專利名稱：一種肝癌細(xì)胞靶向的聚酰胺胺樹狀大分子載體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬高分子靶向納米載體的制備領(lǐng)域，特別是涉及一種肝癌細(xì)胞靶向的聚酰胺胺樹狀大分子載體的制備方法。
背景技術(shù)：
化學(xué)藥物治療作為癌癥治療的重要手段之一，長期以來一直受到高度關(guān)注。然而，許多抗腫瘤藥物所存在的臨床療效低下、毒副作用大等問題已成為癌癥藥物治療中的瓶頸。尤其是在肝癌治療中，由于無法控制抗腫瘤藥物集中于肝臟的病灶部位，將導(dǎo)致病人的正常組織和器官受到不必要的傷害，甚至威脅到患者的生命。近年來，發(fā)展一種肝靶向納米載體，實(shí)現(xiàn)藥物特異性輸送到肝臟的病變部位，提高治療效果的同時(shí)減輕對其他臟器的傷害，已成為研究的熱點(diǎn)與重點(diǎn)。目前已有多項(xiàng)專利公開了以甘草次酸為靶向分子的肝靶向納米藥物載體的制備方法，如公開號為CN101549158、CN101254308, CN101249266, CN101642573 的專利。肝細(xì)胞膜表面特異性表達(dá)的去唾液酸糖蛋白受體(asialoglycoprotein receptor,ASGPR)能夠?qū)Ｒ恍宰R別分子末端帶有半乳糖殘基的糖蛋白并與之結(jié)合。研究表明將半乳糖殘基修飾到納米載體的表面，不僅能夠引導(dǎo)納米載體與肝癌細(xì)胞特異性的結(jié)合，還有望通過受體介導(dǎo)的胞吞過程將納米載體上連接的藥物、酶、基因或示蹤分子定向于肝細(xì)胞，從而降低對其他臟器的毒副作用，提高治療效果，并可能實(shí)現(xiàn)肝癌的早期診斷。中國專利CN101U9342合成了帶有半乳糖殘基的乙烯酯單體，并與不飽和陽離子或陰離子單體共聚得到了肝靶向聚電解質(zhì)。這種靶向材料的合成方法較為復(fù)雜，并且只能通過層層自組裝的方法用于抗腫瘤藥物的負(fù)載與輸送，因此在使用和推廣中仍有一定的局限性。檢索國內(nèi)外有關(guān)肝癌細(xì)胞靶向載體的文獻(xiàn)和專利結(jié)果表明以乳糖酸對聚酰胺胺樹狀大分子進(jìn)行功能化修飾，并用作肝癌細(xì)胞診斷或治療的靶向載體的研究未見相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種肝癌細(xì)胞靶向的聚酰胺胺樹狀大分子載體的制備方法，該制備方法簡單，反應(yīng)條件溫和，易于操作，原料環(huán)保；所得的功能化樹狀大分子材料具有良好的生物相容性，并且能夠特異性地靶向結(jié)合到肝癌細(xì)胞上。本發(fā)明的一種肝癌細(xì)胞靶向的聚酰胺胺樹狀大分子載體的制備方法，包括(1)聚酰胺胺樹狀大分子的異硫氰酸熒光素(FITC)修飾在8-12mL含有15_25mg端基為氨基的第5代聚酰胺胺樹狀大分子G5. NH2的無水 DMSO溶液中逐滴加入5-15mL有異硫氰酸熒光素FITC的DMSO溶液，室溫下攪拌M小時(shí)，然后經(jīng)透析純化，最后冷凍干燥得到G5. NH2-FI ；(2)聚酰胺胺樹狀大分子的部分乙?；揎棇⑸鲜鯣5. NH2-FI溶解在8_13mL的DMSO溶液中，加入三乙胺混合均勻后，逐滴加入3-8mL含醋酸酐的DMSO溶液，攪拌反應(yīng)M小時(shí)，然后經(jīng)透析純化和冷凍干燥得到樹狀大分子表面氨基部分乙酰化的產(chǎn)物G5-FI-Ac-NH2 ；(3)聚酰胺胺樹狀大分子的乳糖酸(La)修飾將乳糖酸(La)、l-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶解在3-8mL磷酸鹽緩沖溶液中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2-5小時(shí)，然后滴加到上述G5-FI-Ac-NH2的10-15mL水溶液中，室溫?cái)嚢?