構(gòu)所覆蓋，其防止細胞離開它們的“籠子”，并且其同時容許細胞的營養(yǎng)和產(chǎn)生的藥物的釋放進行物質(zhì)交換，可以與產(chǎn)生藥物的織物最小化和轉(zhuǎn)位進入眼中相比較。另選地，包囊在如本文定義的(球形)微囊中的細胞，或者如本文定義的(球形)微囊，或者含有該(球形)微囊的(藥物)組合物， 或者適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者本文定義的其片段或變體例如內(nèi)皮抑制素、GLP-I肽或GLP-I融合肽或者其片段或變體可以被施用到眼的前房或后房，例如，施用到房水或玻璃體中。另選地， 可以在視網(wǎng)膜下進行注射，例如通過在視網(wǎng)膜后注射。本發(fā)明的情況下的施用位置進一步包括例如眼內(nèi)施用、眼或視網(wǎng)膜的任何表面、 虹膜或其組織或者周圍區(qū)域，它們可以通過注射或植入而被治療，但不限于此。另選地，編碼和分泌適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者其片段或變體例如內(nèi)皮抑制素、GLP-I肽或如本文定義的GLP-I 融合肽的細胞還可以被植入到前房、晶狀體囊狀袋(例如，內(nèi)障外科后)、視網(wǎng)膜下間隙和脈絡(luò)膜周隙。細胞的植入可通過注射或者任何其它外科手術(shù)或非外科操作來執(zhí)行，使細胞引入到眼的內(nèi)部，其定義為鞏膜內(nèi)部的全部容積。施用位置可以進一步包括適用于本文所述眼疾病的治療的任何空腔。施用如本文定義的(球形)微囊，特別是包裹在如本文定義的(球形)微囊中的編碼和分泌適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或如本文定義的任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)例如內(nèi)皮抑制素、GLP-I肽、GLP-I融合肽等或者其片段或變體的細胞，或者含有這種(球形)微囊的(藥物)組合物到如本文定義的特定施用位置，或者施用適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者其片段或變體例如內(nèi)皮抑制素、GLP-I肽或如本文定義的 GLP-I融合肽，可以使用不同的施用模式進行。包裹在如本文定義的(球形)微囊中的細胞， 或者如本文定義的(球形)微囊，或者含有這種(球形)微囊的(藥物)組合物，或者適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者其片段或變體例如內(nèi)皮抑制素、GLP-I肽或如本文定義的GLP-I融合肽，可以例如全身或局部施用。全身施用的途徑通常包括經(jīng)皮途徑或胃腸外途徑，包括靜脈內(nèi)(例如通過外周靜脈注射)、皮下和/或動脈內(nèi)注射，例如通過門靜脈、到膽管、或者肌內(nèi)、腹膜內(nèi)或鼻內(nèi)。局部施用的途徑通常包括例如眼內(nèi)施用途徑以及局部、經(jīng)皮、肌內(nèi)、皮下、賁門內(nèi)、 心肌內(nèi)和/或心包注射。更優(yōu)選地，包裹在如本文定義的(球形)微囊中的細胞，或者如本文定義的(球形)微囊，或者含有這種(球形)微囊的(藥物)組合物，或者適用于(眼內(nèi)) 治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者其片段或變體例如內(nèi)皮抑制素、GLP-I肽或如本文定義的GLP-I融合肽，可以通過皮內(nèi)、皮下或肌內(nèi)途徑施用。為了注射的目的，包裹在如本文定義的(球形)微囊中的細胞，或者如本文定義的(球形)微囊，或者含有這種(球形)微囊的(藥物)組合物，或者適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者其片段或變體例如內(nèi)皮抑制素、GLP-I肽或如本文定義的GLP-I融合肽，可以被配制成適宜的形式，例如通過添加適宜的藥用載體，例如以在液體藥物組合物、凝膠等的形式?？梢赃m用于任何前述眼疾病或病癥的治療的其它施用方式包括使包裹在如本文定義的(球形)微囊中的細胞，或者如本文定義的(球形)微囊，或者含有這種(球形)微囊的(藥物)組合物移植進入或移植到本文定義的施用位置。對于移植目的，包裹在如本文定義的(球形)微囊中的細胞，或者如本文定義的(球形)微囊，或者含有這種(球形) 微囊的(藥物)組合物可以被配制成適宜的形式，例如通過添加適宜的藥用載體，例如以凝膠、膠囊、片劑等的形式。施用通?？梢砸詥未问┯?、在同一天內(nèi)多次施用、數(shù)周或數(shù)月期間單次施用、或者數(shù)周或數(shù)月期間多次施用來進行。包裹在如本文定義的(球形)微囊中的細胞，或者如本文定義的(球形)微囊，或者含有這種(球形)微囊的(藥物)組合物，或者適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者其片段或變體例如內(nèi)皮抑制素、GLP-I肽或如本文定義的GLP-I融合肽，可以通過介入方式直接遞送到如本文定義的施用位置，例如使用導(dǎo)管引導(dǎo)到受侵襲區(qū)域以及通過注射將這種(球形)微囊植入到施用位置。植入還可使用外科途徑方法或非外科過程來進行。根據(jù)一個特別優(yōu)選的實施方案，(球形)微囊，特別是編碼和分泌適用于(眼內(nèi)) 治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)例如內(nèi)皮抑制素、GLP-I肽、GLP-I融合肽等或者其片段或變體的如本文定義的細胞，或者包含這種(球形)微囊的(藥物)組合物，或者適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者其片段或變體例如內(nèi)皮抑制素、GLP-I肽或如本文定義的GLP-I融合肽，可以例如通過如上文已定義的注射來施用。特別優(yōu)選的，通過使用適宜的注射針來進行注射，例如具有12至^G，更優(yōu)選18至22G尺寸的注射針。根據(jù)另一特別優(yōu)選的實施方案，(球形)微囊，特別是編碼和分泌適用于(眼內(nèi)) 治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)例如內(nèi)皮抑制素、GLP-I肽、GLP-I融合肽等或者其片段或變體的如本文定義的細胞，或者包含這種(球形)微囊的(藥物)組合物，或者適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者其片段或變體例如內(nèi)皮抑制素、 GLP-I肽或如本文定義的GLP-I融合肽，可以例如優(yōu)選通過使用外科裝置例如解剖刀、注射針來移植本文定義的適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)而施用。本發(fā)明進一步包括如本文定義的包含編碼和分泌適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)例如內(nèi)皮抑制素、 GLP-I肽或如本文定義的GLP-I融合肽的細胞的(球形)微囊，或者適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者其片段或變體例如內(nèi)皮抑制素、GLP-I肽或如本文定義的GLP-I融合肽，用于制備產(chǎn)品例如(藥物)組合物或藥盒的用途，以用于在動物中，優(yōu)選如本文定義的哺乳動物如人類中，治療眼疾病或病癥或與其相關(guān)的疾病或病癥。在這種情況下，本發(fā)明的藥物組合物可用于人醫(yī)學(xué)或獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明進一步包括編碼適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者如本文定義的其片段或變體例如內(nèi)皮抑制素、GLP-I肽或如本文定義的GLP-I融合肽的細胞，或者適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者其片段或變體例如內(nèi)皮抑制素、GLP-I肽或如本文定義的GLP-I融合肽，在制備(如本文定義的(球形)微囊，優(yōu)選制備產(chǎn)品例如(藥物)組合物或藥盒的用途，以用于在動物中，優(yōu)選如本文定義的哺乳動物例如人類中，治療眼疾病或病癥或與其相關(guān)的疾病或病癥。如果使用細胞， 則為此目的所使用的細胞優(yōu)選是如本文定義的編碼和分泌適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者如本文定義的其片段或變體例如內(nèi)皮抑制素、GLP-I肽或如本文定義的GLP-I融合肽的細胞，例如間充質(zhì)干細胞或間充質(zhì)基質(zhì)細胞或可用在本發(fā)明上下文中的任何其它細胞(類型)，其中這些細胞被包囊于(球形)微囊中以防止所治療患者的免疫系統(tǒng)反應(yīng)。本發(fā)明另一方面是含有如本文定義(球形)微囊的(藥物)組合物，所述(球形) 微囊包含編碼和分泌適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者如本文定義的其片段或變體例如內(nèi)皮抑制素、GLP-I 肽或如本文定義的GLP-I融合肽的細胞，或者包含適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者其片段或變體例如內(nèi)皮抑制素、GLP-I肽或本文定義的GLP-I融合肽。這種(藥物)組合物可以施用給罹患上述眼疾病或病癥的患者，優(yōu)選以本文定義的方式施用于如本文定義的施用位置。含有如本文定義的包含編碼和分泌適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、 抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者其片段或變體例如內(nèi)皮抑制素、GLP-I肽或如本文定義的GLP-I融合肽的細胞，或者含有適用于(眼內(nèi))治療眼疾病
