專利名稱：用于治療局部病毒感染的新協(xié)同組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種富含單寧的植物提取物的協(xié)同組合物，所述植物提取物的組合物對(duì)蛋白酶和病毒糖蛋白具有協(xié)同抑制性質(zhì)。本發(fā)明還涉及ー種局部施用以治療任何病毒感染的包含所述協(xié)同組合物的藥劑。術(shù)語局部是指身體的所有外部部分，例如皮膚、口腔、咽喉、上呼吸道、鼻腔、陰道粘膜、眼表和天然體竅。因此，本發(fā)明涉及治療表現(xiàn)于體表上的病毒感染，例如口腔皰疹和生殖器皰疹、咽喉流感病毒感染、人類乳頭瘤病毒和其它局部皮膚病毒感染。
背景技術(shù)：
局部病毒感染在人類中非常常見，這是因?yàn)椴《就ǔＪ紫冉?jīng)由病毒與外部體表接觸而進(jìn)入體內(nèi)。病毒是直徑為10納米至300納米不等且長(zhǎng)度達(dá)1400納米(絲狀病毒)或1400納米以上不等的極小傳染物。病毒可僅在宿主細(xì)胞內(nèi)部繁殖。所有病毒都具有由DNA或RNA構(gòu)成的基因和保護(hù)這些基因的蛋白質(zhì)外殼。ー些病毒具有在其位于宿主細(xì)胞外時(shí)包圍其的脂肪包膜。雖然病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞中的機(jī)理隨不同病毒群而變化，但所有病毒按照三個(gè)基本步驟來感染宿主細(xì)胞和繁殖。一旦病毒與宿主細(xì)胞接觸，第一步是病毒附著于宿主細(xì)胞(初期感染)，第二步是細(xì)胞內(nèi)的病毒基因組復(fù)制(病毒増殖)，和第三步是新產(chǎn)生的病毒粒子從宿主細(xì)胞中排出。局部病毒感染的進(jìn)展模式與全身病毒感染完全不同。在局部外部感染(例如流感病毒)期間，最初少量病毒粒子與皮膚或粘膜上的少量細(xì)胞接觸并進(jìn)入細(xì)胞中。在一些情況下，病毒可存在于體內(nèi)作為潛伏性病毒，朝皮膚或粘膜遷移。舉例來說，在唇皰疹或生殖器皰疹病毒感染情況下，存在于神經(jīng)細(xì)胞中的潛伏性病毒朝唇皮膚或朝陰道粘膜遷移且開始在少量細(xì)胞中増殖。在其它情況下，一旦進(jìn)入，一些病毒可仍呈休眠狀態(tài)而進(jìn)入細(xì)胞(例如進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞的皰疹I(lǐng)和皰疹I(lǐng)I)中且一旦身體防御機(jī)理減弱則產(chǎn)生疾病。在所有情況下，在這ー階段幾乎都無臨床征象。初期感染后，病毒在少量細(xì)胞中増殖，然后數(shù)百萬新病毒粒子局部釋放，且其開始攻擊新細(xì)胞，從而產(chǎn)生可見病變。咽喉病毒感染發(fā)生相同過程，除了初期病毒粒子不是存儲(chǔ)于體內(nèi)而是由宿主個(gè)體吸入。病毒包膜對(duì)病毒初期感染來說具有重要作用。病毒包膜與表面層的數(shù)種蛋白質(zhì)(糖蛋白)相關(guān)。 表面層的糖蛋白是跨膜蛋白，通過疏水性域錨定于包膜。其可見于病毒表面上。病毒利用這些糖蛋白附著于細(xì)胞膜并進(jìn)入宿主細(xì)胞中。病毒包膜是含有許多類型糖蛋白的高度復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。舉例來說，單純皰疹病毒(HSV I和HSV 2)含有例如gB、gD、gH、gL、gC、gl、gE等表面糖蛋白作為主要蛋白質(zhì)。為感染細(xì)胞，目前假設(shè)C糖蛋白和/或B糖蛋白(分別為gC和gB)和可能的gH糖蛋白結(jié)合至細(xì)胞表面上的硫酸こ酰肝素受體以與宿主細(xì)胞膜融合和產(chǎn)生病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞所經(jīng)的開ロ或小孔。因此，缺乏硫酸こ酰肝素受體的細(xì)胞不易患HSV(納塔利 車森可(NataliaChesenko)，2002)。這ー特異性決定病毒的宿主范圍。表面糖蛋白結(jié)構(gòu)的差異賦予同一病毒家族不同的形態(tài)和抗原性。舉例來說，三個(gè)不同類型的流感病毒( 稱為A、B和C)已經(jīng)鑒別以HA(血凝素)和NA(神經(jīng)氨酸酶)作為主要表面糖蛋白。早已鑒別13種主要類型的HA和NA的9種主要的抗原決定子。這顯示病毒衣殼在表面層上可含有超多種的糖蛋白。還意味著，各類型的病毒具有自身的促進(jìn)細(xì)胞附著和細(xì)胞進(jìn)入的方式。尚未發(fā)現(xiàn)所有病毒糖蛋白，且正不斷研究新病毒糖蛋白的存在和其在病毒増殖和感染中的作用。不斷發(fā)現(xiàn)新病毒表面糖蛋白、其在宿主細(xì)胞感染中的作用和常見病毒突變，使得幾乎不可能開發(fā)特異性局部抗病毒藥物。在不存在任何特異性抗病毒藥物的情況下，目前認(rèn)為疫苗是最佳抗病毒療法。雖然疫苗可含有病毒糖蛋白亞單位，但其具有不良免疫性，因?yàn)椴皇撬刑堑鞍锥寄茉谝环N疫苗中表現(xiàn)且其抗原性可變。