專利名稱：刺梨果活性提取物及其制備方法、檢測方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉 及刺梨果活性提取物、特別是刺梨果三萜有效部位活性提取物和刺梨果 三萜與黃酮(+)-兒茶素有效部位活性提取物及其制備方法、檢測方法和應(yīng)用，屬于中藥或 天然藥物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤(癌癥)是嚴(yán)重危害人類健康的疾病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2007年全球新發(fā)癌癥患 者約1200萬人，因癌癥死亡760萬人，每天約有2萬人死于癌癥。此外，癌癥的發(fā)病率還在 持續(xù)上升，預(yù)計(jì)2020年全球新發(fā)癌癥患者將達(dá)1500萬。肺癌、肝癌、胃癌、食道癌、結(jié)腸癌、 乳腺癌、宮頸癌及鼻咽癌被確定為我國重點(diǎn)防治的八大癌癥。藥物治療是腫瘤的主要療法 之一，特別是對(duì)出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移的患者，藥物治療尤其重要。藥品銷售的數(shù)據(jù)表明，全球制藥 企業(yè)50強(qiáng)2007年的處方藥銷售額增長為2. 8%，而其中抗腫瘤類藥物增長最快，達(dá)14%。 2006年數(shù)據(jù)同樣表明，在10類藥物中抗腫瘤藥物的銷售增長居首位，達(dá)20.5%。這反映了 對(duì)抗腫瘤藥物的持續(xù)、快速增長的市場需求?，F(xiàn)有的抗癌藥物如斑蝥素、紫杉醇、順鉬、羥基 喜樹堿及其衍生物等臨床用藥，雖然延長了許多癌癥患者的生命周期，在一定程度上改善 了生活質(zhì)量，但毒副作用明顯，且易產(chǎn)生抗藥性。因此，研究開發(fā)新的抗腫瘤藥物成為迫切 的需要。然而，自紫杉醇、喜樹堿等天然抗腫瘤藥物問世以來，目前尚缺乏新的突破。因此， 聚焦我國廣泛的藥用植物，從中尋找新一代的抗腫瘤候選藥物是當(dāng)務(wù)之急。本發(fā)明旨在以資源豐富、民間應(yīng)用歷史悠久且有高含量抗惡性腫瘤活性物質(zhì)的薔 薇科植物刺梨(Rosa roxbughii Tratt)為研究對(duì)象，經(jīng)深入系統(tǒng)的制備工藝與藥理活性研 究，得到工藝穩(wěn)定、療效顯著、質(zhì)量可控、使用安全的天然藥物有效部位活性提取物，以優(yōu)選 出新的抗腫瘤候選藥物。刺梨主產(chǎn)于我國西南地區(qū)，藥食兼用，安全性極高，已有大量栽培。刺梨果有效部 位具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、延緩衰老、解毒、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗應(yīng)激等功效(張春妮，周 毓，汪俊軍.刺梨藥理研究的新進(jìn)展，醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報(bào)，2005，18 (11) :1049-1051，及其引用 文獻(xiàn))。在抗腫瘤方面，已有報(bào)道的研究主要針對(duì)刺梨汁(強(qiáng)宏娟，張春妮，陳桂嬡等.刺 梨汁對(duì)人白血病K562細(xì)胞生長的抑制作用[J].中國腫瘤臨床與康復(fù)，2000，7 (4) 32-34 ； 吳立夫，何剛，何照范等.刺梨汁對(duì)二甲基亞硝胺前體物肝臟腫瘤作用的防護(hù)效應(yīng)[J].貴 州農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，1987，(2) :25)。另外，有兩項(xiàng)專利申請(qǐng)公開了以刺梨作為原料配伍的復(fù) 方藥物一是《一種用于腫瘤放化療后輔助治療的藥物》(鄧杰，龍險(xiǎn)峰，張明江，唐修靜， 發(fā)明專利申請(qǐng)CN1440795) ；二是《治療腫瘤疾病的中草藥藥劑》(晏正錄，國家發(fā)明專利， CN101129896)。