含有鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的表達(dá)載體及細(xì)胞的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于表達(dá)生長(zhǎng)因子的表達(dá)載體和細(xì)胞，具體地，本發(fā)明涉及含有鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的重組載體及重組細(xì)胞，本發(fā)明還涉及所述重組細(xì)胞的制備方法、鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的純化方法以及所述重組載體或重組細(xì)胞用于制備鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的用途。本發(fā)明利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子，并進(jìn)一步證明了該鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子序列正確且具有較高的比活性高，具有良好的應(yīng)用前景。
【專利說明】含有鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的表達(dá)載體及細(xì)胞
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及用于表達(dá)生長(zhǎng)因子的表達(dá)載體和細(xì)胞，具體地，本發(fā)明涉及含有鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的重組載體及重組細(xì)胞，本發(fā)明還涉及所述重組細(xì)胞的制備方法、鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的純化方法以及所述重組載體或重組細(xì)胞用于制備鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]神經(jīng)生長(zhǎng)因子，簡(jiǎn)稱NGF，是一種分泌性蛋白，屬于神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族，對(duì)維持神經(jīng)元的存活，以及促進(jìn)其生長(zhǎng)具有重要作用。NGF最早在1952年由麗塔蒙特蘭奇發(fā)現(xiàn)，最初是由蛇毒中分離而得，隨后人們發(fā)現(xiàn)鼠頜下腺中富含NGF，且比活性很高，從鼠頜下腺中提取NGF工藝相對(duì)簡(jiǎn)便，所以很長(zhǎng)一段時(shí)期，人們將對(duì)NGF的研究集中在鼠頜下腺提取的NGF上。
[0003]在鼠頜下腺中，NGF以7SNGF的形式存在，7SNGF有兩個(gè)阿爾法亞基，兩個(gè)伽馬亞基和兩個(gè)beta亞基組成的多聚體，在該多聚體中，beta亞基具備能夠有效結(jié)合NGF受體，且具備完全的NGF活性，由此beta亞基又被稱為鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子，簡(jiǎn)稱mNGF。mNGF鏈內(nèi)形成3對(duì)beta折疊，鏈內(nèi)形成3對(duì)二硫鍵，由于這三對(duì)二硫鍵的形成，進(jìn)行正確復(fù)性是比較困難的，另外在mNGF的前體鏈內(nèi)有3個(gè)N糖基化位點(diǎn)，其中2個(gè)位于前肽部分，I個(gè)位于成熟肽部分，前肽的N糖基化有助于mNGF的折疊和分泌。
[0004]鼠頜下腺提取的NGF，能夠有效治療外周神經(jīng)損傷，持續(xù)性角膜缺損、角膜潰瘍、干燥性角膜結(jié)膜炎、白內(nèi)障術(shù)后愈合、青光眼等，并成功治愈鼻咽癌放療引起的放射性顳葉壞死。針對(duì)正己烷中毒引起的神經(jīng)損傷以及視神經(jīng)損傷，mNGF功效顯著，目前已經(jīng)有上市產(chǎn)品-注射用神經(jīng)生長(zhǎng)因子。
[0005]由于市售mNGF都是鼠頜下腺中提取，可能存在動(dòng)物源性病毒的污染，因此已有研究應(yīng)用大腸桿菌[1_4]、酵母[5]、昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞[11]表達(dá)系統(tǒng)對(duì)mNGF進(jìn)行表達(dá)。但大腸桿菌表達(dá)出的mNGF容易出現(xiàn)錯(cuò)誤折疊，導(dǎo)致生物學(xué)活性降低，而利用酵母、昆蟲細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)NGF，也存在表達(dá)量低或活性偏低的問題。
[0006]因此，本領(lǐng)域亟需能夠提高NGF表達(dá)量和/或維持NGF生物學(xué)活性的表達(dá)系統(tǒng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明成功構(gòu)建了鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的真核表達(dá)載體，獲得了能夠穩(wěn)定表達(dá)鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的真核表達(dá)細(xì)胞，以及具有正確序列和較高活性的鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子，由此完成了本發(fā)明。
[0008]本發(fā)明 第一方面涉及重組載體，其含有鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子基因的核酸序列。
[0009]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述載體為適合鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子表達(dá)的載體，優(yōu)選為真核表達(dá)載體，例如為pcDNA3.1、pEGFP-Cl、pPIC9K ;在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述載體為 Freedom? pCHOl.0。
[0010]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，將鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子基因的核酸序列插入載體的多克隆位點(diǎn)，即得到重組載體。