雖然完全失活的病毒疫苗更高效，但僅可針對(duì)小規(guī)模且高抗原性的病毒制備。雖然具低病毒病原性的活病毒疫苗是良好的免疫原，但其不穩(wěn)定、危險(xiǎn)(活病毒)且具回復(fù)毒カ的風(fēng)險(xiǎn)。令人遺憾的是，由于表面糖蛋白結(jié)構(gòu)復(fù)雜，因此不能開發(fā)針對(duì)許多病毒的疫苗，例如HIV、皰疹、乳頭瘤病毒和許多其它病毒。當(dāng)病毒粒子存在于皮膚病變(例如唇皰疹)、陰道粘膜(例如生殖器皰疹)或咽喉表面(例如流感)上時(shí)，大多數(shù)抗病毒治療是針對(duì)干擾細(xì)胞內(nèi)病毒增殖過程，而對(duì)游離病毒粒子根本不起作用。所有目前可用的抗病毒藥物是針對(duì)一旦已建立感染則阻止細(xì)胞內(nèi)病毒生長(zhǎng)。舉例來說，使用細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)氨酸酶抑制劑治療流感A、B和C型包膜病毒，有2種主要類別的通過經(jīng)ロ途徑的藥物-金剛烷，干擾細(xì)胞內(nèi)的病毒脫殼且僅有效針對(duì)流感A型病毒；-較新類別的扎那米,(Zanamivir)或奧司他偉(Oseltamivir)(特敏福(Tamiflu))，干擾細(xì)胞內(nèi)子代病毒的釋放且需要早期經(jīng)ロ投予來阻止進(jìn)ー步病毒生長(zhǎng)。為治療全身皰疫病毒感染，使用不同類型的無環(huán)鳥苷(Acycloguanosine)(阿昔洛,(Aciclovirs))且以例如舒維療(Zovirax、昔洛,(Ciclovir、赫派(Herpex、阿昔,(Acivir,阿昔維療(Acivirax、阿昔洛,(Aciclovir和舒維(Zovir等商品名銷售。這些是核苷類似物，其干擾細(xì)胞內(nèi)的病毒生長(zhǎng)但對(duì)體表的游離病毒不起作用，因?yàn)檫@些藥物通過循環(huán)傳播且無法到達(dá)存在于開放的病毒病變上的游離病毒粒子。此外，因?yàn)槿靠共《舅幬锿ㄟ^干擾正常細(xì)胞代謝功能來起作用，所以其通常誘發(fā)重度有毒作用。經(jīng)ロ投予無環(huán)病毒(acyclovirus )和泛昔洛韋(famciclovir )以治療唇皰疹、生殖器皰疹、帯狀皰疹和水痘可誘發(fā)惡心、嘔吐、腹瀉、頭痛、皮疹、腎損傷和精神混亂；金剛胺(amantadine )治療流感A可引起惡心、食欲不振、神經(jīng)緊張(nervousness)、輕度頭痛、不穩(wěn)定、嗜睡和精神混亂；西多福,(cidofovir )、甘昔洛,(ganciclovir )和?？▋?nèi)特(foscamet )治療巨細(xì)胞病毒可廣生腎損傷和低白細(xì)胞計(jì)數(shù)；給予干擾素- a以刺激針對(duì)病毒感染的免疫性可引起流感樣癥狀、貧血癥、抑郁癥、低白細(xì)胞計(jì)數(shù)、低血小板計(jì)數(shù)；已知奧司他,(oseltamivir )治療流感A和流感B產(chǎn)生惡心、嘔吐和眩暈，且病毒唑(ribavirin )用于兒童RSV感染可產(chǎn)生紅細(xì)胞分解和貧血癥(優(yōu)|11 M (URBAN M)，默克手冊(cè)■ (Merck Manual), 2009)。針對(duì)唇皰疫(cold sore)局部施用無環(huán)病毒(舒維療(zovirax )、噴昔洛,(penciclovir )阿糖腺苷(vidarabine ))并不有效且無已知的重度有毒作用。在體表上局部中和游離病毒粒子似乎是阻止感染的非常高效的替代方案；然而目前尚無可用于阻止局部病毒感染，特別是在初期感染階段，從而避免局部病毒進(jìn)入細(xì)胞中的疫苗。近來的科學(xué)研究還證明，除病毒表面糖蛋白以外，蛋白酶也在促進(jìn)局部病毒進(jìn)入細(xì)胞中發(fā)揮重要作用。已知在細(xì)胞內(nèi)部病毒増殖期間使用蛋白酶，但近來發(fā)現(xiàn)蛋白酶涉·及促進(jìn)來自例如皰疹等外部體表的病毒進(jìn)入和來自皮膚病變或咽喉表面的流感病毒進(jìn)入(奇多(Kido)，2007 ;德爾沃伊(Delboy)，2008)。)因?yàn)榈鞍酌妇哂兴馓禺愋缘鞍踪|(zhì)的潛能，所以ー些表面上無附著和進(jìn)入宿主細(xì)胞的特異性受體的病毒借助于這些蛋白酶來破壞細(xì)胞壁并進(jìn)入細(xì)胞中。蛋白酶(protease),也稱為蛋白酶(proteinase)或蛋白水解酶(proteolyticenzyme)，是細(xì)胞內(nèi)部或外部、尤其損傷組織附近可見的一大群酶，且在蛋白質(zhì)分解代謝中通過水解多肽鏈中將氨基酸連接在一起的肽鍵而發(fā)揮重要作用。蛋白酶涉及蛋白質(zhì)分子的分裂。其主要作用是破壞井清潔組織分解期間產(chǎn)生的蛋白質(zhì)殘骸，因?yàn)檫@些物質(zhì)干擾組織修復(fù)過程。其對(duì)為后續(xù)組織修復(fù)產(chǎn)生有利的環(huán)境來說必不可少。