專利名稱：蓮子心或其提取物的新用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及蓮子心在制備預(yù)防或/和治療糖尿病腎病藥物或保健食品中的用途，屬于醫(yī)藥食品領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
糖尿病腎病是糖尿病最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，又是終末期腎病主要原因。隨著經(jīng)濟(jì) 的發(fā)展和生活方式的改變，糖尿病的發(fā)病率逐漸升高，目前尚無較好的治療方法。糖尿病性 腎病其他病理改變特點(diǎn)包括腎小球基膜增厚，腎小球上皮細(xì)胞足突融合以及由于細(xì)胞外系 膜基質(zhì)增多所致腎小球增大。疾病晚期可出現(xiàn)腎小管萎縮腎內(nèi)纖維化。糖尿病病程10年 以上者約50%并發(fā)糖尿病腎病。目前，糖尿病的治療主要在兩方面誘發(fā)因素的控制和DN 發(fā)展中關(guān)鍵環(huán)節(jié)的阻斷。目前，糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)理雖尚未完全清楚，但腎小球基膜增厚，腎小球上皮細(xì) 胞足突融合及腎小球機(jī)械屏障和電荷屏障受損，導(dǎo)致尿蛋白的漏出是其主要原因。腎小球 濾過屏障是腎小球的重要結(jié)構(gòu)，從內(nèi)向外依次為內(nèi)皮窗孔層，腎小球基底膜(GBM)、足細(xì)胞 及其裂孔隔膜(GPSD)，其中GBM和GPSD是阻止蛋白漏出最主要的兩層。GBM主要起電荷屏 障作用，GPSD主要發(fā)揮機(jī)械屏障作用，它們的結(jié)構(gòu)和功能的任何改變均可破壞腎小球?yàn)V過 屏障的完整性，導(dǎo)致蛋白漏出。腎組織足細(xì)胞相關(guān)分子nephrin、podocin和GBM上相關(guān)分 子乙酰肝素酶(heparanase，HPA)的變化可以反映機(jī)械屏障和電荷屏障的變化。因此，如能 減輕腎小球基膜增厚，減少腎小球上皮細(xì)胞足突融合，恢復(fù)腎小球機(jī)械屏障和電荷屏障是 最終減少尿蛋白漏出的關(guān)鍵，也是治療糖尿病腎病的重要靶點(diǎn)。蓮子心(PLUMULANELUMBINIS)，又名蓮心，為睡蓮科Nelumbo nuciferaGaertn.多 年生水生草本植物蓮的成熟種子中的青嫩胚芽?！吨袊幍洹?005版一部收載，具有清心安 神，交通心腎，澀精止血。據(jù)報(bào)道，蓮子心中主要含有蓮子心堿(liensinine)、甲基蓮子心 堿(neferine)、異蓮子心堿(isoliensinine)等生物堿及木犀草素、蘆丁等黃酮類化合物。 蓮子心的藥效主要為降壓和抗心律失常等作用。文獻(xiàn)潘揚(yáng)，等，蓮子心及Nef對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖 尿病及肥胖大鼠模型的影響，《南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)》，2003年19卷4期，公開了蓮子心及甲 基蓮心堿(neferine，Nef)對(duì)鏈脲佐菌素(str印tozotocin，SIZ)和高糖高脂制作的大鼠糖 尿病及肥胖模型的影響，并與二甲雙胍(metformin，Met)作對(duì)照。結(jié)果表明，蓮子心及Nef 對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病及肥胖大鼠有一定的降低血糖及調(diào)節(jié)血脂作用。目前尚有關(guān)于蓮子心及提 取物用于預(yù)防或/和治療糖尿病腎病的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)方案是提供了蓮子心或其提取物的新用途。本發(fā)明提供了蓮子心或其提取物在制備預(yù)防或/和治療糖尿病腎病的藥物或保 健食品中的用途。其中，所述的蓮子心提取物為蓮子心的水或有機(jī)溶液提取物或酸堿提取物。其中，所述的蓮子心提取物是蓮子心水或有機(jī)溶劑提取物。所述的蓮子心提取物，可以是用蓮子 心的水提物，如水煎，水煎液的濃縮液，或蓮子心水提醇沉后經(jīng)噴霧干燥得到的粉劑；可以 是以乙醇或其他有機(jī)溶劑對(duì)蓮子心進(jìn)行提??；可以是以酸液滲漉對(duì)蓮子心進(jìn)行提取；可以 是以離子交換樹脂對(duì)蓮子心進(jìn)行提取；可以是以膜分離技術(shù)對(duì)蓮子心進(jìn)行提取等。其中，所述的蓮子心提取物為蓮子心總生物堿。其中，所述的藥物是減輕腎小球基膜增厚，減少腎小球上皮細(xì)胞足突融合，恢復(fù)腎 小球機(jī)械屏障和電荷屏障的藥物。其中，所述的蓮子心總生物堿中總生物堿的百分含量為5% 95%，含有蓮子心 堿的重量百分含量為 80%。