46的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者其片段或變體例如內(nèi)皮抑制素、GLP-I肽或如本文定義的GLP-I融合肽作為“活性成分”的(球形)微囊的(藥物)組合物的制備通常是本領(lǐng)域公知的，例如美國專利4，608，251 ;4，601，903 ； 4，599，231 ；4, 599，230 ；4, 596，792和4，578，770所示例的，它們?nèi)客ㄟ^引用并入本文。通常，(藥物)組合物被制備成可注射的液體溶液或混懸液，優(yōu)選含有水(水性制劑)或者可以被乳化。術(shù)語“水性制劑”定義為包含至少50% w/w水的制劑。同樣，術(shù)語 “含水溶液”定義為包含至少50% w/w水的溶液，術(shù)語“含水混懸液”定義為包含至少50% w/w水的混懸液。對于到如本文定義的施用位置的肌內(nèi)、靜脈內(nèi)、表皮或皮下注射或者任何其它注射，細胞或者如本文定義的(球形)微囊或者適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、 抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者其片段或變體例如內(nèi)皮抑制素、GLP-I肽或如本文定義的GLP-I融合肽，或者如上文定義的藥物組合物，將是胃腸外可接受的含水溶液形式，其是無熱原的并且具有適宜的PH、等滲性和穩(wěn)定性。液體(藥物)組合物通常包括液體載體例如水。優(yōu)選地，液體載體將包括生理鹽水溶液、葡萄糖乙醇或其它糖溶液，或者可以包括二醇類例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇或其組合。其它實例包括其它等滲載體，如生理鹽溶液，例如林格氏溶液或乳酸林格氏溶液。如果本發(fā)明的(藥物)組合物包含細胞或者如本文定義的(球形)微囊或者適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者其片段或變體例如內(nèi)皮抑制素、GLP-I肽或如本文定義的GLP-I融合肽的含水溶液以及例如緩沖劑，則所述(球形)微囊或者適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者其片段或變體例如內(nèi)皮抑制素、GLP-I肽或如本文定義的GLP-I融合肽通常以0. lmg/ml或以上的濃度存在于(藥物) 組合物中，并且所述(藥物)組合物通常具有約2. 0至約10. 0，優(yōu)選約7. 0至約8. 5的pH。有可能的是，在本發(fā)明(藥物)組合物中可以存在其它成分。這樣的其它成分可包括濕潤劑、乳化劑、抗氧化劑、填充劑、PH緩沖劑(例如磷酸鹽或檸檬酸鹽或馬來酸鹽緩沖劑)、防腐劑、表面活性劑、穩(wěn)定劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑、熬合劑、金屬離子、油脂性載體、蛋白質(zhì) (例如人血清白蛋白、明膠或蛋白質(zhì))和/或兩性離子(例如氨基酸如甜菜堿、?；撬?、精氨酸、甘氨酸、賴氨酸和組氨酸)。由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)包埋在根據(jù)本發(fā)明使用的(球形) 微囊的(球形)核芯中的細胞的具體需求或者適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者其片段或變體例如內(nèi)皮抑制素、GLP-I肽或如本文定義的GLP-I融合肽的具體需求來選擇此類成分，即這些成分不是細胞毒性的并且確保細胞存活。此外，此類成分可以使可由包埋在根據(jù)本發(fā)明使用的(球形)微囊的(球形)核芯中的細胞編碼和分泌的適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者其片段或變體穩(wěn)定。關(guān)于緩沖劑，優(yōu)選選自乙酸鈉、碳酸鈉、檸檬酸鹽、甘氨酰甘氨酸、組氨酸、甘氨酸、 賴氨酸、精氨酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸鈉和三(羥甲基)_氨基甲烷、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(h印es)、N，N_ 二(羥乙基)甘氨酸、曲辛、蘋果酸、琥珀酸鹽、馬來酸、富馬酸、酒石酸、天冬氨酸或其混合物。這些具體緩沖劑中的每一種構(gòu)成本發(fā)明的一個替代實施方案。所有在如本文定義的(藥物)組合物中的上述添加劑的應(yīng)用是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，特別是關(guān)于它們的濃度范圍。為方便起見，可參見Remington :The Science and Practice of Pharmacy,第 19 版，1995。含有包含如本文定義的編碼和分泌適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、 抗血管形成因子和/或如本文定義的任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)的細胞或者包含適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者其片段或變體例如內(nèi)皮抑制素、GLP-I肽或如本文定義的GLP-I融合肽的(球形)微囊的本發(fā)明(藥物)組合物一般優(yōu)選以如本文定義的方式施用以供治療。這樣的施用優(yōu)選與劑型相匹配，并且優(yōu)選包含安全和有效量的活性成分，例如如本文定義的細胞或者適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)或者其片段或變體，即被認為是安全但治療上有效的量。與本發(fā)明(藥物)組合物(或者如果需要的話，單獨地)一起施用的如本文定義的細胞或者適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)的量取決于所治療的受試者和疾病，包括，例如患者疾病的嚴重性。適合的劑量范圍取決于在預(yù)定時間期間直接提供的或者由(球形)微囊(包含在本發(fā)明(藥物)組合物中)分泌的如本文定義的適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的生物活性的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子或其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)的量并且通常以本文定義的每天大約1至數(shù)百微克(本文定義的神經(jīng)保護和/或抗血管形成因子和/或任何其它適宜的因子)。本發(fā)明可進一步包括上述實施方案和特征的組合，只要未另外說明，并且將不限于這些具體定義的單個實施方案。附圖本發(fā)明在附圖中作進一步說明。然而，并不意味著將本發(fā)明范圍限定于以下所示附圖中的內(nèi)容。

