專利名稱：一種制備神經(jīng)生長(zhǎng)因子的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從人胎盤(pán)中制備神經(jīng)生長(zhǎng)因子的方法。
展望二十一世紀(jì)人類正從工業(yè)社會(huì)向信息社會(huì)轉(zhuǎn)變與過(guò)渡。腦力勞動(dòng)將成為產(chǎn)生社會(huì)財(cái)富的主要?jiǎng)趧?dòng)方式。因此研制、開(kāi)發(fā)神經(jīng)保護(hù)劑(Neuroprotecant)，神經(jīng)生長(zhǎng)因子(Nervegrowth factor，NGF)與神經(jīng)甾體類生物制劑(Neurosteroids)將為人類做出重要貢獻(xiàn)。在1997年中國(guó)醫(yī)藥出版社《當(dāng)代新藥研究與開(kāi)發(fā)指南》一書(shū)中更加反映出大規(guī)模開(kāi)發(fā)、生產(chǎn)NGF的迫切性。神經(jīng)系統(tǒng)疾病通常具有很大的破壞性，且經(jīng)常導(dǎo)致死亡。例如中風(fēng)在美國(guó)已成為第三大死因，僅次于心臟病和癌癥。隨著神經(jīng)系統(tǒng)疾病的增多，花在該種疾病治療上的費(fèi)用達(dá)數(shù)十億以至幾百億美元，在美國(guó)NGF已進(jìn)入II期臨床，其年銷售量達(dá)數(shù)十億美元。神經(jīng)系統(tǒng)疾病除了對(duì)病人健康的損害外，其治療與護(hù)理對(duì)病人、家屬乃至整個(gè)社會(huì)都會(huì)產(chǎn)生巨大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。然而用于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的常規(guī)藥物效果往往不理想，所以目前許多國(guó)家都在研究NGF，我國(guó)也有不少科研單位在研制、生產(chǎn)NGF，從我們所了解的現(xiàn)狀來(lái)看，目前生產(chǎn)NGF還存在一些不足。①材料來(lái)源有限(從腦組織或妊娠流產(chǎn)的胚胎組織)；②異種動(dòng)物組織(小鼠頜下腺或狗胚胎組織)；③制取方法繁瑣(幾次層析)；④方法雖簡(jiǎn)便但純度差。
本發(fā)明制備神經(jīng)生長(zhǎng)因子所需的原材料為人胎盤(pán)，取材廣泛，且制備過(guò)程簡(jiǎn)便，快速，成本低，且產(chǎn)品的純度好，活性高，具有很大的經(jīng)濟(jì)效益與社會(huì)效益。
本發(fā)明實(shí)施的技術(shù)方案將正常健康人足月胎盤(pán)處理干凈，打碎勻漿，在50-100℃中水浴10-50min，離心4000-8000rpm/min，20-50min后棄沉淀，調(diào)PI，收集上清液用酸性緩沖液調(diào)pH到4-6，并加中性鹽，使終濃度達(dá)0.1-1M，再離心4000-8000rpm/min，20-50min后，再一次棄沉淀，收集上清液透析(對(duì)蒸餾水、生理鹽水或中性緩沖液，在低溫下)；或?qū)⑸锨逡褐苯映瑸V，后收集透析外液或超濾液，無(wú)菌抽濾測(cè)定NGF含量并做生物活性檢測(cè)，再無(wú)菌分裝，加入適量保護(hù)劑，或-20℃保存。
具體實(shí)施例方式①取新鮮足月胎盤(pán)，沖凈血污，剔除筋膜，剪碎稱重，勻漿；②沸水放20min；③4℃離心7000rpm/min 40min；④收集上清用酸性緩沖液調(diào)PH到4，加2M NaCl使終濃度達(dá)0.4M；⑤4℃離心，7000rpm/min 40min；⑥收集上清裝玻璃紙透析袋對(duì)無(wú)菌生理鹽水4℃透析或直接超濾；⑦收集透析外液或超濾液無(wú)菌抽濾測(cè)定NGF含量并作生物活性檢測(cè)；⑧根據(jù)生物活性結(jié)果分裝安瓿，加入適量保護(hù)劑，或-20℃保存待用。
