專利名稱：治療或預(yù)防腫瘤的藥物、腫瘤全細(xì)胞疫苗及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及治療或預(yù)防腫瘤的藥物、腫瘤全細(xì)胞疫苗(Whole-cell vaccine ； Whole cell vaccine)及其制備方法和用途，屬于生物工程領(lǐng)域和生物免疫學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤具有多種免疫逃逸機制，包括腫瘤細(xì)胞抗原特異性低和/或腫瘤抗原破壞、或缺乏一些免疫輔助因子的表達等，使得現(xiàn)有腫瘤疫苗的臨床治療效果不佳。此外在腫瘤的進展期，腫瘤細(xì)胞具有高度異質(zhì)性，極易發(fā)生突變而逃避免疫系統(tǒng)的監(jiān)督，突變導(dǎo)致腫瘤抗原表型消失，繼而也使針對該抗原的免疫治療效果降低。為了使腫瘤疫苗療效實現(xiàn)最優(yōu)化，常采用細(xì)胞因子(如IL-12，GM-CSF)等作為佐劑以增強免疫效應(yīng)。白細(xì)胞介素 15(IL-15)是近年發(fā)現(xiàn)的一個重要的誘導(dǎo)抗腫瘤免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子，參與對多種組織細(xì)胞的調(diào)節(jié)，是目前機體免疫功能調(diào)節(jié)的研究新熱點。但是未見有以IL-15作為疫苗佐劑使用的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的第一個技術(shù)問題是提供一種預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物組合物。本發(fā)明預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物組合物包括如下組分腫瘤全細(xì)胞疫苗 (Whole-cell vaccine ；Whole cell vaccine)、陽離子脂質(zhì)體(Liposome)和編碼白細(xì)胞介素-15 (Interleukin 15，IL-15)的重組質(zhì)粒。其中，所述的腫瘤全細(xì)胞疫苗優(yōu)選為滅活的具有特異性和主動性激發(fā)生物體主動免疫機能的腫瘤細(xì)胞疫苗。進一步的，所述的腫瘤全細(xì)胞疫苗包含至少一種能激活生物體特異性抗腫瘤T淋巴細(xì)胞的活性成分；其中，所述的活性成分為蛋白質(zhì)、多肽、脂類、蛋白質(zhì)多肽復(fù)合物、DNA 分子、RNA分子、腫瘤相關(guān)抗原、特異性腫瘤抗原中至少一種。其中，本發(fā)明預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物組合物中所述的腫瘤全細(xì)胞疫苗優(yōu)選由下述方法制備而成腫瘤細(xì)胞經(jīng)過細(xì)胞滅活至細(xì)胞增殖活性被抑制；其中，所述的腫瘤細(xì)胞為能特異性的誘導(dǎo)、激活機體主動免疫，增強生物體預(yù)防腫瘤和抗腫瘤免疫的自體細(xì)胞、 同源細(xì)胞系細(xì)胞或具有交叉抗原的異體腫瘤細(xì)胞。包括良性、惡性腫瘤，可為原發(fā)性或者繼發(fā)性甚至轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞。其組織來源可為上皮組織、間葉組織、血液組織等。所述的腫瘤細(xì)胞可以為肺癌細(xì)胞、腸癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、腎癌細(xì)胞、鼻咽癌細(xì)胞、 皮膚癌細(xì)胞、食道癌細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞中至少一種。進一步的，上述的細(xì)胞滅活可以采用如下方法微波細(xì)胞滅活法，電磁波細(xì)胞滅活法，激光細(xì)胞滅活法，高溫細(xì)胞滅活法，超聲破碎細(xì)胞滅活法，反復(fù)細(xì)胞凍融、勻漿、離心、沉淀細(xì)胞滅活法，酶學(xué)消化細(xì)胞滅活法中至少一種。
其中，本發(fā)明藥物中的陽離子脂質(zhì)體和編碼白細(xì)胞介素-15的重組質(zhì)?？梢宰鳛橐呙缱魟┦褂谩Ｆ渲?，本發(fā)明預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物組合物，所述的陽離子脂質(zhì)體為雙鏈季銨鹽型表面活性劑，如D0TAP (N-[1- (2，3-dioleoyloxy) propyl]-N, N, N-trimethylammonium methylsulfate ；1,2- 二油酰氧丙基-N，N，N-三甲基溴化銨)、D0TMA (N-[1- (2，3- 二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化銨)、D0SPA(3-二油酰氧-N-[2(精胺羧基酰胺)乙基]-N， N-二甲基-1-丙基-三氟乙酸銨)或DOGS(雙十八烷基酰胺甘氨酰精胺)中至少一種；陽離子脂質(zhì)體和IL-15重組質(zhì)粒DNA的重量配比優(yōu)選為1 15 1，所述的陽離子脂質(zhì)體和 IL-15重組質(zhì)粒DNA的重量配比更優(yōu)選為3 1。其中，本發(fā)明治療或預(yù)防腫瘤的藥物，所述的LI-15重組質(zhì)粒DNA包括1)、根據(jù)編碼IL-15的基因構(gòu)建的重組質(zhì)粒DNA ；或2)、根據(jù)編碼LI-15的基因序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個核苷酸且具有IL-15基因功能的基因構(gòu)建的重組質(zhì)粒DNA ；或3)、在生物體內(nèi)被吸收轉(zhuǎn)染后能分泌具有IL-15生物活性的質(zhì)粒。其中，上述的治療或預(yù)防腫瘤的藥物的制劑優(yōu)選為試劑盒，其包括包裝在空間獨立的制劑單元中的順序給藥的腫瘤全細(xì)胞疫苗、陽離子脂質(zhì)體和編碼白細(xì)胞介素-15的重組質(zhì)粒。進一步的，為了使本發(fā)明藥物治療或預(yù)防腫瘤的效果最好，本發(fā)明藥物使用時將脂質(zhì)體和IL-15重組質(zhì)粒按照比例混合，以無沉淀為標(biāo)準(zhǔn)。皮下注射、腫瘤內(nèi)部或瘤周注射、淋巴結(jié)內(nèi)或周圍注射等使用時，腫瘤全細(xì)胞疫苗先單獨注射使用，后將脂質(zhì)體與質(zhì)粒的混合物注射，不混合在一起注射使用。還可視具體情況與已誘導(dǎo)的致敏T淋巴細(xì)胞、B-7、 GM-CSF, Y-干擾素(INFY)等聯(lián)合使用。其中，IL-15重組質(zhì)粒DNA可以采用下述方法制備重組質(zhì)粒經(jīng)酶切和測序測定正確后，用質(zhì)粒抽提試劑盒進行大量制備，具體如下1)細(xì)菌培養(yǎng)質(zhì)粒接種于含100 μ g/ml Amp的LB培養(yǎng)液中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜；2)收獲細(xì)菌4°C離心30min，4000rpm，棄上清，敞開瓶口并倒置使上清全部流盡，
稱重；3)重懸在細(xì)菌沉淀中加入125ml Buffer P1，反復(fù)振蕩，吹打直至菌體完全重懸；4)裂解加入125ml Buffer P2，輕柔而徹底地顛倒離心瓶數(shù)次，以充分混勻內(nèi)容物，室溫放置5min ；5)中和加入125ml冰預(yù)冷的Buffer P3，立即徹底而溫和地顛倒離心瓶數(shù)次，充分混勻內(nèi)容物，直至白色絮狀物形成，而裂解物不再粘稠。然后在冰上放置30min，冰浴期間應(yīng)間或混勻樣品數(shù)次；6)沉淀雜蛋白4°C，20000rpm/min離心樣品30min，小心收集上清液到另一干凈