圖1 表示對示例性構(gòu)建體a-m (亦參見實施例1)的概況，所述構(gòu)建體可包含在用于制備根據(jù)本發(fā)明使用的(球形)微囊的細胞中。圖2 描繪了 hTERT-MSC和HEK293細胞中的不同GLP-I構(gòu)建體以及瞬時轉(zhuǎn)染后活化GLP-I的瞬時表達的結(jié)果(也參見實施例2)。僅有邊緣活化GLP-I水平可見于單體GLP-I 構(gòu)建體#103和#317 (僅具有GLP-I (7-37)的一個復(fù)本)。在hTERT-MSC和HEK293細胞中的二聚體GLP-I構(gòu)建體#217中(具有GLP-I (7-37)作為組件(I)和作為組件(III))中觀察到表達中的巨大增長。圖3 表示來自分泌GLP-I的細胞的細胞培養(yǎng)上清液的蛋白印跡分析(也參見實施例幻。泳道1 溶解于模擬轉(zhuǎn)染的hTERT-MSC細胞的上清液中的1 OOng合成的 GLP-I (7-37)；泳道2 來自構(gòu)建體#217的分泌二聚體GLP-I的hTERT-MSC細胞(克隆 79TM217/13)的上清液；泳道3 來自構(gòu)建體#217的分泌二聚體GLP-I的AtT20細胞(克隆 81-A-217/3)的上清液；泳道M 預(yù)先染色的蛋白質(zhì)標記[kDa])。結(jié)果顯示，如本文定義的含有GLP-I (7-37)和C-末端附件(圖3的2和3)的肽由自轉(zhuǎn)染的細胞系分泌并且可使用抗-GLP-I抗體檢測，所述抗體結(jié)合到GLP-I (7-37)的中間分子表位。圖4 描述了用根據(jù)本發(fā)明使用的GLP-I肽進行的血漿穩(wěn)定性實驗(體外)。因此，使 HEK293 細胞用構(gòu)建體(1)#103GLP-1 (7-37)、(2)#317GLP-1 (7_37)_IP2-延長有 IlAA 和(3)#217GLP-l(7-37)-IP2-GLP-l(7-37)瞬時轉(zhuǎn)染。HEK293細胞是基因構(gòu)建體的有效宿主(也參見實施例4)。圖5 描述了分泌由構(gòu)建體 #217GLP-1 (7-37)-IP2-GLP-1 (7-37)產(chǎn)生的 GLP-1 肽 CMl的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的hTERT-MSC細胞克隆79TM217/18K5的上清液進行的血漿穩(wěn)定性動力學(xué) (體外)，并以合成的GLP-I (7-37)作為對照。結(jié)果得自三個獨立的實驗?；罨疓LP-I使用 GLP-I (活化的)ELISA 測定(Linco)。圖6:顯示了用于下文所示肽的蛋白印跡。給出以下值SEQ ID NO 1 (IDlsyn)，對應(yīng)于 GLP-1 (7-37)，31 個氨基酸，3. 3kD;SEQ ID NO :8(ID8syn, CM3)， 對應(yīng)于 LP-I (7-37)-IP2，46 個氨基酸，5. IkD ；SEQ ID NO :7(ID7rec, CM2)，對應(yīng)于 GLP-I (7-37) -IP2-RR-GLP2，83 個氨基酸，9. 4kD ；SEQ ID NO 6 (ID6syn, CMl)，對應(yīng)于 GLP-I (7-37) -IP2-RR-GLP1 (7-37)，79 個氨基酸，8. 7kD (也參見實施例 5)。圖7 說明了生物分析細胞系111CH0349/18中GLP-I受體介導(dǎo)的cAMP增加的劑量響應(yīng)曲線。由構(gòu)建體 #217 GLP-I (7-37)-IP2-GLP-1 (7-37)產(chǎn)生的分泌 CMl 的 79TM217/18K5 細胞的連續(xù)稀釋的條件培養(yǎng)基進行刺激。在親代hMSC-TERT細胞系中未發(fā)現(xiàn)有可檢測的 cAMP響應(yīng)。由5個獨立的實驗制圖。檢測到在cAMP生物分析中產(chǎn)生一半最大效用的肽劑量(ED50)為353pM(也參見實施例6)。圖8 描繪了用于瞬時和穩(wěn)定基因表達的示例性載體。所述載體由兩個分離的轉(zhuǎn)錄單元組成，一個用于感興趣的基因(GOI)，一個用于自殺基因HSV胸苷激酶和抗性基因滅菌素的融合。對于第一轉(zhuǎn)錄單元，使用人泛激素B啟動子，對于第二轉(zhuǎn)錄單元，使用人鐵蛋白啟動子(也參見實施例9)。圖9 說明了在細胞預(yù)先永生化之后用于如本文定義的(球形)微囊的細胞的表征。從圖9A可以看出，永生化細胞像它們的未永生化復(fù)本那樣仍然能夠分化成脂肪細胞、 骨細胞和軟骨細胞(左、右)。如使用CD 44和CD166表位標記的流式細胞儀計量法顯示的， 永生化細胞具有成纖維細胞性形態(tài)并且就大小和粒度而言與人類MSC更具同質(zhì)性，其是本文使用的原代細胞的特征。永生化細胞表達與它們的未永生化復(fù)本相同的CD標記(參見圖 9B)。圖10 表示C-末端延長的GLP-I類似物CMl的抗細胞凋亡效能。通過分別以 10 μ g/ml和100 μ g/ml的終濃度添加蛋白質(zhì)生物合成抑制劑環(huán)己酰亞胺(CHX)，在RIN-5F 細胞中誘導(dǎo)細胞凋亡。不同濃度的大腸桿菌重組產(chǎn)生的二聚體GLP-I融合肽CMl的存在產(chǎn)生細胞存活力的顯著(P < 0. 01)增加，其在24小時孵育期之后定量。圖11 是使用用于治療眼疾病特別是黃斑變性(MD)的編碼和分泌GLP-I的(球形)微囊的本發(fā)明概念的示意圖。細胞，例如間充質(zhì)干細胞、間充質(zhì)基質(zhì)細胞或同種異體細胞，被包囊在薄的選擇性可滲透的藻酸鹽基質(zhì)形成的編碼和分泌GLP-I的(球形)微囊中。 藻酸鹽基質(zhì)對于供應(yīng)給包囊細胞的氧和營養(yǎng)物質(zhì)以及由細胞編碼和分泌的GLP-I或GLP-I 融合肽是可滲透的。另一方面，免疫系統(tǒng)的細胞和成分不能通過上文所述的屏障。左使用編碼和分泌GLP-I的(球形)微囊的本發(fā)明概念的示意圖。含有細胞的核芯珠(奶油色) 被純藻酸鹽層(灰色)包圍。右體外編碼和分泌GLP-I的(球形)微囊。圖12 表示植入編碼和分泌GLP-I和內(nèi)皮抑制素的根據(jù)本發(fā)明的微囊(本文也稱為GLP-I和內(nèi)皮抑制素細胞珠)的家兔的體重發(fā)育。圖13 顯示了在第3天從右眼分離的珠(CB-087GLP-1細胞珠)。
圖14 顯示了在第3天從左眼分離的珠(CB-102內(nèi)皮抑制素細胞珠)。圖15 顯示了在第14天從右眼分離的珠(CB-087GLP-1細胞珠)。圖16 顯示了在第14天從左眼分離的珠(CB-102內(nèi)皮抑制素細胞珠)。圖17 顯示了在第56天從右眼分離的珠(CB-087GLP-1細胞珠)(PJ 碘化丙啶 (propidium iodate))。圖18 顯示了在第56天從左眼分離的珠(CB-102內(nèi)皮抑制素細胞珠)(PJ 碘化丙啶)。圖19 顯示了在第3、14和56天在玻璃體液中的GLP-1濃度。圖20 顯示了最多在第56天在房水中的GLP-I濃度。圖21 顯示了最多在第56天在房水中的內(nèi)皮抑制素濃度。圖22 顯示了在第3、14和56天在玻璃體液中的內(nèi)皮抑制素濃度。圖23 顯示了 GLP-I和內(nèi)皮抑制素細胞珠治療的家兔得到的視網(wǎng)膜上的TUNEL染色。圖M 顯示了 GLP-I和內(nèi)皮抑制素細胞珠治療的家兔得到的視網(wǎng)膜上的TUNEL染色。圖25 顯示了 GLP-I和內(nèi)皮抑制素細胞珠治療的家兔得到的視網(wǎng)膜上的TUNEL染色。圖沈顯示了 GLP-I和內(nèi)皮抑制素細胞珠治療的家兔得到的視網(wǎng)膜上的TUNEL染色-重復(fù)分析。圖27 顯示了 GLP-I和內(nèi)皮抑制素細胞珠治療的家兔得到的視網(wǎng)膜的自發(fā)熒光-重復(fù)分析。
實施例本發(fā)明在所附實施例中作進一步的說明。然而不是要將本發(fā)明的范圍限制于如下所示的實施例的內(nèi)容。實施例1遺傳構(gòu)建體的構(gòu)建GLP-I (7-37) cDNA的編碼序列是如圖Ia所示在包括Hincll和EcoRl位置的序列中以合成方式合成的。另外合成圖Ib所示的cDNA，包括GLP-I (7-37)的編碼序列、IP2以及Sfol、EcoRl和Xbal的限制位點，如圖Ib所示。為了使GLP-I引導(dǎo)到分泌途徑，使用基質(zhì)降解酶3的異源信號序列(登記號NM_005940)。因此，編碼基質(zhì)降解酶信號和引導(dǎo)序列的cDNA是從人RNA擴增的逆轉(zhuǎn)錄酶PCR，并與圖Ia或圖Ib的構(gòu)建體一起使用以分別形成示于圖Ic和圖Id的構(gòu)建體。圖Ia構(gòu)建體的Hincll/EcoRI片段被克隆到圖Id的序列的SfoI位置，以形成圖 Ie構(gòu)建體。類似地，使圖Id的EcoIU片段克隆到真核表達質(zhì)粒的EcoIU位置，以產(chǎn)生圖If 所示的構(gòu)建體。為了形成圖Ig所示的構(gòu)建體，圖Ib所示的構(gòu)建體的HincIIAbaI片段被反復(fù)地克隆到圖Id所示的構(gòu)建體的SfoIAbaI位置。圖Ih顯示了一種合成的、密碼子優(yōu)化的序列，其編碼與編碼人GLP-I (7-37)、IP2和GLP-2 (1-35)的序列融合的縮短的內(nèi)源性內(nèi)含子序列中斷的編碼基質(zhì)降解酶引導(dǎo)和信號序列。圖Ih構(gòu)建體的DNA序列是SEQ ID NO16，而SEQ ID NO :15還顯示了翻譯的肽的序列。還合成了圖Ii和Ij中的序列。然后將這些序列用于通過將圖Ij的Nael/BssHII 片段克隆到圖Ih的Nael/BssHII線性化序列來形成圖Ik的構(gòu)建體。圖Ik構(gòu)建體的DNA 序列是SEQ ID N0:14，而SEQ ID NO 13還顯示了翻譯的肽的序列。圖11的構(gòu)建體是通過圖Ih的序列的BssHII消化和再連接形成的。圖11構(gòu)建體的DNA序列是SEQ ID NO :18， 而SEQ ID NO :17還顯示了翻譯的肽的序列。圖Im的構(gòu)建體是通過將圖Ii的序列的Afel/ BssHII片段克隆到圖Ih的Afel/BssHII線性化序列中來形成的。