而目前為止對(duì)刺梨中抗腫瘤有效部位的提取、精制與分析、檢測等研究尚屬 空白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供刺梨果活性提取物及其制備方法、檢測方法和應(yīng)用。本發(fā)明提供的制備方法不僅有效濃縮、富集了刺梨果中的活性成分，且該工藝易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化 生產(chǎn)；所得活性提取物具有顯著的抗腫瘤作用和較好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，可用于 制備治療惡性腫瘤疾病的藥物、輔助藥物或作為保健食品添加劑，也可用于制備預(yù)防或治 療糖尿病的藥物、保健品或作為食品添加劑(營養(yǎng)補(bǔ)充劑)。本發(fā)明的技術(shù)方案刺梨果活性提取物的制備方法將刺梨果按常規(guī)工藝提取， 過濾，棄去刺梨渣，濾液減壓濃縮，用有機(jī)溶劑萃取，回收有機(jī)溶劑，加水分散，過濾，水洗沉 淀，合并濾液，將濾液濃縮干燥得活性提取物B，將沉淀進(jìn)行干燥得活性提取物Α。更具體的制備方法為取刺梨干果或鮮果，用6 20倍重量的20 95%乙醇或 甲醇水溶液回流或浸漬提取1 4次，每次0. 5 3小時(shí)，濾過，合并濾液，回收乙醇或甲醇 至無醇味，加水定容至相對(duì)密度1. 05 1. 25的浸膏，用有機(jī)溶劑萃取1 4次，有機(jī)溶劑 與水的比例為0.5 2 1，合并有機(jī)溶劑層，回收有機(jī)溶劑，加水超聲或加熱進(jìn)行分散，抽 濾，水洗沉淀1 5次，合并濾液，將濾液濃縮干燥得活性提取物B，將沉淀進(jìn)行干燥得活性 提取物Α。前述有機(jī)溶劑為正丁醇、乙酸乙酯或氯仿。前述干燥采用微波真空干燥、減壓真空干燥、噴霧干燥或冷凍干燥。前述制備方法制備得到的刺梨果活性提取物Α，其中總?cè)坪看笥?0%。前述制備方法制備得到的刺梨果活性提取物B，其中總?cè)坪看笥?5%， (+)_兒茶素含量不少于5%?；钚蕴崛∥顰中的主要活性成分為三萜化合物，包括野鴨春酸(Euscaphic acid)、委陵菜酸(Tormentic acid)和刺梨酸(Roxburic acid)等；活性提取物B中的主 要活性成分為三萜化合物和黃酮化合物，包括刺梨苷(Kaji-ichigoside Fl)、野薔薇苷(Rosamulin)和(+)-兒茶素((+) -Catechin)等。前述刺梨果活性提取物A的檢測方法為刺梨果活性提取物A中總?cè)祁惢衔锏?含量測定方法，該方法是以熊果酸對(duì)照品為對(duì)照，采用香草醛_冰醋酸_高氯酸顯色比色法 測定。前述刺梨果活性提取物B的檢測方法包括刺梨果活性提取物B中總?cè)祁惢衔?的含量測定方法和黃酮類化合物(+)_兒茶素的含量測定方法；總?cè)祁惢衔锏暮繙y 定方法是以熊果酸對(duì)照品為對(duì)照，采用香草醛_冰醋酸_高氯酸顯色比色法測定；(+)_兒 茶素的含量測定方法是以(+)_兒茶素對(duì)照品為對(duì)照，以0. 04mol/L枸櫞酸溶液N，N- 二 甲基甲酰胺四氫呋喃=45 8 2為流動(dòng)相的高效液相色譜法。具體的總?cè)祁惢衔锏暮繙y定方法為精密稱取真空干燥至恒重的熊果酸對(duì) 照品5. 4mg，置25ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液；稱取干燥的 刺梨果活性提取物A或B樣品，用甲醇定容至50ml，取0. 5ml顯色測吸光度，作為供試品溶 液；取0. 5ml供試品溶液，采用香草醛-冰醋酸-高氯酸顯色法，在544nm最大吸收波長下 測定吸光度；根據(jù)熊果酸對(duì)照品的線性回歸方程由吸光度計(jì)算出濃度C，然后由濃度C計(jì)算 出樣品中總?cè)祁惢衔锏暮俊＞唧w的黃酮類化合物(+)_兒茶素的含量測定方法為照《中國藥典》2010年版一 部附錄VI D高效液相色譜法測定色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以0. 04mol/L枸櫞酸溶液N，N-二甲基甲酰胺四氫呋喃=45 8 2為流動(dòng)相；檢測波長為280nm ；柱 溫35°C ；理論板數(shù)按兒茶素峰計(jì)算不低于3000 ；對(duì)照品溶液的制備取(+)_兒茶素對(duì)照品，精密稱定，加甲醇水=1 1混合液 制成每Iml含(+)_兒茶素0. 