離心管中；7)收集質(zhì)粒溶液將收集的上清液再離心15min，4°C，25000rpm/min,小心將上清液全部收集于500ml的玻璃容器中，同時取樣電泳檢查。8)去內(nèi)毒素加入30ml Buffer ER，混勻后冰浴30min ；
9)平衡柱子在Qiagen-tip 10000中加入75ml Buffer QBT，讓其自然流空；10)樣品上柱將樣品倒入柱子里，讓其自然地進入柱子中；11)反復(fù)洗柱用 600ml Buffer QC 洗柱；12)樣品洗脫用75ml Buffer QN將柱子里的質(zhì)粒DNA樣品洗脫下來，收集在沒有內(nèi)毒素污染的離心管里；13)沉淀質(zhì)粒在洗脫下來的DNA樣品中加入0. 70體積(約52. 5ml)處于室溫的異丙醇，混勻后即在4°C，15000rpm離心30min，小心棄上清；14)洗滌沉淀用IOml無內(nèi)毒素的處于室溫的70%乙醇洗滌DNA沉淀，15000rpm/ min離心樣品lOmin，小心頃棄上清；15)涼干溶解敞開離心管口，放置10 20min，直到乙醇蒸發(fā)殆盡，用適量的滅菌的無內(nèi)毒素的生理鹽水溶解質(zhì)粒DNA，并檢測質(zhì)粒的純度；16)為進一步去除內(nèi)毒素，將溶解的質(zhì)粒從第(8)步開始重復(fù)，再次過柱純化；17)用無內(nèi)毒素的生理鹽水溶解質(zhì)粒DNA，采用紫外分光光度儀測定OD 260/280 讀數(shù)，測定質(zhì)粒DNA濃度和純度的測定。分裝后-20°C凍存。其中，陽離子脂質(zhì)體可以采用常規(guī)方法制備，比如采用下述方法制備DOTAP陽離子脂質(zhì)體1)將 D0TAP(D6182)按 1 1 的摩爾比加入 DOPE (Dioleylphosphatidyl-ethanol amine)中，然后溶解于氯仿和甲醇的混合物(氯仿和甲醇的體積比為3 1)；2)再將上述混合物放入充滿氮氣的圓底燒瓶內(nèi)的薄片上進行干燥，采用高度真空法去除掉殘余的氯仿和甲醇；3)經(jīng)上述過程制備的脂質(zhì)體放入5%的葡萄糖溶液中進行水合；4)在近距離超聲破碎儀中進行處理直至完全增溶；5)將制備的脂質(zhì)體通過聚碳酸酯膜進行濾過，形成單層小囊泡形態(tài)；6)制備好的陽離子脂質(zhì)體(濃度:3mg/ml)保存在4°C的條件下備用。本發(fā)明所要解決的第二個技術(shù)問題是提供上述的藥物在制備治療或預(yù)防腫瘤的藥物中的用途。所述的腫瘤可以為人體腦膠質(zhì)瘤、肺癌、黑色素瘤、前列腺癌、結(jié)腸癌、肝癌、 頭頸部癌、胰腺癌或腎細(xì)胞癌等。其中，所述藥物中的腫瘤全細(xì)胞疫苗皮下注射腫瘤疫苗數(shù)目為1 X IO5 1 X IO8個/次。其中，本發(fā)明藥物引入生物體內(nèi)的途徑包括皮下單點注射、皮下多點注射、靜脈注射、瘤周注射、瘤內(nèi)注射、胸腔注射、腹腔注射、蛛網(wǎng)膜下腔注射、淋巴結(jié)內(nèi)或周圍注射、肌肉注射等。上述途徑可視具體情況單獨運用，必要時聯(lián)合運用。本發(fā)明所要解決的第三個技術(shù)問題是提供一種制備腫瘤全細(xì)胞疫苗的方法，該方法包括如下步驟a、取腫瘤細(xì)胞，經(jīng)胰酶或EDTA消化、分離，得到細(xì)胞沉淀；b、a步驟所得細(xì)胞沉淀滅活至細(xì)胞增殖活性被抑制。進一步的，a步驟中所述的腫瘤細(xì)胞的來源可以為腫瘤細(xì)胞株或細(xì)胞系，或來源于生物體的腫瘤組織；其中，當(dāng)腫瘤細(xì)胞的來源為腫瘤細(xì)胞株或細(xì)胞系時，按如下方法準(zhǔn)備腫瘤細(xì)胞取狀態(tài)CN 102343086 A
說明書
4/15 頁
良好、處于對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞進行培養(yǎng)傳代，達到所需細(xì)胞數(shù)后進入腫瘤全細(xì)胞疫苗制備程序；當(dāng)腫瘤細(xì)胞的來源為生物體的腫瘤組織時，按如下方法準(zhǔn)備腫瘤細(xì)胞在無菌條件下取腫瘤新鮮、血供好的未壞死部分，放入盛有含小?；蛱ヅＱ宓腄MEM/F12中在4°C 下保存，用含青霉素、鏈霉素的PBS溶液清洗，通過酶消化法、差速貼壁法或差速消化法分離得到純化的腫瘤細(xì)胞，將純化的腫瘤細(xì)胞移入含小?；蛱ヅＱ宓腄MEM等培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，然后放入37°C，5 % CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2 3d后，細(xì)胞鋪滿瓶底80 90 %時傳代，達到所需細(xì)胞數(shù)后進入腫瘤全細(xì)胞疫苗制備程序。進一步的，上述a步驟優(yōu)選采用下述方法進行分離取腫瘤細(xì)胞，加質(zhì)量濃度為 0. 25%的胰酶或質(zhì)量濃度為0. 02%的EDTA消化至細(xì)胞收縮變圓后加入含10%血清的常規(guī)培養(yǎng)基終止消化，并吹打使細(xì)胞分散脫落，收集液體，離心，棄上清液，得到細(xì)胞沉淀。其中，上述b步驟中可以采用下述方法進行細(xì)胞滅活微波細(xì)胞滅活法，電磁波細(xì)胞滅活法，激光細(xì)胞滅活法，高溫細(xì)胞滅活法，超聲破碎細(xì)胞滅活法，反復(fù)細(xì)胞凍融、勻漿、 離心、沉淀細(xì)胞滅活法，酶學(xué)消化細(xì)胞滅活法中至少一種。進一步的，上述b步驟中優(yōu)選采用下述方法進行細(xì)胞滅活a步驟所得細(xì)胞沉淀用重懸溶液重懸，離心后棄上清液，加入質(zhì)量濃度為的戊二醛固定7- ，然后用相應(yīng)的重懸溶液洗滌，離心，所得細(xì)胞沉淀再次重懸后于5% C02，37°C的培養(yǎng)箱中放置1. 5 2. 5h，然后再用相應(yīng)的重懸溶液洗滌，離心，重復(fù)3次，重懸后即得細(xì)胞疫苗，保存?zhèn)溆?；其中，所述的重懸溶液為生理鹽水NS或磷酸鹽 PBS緩沖液。更進一步的，為了使離心效果更好，上述步驟中離心時的離心速度優(yōu)選為1300 1700rpm/min (離心速度更優(yōu)選為1500rpm/min)，離心時間優(yōu)選為2 ^iin (離心時間更優(yōu)選為3min)。本發(fā)明所要解決的第四個技術(shù)問題是提供由上述的方法制備的腫瘤全細(xì)胞疫苗。IL-15結(jié)構(gòu)和功能與IL-2相似，而IL-15對NK細(xì)胞的分化發(fā)育和功能調(diào)節(jié)尤其密切，也是記憶性免疫細(xì)胞的生長和調(diào)節(jié)因子。此外，對T、B細(xì)胞的刺激作用IL-15也較IL-2 強。因此，以IL-15作為免疫佐劑，能更好地增強主動性免疫反應(yīng)，減少免疫負(fù)調(diào)節(jié)，并增強免疫記憶。目前已上市的自體源性細(xì)胞免疫療法藥物，是利用患者自身腫瘤細(xì)胞成分致敏自身樹突狀細(xì)胞制成的個體化免疫。本發(fā)明是將培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞株滅活處理使瘤細(xì)胞喪失致瘤性，并保留其免疫原性，以此作為全細(xì)胞腫瘤疫苗，同時聯(lián)合IL-15作為免疫佐劑，目的在于建立一種長效的，“按需給藥”的治療方法，這種細(xì)胞疫苗聯(lián)合細(xì)胞因子的特異性主動性免疫是機體自身建立的一種針對腫瘤抗原的長效的主動性防御機制，符合“按需給藥”的治療模式，能夠達到較佳的治療效果。本發(fā)明藥物能促進生物體內(nèi)提高免疫能力，特別是針對腫瘤細(xì)胞的T淋巴細(xì)胞和 NK細(xì)胞等。