圖Im構(gòu)建體的DNA序列是SEQ ID N0:20，而SEQ ID NO 19還顯示了翻譯的肽的序列。以上構(gòu)建體可由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用常規(guī)技術(shù)來制備。實施例2哺乳動物細胞的轉(zhuǎn)染、克隆選擇和GLP-I表達細胞來源HEI^93(人胚腎細胞系，#ACC305，DSMZ Cell Culture Collection, 德國)、AtT20(小鼠 LAFl 垂體腺腫瘤細胞系，#87021902, European Cell Culture Collection，UK)，hTERT-MSC 細胞由丹麥 University Hospital of Odense 的 Kassem 教授生產(chǎn)并提供。對于IO6個細胞的轉(zhuǎn)染，使用具有不同的GLP-I構(gòu)建體的0.5-2 μ g質(zhì)粒DNA。所述構(gòu)建體是如實施例1所述產(chǎn)生的。通過如描述于Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 等人.1994ff Harvard Medical School Vol2. ,Unit 9. 1)中的標準磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)染 HEK293 細胞。如 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 等人，1994ff，Harvard Medical School Vol 2. ,Unit 9.4)所述使用 FuGene (Roche)轉(zhuǎn)染 AtT20細胞。hTERT-MSC細胞的轉(zhuǎn)染使用一種非病毒方法即Nucleofeetor技術(shù)(Amaxa)進行，所述方法是以電參數(shù)和細胞類型特異性溶液的組合為基礎(chǔ)的。使用Nucleofector裝置 (程序C17)，實現(xiàn)了 > 60%的Nucleofector溶液VPE-1001轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染48小時后，用 DNA穩(wěn)定整合到染色體中的細胞克隆體的選擇通過將選擇劑滅菌素Qyg/ml)添加到培養(yǎng)基中來進行。12-15天后，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞克隆體可以被分離和擴增用于表征。不同的GLP-I構(gòu)建體的瞬時表達在hTERT-MSC和HEK293細胞中測定。而在單體 GLP-I構(gòu)建體#103和#317中僅發(fā)現(xiàn)邊緣活化GLP-I水平(僅具有GLP-I (7-37)的一個復(fù)本)。在hTERT-MSC和HEK293細胞中表達的巨大增加可在二聚體GLP-I構(gòu)建體#217 (具有 GLP-I (7-37)作為組件(I)和作為組件(III))中發(fā)現(xiàn)。結(jié)果匯總于圖2。構(gòu)建體到GLP-I 構(gòu)建體#159的延伸(具有4個IP2復(fù)本作為組件(II))沒有導(dǎo)致進一步的顯著增加(未示出)。在用不同構(gòu)建體轉(zhuǎn)染hTERT-MSC細胞之后，選擇穩(wěn)定表達GLP-I的克隆體。表達水平顯示于表1。表1
構(gòu)建體細胞克隆體活化的GLP/I06個細胞 小時 [pmol]#103 CLPIl7j7149TM113/130.4#317 CLPT(7.,71-IP2-1 Iaa71TM169/10.6#217 CLPT ,7 37,-IP2-CLP1(7J i79TM217/132.7實施例3由哺乳動物細胞分泌的GLP-I肽的蛋白印跡分析
來自分泌GLP-I的細胞的細胞培養(yǎng)上清液在10%-20%梯度的SDS PAGE(120V，90 分鐘)中分離，并通過半干印跡法轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Immobilon-P膜0. 45 μ m Millipore IPVH 00010) (2.0mA/cm2，60 分鐘)。甲醇固定并封閉(在 TBS 中 3% (w v)BSA,0. 1% (ν ν) 吐溫-20)后，使膜用 1 μ g/ml 抗-GLP-I 抗體(HYB 147-12，Antibodyshop)在 4°C ο/η 下免疫印跡。洗滌并在RT下與0.02 μ g/ml檢測抗體(Anti Mouse IgG，HRP軛合的，Perkin Elmer PC2855-1197)培養(yǎng)4小時后，化學(xué)發(fā)光檢測顯示蛋白質(zhì)的位置。蛋白印跡分析顯示于圖3(1 IOOng溶解于模擬轉(zhuǎn)染的hTERT-MSC細胞的上清液中的合成的GLP-I (7-37)，2 來自構(gòu)建體#217的分泌二聚體GLP-I的hTERT-MSC細胞(克隆體79TM217/13)的上清液，3 來自構(gòu)建體#217的分泌二聚體GLP-I的AtT20細胞(克隆體81-A-217/3)的上清液；M 預(yù)先染色的蛋白質(zhì)標記[kDa])。結(jié)果顯示，含有GLP-I (7_37) 和C-末端附件的肽(圖3中的2和3)由轉(zhuǎn)染的細胞系分泌并且可使用抗-GLP-I抗體檢測，所述抗體結(jié)合GLP-I (7-37)的中間分子表位。實施例4人細胞分泌的GLP-I肽的體外血漿穩(wěn)定性HEK293和hTERT-MSC細胞用編碼異源基質(zhì)降解酶信號序列的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染，所述構(gòu)建體連接到編碼以下肽的GLP-I變體1 =GLP-I (7-37)(構(gòu)建體 #103)2 =GLP-I (7-37)-IP2-延長有 11 個氨基酸(構(gòu)建體 #317)3 =GLPl (7-37) -IP2-GLP1 (7-37)(構(gòu)建體 #217) 在37 °C和5 % CO2下，使含有細胞分泌的GLP-I肽或者合成的GLP-I (7-37) (Bachem)的細胞培養(yǎng)物上清液(superrT cont)與含有二肽基肽酶活性的富含人淋巴細胞的血漿培養(yǎng)3小時或者再加6和9小時。模擬轉(zhuǎn)染的細胞的上清液中的合成的GLP-I (7-37) 用作DPP-IV活性的陽性對照，其顯示被添加的DPP-IV抑制劑(#DPP4，Biotrend)所抑制。 活化 GLP 使用 GLP-I (活化的)ELISA (#EGLP-35K，Biotrend)、使用結(jié)合到 GLP-I (7-37)識別DPP-IV退化的、失活的GLP-I (9-37)肽的GLP-I (7-37)的N-末端表位的抗體來測定。結(jié)果顯示于圖4 (HEK293 細胞)和 5 (hTERT-MSC 細胞)。HEK293 和 hTERT-MSC 細胞對于基因構(gòu)建體均是有效宿主。對于轉(zhuǎn)染的細胞，結(jié)果編號是，1 來自構(gòu)建體#103的分泌 GLP-I (7-37)的細胞的上清液，2 來自構(gòu)建體#317的IP2和11個氨基酸延伸的分泌GLP-I 的細胞的上清液，3 來自構(gòu)建體#217的分泌二聚體GLP-I的細胞的上清液。雖然構(gòu)建體1 產(chǎn)生以類似于合成的GLP-I的方式通過DPP-IV失活的野生型GLP-1，但是C-末端延長的 GLP-I形式(圖4中的2和3，圖5中的3)更加耐降解。所述C-末端延長的GLP-I肽在體外人血漿中被顯著穩(wěn)定化。具有二聚體GLP-I序列(3)的肽在體外對DPP-IV降解幾乎完全穩(wěn)定。實施例5通過cAMP釋放測定的GLP-I肽的體外生物活性GLP-I (7-37)通過7次跨膜穿越的、G蛋白偶聯(lián)的GLP-I受體發(fā)揮其生物學(xué)作用， 其通過第二信使環(huán)AMP導(dǎo)致蛋白質(zhì)激酶A發(fā)信號的活化。為了確保CMl的C末端延伸不干擾GLP-I的作用模式，在體外生物學(xué)分析中對CMl生物活性定量，所述分析法測定了在與不同濃度的肽培養(yǎng)之后在表達GLP-I受體的細胞系中cAMP的增加。用于該研究的表達GLP-I受體的細胞系(克隆體111CH0349/18)是用人GLP-I受體穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO(中國倉鼠卵巢) 細胞系。79TM217/18K5細胞中產(chǎn)生的CMl對肽的生物活性的劑量響應(yīng)曲線顯示于圖7。在 cAMP生物分析中產(chǎn)生半數(shù)最大效應(yīng)(ED50)的肽的劑量已測定為353pM。實施例6GLP-Icm肽的體外人血漿穩(wěn)定性合成的GLP-I 肽(SEQ ID NO =Isyn, SEQ ID NO :6syn，SEQ ID NO -Jtec, SEQ ID NO 8syn)以20ng/ml的濃度與人血漿在37°C和5% CO2下培養(yǎng)3小時。血漿的二肽基肽酶活性受 DPP-IV 抑制劑(#DPP4, Biotrend)的抑制。