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的蓮子心總生物堿提取物中總生物 堿的重量百分含量為30% 70%，含有蓮子心堿的重量百分含量為10% 30%。本發(fā)明的活性成分蓮子心總生物堿的含量以蓮子心堿為標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算。含量測(cè)定采 用紫外分光光度法測(cè)定蓮子心堿含量，蓮子心堿在處有最大吸收，根據(jù)蓮子心堿的 含量計(jì)算總生物堿的含量，也可采用HPLC法測(cè)定。(參考文獻(xiàn)郭毛娣，李蘭貴.中國大 陸產(chǎn)蓮子心中生物堿成分的研究[J].中草藥，1984，15 (7) 3.袁小紅.蓮子心微囊中總 生物堿的含量測(cè)定[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2006，17(7) :1141-1142 ；柳偉，王宏潔，司南等.蓮 子心總生物堿滴丸的制備工藝及含量測(cè)定[J].中國中藥雜志，2007,32(7) :581-584;陳錦 容.HPLC法測(cè)定不同炮制工藝蓮子心中生物堿的含量[J].海峽藥學(xué)，2009，21 (9) :33-36)本發(fā)明還提供了一種治療糖尿病腎病的藥物組合物，它是由有效量的蓮子心或其 提取物為活性成分，加上藥學(xué)上可接受的輔料或輔助性成分制備而成的制劑。其中，所述的制劑是口服制劑、注射制劑。本發(fā)明蓮子心及其活性成分制成的藥劑、保健食品和食品添加劑中，可以是臨床 上能夠使用的各種不同劑型。如片劑、口服液、丸劑、膠囊劑、注射劑(包括靜脈輸液劑)、膏 劑、酊劑、散劑、沖劑、栓劑、霜?jiǎng)?、透皮制劑等。也可添加到食品、飲料等保健食品中。?dāng)然 也可以將蓮子心原藥直接制備成單方或復(fù)方的制劑、保健食品和食品添加劑。本發(fā)明蓮子心用于預(yù)防或/和治療糖尿病腎病，藥效明確，且用藥安全，為臨床提 供了一種新的用藥選擇。顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識(shí)和慣用手段，在不脫離 本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。以下通過實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式
，對(duì)本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容 所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1本發(fā)明蓮子心總堿的制備取蓮子心，粉碎，加水2 6倍，煎煮3次，每次0. 5 池，合并濾液，回流濃縮，過 濾，加入2 8倍乙醇，使水提溶液中乙醇濃度達(dá)50 60%。靜置12 Mh，過濾，濾液減 壓回收乙醇至盡，并濃縮之相對(duì)密度為1. 20 1. 40，減壓干燥，得蓮子心提取物，即得蓮子 心總堿。含量測(cè)定采用紫外分光光度法，結(jié)果總生物堿的重量百分含量為70%，以蓮子心 堿計(jì)，重量百分含量為30%。
實(shí)施例2本發(fā)明蓮子心總堿的制備取蓮子心，粉碎，用2 5倍量70 85 %乙醇回流提取2 4次，每次回流提取 0. 5 1. 5h，濾過合并濾液，減壓回收乙醇，濃縮之相對(duì)密度為1. 01 1. 10的濃縮液。濃 縮液用硫酸調(diào)pH至2. 0 4. 0，靜置，離心，離心液用10 20%氨堿化調(diào)pH至8 10，靜 置，過濾取沉淀，加乙醇加熱溶解，靜置，過濾，濾液減壓回收乙醇至盡，并濃縮之相對(duì)密度 為1. 20 1. 40，減壓干燥，得蓮子心提取物，即得蓮子心總堿?？偵飰A含量50%，以蓮子 心堿計(jì)占10%。含量測(cè)定采用紫外分光光度法。實(shí)施例3本發(fā)明蓮子心總堿的制備取蓮子心，粉碎，放入滲漉器中，加入2 6%。HCl浸漬膨脹M 48h，然后不斷添 加新的2 6%。HC1，自上而下使其滲透過藥材，從滲漉器下部流出并收集浸出液，合并所有 濾液，用10 20%氨堿化至pH值為8 10，過濾得到沉淀，減壓干燥，即得蓮子心總堿，總 生物堿含量30%，以蓮子心堿計(jì)占15%。含量測(cè)定采用紫外分光光度法。實(shí)施例4蓮子心堿、異蓮子心堿、甲基蓮子心堿可從蓮子心總堿通過如下方式提取路線制備。蓮子心總堿一用制備高效液相分離蓮子心總堿一膠束電動(dòng)色譜分離其中，蓮子心堿、異蓮子心堿、甲基蓮子心堿三個(gè)化合物分離純化方法可參考如下 文獻(xiàn)朱金花，李德亮.膠束電動(dòng)色譜中大體積進(jìn)樣法分離測(cè)定蓮子心中的蓮子心堿、異 蓮子心堿和甲基蓮子心堿.