其中一些可從蛋白質(zhì)鏈分離末端氨基酸(外肽酶，例如氨基肽酶、羧基肽酶)，而其它攻擊蛋白質(zhì)的內(nèi)部肽鍵(內(nèi)肽酶，例如胰蛋白酶、糜蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、彈性蛋白酶)。局部或細(xì)胞內(nèi)部可見數(shù)百種蛋白酶，且所述蛋白酶根據(jù)其催化活性部位的特征和作用條件可分為四個(gè)主要群組絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸(硫醇)蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶或基質(zhì)金屬蛋白質(zhì)(Matrix-Metallo-Protein, MMP)。蛋白酶附著于特定群組取決于催化部位的結(jié)構(gòu)和對(duì)其活性必不可少的氨基酸(作為組分之一)。許多蛋白酶可局部見于病毒感染的皮膚或粘膜上，例如胃蛋白酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、胱氨酸蛋白酶(cystin proteinase)(組織蛋白酶B、H、K、L、S)、天冬氨酸蛋白酶(組織蛋白酶D)、凝血因子和涉及局部傷ロ愈合過程的基質(zhì)金屬蛋白質(zhì)，例如明膠酶A (MMP-2)、明膠酶B (MMP-9)、膠原酶(MMP-I)、膠原酶3 (MMP-13)、溶基質(zhì)素-1 (MMP-3)、溶基質(zhì)素-3 (MMP-11)、MT- IMMP (MMP-14)、巨噬細(xì)胞金屬?gòu)椥缘鞍酌?MMP-12)和當(dāng)然許多尚未發(fā)現(xiàn)的其它蛋白酶。對(duì)胞外基質(zhì)、皮膚上的病毒病變(例如唇皰疹)、粘膜上的病毒病變(例如生殖器皰疹)和咽喉表面上的病毒病變(例如流感病毒)中存在的不同類型的蛋白酶的分析還表明，具有特異性蛋白分解活性的組織感染部位處存在許多不同類型的蛋白酶。已十分明確，許多病毒使用蛋白酶來促進(jìn)其在細(xì)胞內(nèi)部的増殖，例如HIV I蛋白酶，這ー蛋白酶有助于HIV-AIDS病毒通過在適當(dāng)位置裂解新合成的聚合蛋白質(zhì)以產(chǎn)生傳染性HIV病毒粒子的成熟蛋白質(zhì)組分來増殖。如果沒有有效HIV蛋白酶，HIV病毒粒子仍是非傳染性的。因此，開發(fā)了細(xì)胞內(nèi)蛋白酶抑制劑(例如沙奎那韋(saquinavir )、利托那韋(ritonavir )、茚地那韋(indinavir )、奈非那韋(nelfinavir ))和數(shù)種其它類似物來
阻斷HIV病毒生長(zhǎng)。這些產(chǎn)物単獨(dú)或組合經(jīng)ロ給予(例如洛匹那韋(Liponivir )和利托那韋(Ritonavir ))來阻斷HIV病毒生長(zhǎng)。但其作為一般抗病毒劑的使用因其毒性、副作用和不良活性而高度受限。一些細(xì)胞內(nèi)蛋白酶抑制劑(安吉拉司(Agenerase )、克濾滿(Crixivan )、英韋拉司(Invirase )、卡樂曲(Kaletra )、Lexiva 、諾韋(Norvir )、輩力(Prezista )、銳艾妥(Reyataz )和維拉賽特(vitacept ))早已經(jīng)授權(quán)用作抗蛋白酶藥物且與其它抗
病毒藥物組合經(jīng)ロ用于治療AIDS。
令人遺憾的是，大多數(shù)這些蛋白酶抑制劑實(shí)質(zhì)上是蛋白質(zhì)且容易被傷口中所存在的天然蛋白酶破壞(派替克(Patick)等人，1998)，且因此其不能用于局部病毒感染。雖然所有未來抗病毒治療還針對(duì)通過經(jīng)ロ投予例如新蛋白酶抑制劑、核苷RNA復(fù)制酶抑制劑、整合酶抑制劑、核苷反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、非核苷反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑和環(huán)孢素衍生物來阻止細(xì)胞內(nèi)病毒復(fù)制，但歸因于其細(xì)胞內(nèi)作用模式，尚未設(shè)想其局部用于阻止病毒進(jìn)入細(xì)胞中。歸因于其在組織修復(fù)中的作用，蛋白酶的局部濃度在損傷部位處明顯増加。因?yàn)榫植坎《靖腥驹谄つw或粘膜損傷之前通常檢測(cè)不到，所以在所有局部病毒感染中蛋白酶的量都極高。毎年世界范圍內(nèi)感染超過5億人的流感病毒，在吸入期間最初與咽喉細(xì)胞接觸，對(duì)病毒膜融合糖蛋白前體無加工蛋白酶，且所述病毒不能進(jìn)入細(xì)胞中。因此，這ー病毒使用呼吸道表面上存在的蛋白酶來進(jìn)入和感染咽喉細(xì)胞。氣道中早已鑒別至少5種不同的加工蛋白酶(胰蛋白酶樣)(奇多(Kido)，2007)。最初，少量病毒粒子進(jìn)入細(xì)胞中，然后數(shù)倍且數(shù)百萬新病毒粒子釋放于咽喉表面上。所有這些病毒粒子需要借助于蛋白酶才能進(jìn)入新健康細(xì)胞中和傳播感染。因此，我們的身體防御機(jī)理在上呼吸道中釋放稱為分泌白細(xì)胞蛋白酶的抗蛋白酶且在下呼吸道中釋放肺表面活性物質(zhì)來降低病毒進(jìn)入細(xì)胞可利用的游離蛋白酶的量。