專(zhuān)利名稱(chēng)：用酵母分泌表達(dá)重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬醫(yī)藥領(lǐng)域中的重組蛋白質(zhì)藥物的制備工藝。
人神經(jīng)生長(zhǎng)因子(human nerve growth factor，簡(jiǎn)稱(chēng)hNGF)是人體中一種對(duì)正常神經(jīng)細(xì)胞有營(yíng)養(yǎng)作用，對(duì)損傷神經(jīng)修復(fù)機(jī)能有調(diào)節(jié)作用的生物活性因子，它可維持交感神經(jīng)和感覺(jué)神經(jīng)的生存，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的分化，決定軸突的伸展方向。對(duì)促進(jìn)大腦的發(fā)育，神經(jīng)系統(tǒng)的生長(zhǎng)，損傷神經(jīng)的再生和功能恢復(fù)具有決定性作用。
hNGF可應(yīng)用于糖尿病性周?chē)窠?jīng)病變、老年癡呆病、帕金森氏病、面神經(jīng)炎，以及神經(jīng)損傷(包括脊髓損傷、高位截癱、斷指再植、腦損傷，周?chē)窠?jīng)損傷等中樞及外圍神經(jīng)系統(tǒng)的損傷)等神經(jīng)系統(tǒng)疾病，是目前唯一可應(yīng)用于臨床的神經(jīng)系統(tǒng)蛋白質(zhì)因子。rhNGF在人體中含量甚微，天然來(lái)源幾乎不可能。因此，用基因工程的方法生產(chǎn)重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子(rhNGF)是唯一的選擇。
由于hNGF分子包含3對(duì)二硫鍵，若用大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)須經(jīng)過(guò)變性和復(fù)性步驟，復(fù)性率很低，純化困難，成本居高不下，其產(chǎn)量和應(yīng)用受到限制。為了提高h(yuǎn)NGF的表達(dá)產(chǎn)率，我們用甲醇營(yíng)養(yǎng)型的畢赤酵母來(lái)分泌表達(dá)重組hNGF。
本發(fā)明的原理畢赤酵母可以高效地表達(dá)酵母表達(dá)質(zhì)粒上的外源基因并將表達(dá)的外源蛋白分泌至細(xì)胞壁外的培養(yǎng)基中。這樣的表達(dá)產(chǎn)物具天然蛋白結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性。
本發(fā)明的目的使用畢赤酵母高效表達(dá)hNGF并使表達(dá)產(chǎn)物分泌至培養(yǎng)基中，以產(chǎn)生結(jié)構(gòu)正確、活性高的重組hNGF產(chǎn)品，提高產(chǎn)率，降低生產(chǎn)成本。
技術(shù)方案當(dāng)然，亦可依不同方法來(lái)制備hNGF，如可在細(xì)菌或昆蟲(chóng)細(xì)胞及動(dòng)物細(xì)胞等較高等真核細(xì)胞中表達(dá)。但最好是在酵母系統(tǒng)中表達(dá)，例如使用釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、多形漢遜酵母(Hansenulapolymorphis)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)，或最好是巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)。
由酵母細(xì)胞中表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)不僅因?yàn)榭梢苑置趆NGF，而且還因?yàn)樗趯?shí)際上是呈準(zhǔn)確折迭形式的并具有高度活性的。
該體系以醇氧化酶(AOX1)為啟動(dòng)子，通過(guò)同源雙交換使外源基因穩(wěn)定地整合于酵母染色體，有效的避免了外源基因丟失。畢赤巴斯德酵母不但能使表達(dá)產(chǎn)物糖基化，避免釀酒酵母的超糖基化作用，更重要的是它可將表達(dá)產(chǎn)物分泌于胞外，而且自身蛋白的分泌卻很少，非常有利于下游的純化設(shè)備。綜上所述，酵母培養(yǎng)體系經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便，高密度發(fā)酵可得100克/L干重酵母，比較適合于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。目前，尚未見(jiàn)有hNGF分子在酵母表達(dá)體系分泌表達(dá)的報(bào)道。
優(yōu)選采用的酵母載體是所謂的穿梭載體，其具有的細(xì)菌質(zhì)粒和酵母質(zhì)粒的復(fù)制原點(diǎn)，以及在兩種宿主系統(tǒng)中分泌的基因。此外，該類(lèi)型載體還含有表達(dá)外來(lái)基因所必需的啟動(dòng)子順序，以及最好有可改善產(chǎn)率的終止順序，從而即可使利于同分泌信號(hào)融合的異源基因定位于啟動(dòng)子和終止密碼子之間。
具體工藝簡(jiǎn)述如下hNGF基因的PCR擴(kuò)增→表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建→轉(zhuǎn)化畢赤酵母→高密度發(fā)酵表達(dá)→上清液分離→超濾濃縮→陽(yáng)離子交換層析純化→脫鹽→除菌過(guò)濾→制劑分裝→成品凍干。經(jīng)上述步驟，即可制備得到純度大于99％，生物比活性高于105U/mg蛋白的重組hNGF。