分析化學(xué)，2009，37 (10) :126;陳昌國.大孔吸附樹脂分離純 化蓮子心中蓮子心總堿的研究.時(shí)珍國醫(yī)國藥2009,20(4) :981-983 ；張先洲，胡學(xué)民，羅 順德等.高效液相色譜法測(cè)定蓮子心中3種生物堿的含量.藥物分折雜志，1997，17 O) 110-112，或直接通過市售購買化合物標(biāo)準(zhǔn)品。這里所說的活性成分主要為雙芐基異喹 啉-(7-0-1Γ )-單醚鍵生物堿衍生物及類似物，主要為蓮子心堿、異蓮子心堿、甲基蓮子 心堿，可從睡蓮科植物的不同部位，如蓮子心、蓮須、荷葉等或通過全合成或半合成方法制 備。以下通過具體藥效學(xué)試驗(yàn)或臨床試驗(yàn)進(jìn)一步證明本發(fā)明的有益效果。試驗(yàn)例1本發(fā)明提取物的藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)1材料與方法1. 1實(shí)驗(yàn)材料1. 1. 1動(dòng)物清潔級(jí)健康雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠100只，體重180 200g，購 自四川大學(xué)華西實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。在室溫(22士 1)°C、相對(duì)濕度(55士5)%、光照周期12h 12h環(huán)境中適應(yīng)飼養(yǎng)Iwk后試驗(yàn)。1. 1. 2藥物蓮子心提取物，由實(shí)施例1方法制備，使用時(shí)用生理鹽水配制灌胃；開 博通(卡托普利)片，上海中美施貴寶藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)1003052。1. 1. 3主要試劑鏈脲佐菌素(Str印tozotocin，STZ)，Sigma公司，臨用前溶解在 0. 01mol/L枸櫞酸緩沖液中，pH 4. 5 ；兔抗大鼠η印hrin、podocin與HPA多克隆抗體，武漢 博士德；生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG、辣根過氧化酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG及山羊血清封閉 液，北京博奧森生物科技有限公司；動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒(離心柱型)及RT-PCR試劑盒，天根生化科技有限公司；PCR引物，上海生工生物工程技服務(wù)有限公司。1. 2 方法1. 2. 1動(dòng)物模型的建立及分組大鼠單次腹腔注射1 % STZ 65mg/kg, 72h后尾靜 脈采血，血糖儀測(cè)定全血血糖，以空腹1 后血糖> 11. lmmol/L者入選糖尿病大鼠模型。正 常對(duì)照組(n = 10，)單次腹腔注射等量枸櫞酸緩沖液。選取造模成功后的大鼠隨機(jī)分為蓮 子心提取物高劑量組(n = 10)，含蓮子心提取物^ig .kg—1，蓮子心提取物中劑量(n = 10)， 含蓮子心提取物2mg · kg、蓮子心提取物低劑量(n = 10)，含蓮子心提取物Img · kg—1，開 博通組(n = 10)，含開博通3. 6mg/kg(按照人與鼠體表面積換算，相當(dāng)于成人37. 5mg/d)灌 胃，糖尿病腎病模型組(n = 10)，正常對(duì)照組(n = 10)，正常對(duì)照組和模型組口服等量生理 鹽水。每天給藥一次，持續(xù)8wk。所有大鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間均喂標(biāo)準(zhǔn)飲食，自由飲水，不應(yīng)用 胰島素，保持墊料干燥，定期斷尾取血監(jiān)測(cè)血糖，觀察8wk。1. 2. 2標(biāo)本收集處死前準(zhǔn)確收集24h尿液，離心分裝后保存于_20°C冰箱中待測(cè)尿 蛋白和尿白蛋白含量。尾靜脈采血，血糖儀測(cè)定空腹1 后的全血血糖水平。稱量體重。末 次給藥μ小時(shí)后頸椎脫白處死大鼠，迅速取出雙側(cè)腎臟，用4°c預(yù)冷的生理鹽水反復(fù)清洗， 去包膜濾紙吸干血跡后稱重左腎，左腎重(KW)和體質(zhì)量的比值作為腎臟指數(shù)(KI)的指標(biāo)。 右腎縱剖為二，一半用10%中性福爾馬林固定，留做病理學(xué)，免疫組織化學(xué)研究。另一半用 2. 5%戊二醛固定，留做透射電鏡研究。左腎置于DEPC水處理過的凍存管中，液氮凍透后轉(zhuǎn) 入-70°C冰箱待測(cè)RT-PCR。1. 2. 3測(cè)定方法M小時(shí)尿蛋白定量(Upro)，采用考馬斯亮蘭法；尿白蛋白測(cè)定，采用放射免疫法， 由北京北方生物技術(shù)研究所提供大鼠專用尿蛋白試劑盒，用SN-682型自動(dòng)γ免疫計(jì)數(shù)器 檢測(cè)。