相關(guān)實驗發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明藥物治療的小鼠腫瘤中，CD4+的T細(xì)胞、CDS+的T細(xì)胞、 B細(xì)胞(⑶24)、NK(⑶57)細(xì)胞的標(biāo)記物均明顯表達增多，表明其誘導(dǎo)、放大并增強了生物體內(nèi)的特異性免疫應(yīng)答。因此，通過全細(xì)胞疫苗聯(lián)合IL-15質(zhì)粒進行預(yù)防或治療，后者能激發(fā) CD4+的T細(xì)胞、CDS+的T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞的表達，從而加強放大腫瘤細(xì)胞疫苗在腫瘤預(yù)防免疫和抗腫瘤免疫治療中的作用，進一步加強了生物體的特異性抗腫瘤免疫應(yīng)答。本發(fā)明中所述制備預(yù)防或治療腫瘤藥物的方法，類似的方法可制備人類腫瘤細(xì)胞疫苗并治療人體腫瘤。本發(fā)明適用于醫(yī)療領(lǐng)域，特別是預(yù)防或治療腫瘤，亦適用于術(shù)后腫瘤殘留或不能外科切除的腫瘤。本發(fā)明中作為疫苗的細(xì)胞可來自同一人類或非人類生物個體，也可來自不同的人類或者非人類生物個體。本發(fā)明藥物治療或預(yù)防腫瘤的效果顯著，為本領(lǐng)域提供了一種新的選擇，具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1為皮下膠質(zhì)瘤治療性實驗?zāi)[瘤體積曲線。橫坐標(biāo)為處理后的天數(shù)，縱坐標(biāo)為腫瘤體積。圖2為建模成功后，C6/ffistar腫瘤治療后MRI特征及體積變化情況圖。圖3為顱內(nèi)Ce/Wistar膠質(zhì)瘤治療后體積生長曲線圖。橫坐標(biāo)為處理后的天數(shù)， 縱坐標(biāo)為腫瘤體積。圖4為顱內(nèi)Ce/Wistar膠質(zhì)瘤治療后生存曲線圖。橫坐標(biāo)為處理后的天數(shù)，縱坐標(biāo)為存活率(％)。圖5為建模成功后，9L/F344腫瘤治療后MRI特征及體積變化情況圖。圖6為顱內(nèi)F344/9L膠質(zhì)瘤大鼠體積生長曲線圖。橫坐標(biāo)為處理后的天數(shù)，縱坐標(biāo)為腫瘤體積。圖7為顱內(nèi)9L/F344膠質(zhì)瘤治療后生存曲線圖。橫坐標(biāo)為處理后的天數(shù)，縱坐標(biāo)為存活率(％)。圖8LL2小鼠肺癌模型治療后體積生長曲線圖。橫坐標(biāo)為處理后的天數(shù)，縱坐標(biāo)為腫瘤體積。圖9LL2小鼠肺癌模型治療后生存曲線圖。橫坐標(biāo)為處理后的天數(shù)，縱坐標(biāo)為存活率(％ )。
具體實施例方式下面對本發(fā)明的具體實施方式
做進一步的描述，并不因?qū)Ρ景l(fā)明限制。本發(fā)明預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物組合物包括如下組分腫瘤全細(xì)胞疫苗 (Whole-cell vaccine ；Whole cell vaccine)、陽離子脂質(zhì)體(Liposome)和編碼白細(xì)胞介素-15 (Interleukin 15，IL-15)的重組質(zhì)粒。其中，所述的腫瘤全細(xì)胞疫苗優(yōu)選為滅活的具有特異性和主動性激發(fā)生物體主動免疫機能的腫瘤細(xì)胞疫苗。進一步的，所述的腫瘤全細(xì)胞疫苗包含至少一種能激活生物體特異性抗腫瘤T淋巴細(xì)胞的活性成分；其中，所述的活性成分為蛋白質(zhì)、多肽、脂類、蛋白質(zhì)多肽復(fù)合物、DNA 分子、RNA分子、腫瘤相關(guān)抗原、特異性腫瘤抗原中至少一種。其中，本發(fā)明預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物組合物中所述的腫瘤全細(xì)胞疫苗優(yōu)選由下述方法制備而成腫瘤細(xì)胞經(jīng)過細(xì)胞滅活至細(xì)胞增殖活性被抑制；其中，所述的腫瘤細(xì)胞為能特異性的誘導(dǎo)、激活機體主動免疫，增強生物體預(yù)防腫瘤和抗腫瘤免疫的自體細(xì)胞、 同源細(xì)胞系細(xì)胞或具有交叉抗原的異體腫瘤細(xì)胞。包括良性、惡性腫瘤，可為原發(fā)性或者繼發(fā)性甚至轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞。其組織來源可為上皮組織、間葉組織、血液組織等。所述的腫瘤細(xì)胞可以為肺癌細(xì)胞、腸癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、腎癌細(xì)胞、鼻咽癌細(xì)胞、皮膚癌細(xì)胞、食道癌細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞中至少一種。進一步的，上述的細(xì)胞滅活可以采用如下方法微波細(xì)胞滅活法，電磁波細(xì)胞滅活法，激光細(xì)胞滅活法，高溫細(xì)胞滅活法，超聲破碎細(xì)胞滅活法，反復(fù)細(xì)胞凍融、勻漿、離心、沉淀細(xì)胞滅活法，酶學(xué)消化細(xì)胞滅活法中至少一種。其中，本發(fā)明藥物中的陽離子脂質(zhì)體和編碼白細(xì)胞介素-15的重組質(zhì)粒可以作為疫苗佐劑使用。其中，本發(fā)明預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物組合物，所述的陽離子脂質(zhì)體為雙鏈季銨鹽型表面活性劑，如D0TAP (N-[1- (2，3-dioleoyloxy) propyl]-N, N, N-trimethylammonium methylsulfate ；1,2- 二油酰氧丙基-N，N，N-三甲基溴化銨)、D0TMA (N-[1- (2，3- 二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化銨)、D0SPA(3-二油酰氧-N-[2(精胺羧基酰胺)乙基]-N， N-二甲基-1-丙基-三氟乙酸銨)或DOGS (雙十八烷基酰胺甘氨酰精胺)中至少一種，當(dāng)然，制備脂質(zhì)體時還可以加入脂質(zhì)伴侶(如D0PE)等輔料；陽離子脂質(zhì)體和IL-15重組質(zhì)粒DNA的重量配比優(yōu)選為1 15 1，所述的陽離子脂質(zhì)體和IL-15重組質(zhì)粒DNA的重量配比更優(yōu)選為3 1。其中，本發(fā)明治療或預(yù)防腫瘤的藥物，所述的IL-15重組質(zhì)粒DNA包括1)、根據(jù)編碼IL-15的基因構(gòu)建的重組質(zhì)粒DNA ；或2)、根據(jù)編碼IL-15的基因序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個核苷酸且具有IL-15基因功能的基因構(gòu)建的重組質(zhì)粒DNA ；或3)、在生物體內(nèi)被吸收轉(zhuǎn)染后能分泌具有IL-15生物活性的質(zhì)粒。其中，上述的治療或預(yù)防腫瘤的藥物的制劑優(yōu)選為試劑盒，其包括包裝在空間獨立的制劑單元中的順序給藥的腫瘤全細(xì)胞疫苗、陽離子脂質(zhì)體和編碼白細(xì)胞介素-15的重組質(zhì)粒。進一步的，為了使本發(fā)明藥物治療或預(yù)防腫瘤的效果最好，本發(fā)明藥物使用時將脂質(zhì)體和IL-15重組質(zhì)粒按照比例混合，以無沉淀為標(biāo)準(zhǔn)。皮下注射、腫瘤內(nèi)部或瘤周注射、淋巴結(jié)內(nèi)或周圍注射等使用時，腫瘤全細(xì)胞疫苗先單獨注射使用，后將脂質(zhì)體與質(zhì)粒的混合物注射，不混合在一起注射使用。還可視具體情況與已誘導(dǎo)的致敏T淋巴細(xì)胞、B-7、 GM-CSF, Y-干擾素(INFY)等聯(lián)合使用。其中，IL-15重組質(zhì)粒DNA可以采用下述方法制備重組質(zhì)粒經(jīng)酶切和測序測定正確后，用質(zhì)粒抽提試劑盒進行大量制備，具體如下1)細(xì)菌培養(yǎng)質(zhì)粒接種于含100 μ g/ml Amp的LB培養(yǎng)液中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜；2)收獲細(xì)菌4°C離心30min，4000rpm，棄上清，敞開瓶口并倒置使上清全部流盡，