當(dāng)?shù)鞍酌富钚詢?yōu)于抑制性化合物活性時(shí)，不能阻止病毒感染(奇多(Kido)，2004)。近來的科學(xué)研究還表明，其它局部病毒(例如引起唇皰疹和生殖器皰疹的皰疹病毒)也借助于ー些蛋白酶來感染細(xì)胞。已顯示，開放的皰疹病毒病變、MMP-2和MMP-9蛋白酶的含量在早期感染期間增加(馬丁尼茲(Martinez)，2004)，某些蛋白酶抑制劑降低皰疹病毒的活性(拉 法茲(LaFrazia)，2006)，并且細(xì)胞蛋白酶涉及包膜病毒的病原性(奇多(Kido)，1996)?？紤]到表面病毒糖蛋白對(duì)病毒附著宿主細(xì)胞的作用和病毒使用蛋白酶進(jìn)入宿主細(xì)胞，必需尋找ー種通過同時(shí)中和病毒表面糖蛋白和相應(yīng)蛋白酶來治療局部病毒感染的方法。目前，尚無已知的阻斷局部病毒進(jìn)入細(xì)胞的局部抗蛋白酶抑制劑或病毒表面糖蛋白抑制劑。此可與如下事實(shí)相關(guān)因?yàn)榇嬖谠S多蛋白酶，各自具有特異性活性，所以發(fā)現(xiàn)ー種可中和所有蛋白酶的特異性藥物極其困難。在目前尚不了解局部存在的蛋白酶的精確數(shù)目和其在局部病毒感染中的作用的情況下，僅非特異性蛋白酶抑制劑可阻斷所有蛋白酶?？紤]到感染表面上局部存在的游離病毒粒子的量(以百萬計(jì))，有效治療不應(yīng)僅中和特異性病毒糖蛋白，而還應(yīng)使促進(jìn)病毒進(jìn)入細(xì)胞中的蛋白酶的量降至最少。在不存在殺死繼續(xù)感染新細(xì)胞的局部病毒粒子的任何特異性藥物的情況下，含阿昔洛韋(acyclovir )的乳膏現(xiàn)也銷售用于局部施用，但歸因于其細(xì)胞內(nèi)作用模式，阿昔洛韋(acyclovir )不能作用于局部釋放于病變中且存在于細(xì)胞外部的游離病毒粒子。在所有局部病毒感染中，病變表面上存在的游離病毒粒子繼續(xù)從外部攻擊新健康細(xì)胞以傳播感染。
還提出將ー些草本制劑局部施用于病毒病變，但任何這類草本藥物本身不能廣泛使用證明其效率極其受限且其不能視為特異性抗病毒藥物。舉例來說，提出使用大黃(Rhubarb)與鼠尾草植物提取物治療唇皰疹，其中臨床結(jié)果顯示用鼠尾草乳膏，平均病變治愈時(shí)間為7. 6天，大黃-鼠尾草乳膏為6. 7天，且舒維療(zovirax )為6. 5天(沙勒(Sailer)等人，2001)。與含阿昔洛韋(acyclovir )的舒維療(zovirax )乳膏使皰疹病變治愈時(shí)間縮短約15%相比，這兩種植物提取物的組合使皰疹病變治愈時(shí)間縮短約12%，將所述產(chǎn)品視為特異性局部皰疹治療一點(diǎn)也不令人滿意。還使用分離的活體外細(xì)胞培養(yǎng)物模型或?qū)μ禺愋圆《靖街荏w測(cè)試大量植物提取物，但其不足以被視為抗病毒劑而用于進(jìn)一歩臨床試驗(yàn)或進(jìn)ー步開發(fā)為抗病毒藥物。顯示海藻硫酸化多糖干擾HIV肝素受體結(jié)合(微特維奧(Witvrouw)，1997);發(fā)現(xiàn)綠茶沒食子酸表焙兒茶素阻斷分離的細(xì)胞中的HIV-I病毒的gpl20-cd4結(jié)合(哈姆扎(Hamza), 2006);顯不中藥植物夏枯草(Prunella vulgaris)和 Rhizoma cibotte 的提取物可能由于單寧干擾HIV-lgp41六螺旋束形成而抑制活體外HIV-lgp41六螺旋束形成(劉(Liu),2002);發(fā)現(xiàn)印度植物印度當(dāng)藥(Swertia chirata)提取物減少活體外生長(zhǎng)的HIV-1，表明發(fā)現(xiàn)ー些植物提取物具有一定的抗病毒活性，而這一局部抗病毒作用不足以將所述植物用作抗病毒藥物。還提出例如蜂膠等其它天然物質(zhì)抑制II型單純皰疹病毒生長(zhǎng)，這是因?yàn)楦缓交人崆胰狈︻慄S酮的水性提取物和富含類黃酮的こ醇提取物兩者都顯示HSV-2感染性降低(諾肯佩爾(Nolkemper)，2009)。因?yàn)樵谒芯植坎《靖腥局?，表面皮膚或粘膜細(xì)胞最初釋放大量游離病毒粒子于病變表面上且因?yàn)檫@ー游離病毒通常借助于各種蛋白水解酶附著新健康細(xì)胞，所以理想的局部抗病毒治療應(yīng)具有以下主要性質(zhì)-應(yīng)中和幫助病毒粒子進(jìn)入細(xì)胞中的所有病毒糖蛋白受體以阻止新細(xì)胞感染。-應(yīng)同時(shí)中和感染表面上存在的可由病毒使用以進(jìn)入細(xì)胞膜中的所有蛋白酶。-應(yīng)對(duì)皮膚或粘膜細(xì)胞無刺激、無毒且應(yīng)價(jià)格低廉。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的ー個(gè)目標(biāo)是提供ー種協(xié)同組合物，其能夠同時(shí)中和涉及促進(jìn)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞或病毒附著于宿主細(xì)胞和涉及誘導(dǎo)局部感染的糖蛋白包膜病毒的病原性的蛋白酶與病毒糖蛋白。