1.2. 4病理學(xué)檢查光鏡標(biāo)本制作腎組織經(jīng)常規(guī)脫水、包埋、切片厚4 μ m，進(jìn)行HE染色。電鏡標(biāo)本制作樣品經(jīng)3%戊二醛預(yù)固定，四氧化鋨再固定，丙酮逐級(jí)脫水， Epon812包埋，半薄切片光學(xué)定位，超薄切片，醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙重染色，日立H-600IV型 透射電鏡觀察。1.2.5免疫組化研究采用SP法，石蠟切片厚4 μ m，常規(guī)脫蠟至水，3% H2O2阻斷內(nèi) 源性過氧化物酶后，在檸檬酸鈉溶液中微波抗原修復(fù)，10%正常山羊血清封閉。滴加一抗 nephrin(l 100)、podocin(1 120)和 HPA(1 100)，4°C冰箱過夜。PBS 洗片后滴加山 羊抗兔IgG工作液，37 °C孵育20min ；辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液37°C孵育20min ；DAB 顯色，復(fù)染、脫水、透明、封片。每例切片隨機(jī)選取10個(gè)不重復(fù)的腎小球視野(X400)，應(yīng)用 Image Proplus 6. 0軟件，檢測(cè)腎小球內(nèi)陽性信號(hào)的平均光密度和面積，用陽性指數(shù)(PI) 表示陽性物質(zhì)的相對(duì)含量，計(jì)算公式為PI =陽性信號(hào)平均光密度X陽性信號(hào)面積/腎小 球面積。1. 2. 6RT-PCR研究由基因庫分別查得大鼠η印hrin、podocin、HPA及β -actin的 mRNA核苷酸序列，PCR引物用ft~imer引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有 限公司合成，見表1。表 1 大鼠 η印hrin、podocin、HPA 及 β—actin 引物序列
權(quán)利要求
1.蓮子心或其提取物在制備預(yù)防或/和治療糖尿病腎病的藥物或保健食品中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述的藥物是減輕腎小球基膜增厚，減少 腎小球上皮細(xì)胞足突融合，恢復(fù)腎小球機(jī)械屏障和電荷屏障的藥物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征在于所述的蓮子心提取物為蓮子心的水、 有機(jī)溶液提取物或酸堿提取物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于所述的蓮子心有機(jī)溶液提取物為乙醇提 取物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征在于所述的蓮子心提取物為蓮子心總生 物堿提取物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用途，其特征在于所述的蓮子心總生物堿提取物中總生物 堿的重量百分含量為5% 95%，含有蓮子心堿的重量百分含量為 80%。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于所述的蓮子心總生物堿提取物中總生物 堿的重量百分含量為30% 70%，含有蓮子心堿的重量百分含量為10% 30%。
8.一種治療糖尿病腎病的藥物組合物，它是由有效量的蓮子心或其提取物為活性成 分，加上藥學(xué)上可接受的輔料或輔助性成分制備而成的制劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的藥物組合物，其特征在于所述的制劑是口報(bào)制劑、注射制劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的藥物組合物，其特征在于所述的制劑為片劑、口服液、丸 劑、膠囊劑、注射劑、膏劑、酊劑、散劑、沖劑、栓劑、霜?jiǎng)?、透皮制劑?br> 全文摘要
本發(fā)明提供了蓮子心或其提取物在制備治療糖尿病腎病藥物中的用途。蓮子心及提取物用于防治糖尿病腎病主要通過減輕腎小球基膜增厚，減少腎小球上皮細(xì)胞足突融合，恢復(fù)腎小球機(jī)械屏障和電荷屏障，從而減少蛋白的漏出。劑型可以是口服、舌下、鼻粘膜、經(jīng)皮、直腸等不同給藥的固體制劑和液體制劑等。
文檔編號(hào)A61P3/10GK102091131SQ201110056788
公開日2011年6月15日 申請(qǐng)日期2011年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月10日
發(fā)明者劉冬戀, 尤思路, 李宏, 鄧晶晶, 馬松濤 申請(qǐng)人:成都醫(yī)學(xué)院