成品檢定外觀 無(wú)異物無(wú)沉淀的無(wú)色透明，澄清的液體無(wú)菌試驗(yàn) 按《生物制品無(wú)菌試驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行PH值 pH＝6.5-7.5多膚含量紫外吸收法0.2-1.2mg/ml過(guò)敏試驗(yàn)豚鼠隔日腹腔注射(ip)神經(jīng)生長(zhǎng)因子注射液50BU/kg致敏，共三次，分別于首次致敏注射后d14和d21，靜脈注射(iv)神經(jīng)生長(zhǎng)因子注射液100BU/kg進(jìn)行攻擊實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，兩次iv神經(jīng)生長(zhǎng)因子注射液攻擊，均未發(fā)現(xiàn)豚鼠產(chǎn)生全身過(guò)敏反應(yīng)。表明神經(jīng)生長(zhǎng)因子注射液對(duì)豚鼠未見(jiàn)全身致敏作用。
純度鑒定 SDS-PAGE電泳，30％聚丙烯酰胺凝膠，厚度1mm垂直平板電泳。T＝15％，C＝6％，SDS濃度為1％，電極緩沖液為三羥甲基氨基甲烷-甘氨酸(pH8.0)，上樣量40ug，電壓160V，電泳1hr，用考馬斯亮藍(lán)R-250染色。結(jié)果顯示，二條區(qū)帶，主帶分子量約為14ku左右，背景干凈無(wú)雜蛋白。
分離純化的NGF的活性檢測(cè)過(guò)程及結(jié)果1.脊髓神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)采用原代培養(yǎng)的方法，在無(wú)菌條件下分離胚胎12天小鼠的脊髓及脊神經(jīng)節(jié)，剔除血管及脊膜，0.125％的胰酶進(jìn)行消化，制成單細(xì)胞懸液，然后接種在24孔，96孔的塑料培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24小時(shí)后，加入阿糖胞苷抑制非神經(jīng)元的生長(zhǎng)增殖，阿糖胞苷作用24小時(shí)后，換上新鮮的培養(yǎng)液，并將同一批標(biāo)本隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組加入純化的NGF，它們作用的終濃度分別為160ng/ml，80ng/ml，40ng/ml，20ng/ml，10ng/ml，連續(xù)在二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí)，此時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯的梯度，進(jìn)行測(cè)活。
2.大腦皮質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)采用原代培養(yǎng)的方法，在無(wú)菌條件下分離胚胎18天小鼠的皮質(zhì)，剔除血管及腦膜。在D-SGH平衡液中清洗。0.125％的胰酶消化，制成單細(xì)胞懸液，然后接種在24孔，94孔的塑料培養(yǎng)板中，培養(yǎng)3天后，加入阿糖胞苷抑制非神經(jīng)元的生長(zhǎng)增殖，作用24小時(shí)后。換上新鮮的培養(yǎng)液，同時(shí)分組加樣，分組加樣同上。
3.活性檢測(cè)(1).將培養(yǎng)好的96孔板標(biāo)本的上清吸出，每空加入200ul 4％福爾馬林固定液，固定1小時(shí)，吸出固定液，每孔用蒸餾水洗3次，每孔200ul，空氣中干燥，每孔再加入100 ul 0.02％結(jié)晶紫染色液，染色30分鐘后，吸出染色液，用蒸餾水洗3次，每孔200ul，空氣中自然干燥后，每孔再加入200ul 10％HAc溶解3小時(shí)，測(cè)OD值。檢測(cè)波長(zhǎng)590nm作曲線圖，計(jì)算統(tǒng)計(jì)活性濃度。(2).同時(shí)在同一批培養(yǎng)的96孔板的細(xì)胞中加入10ul10mg/ml的四唑嗅鹽，再培養(yǎng)4小時(shí)，棄去上清液，每孔再加入100ul的二甲基亞砜。使細(xì)胞上吸附的結(jié)晶充分溶解，于雙波570-630nm的Dynatech MR4000 reader上檢測(cè)OD值，實(shí)驗(yàn)波長(zhǎng)570nm，參考波長(zhǎng)630nm統(tǒng)計(jì)NGF的活性濃度。