[0011]在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述重組載體為pXL-mNGF。
[0012]在本發(fā)明中的實(shí)施方案中，所述鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子基因的核酸序列為SEQ ID N0:3或SEQ ID NO:5所示的序列。其氨基酸序列分別對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所示的序列。
[0013]在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子基因的核酸序列為SEQ ID NO:3所示的序列。
[0014]本發(fā)明第二方面涉及重組細(xì)胞，其含有本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的重組載體。
[0015]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞為適合鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子表達(dá)的細(xì)胞，優(yōu)選為真核細(xì)胞，例如為CHO細(xì)胞、293細(xì)胞、Hela細(xì)胞；在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述細(xì)胞為CHO細(xì)胞。
[0016]根據(jù)本發(fā)明第二方面任一項(xiàng)的重組細(xì)胞，所述重組細(xì)胞為經(jīng)過無血清培養(yǎng)基馴化培養(yǎng)后的細(xì)胞。
[0017]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述無血清培養(yǎng)基為⑶Forti? CH0。
[0018]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述重組細(xì)胞是在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的。
[0019]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述重組細(xì)胞的培養(yǎng)方式為懸浮培養(yǎng)。
[0020]根據(jù)本發(fā)明第二方面任一項(xiàng)的重組細(xì)胞，所述重組細(xì)胞為經(jīng)過氨甲喋呤和嘌呤霉素加壓篩選培養(yǎng)后的細(xì)胞。
[0021]根據(jù)本發(fā)明第二方面任一項(xiàng)的重組細(xì)胞，所述加壓篩選為兩個(gè)階段的加壓篩選。
[0022]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述第一階段為細(xì)胞培養(yǎng)的第21-29天，例如為第25天。
[0023]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述第二階段為第一階段細(xì)胞培養(yǎng)后的18-25天，例如為21天。
[0024]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述第一階段篩選中氨甲喋呤的濃度為100~200nM ;第二階段篩選中氨甲喋呤的濃度為500~1000nM ；
[0025]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述第一階段篩選中嘌呤霉素的濃度為10~20y g/mL ；第二階段篩選中嘌呤霉素的濃度為30~50 ii g/mL。
[0026]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，細(xì)胞的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為含有8mM谷氨酰胺的無血清培養(yǎng)基。
[0027]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，加壓篩選時(shí)的培養(yǎng)基是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入氨甲喋呤和嘌呤霉素后得到的選擇培養(yǎng)基。
[0028]根據(jù)本發(fā)明第二方面任一項(xiàng)的重組細(xì)胞，其保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏編號(hào)為CGMCC N0.8305。
[0029]本發(fā)明第三方面涉及鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子，其由本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的重組載體或第二方面任一項(xiàng)的重組細(xì)胞制備得到。
[0030]本發(fā)明第四方面涉及本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的重組載體或第二方面任一項(xiàng)的重組細(xì)胞用于制備或生產(chǎn)鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的用途。
[0031]本發(fā)明第五方面涉及本發(fā)明第二方面任一項(xiàng)的重組細(xì)胞的制備方法，其包括以下步驟:
[0032](I)將本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的重組載體轉(zhuǎn)染入CHO細(xì)胞中，在含有無血清培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中靜止培養(yǎng)10~14天(例如12天)，所述無血清培養(yǎng)基中氨甲喋呤的濃度為100~200nM，嘌呤霉素的濃度為10~20 μ g/mL ；
[0033](2)將步驟(1)培養(yǎng)獲得的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至搖瓶中搖動(dòng)培養(yǎng)11~15天(例如第13天)，每3~4天傳一代，培養(yǎng)基與步驟(1)相同；
[0034](3)適當(dāng)增加細(xì)胞密度，繼續(xù)在含有無血清培養(yǎng)基的搖瓶中搖動(dòng)培養(yǎng)18~25天，每3~4天傳一代，所述無血清培養(yǎng)基中氨甲喋呤的濃度為500~ΙΟΟΟηΜ，嘌呤霉素的濃度為30~50 μ g/mL,即獲得本發(fā)明第二方面任一項(xiàng)的重組細(xì)胞；
[0035](4)任選地，還包括對(duì)所獲得的細(xì)胞進(jìn)行單克隆篩選、以獲得更高表達(dá)量的細(xì)胞株的過程。