稱重；3)重懸在細(xì)菌沉淀中加入125ml Buffer P1，反復(fù)振蕩，吹打直至菌體完全重懸；4)裂解加入125ml Buffer P2，輕柔而徹底地顛倒離心瓶數(shù)次，以充分混勻內(nèi)容物，室溫放置5min ；5)中和加入125ml冰預(yù)冷的Buffer P3，立即徹底而溫和地顛倒離心瓶數(shù)次，充分混勻內(nèi)容物，直至白色絮狀物形成，而裂解物不再粘稠。然后在冰上放置30min，冰浴期間應(yīng)間或混勻樣品數(shù)次；
6)沉淀雜蛋白4°C，20000rpm/min離心樣品30min，小心收集上清液到另一干凈
離心管中；7)收集質(zhì)粒溶液將收集的上清液再離心15min，4°C，25000rpm/min,小心將上清液全部收集于500ml的玻璃容器中，同時取樣電泳檢查。8)去內(nèi)毒素加入30ml Buffer ER，混勻后冰浴30min ；9)平衡柱子在Qiagen-tip 10000中加入75ml Buffer QBT，讓其自然流空；10)樣品上柱將樣品倒入柱子里，讓其自然地進入柱子中；11)反復(fù)洗柱用 600ml Buffer QC 洗柱；12)樣品洗脫用75ml Buffer QN將柱子里的質(zhì)粒DNA樣品洗脫下來，收集在沒有內(nèi)毒素污染的離心管里；13)沉淀質(zhì)粒在洗脫下來的DNA樣品中加入0. 70體積(約52. 5ml)處于室溫的異丙醇，混勻后即在4°C，15000rpm離心30min，小心棄上清；14)洗滌沉淀用IOml無內(nèi)毒素的處于室溫的70%乙醇洗滌DNA沉淀，15000rpm/ min離心樣品lOmin，小心頃棄上清；15)涼干溶解敞開離心管口，放置10 20min，直到乙醇蒸發(fā)殆盡，用適量的滅菌的無內(nèi)毒素的生理鹽水溶解質(zhì)粒DNA，并檢測質(zhì)粒的純度；16)為進一步去除內(nèi)毒素，將溶解的質(zhì)粒從第(8)步開始重復(fù)，再次過柱純化；17)用無內(nèi)毒素的生理鹽水溶解質(zhì)粒DNA，采用紫外分光光度儀測定OD 260/280 讀數(shù)，測定質(zhì)粒DNA濃度和純度的測定。分裝后-20°C凍存。其中，陽離子脂質(zhì)體可以采用常規(guī)方法制備，比如采用下述方法制備DOTAP陽離子脂質(zhì)體1)將 D0TAP(D6182)按 1 1 的摩爾比加入 DOPE (Dioleylphosphatidyl-ethanol amine)中，然后溶解于氯仿和甲醇的混合物(氯仿和甲醇的體積比為3 1)；2)再將上述混合物放入充滿氮氣的圓底燒瓶內(nèi)的薄片上進行干燥，采用高度真空法去除掉殘余的氯仿和甲醇；3)經(jīng)上述過程制備的脂質(zhì)體放入5%的葡萄糖溶液中進行水合；4)在近距離超聲破碎儀中進行處理直至完全增溶；5)將制備的脂質(zhì)體通過聚碳酸酯膜進行濾過，形成單層小囊泡形態(tài)；6)制備好的陽離子脂質(zhì)體(濃度3mg/ml)保存在4°C的條件下備用。本發(fā)明還提供了上述的藥物在制備治療或預(yù)防腫瘤的藥物中的用途。所述的腫瘤可以為人體腦膠質(zhì)瘤、肺癌、黑色素瘤、前列腺癌、結(jié)腸癌、肝癌、頭頸部癌、胰腺癌或腎細(xì)胞寺。其中，所述藥物中的腫瘤全細(xì)胞疫苗皮下注射腫瘤疫苗數(shù)目為1 X IO5 1 X IO8個/次。其中，本發(fā)明藥物引入生物體內(nèi)的途徑包括皮下單點注射、皮下多點注射、靜脈注射、瘤周注射、瘤內(nèi)注射、胸腔注射、腹腔注射、蛛網(wǎng)膜下腔注射、淋巴結(jié)內(nèi)或周圍注射、肌肉注射等。上述途徑可視具體情況單獨運用，必要時聯(lián)合運用。本發(fā)明還提供了一種制備腫瘤全細(xì)胞疫苗的方法，該方法包括如下步驟a、取腫瘤細(xì)胞，經(jīng)胰酶或EDTA消化、分離，得到細(xì)胞沉淀；
b、a步驟所得細(xì)胞沉淀滅活至細(xì)胞增殖活性被抑制。進一步的，a步驟中所述的腫瘤細(xì)胞的來源可以為腫瘤細(xì)胞株或細(xì)胞系，或來源于生物體的腫瘤組織；其中，當(dāng)腫瘤細(xì)胞的來源為腫瘤細(xì)胞株或細(xì)胞系時，按如下方法準(zhǔn)備腫瘤細(xì)胞取狀態(tài)良好、處于對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞進行培養(yǎng)傳代，達到所需細(xì)胞數(shù)后進入腫瘤全細(xì)胞疫苗制備程序；當(dāng)腫瘤細(xì)胞的來源為生物體的腫瘤組織時，按如下方法準(zhǔn)備腫瘤細(xì)胞在無菌條件下取腫瘤新鮮、血供好的未壞死部分，放入盛有含小?；蛱ヅＱ宓腄MEM/F12中在4°C 下保存，用含青霉素、鏈霉素的PBS溶液清洗，通過酶消化法、差速貼壁法或差速消化法分離得到純化的腫瘤細(xì)胞，將純化的腫瘤細(xì)胞移入含小?；蛱ヅＱ宓腄MEM等培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，然后放入37°C，5 % CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2 3d后，細(xì)胞鋪滿瓶底80 90 %時傳代，達到所需細(xì)胞數(shù)后進入腫瘤全細(xì)胞疫苗制備程序。進一步的，上述a步驟優(yōu)選采用下述方法進行分離取腫瘤細(xì)胞，加質(zhì)量濃度為 0. 25%的胰酶或質(zhì)量濃度為0. 02%的EDTA消化至細(xì)胞收縮變圓后加入含10%血清的常規(guī)培養(yǎng)基終止消化，并吹打使細(xì)胞分散脫落，收集液體，離心，棄上清液，得到細(xì)胞沉淀。其中，上述b步驟中可以采用下述方法進行細(xì)胞滅活微波細(xì)胞滅活法，電磁波細(xì)胞滅活法，激光細(xì)胞滅活法，高溫細(xì)胞滅活法，超聲破碎細(xì)胞滅活法，反復(fù)細(xì)胞凍融、勻漿、 離心、沉淀細(xì)胞滅活法，酶學(xué)消化細(xì)胞滅活法中至少一種。進一步的，上述b步驟中優(yōu)選采用下述方法進行細(xì)胞滅活a步驟所得細(xì)胞沉淀用重懸溶液重懸，離心后棄上清液，加入質(zhì)量濃度為的戊二醛固定7- ，然后用相應(yīng)的重懸溶液洗滌，離心，所得細(xì)胞沉淀再次重懸后于5% C02，37°C的培養(yǎng)箱中放置1. 5 2. 5h，然后再用相應(yīng)的重懸溶液洗滌，離心，重復(fù)3次，重懸后即得細(xì)胞疫苗，保存?zhèn)溆?；其中，所述的重懸溶液為生理鹽水NS或磷酸鹽 PBS緩沖液。更進一步的，為了使離心效果更好，上述步驟中離心時的離心速度優(yōu)選為1300 1700rpm/min (離心速度更優(yōu)選為1500rpm/min)，離心時間優(yōu)選為2 ^iin (離心時間更優(yōu)選為3min)。本發(fā)明還提供了由上述的方法制備的腫瘤全細(xì)胞疫苗。實施例本發(fā)明治療或預(yù)防腫瘤的藥物的制備1、IL-15的制備及方法(hIL-15質(zhì)粒的擴增與純化)重組質(zhì)粒經(jīng)酶切和測序測定正確后，用Qiagen公司的EndofreeTM plasmid Giga 試劑盒進行大量制備。方法參考操作手冊進行。步驟如下(下述各種Buffer的用量，適合于2. 5L細(xì)菌培養(yǎng)物)1)細(xì)菌培養(yǎng)質(zhì)粒接種于含100 μ g/ml Amp的LB培養(yǎng)液中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜；2)收獲細(xì)菌4°C條件下4000rpm/min離心30分鐘，棄上清，敞開瓶口并倒置使上