15mg的溶液，即得；供試品溶液的制備取提取物B粉末20mg，精密稱定，置50ml量瓶中，加甲醇水= 1 1混合液40ml，超聲處理20分鐘，并加甲醇水=1 1混合液至刻度，搖勻，濾過，取 續(xù)濾液，即得；測定法精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μ 1，注入高效液相色譜儀，測定， 即得；刺梨果活性提取物B中(+)_兒茶素含量不少于5%。前述刺梨果活性提取物A或B可用于制備治療惡性腫瘤疾病的藥物、輔助藥物或 者作為保健食品添加劑。前述刺梨果活性提取物A或B可作為α _葡萄糖苷酶抑制劑用于制備預(yù)防或治療 糖尿病的藥物、保健品或者作為食品添加劑(營養(yǎng)補(bǔ)充劑)。前述的藥物劑型為硬膠囊、片劑、口服液、顆粒劑、軟膠囊或滴丸劑。為了驗(yàn)證本發(fā)明所述刺梨果活性提取物的藥理活性，申請(qǐng)人進(jìn)行了一系列試驗(yàn)研 究Α、體內(nèi)抗腫瘤活性試驗(yàn)受試藥物注射用環(huán)磷酰胺，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)08052921 ；
權(quán)利要求
1.刺梨果活性提取物的制備方法，其特征在于將刺梨果按常規(guī)工藝提取，過濾，棄去 刺梨渣，濾液減壓濃縮，用有機(jī)溶劑萃取，回收有機(jī)溶劑，加水分散，過濾，水洗沉淀，合并濾 液，將濾液濃縮干燥得活性提取物B，將沉淀進(jìn)行干燥得活性提取物A。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述刺梨果活性提取物的制備方法，其特征在于取刺梨干果或鮮 果，用6 20倍重量的20 95%乙醇或甲醇水溶液回流或浸漬提取1 4次，每次0. 5 3小時(shí)，濾過，合并濾液，回收乙醇或甲醇至無醇味，加水定容至相對(duì)密度1. 05 1. 25的浸 膏，用有機(jī)溶劑萃取1 4次，有機(jī)溶劑與水的比例為0.5 2 1，合并有機(jī)溶劑層，回收 有機(jī)溶劑，加水超聲或加熱進(jìn)行分散，抽濾，水洗沉淀1 5次，合并濾液，將濾液濃縮干燥 得活性提取物B，將沉淀進(jìn)行干燥得活性提取物A。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述刺梨果活性提取物的制備方法，其特征在于所述有機(jī)溶 劑為正丁醇、乙酸乙酯或氯仿。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述刺梨果活性提取物的制備方法，其特征在于所述干燥采 用微波真空干燥、減壓真空干燥、噴霧干燥或冷凍干燥。
5.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述制備方法制備得到的刺梨果活性提取物A，其中總?cè)?萜含量大于50%。
6.如權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述制備方法制備得到的刺梨果活性提取物B，其中總?cè)?萜含量大于45%，(+)_兒茶素含量不少于5%。
7.如權(quán)利要求5所述刺梨果活性提取物A的檢測方法，其特征在于所述檢測方法為 刺梨果活性提取物A中總?cè)祁惢衔锏暮繙y定方法，該方法是以熊果酸對(duì)照品為對(duì) 照，采用香草醛-冰醋酸-高氯酸顯色比色法測定。
8.如權(quán)利要求6所述刺梨果活性提取物B的檢測方法，其特征在于所述檢測方法 包括刺梨果活性提取物B中總?cè)祁惢衔锏暮繙y定方法和黃酮類化合物(+)_兒茶 素的含量測定方法；總?cè)祁惢衔锏暮繙y定方法是以熊果酸對(duì)照品為對(duì)照，采用香草 醛-冰醋酸-高氯酸顯色比色法測定；(+)_兒茶素的含量測定方法是以(+)_兒茶素對(duì)照 品為對(duì)照，以0. 04mol/L枸櫞酸溶液N，N- 二甲基甲酰胺四氫呋喃=45 8 2為流 動(dòng)相的高效液相色譜法。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述刺梨果活性提取物A或B的檢測方法，其特征在于具體 的總?cè)祁惢衔锏暮繙y定方法為精密稱取真空干燥至恒重的熊果酸對(duì)照品5. 