使用 GLP-1 (活化的)ELISA(#EGLP_3^(， Biotrend)測定活化 GLP。與天然GLP-I(7_37) (SEQ ID NO 1)相比，C-末端延長的 GLP-1 肽 SEQ ID NO :6、SEQ ID NO 7和SEQ ID NO 8在體外在人血漿中被顯著穩(wěn)定化(圖7)。作為對照(在右手側(cè))， 顯示了添加DPP-IV抑制劑的實驗所獲得的結(jié)果。在這些對照實驗中，GLP-I活性完全保留。實施例7質(zhì)粒創(chuàng)建瞬時和穩(wěn)定基因表達的載體由兩個分離的轉(zhuǎn)錄單元組成，一個用于感興趣的基因 (GOI)，一個用于自殺基因HSV胸苷激酶和抗性基因滅菌素的融合。對于第一轉(zhuǎn)錄單元，使用人泛激素B啟動子，對于第二轉(zhuǎn)錄單元，使用人鐵蛋白啟動子。質(zhì)?；诰哂?，919個堿基對的質(zhì)粒PCM4，其示意地表示于圖8中。如圖8所示，轉(zhuǎn)錄單元1包括以下成分CMVenh 即刻早期增強子人細胞巨化病毒UbiB人泛激素啟動子BStro-GLP 融合基因，編碼基質(zhì)降解酶和GLPI構(gòu)建體的信號肽和引導(dǎo)序列ori pMBI 大腸桿菌最低復(fù)制起始區(qū)。Hygro 潮霉素B抗性基因。轉(zhuǎn)錄單元2，SV40 enh :SV40 增強子。FerH 與鼠EFI基因的5，UTR組合的人鐵蛋白H啟動子。Tk-bla 編碼1型單純皰疹病毒胸苷激酶和滅菌素抗性基因的融合基因。為了瞬時表達，使用環(huán)狀質(zhì)粒。為了篩選穩(wěn)定表達的細胞克隆體，使質(zhì)粒線性化， 并清除細菌序列(PMB1源和潮霉素基因)。實施例8間充質(zhì)干細胞系或間充質(zhì)基質(zhì)細胞系(MSC)的產(chǎn)生。間充質(zhì)干細胞系是由丹麥University Hospital of Odense的Kassem教授(發(fā)表于 Simonsen 等人，2002，Nature Biotechnology 20m，592-596)根據(jù)以下標準產(chǎn)生來源產(chǎn)物細胞系由健康男性供者(33歲)的骨髓抽吸物分離的間充質(zhì)干細胞(MSC)組成。永生化通過引入端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶的編碼序列來使細胞永生化。逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)通過將GCsam逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包裹在PG13中進行，在所述載體中，轉(zhuǎn)基因的表達由Moloney鼠白血病病毒長末端重復(fù)序列驅(qū)動。在培養(yǎng)的第9天(PDL 12)進行轉(zhuǎn)導(dǎo)。迄今為止細胞系被培養(yǎng)直到沈0的群體倍增數(shù)水平(PDL)。通過熒光原位雜交和索瑟恩斑跡法(southern blot)測試插入部位。在染色體 5(5q23-31)上僅有一個異位的(ecotopic)hTERT的插入部位。在PDL 186處進行分析。吉姆薩顯帶技術(shù)和比較基因組雜交揭示，hMSC-TERT在PDL 96處不產(chǎn)生任何數(shù)目或結(jié)構(gòu)的染色體異常，并維持正常二倍體雄性核型。在皮下植入6個月后在免疫缺陷小鼠中檢測致腫瘤性，發(fā)現(xiàn)PDL80為陰性。流式細胞計量法(FACS)分析使細胞在標準生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)到80%融合。使細胞胰蛋白酶化(typsinised) 并通過FACScan流式細胞測定器(Becton-Dickinson)分析大小和粒度。對于表面標記研究，使胰蛋白酶化的細胞在冰上用直接軛合于熒光染料(FITC-軛合的小鼠抗人CD44單克隆抗體，#CBL1MF，Cymbus Biotechnology ；藻紅蛋白-軛合的小鼠抗人⑶166單克隆抗體，#559263，BD Pharmingen)的抗體染色30min。清洗樣品，再用1 %多聚甲醛固定直至用 FACScan (Becton-Dickinson)分析。表征像其未永生化負體那樣，永生化細胞仍然能夠分化成脂肪細胞、骨細胞和軟骨細胞(參見圖9A)。永生化細胞具有成纖維細胞性形態(tài)，并且在大小和粒度方面如通過例如使用⑶44和⑶166表位標記經(jīng)流式細胞計量法顯示的與人類MSC有更多的同質(zhì)性，這是本文所用原代細胞的特征。永生化細胞表達與其未永生化負體相同的CD標記(參見圖9B)。培養(yǎng)含有血清的介質(zhì)7% Earles MEM10% FCS2mM L-谷氨酰胺ImM丙酮酸鈉100U/ml 青霉素0. lmg/ml 鏈霉素群體倍增在沈小時與30小時之間。轉(zhuǎn)染和克隆選擇對于IO6個細胞的轉(zhuǎn)染，使用具有不同的GLP-I構(gòu)建體的0.5-2 μ g質(zhì)粒DNA。通過標準磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)染HEK293細胞。使用FuGene (Roche)轉(zhuǎn)染AtT20細胞。hTERT-MSC細胞的轉(zhuǎn)染是使用一種非病毒方法即Nucleofector技術(shù)(Amaxa 公司)來進行的，所述方法是以電參數(shù)和細胞類型特異性溶液的組合為基礎(chǔ)的。使用 Nucleofector 裝置(程序 C17)和 Nucleofector 溶液 VPE-1001，實現(xiàn)了 > 60% 的轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染48小時后，通過將選擇劑滅菌素Qy g/ml)添加到培養(yǎng)基中來進行DNA穩(wěn)定整合到染色體中的細胞克隆體的選擇。12-15天后，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞克隆體可以被分離和擴增用于表征。表達
不同的GLP-I構(gòu)建體的瞬時表達是在hTERT-MSC和HEK293細胞中測定的?；罨?GLPl 水平可見于單體 GLPl 構(gòu)建體 #103 (Stro-GLPl (7_37))和 #317 (Stro-GLPl(7_37)-IP2_ 延長有11個氨基酸)中，在hTERT-MSC和HEK293細胞中，表達的巨大增加可見于二聚體 GLPl 構(gòu)建體 #217 (Stro-GLP 1(7_37)-IP2-GLP1(7_37))中。構(gòu)建體 #317 到四聚體 GLPl 構(gòu)建體 #159 (Stro-GLPl(7_37)-IP2Gx)-11個氨基酸)的延伸產(chǎn)生類似活性(也參見上述圖2)。在用不同構(gòu)建體轉(zhuǎn)染hTERT-MSC細胞之后，選擇穩(wěn)定表達GLPl的克隆體(參見上文圖4和5， 實施例4)。實施例9包裹使用？85( 六六，奧地利)洗滌待包囊的培養(yǎng)細胞，并使用胰蛋白酶/EDTA(PAA，奧地利)分離。使用培養(yǎng)基將反應(yīng)快速中止(取決于細胞類型，例如RPMI、PAA，奧地利)，并使細胞混懸物離心出來(8min，1，200rpm)。使顆粒重新混懸于PBS中并測定細胞計數(shù)。再次離心出期望量的4x IO7個細胞(8min，1，200rpm)。然后通過抽吸完全去除PBS，并在沒有空氣泡的情況下將50 μ 1顆粒重新混懸于用5mM 1-組氨酸緩沖至7. 4的pH的50 μ 10.9% 鹽水中。將這一細胞混懸液置于900 μ 1的1. 5-1. 7% (w/v)藻酸鈉溶液中(使用在室溫下 0. 2% (w/v)含水溶液具有大約5mPa. s的粘度的藻酸鹽)。為了使重新混懸的細胞與藻酸鹽溶液混合，將溶液吸到Iml帶有套管的注射器中，并通過反復(fù)緩慢吸取和排出的方式與細胞均勻混合。得到4X107個細胞/ml的細胞濃度。為了產(chǎn)生具有約200 μ m直徑的微囊，在充氣噴嘴中使用具有120 μ m內(nèi)徑的套管。 具有2. Omm開口的空氣環(huán)以螺絲擰緊于內(nèi)部套管上。該裝置是WO 00/09566所述裝置的修改版。使均質(zhì)的細胞/藻酸鹽溶液混合物通過所描述的噴嘴滴下。為此目的，將含有所述混合物的Iml注射器通過路厄(Iuer)接頭置于套管上。以50 μ 1/min的速度使細胞/藻酸鹽溶液混合物壓縮通過套管。以2.51/min的速度使空氣流通過外空氣環(huán)。使所得微囊沉淀于含鋇沉淀浴(20mM BaCl, 5mM L-組氨酸，124mM NaCl, pH 7. 0士0. 1，290m0smol 士3) 中，所述沉淀浴設(shè)置于噴嘴下大約IOcm處。在含鋇沉淀浴中停留5min之后，在每一情況下將微囊用20mlPBS洗滌5次。然后將500μ1的單層微囊置于500μ1的與上文用于核芯的溶液相同的 1.5-1.7% (w/v)藻酸鹽溶液中，并混合均勻。將這一混懸液置于Iml注射器中，并通過路厄接頭連接到噴嘴的內(nèi)部通道(內(nèi)徑200 μ m)，以50 μ 1/min的速度壓縮通過內(nèi)部通道。 將含有1. 5-1. 