本發(fā)明的另一目標(biāo)是提供ー種協(xié)同組合物，其能夠中和涉及局部感染的蛋白酶與病毒糖蛋白，局部感染例如皰疹病毒、流感病毒、人類乳頭瘤病毒、腺病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒和其它局部包膜病毒。本發(fā)明的另一目標(biāo)是提供ー種協(xié)同組合物，其能夠中和涉及局部感染的蛋白酶與病毒糖蛋白，局部感染例如唇皰疹、生殖器皰疹、病毒咽喉感染、皰疹性濕疹、人類乳頭瘤、皮疹、病毒疣病變和游離病毒粒子可見于病變表面的其它病毒感染。本發(fā)明的另一目標(biāo)是提供ー種協(xié)同組合物，其用作局部病毒感染的預(yù)防性或治愈性治療。本發(fā)明的另一目標(biāo)是提供ー種協(xié)同組合物，其用作治療人體和動(dòng)物體的局部病毒感染的安全、高效且廉價(jià)的化妝品或藥物或醫(yī)學(xué)裝置。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明發(fā)明者已完全或部分解決了以上提及的問題。如先前所指示，已知感染表面上的數(shù)百種蛋白酶，但仍有許多其它蛋白酶尚未知。因此，幾乎不可能發(fā)現(xiàn)ー種針對(duì)各蛋白酶的特異性抑制劑。類似地，因?yàn)椴《就鈮由洗嬖诒姸嗵堑鞍?，所以同時(shí)中和所有病毒糖蛋白同樣極其困難。在研究期間，令人驚訝的是，本發(fā)明發(fā)明者觀察到富含特異性單寧的植物提取物的組合可同時(shí)協(xié)同中和特異性病毒糖蛋白和蛋白酶，且因此在最初感染階段中和局部病毒感染。本發(fā)明發(fā)明者進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)清楚表明，如果僅中和病毒糖蛋白或如果僅阻斷蛋白酶，那么局部病毒感染不能完全被阻止。這是因?yàn)楸砻嫔洗嬖跀?shù)百萬的病毒粒子，且必需同時(shí)中和這兩種系統(tǒng)以降低感染。令人遺憾的是，到目前為止，尚無具有對(duì)阻止局部病毒感染必不可少的這兩個(gè)基本性質(zhì)的已知的藥物或植物提取物或單寧。在本發(fā)明之前，尚不知為治療局部病毒感染必需同時(shí)中和病毒糖蛋白和特異性蛋白酶，也不存在針對(duì)同時(shí)阻斷病毒糖蛋白和蛋白酶以治療局部病毒感染的任何天然或合成產(chǎn)物。因此，本發(fā)明涉及ー種用于治療局部病毒感染的包含富含單寧的植物提取物的協(xié)同組合物，所述植物提取物含有至少ー種蛋白酶抑制劑和/或至少ー種病毒糖蛋白抑制齊U。尤其取決于所用提取物中單寧的濃度，根據(jù)本發(fā)明的協(xié)同組合物優(yōu)選包含以協(xié)同組合物的總重量計(jì)0. I重量％至20重量％、尤其0，5重量％至6重量％且更尤其2重量％至4重量％的各植物提取物。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的協(xié)同組合物的至少ー種蛋白酶抑制劑來自選自包含以下植物提取物的群組的富含單寧的植物提取物紫花紫錐菊(Echinacea purpurea)和/或山茶(Camellia sinensis),且根據(jù)本發(fā)明的協(xié)同組合物的至少ー種病毒糖蛋白抑制劑來自選自包含以下植物提取物的群組的植物提取物細(xì)花含羞草(Mimosa tenuiflora)、羽衣草(Alchemilla vulgaris)、積雪草(Centella asiatica)、歐洲七葉樹(Asculushippocastanum)、JL茶(Acacia catechu；ネロ鼠尾卓(Salvia officinalisノ。
所述提取物可使用所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的傳統(tǒng)提取技術(shù)制備。具體來說，所述提取物可使用溶劑提取技術(shù)來制備。所用溶劑可為水、こ醇、甘油、こニ醇，優(yōu)選為甘油。提取之前，植物可粉碎或切碎，且可為新鮮的、冷凍的、干燥的或凍干的?？蛇B續(xù)進(jìn)行數(shù)次提取直到活性成分被所用溶劑完全抽出。提取時(shí)間隨用于提取的溶劑、溫度和可能壓カ而變化。實(shí)際上，對(duì)于可盈利的エ業(yè)開發(fā)，這ー時(shí)間可限于不到兩小時(shí)。植物的任何部分都可用于制備根據(jù)本發(fā)明的植物提取物。羽衣草、積雪草、紫花紫錐菊和歐洲七葉樹的提取物優(yōu)選是至少ー個(gè)地上部分的提取物，且更優(yōu)選是全植物提取物，而細(xì)花含羞草和兒茶的提取物是植物的樹皮提取物。術(shù)語“所述植物的地上部分”打算意指植物不在地下的任何部分。植物的地上部分包含葉子、果實(shí)、花、莖、種子，優(yōu)選是葉子和樹枝。 術(shù)語“全植物提取物”打算意指植物整個(gè)地上部分的提取物。這些提取物可使用惠*W 卡爾曼(Huie W Carmen)撰寫的綜述文章(惠(Huie),2002)中所描述的不同方法來制備。