[0036]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述無血清培養(yǎng)基為⑶Forti? CHO培養(yǎng)基。
[0037]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，步驟(1)中接種細(xì)胞的密度為IXlO5~9X105/ml，例如為 3X105 ~8X105/ml，例如為 5X105/ml。
[0038]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，步驟(2)中接種細(xì)胞的密度為lX105~6X105/mlj^B為 3 X105/ml ο
[0039]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，步驟(3)中接種細(xì)胞的密度為2X IO5~7X105/ml，例如為 4 X105/ml ο
[0040]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述單克隆篩選的方法為本領(lǐng)域所公知，例如可采用有限稀釋法篩選單克隆細(xì) 胞。
[0041]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述細(xì)胞培養(yǎng)的條件為37°C，5%~8%C02。
[0042]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，當(dāng)在搖床上培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，搖床的轉(zhuǎn)速為100_150rpm，例如為 120rpm。
[0043]本發(fā)明還涉及鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的制備方法，其包括本發(fā)明第五方面任一項(xiàng)的制備方法，以及培養(yǎng)重組細(xì)胞和收獲細(xì)胞培養(yǎng)上清的步驟。
[0044]本發(fā)明還涉及鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的純化方法，其包括以下步驟:
[0045]I)培養(yǎng)表達(dá)鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的重組細(xì)胞，收獲細(xì)胞培養(yǎng)上清；
[0046]2)將細(xì)胞培養(yǎng)上清用離子交換層析進(jìn)行純化，得到純化后的樣品；
[0047]3)將步驟2)獲得的樣品用分子篩層析進(jìn)行純化，得到純化的鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子。
[0048]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述表達(dá)鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的重組細(xì)胞為本發(fā)明第二方面任一項(xiàng)的重組細(xì)胞；
[0049]在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述重組細(xì)胞是按照本發(fā)明第五方面任一項(xiàng)所述的制備方法制備得到的。
[0050]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述離子交換層析中的填料為陽離子交換填料；在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述離子交換填料為瓊脂糖凝膠，例如為SP Sepharose Fast Flow。
[0051]在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述分子篩層析中的填料為葡聚糖和瓊脂糖的混合物，例如為Superdex,例如為Superdex75 ;在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述分子篩填料為superdex75pre grade0
[0052]發(fā)明的有益效果
[0053]本發(fā)明成功構(gòu)建了鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的真核表達(dá)載體，通過加壓篩選獲得了穩(wěn)定表達(dá)鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的真核細(xì)胞株，并進(jìn)一步獲得了純化的鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子。該鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子序列正確、表達(dá)量高、活性好，能夠在無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)，為鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的大規(guī)模制備奠定了基礎(chǔ)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0054]圖1為pXL-mNGF表達(dá)質(zhì)粒示意圖
[0055]圖2為電泳結(jié)果圖，其中左圖為PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果，IaneM:marker DL2000 ；lanel, lane2:PCR產(chǎn)物；右圖為EcoRV、PacI雙酶切pXL-mNGF產(chǎn)物電泳結(jié)果，Lane M:Marker DL15000 ；Lane 1:EcoRV、PacI 雙酶切產(chǎn)物；Lane2:未經(jīng)酶切的表達(dá)質(zhì)粒 pXL-mNGF。
[0056]圖3為pEGFP-Nl質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞(轉(zhuǎn)染陽性對(duì)照組)圖。
[0057]圖4為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48h表達(dá)上清Western Blot結(jié)果，其中I為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pXL_mNGF的細(xì)胞48小時(shí)表達(dá)上清；2為陽性對(duì)照:鼠頜下腺提取NGF ；3為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞48小時(shí)表達(dá)上清。