7%藻酸鹽溶液的5ml注射器通過路厄接頭連接到第二內(nèi)部通道(內(nèi)徑 700 μ m)，以250 μ 1/min的速度壓縮通過第二內(nèi)部通道。以2. 91/min的速度使空氣流通過外空氣環(huán)。使所得微囊沉淀于含鋇沉淀浴OOmM BaCl, 5mM L-組氨酸，124mM NaCl，pH 7. 0士0. l，290m0smOl士3)中，所述沉淀浴設(shè)置于噴嘴下大約IOcm處。在含鋇沉淀浴中停留 5min之后，在每一情況下將微囊用20ml PBS洗滌4次，再用培養(yǎng)基洗滌1次。通過這一方法制備具有大約180-200 μ m的總直徑的兩層微囊(包括藻酸鹽層)，其中內(nèi)部的含有細胞的核芯的直徑為120-150 μ m。在核芯中細胞的濃度為大約虹IO7個細胞/ml藻酸鹽。這樣得到具有 0. 002-0. 004 μ 1珠體積的、每個珠含有大約100個細胞的(球形)微囊(細胞珠)。編碼和分泌GLP-I的(球形)微囊每小時產(chǎn)生平均0. 2fmol活化GLP-I。在核芯中含有包囊的分泌GLP-I的hTERT-MSC細胞的細胞珠的顯微照片顯示于圖 10中。為了產(chǎn)生具有約600 μ m直徑的微囊，將內(nèi)徑400 μ m的套管在充氣三通道噴嘴中用于內(nèi)部通道。將套管固定在內(nèi)徑700μπι的外噴嘴上。將具有1.5mm開口的空氣環(huán)以螺絲固定于兩個內(nèi)套管上。該裝置是WO 00/09566所述裝置的修改版。使均質(zhì)的細胞/藻酸鹽溶液混合物通過所描述的噴嘴滴下。為此目的，將含有所述混合物的Iml注射器通過路厄接頭置于內(nèi)部通道上。以300μ Ι/min的速度使細胞/藻酸鹽溶液混合物壓縮通過內(nèi)部通道。以2.51/min的速度使空氣流通過外空氣環(huán)。使所得微囊沉淀于含鋇沉淀浴QOmM BaCl，5mM L-組氨酸，124mM NaCl，pH 7.0 士0· 1，290m0smol 士 3)中，所述沉淀浴設(shè)置于噴嘴下大約IOcm處。在含鋇沉淀浴中停留5min之后，在每一情況下將微囊用20ml PBS洗滌5 次。然后將500μ 1的單層微囊置于500μ 1的與上文用于核芯的溶液相同的0. 8% (w/v)藻酸鹽溶液中，并混合均勻。將這一混懸液置于Iml注射器中，并通過路厄接頭連接到噴嘴的內(nèi)部通道(內(nèi)徑400μπι)，以50μ Ι/min的速度壓縮通過內(nèi)部通道。將含有 0.8%藻酸鹽溶液的5ml注射器通過路厄接頭連接到第二內(nèi)部通道(內(nèi)徑700 μ m)，以 250μ 1/min的速度壓縮通過第二內(nèi)部通道。以2. 91/min的速度使空氣流通過外空氣環(huán)。 使所得微囊沉淀于含鋇沉淀浴OOmM BaCl, 5mM L-組氨酸，124mM NaCl，pH 7.0士0.1， 290m0smol 士3)中，所述沉淀浴設(shè)置于噴嘴下大約IOcm處。在含鋇沉淀浴中停留5min之后， 在每一情況下將微囊用20mlPBS洗滌4次，并用培養(yǎng)基洗滌1次。通過這一方法制備具有大約600 μ m士 100 μ m的總直徑的兩層微囊(包括藻酸鹽層)，其中內(nèi)部的含有細胞的核芯的直徑為380 μ m士20 μ m。在核芯中細胞的濃度為大約2_3 X IO7個細胞/ml藻酸鹽。這樣得到具有0. 065-0. 180 μ 1珠體積的、每個珠含有大約1000個細胞的球形微囊(細胞珠)。 具有分泌GLP-I的細胞的細胞珠每小時產(chǎn)生平均5fmol的活化GLP。實施例10C-末端延長的GLP-I的抗細胞凋亡功效C-末端延長的GLP-I類似物CMl的細胞保護功效使用大鼠胰島素瘤細胞系 Rin-5F在體外測試。將40，000個RIN-5F細胞經(jīng)96孔播種，再在用1 % L-谷氨酰胺和10% 胎牛血清補充的RPMI中培養(yǎng)2天。在轉(zhuǎn)變成無血清條件(補充1 % L-谷氨酰胺的RPMI) 后，在不同濃度的大腸桿菌產(chǎn)生的重組二聚體GLP-I融合肽CMl存在下，通過添加蛋白質(zhì)生物合成抑制劑環(huán)己酰亞胺(CHX)誘導(dǎo)細胞凋亡。對小時之后，使用AlamarBlue對細胞存活力定量。在InM GLP-I類似物CMl存在下，已經(jīng)觀察到顯著的抗細胞凋亡效果(ρ < 0. 01)。 結(jié)果給于圖10。實施例11產(chǎn)生GLP-I的h TERT-MSC細胞系的細胞因子譜為了研究與GLP-I無關(guān)的、細胞保護的效果，針對細胞因子、趨化因子和生長因子的分泌檢測分泌GLP-I的細胞系79TM217/18K5細胞系。所述細胞系得自人基質(zhì)細胞，并因此分泌特征性的細胞因子譜。多重分析試劑盒 (Biosource Cytokine 30-plex)用于同時測定30最大量的人細胞因子、趨化因子和生長因子。關(guān)于細胞因子 IL-1RA、IL-I β、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-5、IL 7、IL-10、IL_12(p40/ p70)、IL-13、IL-15、IL-17、IP-10、EGF、嗜酸粒細胞親和素、FGF-堿性、IFN_a、IFN γ , GM CSF、G-CSF、HGF、MIG、MIP-b、MIP-I α、RANTES 和 TNFa (各分析物的檢測限為20pg 每 IO5 個細胞· 24h)，未發(fā)現(xiàn)表達。以可檢測水平表達的細胞因子匯總于表1中。表1 生長因子血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子-3 (NT-3)、神經(jīng)膠質(zhì)細胞系-衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)和細胞因子白細胞介素6(IL-6)、白細胞介素8(IL-8)和單核細胞趨化蛋白I(MCP-I)的表達水平。這些因子已使用VEGF ELISA(#ELH-VEGF-001 ； RayBio 公司)、NT-3ELISA (#TBM3，Promega 公司)、GDNF ELISA (#TB22LPromega 公司)以及人IL-6、IL-8和MCP-I ELISA試劑盒(RayBio公司)在CMl分泌細胞系79TM217/18K5 的細胞培養(yǎng)上清液中定量。
權(quán)利要求
1.基因工程化為編碼和分泌神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或其片段或變體以用于眼內(nèi)治療眼疾病或病癥的細胞，其中基因工程化為編碼和分泌神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或其片段或變體的所述細胞被包囊在球形微囊中。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細胞，其中所述神經(jīng)保護因子選自GLP-I肽或GLP-I融合肽或者其片段或變體，并且所述抗血管形成因子選自內(nèi)皮抑制素或者其片段或變體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2中任一項所述的細胞，其中所述球形微囊包含球形核芯和至少一個表面包裹層，其中所述球形核芯包含或組成為交聯(lián)聚合物和細胞的混合物，所述細胞編碼和分泌神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或其片段或變體；和其中所述至少一個表面包裹層包含或組成為交聯(lián)聚合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的細胞，其中所述球形微囊具有約120μ m至約 800 μ m的總直徑、約120 μ m至約700 μ m的總直徑、約150 μ m至約650 μ m的總直徑或約 165 μ m至約600 μ m的總直徑，或者甚至約120 μ m至約300 μ m的總直徑、約150 μ m至約 250 μ m的總直徑、約165 μ m至約225 μ m的或約180 μ m至約200 μ m的總直徑，包括約180、 185、190或200 μ m的總直徑。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項所述的細胞，其中所述細胞是編碼和分泌神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或其片段或變體的間充質(zhì)干細胞、間充質(zhì)基質(zhì)細胞、人間充質(zhì)干細胞，得自人間充質(zhì)干細胞、同種異體細胞或自體細胞的分化的細胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求3至5中任一項所述的細胞，其中所述核芯和/或所述至少一個表面包裹層的所述交聯(lián)聚合物包含相同或不同濃度的化學(xué)上相同的聚合物，其中所述聚合物可進一步具有不同分子量和/或可以是不同交聯(lián)的。
7.根據(jù)權(quán)利要求3至6中任一項所述的細胞，其中所述交聯(lián)聚合物選自生物聚合物和藻酸鹽。