清全部流盡，稱重；3)重懸在細(xì)菌沉淀中加入125ml Buffer P1，反復(fù)振蕩，吹打直至菌體完全重懸；4)裂解加入125ml Buffer P2，輕柔而徹底地顛倒離心瓶數(shù)次，以充分混勻內(nèi)容物，室溫放置5分鐘；
5)中和加入125ml冰預(yù)冷的Buffer P3，立即徹底而溫和地顛倒離心瓶數(shù)次，充分混勻內(nèi)容物，直至白色絮狀物形成，而裂解物不再粘稠。然后在冰上放置30分鐘，冰浴期間應(yīng)間或混勻樣品數(shù)次；6)沉淀雜蛋白4°C下彡20000rpm/min離心樣品30min，小心收集上清液到另一干
凈離心管中；7)收集質(zhì)粒溶液將收集的上清液再離心15分鐘，4°C，20000rpm/min，收集上清， 同時取樣電泳檢查。8)去內(nèi)毒素加入30ml Buffer ER，混勻后冰浴30min ；9)平衡柱子在Qiagen-tip 10000中加入75ml Buffer QBT,以自然流速過柱；10)樣品上柱將樣品倒入柱子，以自然流速過柱；11)反復(fù)洗柱用 600ml Buffer QC 洗柱；12)樣品洗脫用75ml Buffer QN將吸附于膜上的質(zhì)粒DNA樣品洗脫下來，收集于無內(nèi)毒素的離心管里；13)沉淀質(zhì)粒在洗脫下來的DNA樣品中加入0. 70體積置于室溫的異丙醇，混勻后即在4D 15000rpm離心30分鐘，小心棄上清；14)洗滌沉淀用IOml 70%乙醇洗滌DNA沉淀，彡15000rpm/min離心樣品10分鐘，小心頃棄上清；15)涼干溶解敞開離心管口，放置10 20分鐘，直到乙醇蒸發(fā)殆盡，用適量無內(nèi)毒素的滅菌雙蒸水溶解質(zhì)粒DNA，并檢測質(zhì)粒的純度；16)紫外分光光度儀測定其純度及濃度，并將其濃度調(diào)整為lmg/ml，_20°C凍存?zhèn)溆谩?、陽離子脂質(zhì)體制備1)將陽離子脂質(zhì)體 D0TAP(D6182)按 1 1 的摩爾比加入 DOPE (Dioleylphosphat idyl-ethanolamine, Sigma P1223)中，然后溶解于氯仿和甲醇的混合物(氯仿和甲醇的體積比為3 1)。2)再將上述脂質(zhì)體混合物放入充滿氮氣的圓底燒瓶內(nèi)的薄片上進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，然后進行真空干燥。3)經(jīng)上述過程制備的脂質(zhì)體放入5%的葡萄糖溶液中進行水合，再次旋蒸。4)將旋蒸后液體進行水浴超聲破碎直至完全增溶。5)再將制備的脂質(zhì)體通過聚碳酸酯膜進行濾過，形成單層小囊泡形態(tài)。6)制備好的陽離子脂質(zhì)體(濃度3mg/ml)保存在4°C的條件下備用。3、腫瘤全細(xì)胞疫苗的制備3.1細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)1)從液氮中取出裝有C6細(xì)胞的凍存管、迅速置于37°C恒溫水浴箱，使凍存管中的凍存物迅速融化；2)打開凍存管，將細(xì)胞懸液吸到離心管中；3) 1000rpm/min 離心 lOmin，棄去上清液；4)沉淀加10ml DMEM培養(yǎng)液，吹打均勻，離心1000rpm/min，IOmin,棄上清液；5)加入DMEM培養(yǎng)基，吹打均勻，接種與細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37°C培養(yǎng)，次日觀察細(xì)胞生長情況。3. 2細(xì)胞傳代從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)瓶，吸去培養(yǎng)基后，用無血清培養(yǎng)基洗滌2次，加入0. 25%的胰酶或0. 02 % EDTA消化，顯微鏡下觀察細(xì)胞收縮變圓后，加入完全培養(yǎng)基終止消化，并吹打使細(xì)胞脫落分散，收集液體，1500rpm/min,離心3min，細(xì)胞沉淀用完全培養(yǎng)基重懸，吹打均勻后分瓶培養(yǎng)。一般3-4天傳代1次。3. 3細(xì)胞保種1)胰酶消化細(xì)胞，將細(xì)胞懸液收集至離心管中。2) 1000rpm/min 離心 lOmin，棄上清液。3)沉淀加細(xì)胞保種液，計數(shù)，調(diào)整至5 X 106/ml左右。4)將懸液分至凍存管中，每管1ml。5)將凍存管口封嚴(yán)。6)貼上標(biāo)簽，寫明細(xì)胞種類，凍存日期。7)按下列順序緩慢降溫①室溫，②4°C (20min)，③冰箱冷凍室(30min)④低溫冰箱(Ih)，⑤氣態(tài)氮(30min)，⑥液氮。3. 4腫瘤細(xì)胞疫苗制備及方法1)取出對數(shù)生長期細(xì)胞，吸去培養(yǎng)基上清；2)用無血清培養(yǎng)基洗滌2次，加入0. 25%的胰酶或0. 02% EDTA消化，顯微鏡下觀察細(xì)胞收縮變圓后，加入完全培養(yǎng)基終止消化，并吹打使細(xì)胞分散脫落收集液體，1500rpm, 離心3min，細(xì)胞沉淀用PBS重懸，細(xì)胞懸液計數(shù)；3)再次離心后棄上清；4)細(xì)胞加入戊二醛IOml固定過夜；5)用PBS洗滌后離心，重復(fù)3次；6)用 IOmlPBS 重懸后置 37°C，5% CO2 孵箱 2h ；7)用PBS洗滌后離心，重復(fù)3次；8)重懸后細(xì)胞4°C保存。試驗例1本發(fā)明藥物用于治療Wistar/Ce皮下腦膠質(zhì)瘤腫瘤模型1、模型建立及評
①Wistar雄性大鼠，每組12只，體重250g 士 20g ；②大鼠右后肢去毛，局部予以碘酒和75%酒精消毒；③用微量進樣器將20 μ 1細(xì)胞懸液(含2Χ106個C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞)接種于大鼠右后肢皮下，制成C6膠質(zhì)瘤皮下模型；④術(shù)后前3天，每只大鼠每天給予青霉素10-20萬U/只腹腔注射預(yù)防感染。⑤觀察大鼠生長情況，體重變化、飲食、毛色、活動情況及注射局部有無紅腫及包塊等。2、皮下膠質(zhì)瘤動物模型分組及治療腫瘤成瘤后(直徑大于5mm)，隨后將其隨機分成5組，即溶劑對照組(Control)、 脂質(zhì)體組(Liposome)，白介素15重組質(zhì)粒+脂質(zhì)體組(pORF-hIL-15+lipo)，全細(xì)胞瘤苗+ 脂質(zhì)體+空載質(zhì)粒組(TV+pORF+lipo)(簡稱TV-ORF組)，聯(lián)合治療組即全細(xì)胞瘤苗+脂質(zhì)