_5天，最后經(jīng)透析純化和冷凍干燥后得到 G5-FI-Ac-La。步驟⑴中所述的異硫氰酸熒光素FITC與樹狀大分子G5. NH2的摩爾比為3 1 10 1。步驟O)中所述的醋酸酐與三乙胺的摩爾比為1 1 1 12。步驟O)中所述的醋酸酐與樹狀大分子G5. NH2的摩爾比為80 1 100 1。步驟(3)中所述乳糖酸與樹狀大分子G5. NH2的摩爾比為3 1 20 1。步驟(3)中所述的乳糖酸與1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽的摩爾比1 3 1 10 ;1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽與N-羥基琥珀酰亞胺的摩爾比為2 1 1 1。步驟(3)中所述的磷酸鹽緩沖溶液的pH值為6. 0。步驟(1) (3)中所述的透析為用截留分子量為10000的纖維素透析膜逐次在 PBS緩沖溶液4LX 3和超純水4LX 3中透析3天。聚酰胺胺(PAMAM)樹狀大分子是一種高度支化的單分散大分子，它具有良好的尺寸可控性和水溶性，在使用劑量下沒有細(xì)胞毒性和免疫原性，因此受到了廣泛關(guān)注。它具有規(guī)整精細(xì)的結(jié)構(gòu)內(nèi)部呈疏水性空腔，可以為疏水性藥物以及無機(jī)探針分子的負(fù)載提供場所；表面有大量可控功能基團(tuán)，可以化學(xué)連接或吸附一些靶向基團(tuán)、抗體或藥物分子等。乳糖酸(La)是一種含有半乳糖殘基的小分子，能夠修飾在納米載體或高分子材料的表面以提高其對肝細(xì)胞結(jié)合能力。因此，如果將乳糖酸修飾在樹狀大分子表面，則有望制備一種具有肝癌細(xì)胞靶向功能的納米載體，實(shí)現(xiàn)藥物、基因或診斷分子探針的負(fù)載與靶向輸送。本發(fā)明以端基為氨基的第5代聚酰胺胺(PAMAM)樹狀大分子為原料，在其表面接枝5個(gè)異硫氰酸熒光素(FITC)分子賦予載體熒光示蹤功能，將樹狀大分子表面的部分端氨基進(jìn)行乙?；磻?yīng)使其表面電荷呈中性以提高生物相容性，再將10個(gè)乳糖酸分子連接在樹狀大分子表面，最終得到了具有肝癌細(xì)胞靶向功能的G5-FI-Ac-La納米載體。本發(fā)明使用核磁共振譜(NMR)與介質(zhì)輔助的激光脫附離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜 (MALDI-TOF MS)的方法表征制備的肝癌細(xì)胞靶向的樹狀大分子載體，并用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)分析和激光共聚焦顯微鏡來檢驗(yàn)功能化的載體對人體肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞的毒性和特異性結(jié)合。結(jié)果表明依據(jù)本發(fā)明制備的樹狀大分子載體在濃度達(dá)到2000 nM時(shí)對肝癌細(xì)胞不具有細(xì)胞毒性，而且能夠顯著地特異結(jié)合肝癌細(xì)胞，而對照的不含乳糖酸的樹狀大分子則不顯示對肝癌細(xì)胞的特異結(jié)合，因此本發(fā)明制備的修飾乳糖酸的樹狀大分子能夠作為載體用于針對肝癌細(xì)胞的化療藥物、基因以及造影劑等的靶向輸送。有益效果(1)本發(fā)明的制備方法簡單，易于操作，反應(yīng)條件溫和，對設(shè)備的要求低，且所用的聚合物為環(huán)境友好的高分子材料，具有產(chǎn)業(yè)化實(shí)施的前景；(2)本發(fā)明制備的功能化樹狀大分子材料具有良好的生物相容性，并且能夠特異性地靶向結(jié)合到肝癌細(xì)胞上，可用于藥物、基因或診斷分子探針的負(fù)載與靶向輸送。