8.根據(jù)權(quán)利要求3至7中任一項所述的細胞，其中所述球形微囊包含1個、2個、3個、 4個或5個或者更多個表面包裹層。
9.根據(jù)權(quán)利要求3至8中任項所述的細胞，其中所述球形微囊包含由聚陽離子組成的另外的外表面包裹層。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項所述的細胞，其中所述神經(jīng)保護因子和/或其片段或變體是選自下列的GLP-I肽a)包含GLP-I的氨基酸7-35的肽；或者b)包含GLP-I或GLP-I(7-36)酰胺的氨基酸7_36的肽；或者c)包含GLP-I的氨基酸7-37的肽；或者d)包含根據(jù)式II的序列的肽Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaal6-Ser-Xaal8-Xaal9-Xaa20-Glu-X aa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xa a36_Xaa37，其中 Xaa7 是 L-組氨酸；Xaa8 是 Ala、Gly、Val、Leu、Ile 或 Lys ；Xaal6 是 Val 或 Leu ；Xaal8 是 Ser> Lys 或 Arg ；Xaal9 是 Tyr 或 Gln ；Xaa20 是 Leu 或 Met ；Xaa22 是 Gly 或 Glu ；Xaa23 是 Gin,Glu,Lys 或 Arg ；Xaa25 是 Ala 或 Val ；Xaa26 是 Lys,Glu 或 Arg ；Xaa27 是 Glu 或 Leu ；Xaa30 是 Ala、Glu 或 Arg ；Xaa33 是 Val 或 Lys ；Xaa34 是 Lys> Glu、Asn 或 Arg ；Xaa35 是 Gly ；Xaa36 是 Arg、Gly 或 Lys 或者酰胺或者不存在；Xaa37 是 Gly、Ala、Glu、Pro、 Lys、酰胺或者是不存在；或者e)何含根據(jù)式III的序列的肽Xaa7~Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaal8-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa 23-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37, 其中 Xaa7 是 L-組氨酸；Xaa8 是 Ala、Gly、Val, Leu、lie 或 Lys ；Xaal8 是 Ser、Lys 或 Arg ；Xaa22 是 Gly 或 Glu ；Xaa23 是 Gin、Glu、Lys 或 Arg ；Xaa26 是 Lys、Glu 或 Arg ；Xaa30 是 Ala、Glu 或 Arg ；Xaa34 是 Lys、Glu 或 Arg ；Xaa35 是 Gly ；Xaa36 是 Arg 或 Lys、酰胺或者是不存在；Xaa37是Gly、Ala、Glu或Lys、酰胺或者是不存在，或者f)顯示與上述根據(jù)a)至e)的肽中任一個有至少80%同一性的肽。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至9中任一項所述的細胞，其中所述神經(jīng)保護因子和/或其片段或變體是包含組件(I)和(II)的GLP-I融合肽或者其片段或變體，其中組件⑴N-末端基選自由下列序列組成的肽或者包含下列序列的肽a)GLP-I (7-35、7-36 或 7-37)序列，或者b)序歹IjSEQ ID NO 1 ；或者c)包含根據(jù)^II的序列或由根據(jù)式II的序列組成的肽Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaal6-Ser-Xaal8-Xaal9-Xaa20-Glu-X aa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xa a36-Xaa37，其中 Xaa7 是 L-組氨酸；Xaa8 是 Ala、Gly、Val、Leu、Ile 或 Lys ；Xaal6 是 Val 或 Leu ；Xaal8 是 Ser> Lys 或 Arg ；Xaal9 是 Tyr 或 Gln ；Xaa20 是 Leu 或 Met ；Xaa22 是 Gly 或 Glu ；Xaa23 是 Gin,Glu,Lys 或 Arg ；Xaa25 是 Ala 或 Val ；Xaa26 是 Lys,Glu 或 Arg ；Xaa27 是 Glu 或 Leu ；Xaa30 是 Ala、Glu 或 Arg ；Xaa33 是 Val 或 Lys ；Xaa34 是 Lys> Glu、Asn 或 Arg ； Xaa35 是 Gly ；Xaa36 是 Arg、Gly 或 Lys 或者酰胺或者不存在；Xaa37 是 Gly、Ala、Glu、Pro、 Lys、酰胺或者是不存在；或者d)包含根據(jù)式II的序列或由根據(jù)式III的序列組成的肽Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaal8-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xaa 23-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37,其中 Xaa7 是 L-組氨酸；Xaa8 是 Ala、Gly、Val、Leu、lie 或 Lys ；Xaal8 是 Ser、Lys 或 Arg ；Xaa22 是 Gly 或 Glu ；Xaa23 是 Gin、Glu、Lys 或 Arg ；Xaa26 是 Lys、Glu 或 Arg ；Xaa30 是 Ala、Glu 或 Arg ；Xaa34 是 Lys、Glu 或 Arg ；Xaa35 是 Gly ；Xaa36 是 Arg 或 Lys、酰胺或者是不存在；Xaa37是Gly、Ala、Glu或Lys、酰胺或者是不存在；或者e)或者與根據(jù)a)至d)的序列中任一項的序列具有至少80%序列同一性的序列；和組件(II)，組件(II)的C-末端基選自至少9氨基酸的肽序列或其功能片段或變體。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的細胞，其中所述GLP-I融合肽的組件(II)選自a)含有根據(jù)SEQ ID NO 22 (RRDFPEEVAI), SEQ ID NO :27 (DFPEEVAI)、SEQ ID NO: 28 (RDFPEEVA)或 SEQ ID NO :29 (RRDFPEEV)、SEQ ID NO :30 (AADFPEEVAI)、SEQ ID NO: 31 (ADFPEEVA)或 SEQ ID NO 32 (AADFPEEV)的序列或者與 SEQ ID NO :22、27、28、29、30、31 或32具有至少80%序列同一性的序列的肽序列；或者b)含有根據(jù)SEQ ID NO 23 (RRDFPEEVAI VEEL)或 SEQ ID NO 24 (RRDFPEEVAIAEEL)或 SEQ ID NO 33 (AADFPEEVAIVEEL)或 SEQ ID NO 34 (AADFPEEVAIAEEL)的序列或者與SEQ ID NO :23、24、33或34具有至少80%序列同一性的序列的肽序列；或者c)含有根據(jù) SEQ ID NO 2 (RRDFPEEVAIVEELG), SEQ ID NO :3 (RRDFPEEVAIAEELG)、SEQ ID NO: 35(AADFPEEVAIVEELG)或SEQ ID NO :36 (AADFPEEVAIAEELG)的序列或者與 SEQ ID NO :2、3、 35或36具有至少80%序列同一性的序列的肽序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12中任一項所述的細胞，其中所述GLP-I融合肽的組件(I)和組件(II)直接連接或者通過連接子序列連接。