13體+白介素15重組質(zhì)粒組(TV+pORF-hIL-15+lipo)(簡稱TV+IL-15組)，每組12只。3、治療各組動物成瘤后，分別予上述分組進行干預(yù)，每3天治療1次，連續(xù)8次。4、皮下膠質(zhì)瘤動物模型觀察指標(biāo)①常規(guī)觀察每周測大鼠體重3次，每日定時觀察其意識、接觸反應(yīng)、運動缺陷、顱神經(jīng)損害及視覺反應(yīng)，有無偏癱和癲癇發(fā)作等。②皮下膠質(zhì)瘤動物模型體積檢測用游標(biāo)卡尺每3天檢測皮下腫瘤大小，測量出腫瘤的短徑(a)和最大徑(b)，根據(jù)公式計算各組的腫瘤體積皮下腫瘤體積=1/2X腫瘤短徑2X腫瘤長徑(a2b/^)。將腫瘤體積均值與生長時間的變化繪出生長曲線。按公式[1_(治療組平均體積變化/對照組平均體積變化)]X 100 %，計算抑瘤率。③生存期觀察及標(biāo)本采集記錄各組大鼠的生存天數(shù)，用公式(治療組平均存活天數(shù)-對照組平均存活天數(shù))/對照組平均存活天數(shù)X 100%，計算延長生存期。5、治療效果皮下接種大鼠55只，接種5-7天后，右后肢接種腫瘤處包塊隆起，為實體性包塊， 當(dāng)直徑大于0. 5cm時認(rèn)為建模成功，3只未見確切腫瘤，成瘤率為94. 5%，將其中50只建模成功者隨機分為5組予以相應(yīng)措施干預(yù)。腫瘤逐漸長大，以后期為甚，大鼠右后肢皮下可見團塊性腫瘤形成，大多瘤體隨瘤齡延長其體積明顯增大。自15天開始，個別腫瘤開始變小， 大部分體積逐步增加，每次治療同時測一次腫瘤體積，治療結(jié)束后仍每3d檢測1次，直到腫瘤完全消失或者大鼠死亡。根據(jù)體積的檢查變化，可見各組體積均表現(xiàn)出增大的趨勢，以對照組和脂質(zhì)體組最為明顯。pORF-hIL-15組、TV+pORF組及聯(lián)合治療組體積增加趨勢變緩，以聯(lián)合組最為明顯，大部分腫瘤生長受到抑制，部分腫瘤完全消失，至40d時，聯(lián)合組腫瘤均消失。其他各組腫瘤體積在同期逐漸變大，而部分腫瘤在干預(yù)結(jié)束后體積逐漸變小，而對照組也出現(xiàn)體積變小的趨勢。至60天時，各組腫瘤均完全消失(如圖1所示)。計算各組腫瘤平均體積大小并稱重，根據(jù)前述公式計算與Control組對比，聯(lián)合治療組(TV+IL-15)腫瘤的抑瘤率約為86%，明顯高于其余各組。試驗例2本發(fā)明藥物用于治療Wistar/C6顱內(nèi)腫瘤1、模型建立及評估①接種前3d灌胃給予地塞米松10 μ g/g，降低免疫力，減少排斥反應(yīng)。②參照Paxinos和Watson的《大鼠腦立體定位圖譜》確定右尾狀核區(qū)靶點接種。 在大鼠腦立體定位儀上選取大鼠腦右側(cè)尾狀核區(qū)為靶點，其坐標(biāo)為前因中點前1. 0mm，矢狀縫右旁開3 3. 5mm,硬膜下4 5. 0mm。③大鼠經(jīng)10%水合氯醛腹腔注射麻醉(3yl/g)后，固定于腦立體定向手術(shù)臺 (DW-2000，中國)，俯臥位，將上齒固定，保持氣道通暢，雙側(cè)耳桿固定。④以雙側(cè)內(nèi)珧連線與頭正中矢狀線交點向后Icm為切口，剪去頭頂部毛，碘酒、 75%酒精消毒，于選定切口向后縱向切開皮膚，暴露顱骨標(biāo)志，按上述坐標(biāo)點定位，用牙科鉆在露骨上鉆孔，孔徑1. 2mm，用25ul的微量注射器(Hamilton syringe)針頭銳性刺破硬膜在立體定向引導(dǎo)下接種針垂直緩慢延伸至硬膜下6. 0mm，上提(后延)1. Omm硬膜下5mm靶點處，將細(xì)胞懸液IX IO6個細(xì)胞以luL/min緩慢注入靶區(qū)(注射量為10 μ 1/只，速度不超過1 μ 1/min)，留針5-lOmin，使細(xì)胞充分沉積，避免返流(如為9L細(xì)胞，同樣為1 X IO6個腫瘤細(xì)胞重懸于10 μ IPBS中，1 μ 1/min)，注射完后留針3min，退出;3min。在注射過程中，密切觀察實驗動物的呼吸狀況，如果出現(xiàn)呼吸急促，嘆氣樣呼吸， 呼吸微弱等情況，需暫停注射。⑤緩慢拔針后，顱骨鉆孔處以骨蠟封閉，縫合頭皮，側(cè)臥，保溫，置于干燥環(huán)境。常規(guī)分籠飼養(yǎng)。⑥術(shù)后前3天，每只大白鼠每天給予青霉素10 20萬U/只腹腔注射預(yù)防感染。 觀察大鼠生長情況，體重變化、飲食及活動情況等。手術(shù)后動物保溫，觀察有無手術(shù)后死亡等。待麻醉清醒后，分籠飼養(yǎng)，自由進食水。 手術(shù)后第10日進行磁共振檢查，觀察顱內(nèi)腫瘤的成瘤情況、形態(tài)特征等。2、分組及治療經(jīng)過MRI檢測觀察成瘤后，去除成瘤不確切、體積過大及顱外有腫瘤生長者， 選擇60只隨機分為5組，分組及干預(yù)方案同皮下膠質(zhì)瘤。即對照組，Liposome組， pORF-IL-15+lipo 組，TV+pORF+lipo 組，TV+pORF-IL-15+lipo。每組各 12 只。3、實驗結(jié)果從手術(shù)后第8日開始，各組按照預(yù)定實驗方案在皮下予以治療，以多點局部注射方式進行，在進行聯(lián)合治療時，先予以皮下注射全細(xì)胞膠質(zhì)瘤疫苗，后在疫苗周圍注射由脂質(zhì)體包裹的pORF-hIL-15，每3d注射一次，共注射8次。經(jīng)過治療干預(yù)后，第二次(治療后2w)MRI檢測時腫瘤體積仍呈總體增大的趨勢， 以對照組、脂質(zhì)體和IL-15組為甚，腫瘤體積明顯變大，平均體積為；而TV組和聯(lián)合組腫瘤體積增大較緩慢，部分腫瘤幾乎沒有變大，少部分腫瘤開始變小(圖幻。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)后兩組平均體積為較前三組有統(tǒng)計學(xué)意義，后兩者間間尚沒有統(tǒng)計學(xué)差異。經(jīng)過干預(yù)后，第二次(治療后2w)MRI檢測時腫瘤體積仍呈總體增大的趨勢，以對照組、脂質(zhì)體和IL-15組為甚，腫瘤體積明顯變大；而TV組和聯(lián)合組腫瘤體積增大較緩慢，特別是聯(lián)合組，部分腫瘤幾乎沒有變大，少部分腫瘤開始變小(圖幻。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)后兩組平均體積為較前三組有統(tǒng)計學(xué)意義，后兩者間聯(lián)合組TV+IL-15組效果明顯較 TV+pORF效果更佳。自接種后5w(治療后#，8次免疫已經(jīng)完成)，對照組僅存活2只，1只腫瘤已經(jīng)消失，1只腫瘤體積巨大。pORF-hIL-15+lipo、脂質(zhì)體組也大部分大鼠死亡，至35d時分別存活4只和2只；聯(lián)合組腫瘤體積明顯變小，大部分已消失，而TV組大鼠雖然體積增加緩慢， 但是大鼠死亡率較聯(lián)合組高，至60d時，聯(lián)合組有7只存活，腫瘤消失，而TV+pORF+lipo組僅剩3只，其余各組均剩下1只為死亡。計算各組生存率后得到生存曲線如下(圖4)。計算腫瘤的長、寬、高，根據(jù)前述公式計算腫瘤抑瘤率，相對于溶劑對照組， TV+IL-15組的抑瘤率在第3w和第5w分別為72%和83%，最終TV+IL-15組治療的有效率為 58. 3%。試驗例3本發(fā)明藥物用于治療F344/9L顱內(nèi)腫瘤1、建模及分組、干預(yù)同試驗例22、實驗結(jié)果
1)MRI影像學(xué)檢查結(jié)果因為腫瘤破壞正常的血腦屏障，經(jīng)尾靜脈注射的Gd-BOPTA大量通過破壞的血腦屏障進入組織間隙，形成影像上的造影劑濃聚區(qū)域，因此高信號區(qū)域可以認(rèn)為是腫瘤生長的范圍。磁共振影像上腫瘤呈不規(guī)則圓形或類圓形，與周圍腦組織之間分界不清。在21及 35d的磁共振影像上，腫瘤體積繼續(xù)增大，以對照組和脂質(zhì)體組明顯。TV-ORF組和TV+IL-15 組腫瘤早期(術(shù)后21d前)生長較緩慢，隨治療時間延長，聯(lián)合治療組腫瘤部分開始出現(xiàn)變小，或者消失；而TV-ORF組組等對照組腫瘤體積均呈增大的趨勢(圖5)。與C6膠質(zhì)瘤不同，9L所致腫瘤出現(xiàn)瘤內(nèi)壞死的幾率低，常常為實體瘤，即便體積巨大時，瘤內(nèi)可見部分小是囊性壞死區(qū)，仍以實體性為主。2)顱內(nèi)F344/9L膠質(zhì)瘤干預(yù)后體積變化手術(shù)后第7d，通過磁共振證實大鼠顱內(nèi)腫瘤種植成功后，精確測量腫瘤的前后徑、左右徑及上下徑的最大值，數(shù)據(jù)精確到立方毫米，計算腫瘤體積(腫瘤容積= LXffXDX π /6，即長X寬X深X π /6)。發(fā)現(xiàn)第一次檢測時平均體積在0. 5cm3左右，各組間沒有統(tǒng)計學(xué)差異。經(jīng)過干預(yù)后，腫瘤的體積變化類似Wistar/C6，第二次(治療后2周)MRI檢測時腫瘤體積仍呈總體增大的趨勢，以對照組、脂質(zhì)體和IL-15組為甚，腫瘤體積明顯變大；而 TV-ORF組和TV+IL-15組腫瘤體積增大較緩慢，部分腫瘤幾乎沒有變大，少部分腫瘤開始變小。