取決于植物提取物和制備方法，單寧的濃度可為1%至35%、尤其2%至12%縮合單寧不等。所述含有所要數(shù)量單寧的植物提取物中的一些例如由法國(guó)法倫休(Valanjou)的馬丁鮑爾公司(Martin Bauer Company)出售。單寧可視為含有足夠羥基和其它適合基團(tuán)(即羧基)以與大多數(shù)大分子有效形成強(qiáng)鍵的具足夠高分子量的任何酚系化合物。歸因于單寧的蛋白質(zhì)結(jié)合性質(zhì)，其自古代起即用于將皮膚制成生皮，因?yàn)槠湓谒兴劳龅钠つw蛋白質(zhì)分子之間產(chǎn)生鍵以將皮膚制成皮革。根據(jù)本發(fā)明的羽衣草的提取物尤其可包含以提取物的總重量計(jì)I重量％至20重量％、優(yōu)選2重量％至12重量％且更優(yōu)選3重量％至8重量％的單寧，以干提取物表示。根據(jù)本發(fā)明的細(xì)花含羞草的提取物尤其可包含以提取物的總重量計(jì)I重量％至25重量％ ,優(yōu)選2重量％至14重量％且更優(yōu)選3重量％至12重量％的單寧，以干提取物表
/Jn o根據(jù)本發(fā)明的紫花紫錐菊的提取物尤其可包含以提取物的總重量計(jì)0，5重量％至12重量％ ,優(yōu)選I重量％至8重量％且更優(yōu)選2重量％至7重量％的單寧，以干提取物表不。根據(jù)ー個(gè)實(shí)施例,本發(fā)明的協(xié)同組合物包含來自紫花紫錐菊(E. purpurea)的富含單寧的植物提取物以及來自細(xì)花含羞草(M. tenuiflora)、羽衣草(A. vulgaris)、積雪草(C. asiatica)或歐洲七葉樹(A. hippocastanum)的富含單寧的植物提取物,其用于治療皰疹病毒中和。根據(jù)另ー實(shí)施例，本發(fā)明的協(xié)同組合物包含來自紫花紫錐菊的富含單寧的植物提取物以及來自山茶(C. sinensis)的富含單寧的植物提取物，其用于治療流感病毒。根據(jù)另ー實(shí)施例，本發(fā)明的協(xié)同組合物包含來自山茶的富含單寧的植物提取物以及來自兒茶或細(xì)花含羞草的富含單寧的植物提取物，其用于治療流感病毒。根據(jù)ー個(gè)實(shí)施例，本發(fā)明的協(xié)同組合物包含富含抗蛋白酶活性選自紫花紫錐菊或山茶的植物提取物與選自細(xì)花含羞草、羽衣草、山茶、積雪草、歐洲七葉樹、鼠尾草或兒茶的提取物的能夠中和病毒糖蛋白的植物提取物的協(xié)同組合。提取物的組合比率可為I : Iw/W，但這ー比率可視欲治療的病毒感染類型而變化。協(xié)同組合物優(yōu)選是用于治療選自包含以下的群組的局部病毒感染的組合物唇皰疹或生殖器皰疹、流感、咽喉感染、乳頭瘤病毒和皮膚和粘膜的其它病毒感染。如先前所定義，術(shù)語“局部”是指身體的所有外部部分，例如皮膚、口腔、咽喉、上呼吸道、鼻腔、陰道粘膜、眼表和天然體竅。因此，本發(fā)明的協(xié)同組合物涉及用于治療表現(xiàn)于體表上的病毒感染的組合物，所述病毒感染例如口腔皰疹和生殖器皰疹、咽喉流感病毒感染和其它局部皮膚病毒感染。術(shù)語“局部病毒感染”打算意指病毒粒子局部存在的所有局部感染。術(shù)語“協(xié)同”打算意指組合物的富含單寧的植物提取物的組合作用高于單獨(dú)使用各植物提取物的作用。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明協(xié)同組合物的用途，其用于制造供治療局部病毒感染的藥劑或醫(yī)學(xué)裝置。術(shù)語“醫(yī)學(xué)裝置打算”意指在不影響體細(xì)胞功能的情況下主要通過其物理性質(zhì)(例如與損傷腔中的蛋白水解酶或其它蛋白質(zhì)結(jié)合)發(fā)揮其作用的任何產(chǎn)品(例如植物提取物的組合)或物品。醫(yī)學(xué)裝置可包括壓迫繃帶、水凝膠、聚合物膜、溶液、懸浮液、乳膏、凝膠劑、軟膏、洗劑、緩慢釋放設(shè)計(jì)或噴霧劑。本發(fā)明還涉及ー種治療局部病毒感染的方法，其包含向個(gè)體投予本發(fā)明協(xié)同組合物的步驟。本發(fā)明還涉及本發(fā)明協(xié)同組合物的非治療用途，其用作局部施用于病毒起源皮膚病變上的化妝產(chǎn)品。這些化妝產(chǎn)品可為溶液、懸浮液、乳膏、凝膠劑、軟膏、洗剤、緩慢釋放設(shè)計(jì)、膜或噴霧劑。兩種植物提取物的組合在預(yù)防和/或治愈局部病毒感染中的協(xié)同抗病毒性質(zhì)的證據(jù)由以下藥理學(xué)、毒理學(xué)和臨床研究顯而易見。雖然所提供實(shí)例說明本發(fā)明，但其無論如何不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明發(fā)明者提供的實(shí)驗(yàn)概要包括以下步驟-選擇植物，-制備植物提取物，-選擇病毒物種，-測(cè)試和分析所制備植物提取物的蛋白酶抑制活性，-測(cè)試和分析所制備植物提取物的病毒糖蛋白中和性質(zhì)，-測(cè)試具有抗蛋白酶或病毒糖蛋白抑制性質(zhì)的植物提取物中和病毒的協(xié)同活性，-協(xié)同組合物的臨床評(píng)估和安全性評(píng)估。