實(shí)施例1首先用PCR擴(kuò)增的方法獲得hNGF的全長(zhǎng)基因。經(jīng)DNA序列測(cè)定證實(shí)其序列正確后，插入我們已改建過(guò)的酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-Y。所構(gòu)建成的表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)DNA序列測(cè)定分析正確后，用SalI酶切成線性質(zhì)粒，用電穿孔的方法轉(zhuǎn)化入畢赤酵母，經(jīng)過(guò)篩選即得到hNGF的高表達(dá)酵母工程菌。該工程菌在酵母培養(yǎng)基中生長(zhǎng)、誘導(dǎo)、分泌，再將發(fā)酵液離心后，取上清液，超濾至十分之一體積，經(jīng)脫鹽后，過(guò)CM-Sepharose陽(yáng)離子交換層析柱純化，即得到純度＞99％，比活性高于105U/mg的hNGF純品。
實(shí)施例2表達(dá)用得自實(shí)施例1基本培養(yǎng)之新鮮過(guò)夜培養(yǎng)物的細(xì)胞接種10ml酵母完全培養(yǎng)基，以這種方式達(dá)到最適密度OD600＝0.1。于28℃振蕩培養(yǎng)8小時(shí)，然后加入90ml新鮮培養(yǎng)基。再振蕩培養(yǎng)20小時(shí)。離心分離細(xì)胞后，檢測(cè)上清液中的hNGF活性。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明提供了一種用酵母分泌表達(dá)具天然蛋白結(jié)構(gòu)和生物活性的hNGF的新型工藝方法。它與傳統(tǒng)的大腸桿菌表達(dá)體系相比具有以下優(yōu)點(diǎn)①表達(dá)產(chǎn)率高②產(chǎn)物具天然結(jié)構(gòu)和生物活性，無(wú)需變性和復(fù)性③培養(yǎng)基簡(jiǎn)單、價(jià)廉④熱源性物質(zhì)減少。因此，產(chǎn)率顯著提高，生產(chǎn)成本大幅度降低。上述優(yōu)勢(shì)使本發(fā)明具有明顯的技術(shù)創(chuàng)新性與工藝先進(jìn)性，產(chǎn)率提高，成本降低，更適合于工業(yè)化生產(chǎn)重組hNGF。
權(quán)利要求
1.用酵母分泌表達(dá)重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子。其特征在于表達(dá)用宿主細(xì)胞為畢赤酵母。
2.如權(quán)利要求1所述的重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子表達(dá)工程酵母的構(gòu)建。其特征在于人神經(jīng)生長(zhǎng)因子基因插入酵母表達(dá)載體如pPIC，將此表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母，即構(gòu)建成重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子表達(dá)工程酵母。
3.如權(quán)利要求1所述的重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子的分泌表達(dá)。其特征在于重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子在酵母中表達(dá)后可以有效地分泌至培養(yǎng)基中，并且表達(dá)產(chǎn)物具天然蛋白結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性。
4.重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子的分離和純化。其特征在于經(jīng)過(guò)培養(yǎng)液分離、超濾濃縮、陽(yáng)離子交換層析等步驟，獲得高純度、高比活的重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種用畢赤酵母分泌表達(dá)重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子的新型工藝方法。將重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子基因插入酵母表達(dá)質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化畢赤酵母后經(jīng)篩選得到高表達(dá)酵母工程菌，再經(jīng)過(guò)表達(dá)和一系列純化步驟，可以制備得到高純度、高比活性的重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子。
文檔編號(hào)C07K14/48GK1410539SQ0213579
公開(kāi)日2003年4月16日 申請(qǐng)日期2002年11月15日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月15日
發(fā)明者王革 申請(qǐng)人:王革