14.根據(jù)權(quán)利要求11至13中任一項所述的細胞，其中所述GLP-I融合肽替代地含有或者除組件⑴和(II)以外另外地含有組件(III)，其中如果組件⑴和(III)以融合蛋白形式存在，則組件(III)可連接到組件(I)的C-末端和/或組件(I)的N-末端，或者其中如果組件(I)、(II)和(III)以融合蛋白的形式存在，則組件(III)可連接到組件(II)的 C-末端和/或組件⑴的N-末端。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的細胞，其中組件(III)包含至少4個氨基酸殘基，優(yōu)選至少10個另外的氨基酸殘基，更優(yōu)選至少20或者最優(yōu)選至少30個，或者其中組件(III)包含至少4個，優(yōu)選至少10個，更優(yōu)選至少20個另外的氨基酸殘基， 所述氨基酸殘基為以下的序列的殘基a)如在胰高血糖素原中的GLP-2的N-末端序列，或者b)GLP-I (5-37、6-37 或 7-37)序列，或者c)包含根據(jù)式II的序列的肽Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaal6-Ser-Xaal8-Xaal9-Xaa20-Glu-X aa22-Xaa23-Ala-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Xaa33-Xaa34-Xaa35-Xa a36_Xaa37,其中 Xaa7 是 L-組氨酸；Xaa8 是 Ala、Gly、Val、Leu、lie 或 Lys ；Xaal6 是 Val 或 Leu ； Xaa 18 是 Ser> Lys 或 Arg ；Xaal9 是 Tyr 或 Gln ；Xaa20 是 Leu 或 Met ；Xaa22 是 Gly 或 Glu ； Xaa23 是 Gln、Glu、Lys 或 Arg ；Xaa25 是 Ala 或 Val ；Xaa26 是 Lys、Glu 或 Arg ；Xaa27 是 Glu 或 Leu ；Xaa30 是 Ala、Glu 或 Arg ；Xaa33 是 Val 或 Lys ；Xaa34 是 Lys、Glu、Asn 或 Arg ；Xaa35 是 Gly ；Xaa36 是 Arg、Gly 或 Lys 或者酰胺或者不存在；Xaa37 是 Gly、Ala、Glu、Pro、Lys, 酰胺或者是不存在；或者d)包含根據(jù)式III的序列的肽Xaa7~Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Xaa18-Tyr-Leu-Glu-Xaa22-Xa a23-Ala-Ala-Xaa26-Glu-Phe-Ile-Xaa30-Trp-Leu-Val-Xaa34-Xaa35-Xaa36-Xaa37,其中 Xaa7 是 L-組氨酸；Xaa8 是 Ala、Gly、Val、Leu、Ile 或 Lys ；Xaal8 是 Ser、Lys 或 Arg ；Xaa22 是 Gly 或 Glu ；Xaa23 是 Gin、Glu、Lys 或 Arg ；Xaa26 是 Lys、Glu 或 Arg ；Xaa30 是 Ala、Glu 或Arg ；Xaa34是Lys、Glu或Arg ；Xaa35是Gly ；Xaa36是Arg或Lys、酰胺或者是不存在； Xaa37是Gly、Ala、Glu或Lys、酰胺或者是不存在。e)或者與根據(jù)a)至d)的序列中任一項的序列具有至少80%序列同一性的序列，或者其中組件(III)含有或者包含SEQ ID NO :4或5的序列，或者與SEQ ID NO :4或5具有至少80%序列同一性的序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求2至15中任一項所述的細胞，其中所述GLP-I融合肽另外含有或者包含作為組件(IV)的載體蛋白質(zhì)，特別是轉(zhuǎn)鐵蛋白或白蛋白。
17.根據(jù)權(quán)利要求2至16中任一項所述的細胞，其中所述GLP-I融合肽包含或組成為選自下列序列的肽序列:SEQ ID N0:6、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO : 10、SEQ ID NO : 11、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO :26、SEQ ID NO :37、SEQ ID NO :38、SEQ ID NO :39、SEQ ID NO :40、SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :42、SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :44、SEQ ID NO :45、 SEQ ID NO 46,SEQ ID N0:47 或 SEQ ID N0:48，或者與 SEQ ID NO :6、7、8、10、11、12、26 或 37至48具有至少80%序列同一性的序列。
18.根據(jù)權(quán)利要求1至17中任一項所述的細胞，其中在所述球形微囊的核芯中的所述細胞被基因工程化為另外分泌選自下列的因子抗細胞凋亡因子、生長因子、VEGF、促紅細胞生成素(EPO)、抗血小板藥、抗凝血藥和抗血栓形成藥，和/或分泌以治療水平通過所述膠囊釋放選自VEGF、IL6、IL8、⑶NF、NT3和MCPl的內(nèi)源性蛋白質(zhì)或肽如旁分泌因子，和/ 或被基因工程化為另外含有自殺基因。
19.根據(jù)權(quán)利要求1至18中任一項所述的細胞，其中眼疾病和病癥包括由視網(wǎng)膜退化所致眼疾病和病癥，包括視網(wǎng)膜疾病，選自色素性視網(wǎng)膜炎(RP)、黃斑變性(MD)、年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD或ARMD)、視網(wǎng)膜病、糖尿病性視網(wǎng)膜病、斑點水腫、血管內(nèi)皮和周皮細胞異常、視網(wǎng)膜血管阻塞、青光眼、包括小梁網(wǎng)，以及視神經(jīng)病，包括小梁網(wǎng)改變和角膜內(nèi)皮異常，起因于眼新生血管形成、脈絡(luò)膜新生血管形成的眼疾病，起因于黃斑變性的脈絡(luò)膜新生血管形成，頑固性和復(fù)發(fā)性脈絡(luò)膜新生血管形成，由組織胞漿菌病和病理性近視所致脈絡(luò)膜新生血管形成，由血管樣紋所致脈絡(luò)膜新生血管形成，前部缺血性視神經(jīng)病，細菌性心內(nèi)膜炎，先天性黃斑變性，鳥槍彈樣視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜病變，脈絡(luò)膜血管瘤，脈絡(luò)膜痣，脈絡(luò)膜無灌注，脈絡(luò)膜骨瘤，脈絡(luò)膜破裂，無脈絡(luò)膜，慢性視網(wǎng)膜剝離，視網(wǎng)膜缺損，脈網(wǎng)膜小疣，內(nèi)源性念珠菌屬眼內(nèi)炎，視網(wǎng)膜色素性上皮細胞的外乳頭狀錯構(gòu)瘤，黃點狀眼底，原發(fā)性，黃斑裂洞，惡性黑色素瘤，膜增生性腎小球腎炎(II型)，金屬性眼內(nèi)異物，牽?；ㄗ甸g盤綜合征， 多發(fā)性消散性白點綜合征(MEWDS)，鋸齒緣處新生血管形成，手術(shù)顯微鏡痛，視神經(jīng)乳頭凹陷，光凝固法，斑點狀內(nèi)脈絡(luò)膜病，風(fēng)疹，肉狀瘤病，匐行性或地圖狀脈絡(luò)膜炎，視網(wǎng)膜下液引流，傾斜椎間盤綜合征，弓形蟲性視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜炎，結(jié)核病，或伏格特_小柳_原田三氏綜合征，糖尿病性視網(wǎng)膜病所致新生血管形成，非糖尿病性視網(wǎng)膜病，靜脈分支閉塞，中央視網(wǎng)膜靜脈閉塞，早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病，虹膜發(fā)紅，新生血管性青光眼，黃斑旁毛細血管擴張癥， 鐮狀紅細胞視網(wǎng)膜病，伊爾斯病，視網(wǎng)膜脈管炎，腦視網(wǎng)膜血管瘤病，放射性視網(wǎng)膜病，視網(wǎng)膜冷凍創(chuàng)傷，色素性視網(wǎng)膜炎，視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜缺損，單純皰疹性角膜炎所致角膜新生血管形成，角膜潰瘍，角膜成形術(shù)，翼狀胬肉或創(chuàng)傷。
20.根據(jù)權(quán)利要求1至19中任一項所述的細胞，其中所述球形微囊被植入到或者注射到施用位置，所述施用位置選自待治療患者的眼，包括眼的組織或區(qū)域，包括待治療患者的眼的受侵襲區(qū)域或組織，包括視網(wǎng)膜、虹膜、離虹膜2-3mm的區(qū)域或區(qū)，包括結(jié)膜和鞏膜被輕微攪亂之后離虹膜2-3mm的區(qū)域或區(qū)，眼的玻璃體腔，眼或視網(wǎng)膜的任何表面，虹膜或其組織或周圍區(qū)域，前房，晶狀體囊狀袋，視網(wǎng)膜下間隙，脈絡(luò)膜周隙，眼的內(nèi)部，或者眼的任何腔室。
全文摘要
本申請涉及編碼和分泌適用于(眼內(nèi))治療眼疾病的神經(jīng)保護因子、抗血管形成因子和/或任何其它蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)樣物質(zhì)的細胞，例如間充質(zhì)干細胞或間充質(zhì)基質(zhì)細胞或者任何其它適宜細胞。此類眼疾病包括青光眼和其它視神經(jīng)病癥、視網(wǎng)膜疾病，特別是色素性視網(wǎng)膜炎(RP)、年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)和糖尿病性視網(wǎng)膜病等。本文所用細胞被包囊于(球形)微囊中，所述微囊優(yōu)選包括核芯和至少一個表面層，以防止所治療患者的免疫系統(tǒng)反應(yīng)。本申請還涉及這些(球形)微囊或者本文定義的用于(眼內(nèi))治療眼疾病的此類因子(用于制備(藥物)組合物)以用于治療此類眼疾病的用途。
文檔編號A61P27/02GK102438647SQ201080021065
公開日2012年5月2日 申請日期2010年5月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月12日
發(fā)明者克里斯蒂娜·瓦爾坎普, 埃里克·特內(nèi)斯, 彼得·蓋格萊, 松格弘米特拉·潘達-喬納斯, 約斯特·B.·喬納斯 申請人:生物相容英國有限公司