4.將同一批接種在24孔培養(yǎng)板的細(xì)胞再同等條件下培養(yǎng)72小時(shí)后，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況并照相記錄。然后于0.125％的Trypsin消化7-8分鐘，再加入2ml 10％FBS/DMEM，用移液管吹打幾次，成單細(xì)胞后移入離心管內(nèi)離心0.5分鐘，輕輕吸出上清，下層加入2ml Ins-培養(yǎng)液，同時(shí)加入20ul胎盤(pán)藍(lán)充分混勻，然后記數(shù)存活的細(xì)胞數(shù)將三結(jié)果進(jìn)行分析，取與對(duì)照組有顯著差異的濃度組，然后取具有活性的共同部分。即為純化NGF的最佳活性濃度。
結(jié)果1. NGF作用脊髓神經(jīng)元的活性結(jié)果NGF(ng/ml)OD(10)0.568+0.061** (20)0.542+0.046* (40)0.551+0.057(80)0.482+0.080(160)0.548+0.091Control 0.461+0.019**P＜0.01 *P＜0.052.NGF作用大腦皮質(zhì)細(xì)胞的活性結(jié)果NGF(ng/ml)OD (10)0.265+0.025 (20)0.271+0.049 (40)0.267+0.042(80)0.348+0.014*(160)0.286+0.041Control0.240+0.021P＜0.05以上結(jié)果表明此種方法純化獲得的NGF不但對(duì)脊髓神經(jīng)元有強(qiáng)烈的促生長(zhǎng)作用，而且對(duì)大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)也有促進(jìn)作用，它對(duì)脊髓和皮質(zhì)神經(jīng)元作用的活性濃度也不同，作用脊髓細(xì)胞的最佳活性濃度是10ng/ml，作用皮質(zhì)是80ng/ml。
權(quán)利要求
1.一種制備神經(jīng)因子的方法，其特征在于制備所需的原材料為正常健康人足月胎盤(pán)，制備過(guò)程為勻漿→水浴50-100℃，10-50min→離心4000-8000rpm/min，20-50min→調(diào)PI，上清液用酸性緩沖液調(diào)pH到4-6，并加中性鹽使終濃度達(dá)0.1-1M→離心4000-8000rpm/min，20-50min→透析(或超濾)→定量、定性→無(wú)菌分裝。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種制備神經(jīng)因子的方法，其特征在于透析條件是對(duì)蒸餾水、生理鹽水或中性緩沖液、在低溫下。
全文摘要
一種制備神經(jīng)生長(zhǎng)因子的方法,涉及從人胎盤(pán)中制備神經(jīng)生長(zhǎng)因子的方法,其制備的過(guò)程為經(jīng)加熱、調(diào)等電點(diǎn)、透析(或超濾)三步,本發(fā)明取材容易、生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)便、生產(chǎn)時(shí)間短(一天內(nèi)完成)、生產(chǎn)費(fèi)用極低。制得的人神經(jīng)生長(zhǎng)因子活性高、產(chǎn)量高、純度好、無(wú)異體蛋白,對(duì)人體使用安全。經(jīng)臨床觀察對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有良好的療效。本發(fā)明具有廣闊的應(yīng)用前景和重要的社會(huì)價(jià)值。
文檔編號(hào)C07K14/435GK1241572SQ9811290
公開(kāi)日2000年1月19日 申請(qǐng)日期1998年7月2日 優(yōu)先權(quán)日1998年7月2日
發(fā)明者王國(guó)華 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)