棺物的選擇和棺物提取物的制備:選擇134種富含單寧的已知植物，包括紫花紫錐菊、細(xì)花含羞草(Mimosatenuiflora/M. tenuiflora)、歐洲七葉樹(Asculus hippocastanum/A. hippocastanum)、鼠尾草(S alvia officinalis/S. officinalis)> 習(xí)習(xí)衣草(Alchemilla vulgaris/A. vulgaris)、積雪草(Centella asiatica/C. asiatic)、山條(Camilla sinensis)(綠茶(Green tea))和兒茶(Acacia catechu/A. catechu)。
使用植物的含有最大量的縮合單寧的部分制備所選植物的植物提取物。因?yàn)樗苄詥螌幉贿m于局部施用，所以通過使用文獻(xiàn)(納菲斯(Nafisi)-莫伐格爾(movaghar)，1991)中公開的不同提取方法，植物提取物富含縮合單寧。簡(jiǎn)言之，最初在I 12固體與水的比率下，混合植物材料與水，且在200-300° F下在2-50Psi壓カ下攪拌I小吋。所獲得的水溶液然后經(jīng)聚合膜過濾以去除大粒子。溶液通過添加3% w/w膨土純化并通過過濾去除。提取物然后與吸附材料(填充在柱中的非離子型樹脂)保持接觸，且保留在吸附材料上的單寧用極性溶劑洗脫。濃單寧提取物然后通過原子化干燥，獲得富含單寧的可溶性干植物提取物。取決于單寧中植物的最初富含程度和所用的植物部分，干提取物中單寧的百分比為5%至34%不等。在使用之前，這些干提取物溶解于水中(10mg/ml)作為母溶液。為進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，各植物提取物進(jìn)ー步稀釋，最終濃度為lmg/ml，且當(dāng)兩種植物提取物組合時(shí)，最終濃度為0，5mg/ml。參考病毒的選擇:在局部病毒感染中，誘發(fā)局部唇病變和生殖器病變的皰疹病毒和引起咽喉感染的 流感病毒代表具有表面糖蛋白的主要局部病毒。因此，所有實(shí)驗(yàn)都采用這兩種病毒作為參考病毒。測(cè)試和分析所制備植物提取物的蛋白_抑制活性:關(guān)于涉及病毒進(jìn)入細(xì)胞中的蛋白酶的研究在尚不了解涉及促進(jìn)病毒進(jìn)入細(xì)胞中的蛋白酶的情況下，用不同蛋白酶進(jìn)行最初實(shí)驗(yàn)以選擇涉及促進(jìn)抱疫和流感病韋進(jìn)入細(xì)胞中的蛋白酶。所選基質(zhì)金屬蛋白質(zhì)MMP1、MMP2、MMP3、MMP7、MMP9、MMP10和MMP12然后以不同組合測(cè)試以發(fā)現(xiàn)所有涉及特定病毒進(jìn)入的 MMP。純?nèi)祟怣MP(蛋白酶)和蛋白酶分析試劑盒購(gòu)自美國(guó)亞培公司(AnaSpec, Inc,USA)。MMPl (間質(zhì)和纖維母細(xì)胞膠原酶，Ref. 72004和71128) ,MMP 2(明膠酶A，Ref. 72005和 71151) ,MMP 3 (溶基質(zhì)素-l,transinl,Ref. 72006 和 71153)、MMP7 (酶原，Ref. 72007)、MMP-9 (明膠酶 B，膠原酶 IV，Ref. 72009 和 71134)和 MMP-12 (彈性蛋白酶，Ref. 72010 和71137)、MMP_10 (溶基質(zhì)素2，Ref. 72067和72024)以0. 5 y g/ml濃度與病毒懸浮液或細(xì)胞培養(yǎng)物一起使用，且用于定量分析。最初，Vero(非洲綠猴腎(African Green monkey kidney))和 MDCK(MadineDurby Canin Kidney)細(xì)胞在75cm2組織培養(yǎng)燒瓶(美國(guó)康寧(Corning,USA))中在補(bǔ)充有10%胎牛血清(FCS)和抗生素的杜氏改良伊氏培養(yǎng)基(Dulbeccc/ s Modified Eagle; sMedium, DMEM)中生長(zhǎng)。所有細(xì)胞在37°C、5% CO2下培養(yǎng)。在使用無血清培養(yǎng)基和適當(dāng)對(duì)照的于96孔組織培養(yǎng)板中生長(zhǎng)的細(xì)胞培養(yǎng)物中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。使用細(xì)胞仍暴露于外部環(huán)境的細(xì)胞培養(yǎng)模型來模擬局部病毒感染。使用對(duì)皰疫病毒感染敏感的Vero細(xì)胞和對(duì)流感病毒感染敏感的MDCK細(xì)胞。細(xì)胞和病毒購(gòu)自美國(guó)ATCC培養(yǎng)中心。為確定病毒カ價(jià)和50%組織培養(yǎng)感染劑量(TCID5tl)或100%組織培養(yǎng)感染劑量(TCID100)，細(xì)胞在96孔組織培養(yǎng)板中與10倍病毒稀釋液(m. o. i. 2)生長(zhǎng)匯合，且在37°C下培育I小吋。