較前三組差異有統(tǒng)計學(xué)意義，后兩者間尚沒有統(tǒng)計學(xué)差異(圖6)。經(jīng)過不同干預(yù)后，對照組腫瘤體積逐步快速增大，而聯(lián)合組腫瘤體積增加緩慢，至后期腫瘤完全消失。3)顱內(nèi)F344/9L膠質(zhì)瘤干預(yù)后生存時間荷瘤大鼠大多數(shù)在接種后4 5w死亡(治療后#，8次免疫已經(jīng)完成)，對照組僅存活2只，MRI顯示腫瘤巨大，中線移位明顯，而聯(lián)合治療組腫瘤體積增加不明顯，大部分腫瘤體積開始變小，甚至完全消失，腫瘤的體積變化曲線見圖7。至40d時，對照組和脂質(zhì)體組大鼠全部死亡，而TV-ORF組和IL-15組也大部分死亡，TV+IL-15組腫瘤體積明顯變小，大部分已消失，至60d時，聯(lián)合組有7只存活，腫瘤消失，其余各組均死亡，由此描繪的大鼠生存曲線如下(圖7)。從圖9可知，各組荷瘤大鼠經(jīng)過治療后生存情況可見荷瘤大鼠大多在 3-5周內(nèi)死亡，聯(lián)合組經(jīng)治療后存活率可達近60%。根據(jù)前述公式計算腫瘤的抑瘤率，相對于對照組，TV+IL-15聯(lián)合組的抑瘤率在第 3w和第5w分別為66. 3%和63%，聯(lián)合組長期存活為58. 3%0試驗例4本發(fā)明藥物用于LL2小鼠肺癌1. LL2小鼠肺癌皮下荷瘤模型建立75%酒精消毒，用Iml皮試針將制備好的LL2腫瘤細(xì)胞懸液均勻接種于小鼠右后肢皮下，建立LL2肺癌皮下模型。2.動物分組及免疫將健康C57小鼠隨機分成6組，每組5只A生理鹽水組皮下注射生理鹽水，100 μ 1/只；B脂質(zhì)體組皮下注射脂質(zhì)體，25 μ g/只，注射體積100 μ 1/只；C空載體組皮下注射按前述方法制備的未連接IL-15基因片段的pORF-lipo (空載)質(zhì)粒，10 μ g/只(單純pORF質(zhì)粒質(zhì)量)，注射體積100 μ 1/只；
D IL-15組皮下注射前述方法制備的IL-15-pORF-lipo質(zhì)粒，10 μ g/只(單純 IL-15-pORF質(zhì)粒質(zhì)量)，注射體積100 μ 1/只；E全細(xì)胞瘤苗組皮下注射前述方法制備的LL2全細(xì)胞瘤苗，106/只，注射體積 100 μ 1/ 只；F聯(lián)合免疫組皮下注射全細(xì)胞瘤苗，劑量方法同TV組，圍繞TV組皮下注射點周圍多點皮下注射IL-15-pORF-lipo質(zhì)粒，總劑量同IL-15組。免疫方案分別于第1周、第3周、第4周、第5周按上述方法及劑量免疫C57小鼠，并與設(shè)定時間采集小鼠血清。3.實驗結(jié)果1)荷瘤小鼠一般情況免疫結(jié)束后第7天(DO)建立LL2肺癌皮下模型，接種后12天(D12)開始，聯(lián)合免疫組小鼠進食飲水明顯多于其它組小鼠，全細(xì)胞瘤苗組次之，IL-15組再次，精神狀況及活動情況各組均無明顯異常。接種后第15天(DK)開始，除聯(lián)合免疫組小鼠外各組小鼠均開始出現(xiàn)進行性的進食及活動減少，伴體重減輕、精神不振、皮毛粗糙。2)LL2皮下腫瘤生長接種后8天(D8)開始觸及右后肢皮下米粒大小團塊形成，大多數(shù)瘤體隨瘤齡延長而體積明顯增大，質(zhì)韌、可推動。根據(jù)前述公式計算腫瘤抑瘤率，聯(lián)合免疫組相對生理鹽水對照組的抑瘤率在接種后15天最大，達93. 02% (圖8)。3)荷瘤小鼠生存情況聯(lián)合免疫組小鼠生存情況明顯優(yōu)于其它5組。接種后21天開始出現(xiàn)對照組小鼠死亡，到接種后45天，聯(lián)合免疫組和全細(xì)胞瘤苗組各存活2只，其余組小鼠全部死亡，其中聯(lián)合免疫組存活的兩只小鼠腫瘤體積不超過2500mm3，至接種后60天觀察結(jié)束時仍帶瘤存活(圖9)。4)聯(lián)合免疫對小鼠細(xì)胞免疫的影響實驗結(jié)果顯示，生理鹽水組、脂質(zhì)體組和空載體組殺傷效應(yīng)均小于15%，IL-15 組、全細(xì)胞瘤苗組及聯(lián)合免疫組抑制率升高，其中聯(lián)合免疫組升高最為明顯，且在效靶比為 1 100時達到最大的58. 17%。5)聯(lián)合免疫對小鼠體液免疫的影響以LL2細(xì)胞為包被抗原，檢測小鼠血清中LL2全細(xì)胞瘤苗抗體的含量，通過此實驗結(jié)果可了解聯(lián)合免疫對小鼠體液免疫的影響。圖示不同時間點各組小鼠血清LL2全細(xì)胞瘤苗抗體表達量的差異，免疫后聯(lián)合免疫組和全細(xì)胞瘤苗組血清中的LL2瘤苗抗體表達量明顯增高，且聯(lián)合免疫組抗體表達量增高更為顯著。而IL-15基因疫苗組和其余對照組免疫前后抗體表達量改變無統(tǒng)計學(xué)差異。6)免疫組化結(jié)果選擇了⑶4、⑶8、⑶24、⑶57抗體分別作為CD4+的T細(xì)胞、CD8+的T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞的標(biāo)志物，對各組小鼠腫瘤組織進行了免疫組化檢測。結(jié)果顯示，IL-15組腫瘤中⑶57、⑶8有較多表達，⑶4和⑶對相對表達較少，而全細(xì)胞瘤苗組的⑶4、⑶8和⑶對都有較多表達，CD57相對表達較少。全細(xì)胞瘤苗聯(lián)合IL-15組的小鼠腫瘤中各標(biāo)記物均明顯表達增多，且均多于單獨全細(xì)胞瘤苗組或IL-15組。余組偶見少量非特異性染色，上述各
17標(biāo)記物均未見明顯陽性征。 綜上，經(jīng)過相應(yīng)干預(yù)后，TV-ORF組、p0RF-hIL_15和TV+IL-15聯(lián)合組通過激活淋巴細(xì)胞CTL作用和NK細(xì)胞及體液免疫參與抗瘤治療，而聯(lián)合組顯示了更強的抗瘤效應(yīng)。35d 時皮下腫瘤抑制率達到86%，顱內(nèi)為81% (C6/ffistar)和79% (9L/F344)；聯(lián)合治療組生存期延長，部分治療后腫瘤消失；血清學(xué)分析顯示腫瘤TNF- α、IFN- y、IL-12、IL_6、IL-15 等明顯升高，抗膠質(zhì)瘤抗原的抗體滴度增加。CTL顯示聯(lián)合組明顯高于其他組，4h時細(xì)胞死亡約40%;淋巴細(xì)胞流式表型分析發(fā)現(xiàn)⑶4+、⑶8+細(xì)胞在聯(lián)合組相應(yīng)增多，⑶47⑶8+比值約為3，明顯超過正常值；免疫組化顯示⑶4+、⑶8+和⑶56抗體在瘤周及瘤內(nèi)明顯增多，說明細(xì)胞免疫在腦膠質(zhì)瘤免疫治療中占有主導(dǎo)性地位，VEGF等表達和MVD在聯(lián)合組明顯降低， 可能同時抑制了腫瘤血管生長和腫瘤細(xì)胞增殖。總之，通過實驗證實采用滅活腫瘤全細(xì)胞瘤苗、脂質(zhì)體包裹IL-15質(zhì)粒局部多點注射后，機體的細(xì)胞免疫和體液免疫均被激活，CD4+、 CDS+T細(xì)胞和NK細(xì)胞被激活，荷瘤大鼠針對膠質(zhì)瘤抗原的抗體IgG滴度增高，可直接通過細(xì)胞毒效應(yīng)和/體液免疫方式參與免疫過程，能顯著抑制腫瘤生長，甚至部分被治愈，有效提高了抗瘤效果，延長了生存期。
權(quán)利要求