[0058]圖5為第二次ELISA實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0059]圖6為雞胚背根神經(jīng)節(jié)活性測(cè)定。
[0060]圖7為第一階段篩選活細(xì)胞比例隨篩選時(shí)間的變化趨勢(shì)圖。
[0061]圖8為蛋白產(chǎn)率評(píng)估結(jié)果。
[0062]圖9為Western Blot鑒定結(jié)果，其中I為未轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞培養(yǎng)上清；2為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞表達(dá)上清；3為陽性對(duì)照(鼠頜下腺提取的NGF)。
[0063]圖10為克隆擴(kuò)大培養(yǎng)流程圖。
[0064]圖11為顯微鏡下單細(xì)胞照片，其中左圖為96孔板中其中一孔單細(xì)胞，右圖為96孔板中一單細(xì)胞培養(yǎng)12天。
[0065]圖12為離子交換層析圖。
[0066]圖13為4~12%SDS_PAGE電泳圖，其中M =Marker, S1:離子交換上樣前的樣品
[0067]圖14為離子交換層析產(chǎn)物經(jīng)4~12%SDS_PAGE還原電泳圖譜，字母t后面的數(shù)字
表示收集管編號(hào)(按照收集順序編號(hào)):
[0068]
【權(quán)利要求】
1.重組載體，其含有鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子基因的核酸序列；優(yōu)選的，所述載體為Freedom?pCHOl.0 ;進(jìn)一步優(yōu)選的，所述重組載體為pXL-mNGF。
2.重組細(xì)胞，其含有權(quán)利要求1的重組載體；優(yōu)選的，所述細(xì)胞為CHO細(xì)胞。
3.權(quán)利要求2的重組細(xì)胞，其為經(jīng)過無血清培養(yǎng)基馴化培養(yǎng)后的細(xì)胞，優(yōu)選地，所述無血清培養(yǎng)基為⑶Forti? CHO。
4.權(quán)利要求2的重組細(xì)胞，其為經(jīng)過氨甲喋呤和嘌呤霉素加壓篩選培養(yǎng)后的細(xì)胞。
5.權(quán)利要求4的重組細(xì)胞，所述加壓篩選為兩個(gè)階段的加壓篩選， 優(yōu)選地，所述第一階段篩選中氨甲喋呤的濃度為100~200nM ;第二階段篩選中氨甲喋呤的濃度為500~1000nM ； 優(yōu)選地，所述第一階段篩選中嘌呤霉素的濃度為10~20μ g/mL ;第二階段篩選中嘌呤霉素的濃度為30~50 μ g/mL。
6.權(quán)利要求2-5任一項(xiàng)的重組細(xì)胞，其保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏編號(hào)為CGMCC N0.8305。
7.鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子，其由權(quán)利要求1的重組載體或權(quán)利要求2-6任一項(xiàng)的重組細(xì)胞制備得到。
8.權(quán)利要求1的重組載體或權(quán)利要求2-6任一項(xiàng)的重組細(xì)胞用于制備或生產(chǎn)鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的用途。
9.權(quán)利要求2-6任一項(xiàng)的重組細(xì)胞的制備方法，其包括以下步驟: (1)將權(quán)利要求1的重組載體轉(zhuǎn)染入CHO細(xì)胞中，在含有無血清培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中靜止培養(yǎng)10~14天(例如12天)，所述無血清培養(yǎng)基中氨甲喋呤的濃度為100~200nM，嘌呤霉素的濃度為10~20 μ g/mL ； (2)將步驟(1)培養(yǎng)獲得的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至搖瓶中搖動(dòng)培養(yǎng)11~15天(例如第13天)，每3~4天傳一代，培養(yǎng)基與步驟(1)相同； (3)適當(dāng)增加細(xì)胞密度，繼續(xù)在含有無血清培養(yǎng)基的搖瓶中搖動(dòng)培養(yǎng)18~25天，每3~4天傳一代，所述無血清培養(yǎng)基中氨甲喋呤的濃度為500~ΙΟΟΟηΜ，嘌呤霉素的濃度為30~50 μ g/mL,即獲得權(quán)利要求2-6任一項(xiàng)的重組細(xì)胞； (4)任選地，還包括對(duì)所獲得的細(xì)胞進(jìn)行單克隆篩選、以獲得更高表達(dá)量的細(xì)胞株的過程。
10.鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的制備方法，其包括權(quán)利要求9的制備方法，以及培養(yǎng)重組細(xì)胞和收獲細(xì)胞培養(yǎng)上清的步驟。
11.鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的純化方法，其包括以下步驟: 1)培養(yǎng)表達(dá)鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的重組細(xì)胞，收獲細(xì)胞培養(yǎng)上清； 2)將細(xì)胞培養(yǎng)上清用離子交換層析進(jìn)行純化，得到純化后的樣品； 3)將步驟2)獲得的樣品用分子篩層析進(jìn)行純化，得到純化的鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子； 優(yōu)選地，所述表達(dá)鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子的重組細(xì)胞為權(quán)利要求2-6任一項(xiàng)的重組細(xì)胞；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述重組細(xì)胞是按照權(quán)利要求9所述的制備方法制備得到的。
【文檔編號(hào)】C07K1/18GK103740754SQ201310544508
【公開日】2014年4月23日 申請(qǐng)日期:2013年10月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月25日
【發(fā)明者】饒春明, 徐莉, 李永紅, 韓春梅, 史新昌, 陶磊 申請(qǐng)人:中國(guó)食品藥品檢定研究院