接種物去除后，用PBS洗滌細(xì)胞且與新鮮培養(yǎng)基一起培育72小吋。用MTT活體染色評(píng)估細(xì)胞死亡。在一些情況下，對(duì)于流感病毒，從各孔取出50 Ul上清液樣品，轉(zhuǎn)移到新的96孔板，且用0. 5%雞紅細(xì)胞懸浮液通過血細(xì)胞凝集(HA)試驗(yàn)滴定病毒。利用里德(Reed)和穆徹(Muench) (1938)方法計(jì)算TCID劑量。為研究涉及病毒進(jìn)入細(xì)胞中的蛋白酶，個(gè)別蛋白酶或蛋白酶組合(0. 5iig/ml)暴露于無蛋白酶無血清組織培養(yǎng)基中的感染TCID5tl濃度的皰疹或流感病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物72小吋。然后如先前所述確定病毒生長(zhǎng)。如果病毒生長(zhǎng)無變化，那么MMP視為不涉及病毒進(jìn)入細(xì)胞中的過程，但如果病毒生長(zhǎng)優(yōu)于相應(yīng)未添加MMP的病毒對(duì)照，確定病毒生長(zhǎng)的增加％以評(píng)估MMP涉及病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞中的程度。值表示最少3個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值(每實(shí)驗(yàn)，n = 16)。僅涉及皰疹和流感病毒生長(zhǎng)的MMP的結(jié)果呈現(xiàn)如下(表I):
權(quán)利要求
1.ー種用于治療局部病毒感染的包含富含單寧的植物提取物的協(xié)同組合物，所述植物提取物含有至少ー種蛋白酶抑制劑和/或至少ー種病毒糖蛋白抑制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的協(xié)同組合物，其中至少ー種蛋白酶抑制劑來自選自包含以下植物提取物的群組的富含單寧的植物提取物紫錐菊(Echinacea purpurea)和/或山茶(Camellia sinensis),以及至少ー種病毒糖蛋白抑制劑植物提取物選自包含以下植物提取物的群組細(xì)花含羞草(Mimosa tenuiflora)、羽衣草(Alchemilla vulgaris)、積雪草(Centella asiatica)、歐洲七葉樹(Asculus hippocastanum)、兒茶(Acacia catachu)和鼠尾草(Salvia officinalis)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的協(xié)同組合物,其包含來自紫花紫錐菊(E.purpurea)的富含單寧的植物提取物以及來自細(xì)花含羞草(M. tenuiflora)、羽衣草(A. vulgaris)、積雪草(C. asiatica)或歐洲七葉樹(A. hippocastanum)的富含單寧的植物提取物,其用于治療皰疫病毒。
4.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的協(xié)同組合物,其包含來自紫花紫錐菊(E.purpurea)的富含單寧的植物提取物以及來自山茶(C. sinensis)的富含單寧的植物提取物，其用于治療流感病毒。
5.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的協(xié)同組合物,其包含來自山茶(C.sinensis)的富含單寧的植物提取物以及來自兒茶(A. catechu)或細(xì)花含羞草(M. tenuiflora)的富含單寧的植物提取物，其用于治療流感病毒。
6.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的協(xié)同組合物，其中局部病毒感染選自包含以下的群組唇皰疹或生殖器皰疹、流感、咽喉感染、乳頭瘤病毒和皮膚和粘膜的其它病毒感染。
7.—種如權(quán)利要求I或2中所述的協(xié)同組合物的用途，其用于制造供治療局部病毒感染用之藥劑或醫(yī)學(xué)裝置。
8.一種治療局部病毒感染的方法，其包含向個(gè)體投予如權(quán)利要求I或2中所述的協(xié)同組合物的步驟。
9.一種本發(fā)明協(xié)同組合物的非治療用途，其用作局部施用于病毒起源皮膚病變上的化妝產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于治療局部病毒感染的包含富含單寧的植物提取物的協(xié)同組合物，所述植物提取物含有至少一種蛋白酶抑制劑和/或至少一種病毒糖蛋白抑制劑。
文檔編號(hào)A61P31/12GK102844041SQ201080061220
公開日2012年12月26日 申請(qǐng)日期2010年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月11日
發(fā)明者拉維·蘇尼爾光塔瓦, 克里斯汀娜·蘇尼爾光塔瓦 申請(qǐng)人:維托生物有限責(zé)任公司