1.預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物組合物，其特征在于包括如下組分腫瘤全細(xì)胞疫苗、陽離子脂質(zhì)體和編碼白細(xì)胞介素-15的重組質(zhì)粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物組合物，其特征在于所述的腫瘤全細(xì)胞疫苗為滅活的具有特異性和主動性激發(fā)生物體主動免疫機能的腫瘤細(xì)胞疫苗。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物組合物，其特征在于所述的腫瘤全細(xì)胞疫苗包含至少一種能激活生物體特異性抗腫瘤T淋巴細(xì)胞的活性成分；其中，所述的活性成分為蛋白質(zhì)、多肽、脂類、蛋白質(zhì)多肽復(fù)合物、DNA分子、RNA分子、腫瘤相關(guān)抗原、特異性腫瘤抗原中至少一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3任一項所述的預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物組合物，其特征在于所述的腫瘤全細(xì)胞疫苗由下述方法制備而成腫瘤細(xì)胞經(jīng)過細(xì)胞滅活至細(xì)胞增殖活性被抑制；其中，所述的腫瘤細(xì)胞為能特異性的誘導(dǎo)、激活機體主動免疫，增強生物體預(yù)防腫瘤和抗腫瘤免疫的自體細(xì)胞、同源細(xì)胞系細(xì)胞或具有交叉抗原的異體腫瘤細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物組合物，其特征在于所述的腫瘤細(xì)胞為肺癌細(xì)胞、腸癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、腎癌細(xì)胞、鼻咽癌細(xì)胞、皮膚癌細(xì)胞、食道癌細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞中至少一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物組合物，其特征在于細(xì)胞滅活的方法為微波細(xì)胞滅活法，電磁波細(xì)胞滅活法，激光細(xì)胞滅活法，高溫細(xì)胞滅活法，超聲破碎細(xì)胞滅活法，反復(fù)細(xì)胞凍融、勻漿、離心、沉淀細(xì)胞滅活法，酶學(xué)消化細(xì)胞滅活法中至少一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求1 6任一項所述的預(yù)防和/或治療腫瘤的藥物組合物，其特征在于 所述的陽離子脂質(zhì)體為DOTAP、DOTMA、DOSPA、DOGS中至少一種；陽離子脂質(zhì)體和IL-15重組質(zhì)粒DNA的重量配比為1 15 1，所述的陽離子脂質(zhì)體和IL-15重組質(zhì)粒DNA的重量配比優(yōu)選為3 1。
8.根據(jù)權(quán)利要求1 7任一項所述的治療或預(yù)防腫瘤的藥物，其特征在于所述的 IL-15重組質(zhì)粒DNA包括1)、根據(jù)編碼IL-15的基因構(gòu)建的重組質(zhì)粒DNA；或2)、根據(jù)編碼IL-15的基因序列中經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個核苷酸且具有 IL-15基因功能的基因構(gòu)建的重組質(zhì)粒DNA ；或3)、在生物體內(nèi)被吸收轉(zhuǎn)染后能分泌具有IL-15生物活性的質(zhì)粒。
9.根據(jù)權(quán)利要求1 8任一項所述的治療或預(yù)防腫瘤的藥物，其特征在于所述的治療或預(yù)防腫瘤的藥物的制劑為試劑盒，其包括包裝在空間獨立的制劑單元中的順序給藥的腫瘤全細(xì)胞疫苗、陽離子脂質(zhì)體和編碼白細(xì)胞介素-15的重組質(zhì)粒。
10.權(quán)利要求1 9任一項所述的藥物在制備治療或預(yù)防腫瘤的藥物中的用途。
11.更具權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于所述藥物中的腫瘤全細(xì)胞疫苗皮下注射腫瘤疫苗數(shù)目為IXlO5 IXlO8個/次。
12.制備腫瘤全細(xì)胞疫苗的方法，其特征在于包括如下步驟a、取腫瘤細(xì)胞，經(jīng)胰酶或EDTA消化、分離，得到細(xì)胞沉淀；b、a步驟所得細(xì)胞沉淀滅活至細(xì)胞增殖活性被抑制。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的制備腫瘤全細(xì)胞疫苗的方法，其特征在于a步驟中所述的腫瘤細(xì)胞的來源為腫瘤細(xì)胞株或細(xì)胞系，或來源于生物體的腫瘤組織；其中，當(dāng)腫瘤細(xì)胞的來源為腫瘤細(xì)胞株或細(xì)胞系時，按如下方法準(zhǔn)備腫瘤細(xì)胞取狀態(tài)良好、 處于對數(shù)生長期的腫瘤細(xì)胞進行培養(yǎng)傳代，達到所需細(xì)胞數(shù)后進入腫瘤全細(xì)胞疫苗制備程序；當(dāng)腫瘤細(xì)胞的來源為生物體的腫瘤組織時，按如下方法準(zhǔn)備腫瘤細(xì)胞在無菌條件下取腫瘤新鮮、血供好的未壞死部分，放入盛有含小?；蛱ヅＱ宓腄MEM/F12中在4°C下保存，用含青霉素、鏈霉素的PBS溶液清洗，通過酶消化法、差速貼壁法或差速消化法分離得到純化的腫瘤細(xì)胞，將純化的腫瘤細(xì)胞移入含小?；蛱ヅＱ宓腄MEM等培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，然后放入37°C，5 % CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2 3d后，細(xì)胞鋪滿瓶底80 90 %時傳代，達到所需細(xì)胞數(shù)后進入腫瘤全細(xì)胞疫苗制備程序。
14.根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的制備腫瘤全細(xì)胞疫苗的方法，其特征在于所述a步驟采用下述方法進行分離取腫瘤細(xì)胞，加質(zhì)量濃度為0. 25%的胰酶或質(zhì)量濃度為0. 02%的EDTA消化至細(xì)胞收縮變圓后加入含10%血清的常規(guī)培養(yǎng)基終止消化，并吹打使細(xì)胞分散脫落，收集液體，離心，棄上清液，得到細(xì)胞沉淀；所述b步驟中采用下述方法進行細(xì)胞滅活微波細(xì)胞滅活法，電磁波細(xì)胞滅活法，激光細(xì)胞滅活法，高溫細(xì)胞滅活法，超聲破碎細(xì)胞滅活法，反復(fù)細(xì)胞凍融、勻漿、離心、沉淀細(xì)胞滅活法，酶學(xué)消化細(xì)胞滅活法中至少一種。
15.根據(jù)權(quán)利要求12 14任一項所述的制備腫瘤全細(xì)胞疫苗的方法，其特征在于b 步驟中采用下述方法進行細(xì)胞滅活a步驟所得細(xì)胞沉淀用重懸溶液重懸，離心后棄上清液，加入質(zhì)量濃度為1 %的戊二醛固定7-8h，然后用相應(yīng)的重懸溶液洗滌，離心，所得細(xì)胞沉淀再次重懸后于5% C02，37°C的培養(yǎng)箱中放置1. 5 2. 5h，然后再用相應(yīng)的重懸溶液洗滌，離心，重復(fù)3次，重懸后即得細(xì)胞疫苗，保存?zhèn)溆?；其中，所述的重懸溶液為生理鹽水NS 或磷酸鹽PBS緩沖液。
16.由權(quán)利要求12 15任一項所述的方法制備的腫瘤全細(xì)胞疫苗。
全文摘要
本發(fā)明涉及治療或預(yù)防腫瘤的藥物、腫瘤全細(xì)胞疫苗及其制備方法和用途，屬于生物工程領(lǐng)域和生物免疫學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是提供了一種治療或預(yù)防腫瘤的效果較好的藥物和腫瘤全細(xì)胞疫苗。本發(fā)明藥物包含腫瘤全細(xì)胞疫苗、陽離子脂質(zhì)體和編碼白細(xì)胞介素-15基因的重組質(zhì)粒。本發(fā)明藥物具有腫瘤預(yù)防免疫和抗腫瘤免疫治療的雙重作用，其作用持久，治療或預(yù)防腫瘤的效果顯著。
文檔編號A61K39/39GK102343086SQ20111014237
公開日2012年2月8日 申請日期2011年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月28日
發(fā)明者仝愛平, 吳揚, 周良學(xué), 郭剛, 陳曦, 魏于全 申請人:四川大學(xué)