4mg, 置25ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液；稱取干燥的刺梨果活性 提取物A或B樣品，用甲醇定容至50ml，取0. 5ml顯色測吸光度，作為供試品溶液；取0. 5ml 供試品溶液，采用香草醛-冰醋酸-高氯酸顯色法，在M4nm最大吸收波長下測定吸光度； 根據(jù)熊果酸對(duì)照品的線性回歸方程由吸光度計(jì)算出濃度C，然后由濃度C計(jì)算出樣品中總 三萜類化合物的含量。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述刺梨果活性提取物B的檢測方法，其特征在于具體的黃酮類 化合物(+)_兒茶素的含量測定方法為照《中國藥典》2010年版一部附錄VI D高效液相色 譜法測定色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以0. 04mol/L枸櫞酸 溶液N，N-二甲基甲酰胺四氫呋喃=45 8 2為流動(dòng)相；檢測波長為^Onm ；柱溫 350C ；理論板數(shù)按兒茶素峰計(jì)算不低于3000 ；對(duì)照品溶液的制備取(+)_兒茶素對(duì)照品，精密稱定，加甲醇水=1 1混合液制成 每Iml含(+)-兒茶素0. 15mg的溶液，即得；供試品溶液的制備取提取物B粉末20mg，精密稱定，置50ml量瓶中，加甲醇水= 1 1混合液40ml，超聲處理20分鐘，并加甲醇水=1 1混合液至刻度，搖勻，濾過，取 續(xù)濾液，即得；測定法精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各ΙΟμΙ，注入高效液相色譜儀，測定，即得；刺梨果活性提取物B中(+)_兒茶素含量不少于5%。
11.如權(quán)利要求5或6所述刺梨果活性提取物A或B在制備治療惡性腫瘤疾病的藥物、 輔助藥物或者保健食品添加劑中的應(yīng)用。
12.如權(quán)利要求5或6所述刺梨果活性提取物A或B作為α-葡萄糖苷酶抑制劑在制 備預(yù)防或治療糖尿病的藥物、保健品或者食品添加劑中的應(yīng)用。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12所述刺梨果活性提取物A或B的應(yīng)用，其特征在于所述的 藥物劑型為硬膠囊、片劑、口服液、顆粒劑、軟膠囊或滴丸劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了刺梨果活性提取物及其制備方法、檢測方法和應(yīng)用，將刺梨果按常規(guī)工藝提取，過濾，棄去刺梨渣，濾液減壓濃縮，用有機(jī)溶劑萃取，回收有機(jī)溶劑，加水分散，過濾，水洗沉淀，合并濾液，分別將濾液和沉淀進(jìn)行干燥，分別得活性提取物B和A。本發(fā)明所提供的制備方法不僅解決了刺梨中有效活性成分的提取、富集和精制問題，該制備工藝還易于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)；所提供的檢測方法可有效確保活性提取物的質(zhì)量；所得活性提取物的抗惡性腫瘤活性顯著，且與臨床抗癌藥有協(xié)同作用，并具有較好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，可用于制備治療惡性腫瘤疾病的藥物、輔助藥物或作為保健食品添加劑，也可用于制備預(yù)防或治療糖尿病的藥物、保健品或作為食品添加劑，具有較高的應(yīng)用價(jià)值和良好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102145062SQ20111008099
公開日2011年8月10日 申請(qǐng)日期2011年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月29日
發(fā)明者余麗梅, 朱海燕, 李淑芳, 楊小生, 梁冰, 馬琳 申請(qǐng)人:貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室