圖1為對比例1所得的G5-FI-AC (a)與實(shí)施例1所得的G5_FI-AC-La(b)的核磁共振譜圖；圖2為對比例1所得的G5-FI-Ac與實(shí)施例1所得的G5_FI-Ac_La的MALDI-T0F 譜圖；圖3為MTT法測試的H印G2細(xì)胞經(jīng)過對比例1所得的G5_FI_Ac與實(shí)施例1所得的G5-FI-Ac-La(濃度范圍在0_2000ηΜ)分別處理M小時(shí)后的細(xì)胞活力；圖4為對比例1所得的G5-FI-AC與實(shí)施例1所得的G5-FI_AC-La兩種材料在不同濃度下與HepG2細(xì)胞共培養(yǎng)池后的流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果；圖5為經(jīng)過PBS緩沖液(a, d)、對比例1所得的G5-FI_Ac (b，e)和實(shí)施例1所得的G5-Fl-Ac-La(c，f)處理濁后的!fepG2細(xì)胞和MCF-7細(xì)胞的激光共聚焦顯微鏡圖片；圖6為本發(fā)明的反應(yīng)方程式。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。實(shí)施例1(1)聚酰胺胺樹狀大分子的異硫氰酸熒光素FITC修飾在含有20mg端基為氨基的第5代聚酰胺胺樹狀大分子G5. NH2的IOmL無水二甲亞砜(DMSO)溶液中逐滴加入含有1. 5mg FITC的IOmL DMSO溶液，室溫下強(qiáng)磁力攪拌M小時(shí)，隨后將反應(yīng)產(chǎn)物用截留分子量為10000的纖維素透析膜逐次在PBS緩沖溶液4LX3和超純水4LX3中透析3天，最后經(jīng)冷凍干燥得到產(chǎn)物G5. NH2-FI0(2)聚酰胺胺樹狀大分子的部分乙?；揎棇5. NH2-FI溶解在IOmL的DMSO溶液中，與9. 6 μ L三乙胺充分混合后，逐滴加入含7. Img醋酸酐的DMSO溶液5mL，強(qiáng)磁力攪拌下反應(yīng)M小時(shí)，經(jīng)透析純化和冷凍干燥得到樹狀大分子表面氨基部分乙?；漠a(chǎn)物G5-FI-Ac-NH2。(3)聚酰胺胺樹狀大分子的乳糖酸(La)修飾2. 76mg乳糖酸(La)，5. 9mg 1_乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC) 與3. 6mg N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)溶解在5mL磷酸鹽緩沖溶液中(pH6. 0)，室溫條件下磁力攪拌反應(yīng)3小時(shí)，將反應(yīng)后的溶液逐漸滴加到G5-FI-Ac-NH2的水溶液中，室溫條件下強(qiáng)磁力攪拌3天。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)透析純化和冷凍干燥后得到G5-FI-Ac-La。對得到的產(chǎn)品G5-FI-Ac-La進(jìn)行核磁表征，結(jié)果見附圖Ib 在1. 87ppm處有一個(gè)明顯的質(zhì)子峰，對應(yīng)著乙酰基上甲基的特征峰；在6. 47-7. 07ppm處的質(zhì)子峰歸屬于樹狀大分子表面修飾的熒光分子FITC中苯環(huán)上的特征峰；在3. 40-4. IOppm處的質(zhì)子峰，對應(yīng)于乳糖酸分子上的特征峰。對各個(gè)峰進(jìn)行積分計(jì)算可知樹狀大分子載體表面修飾了 5個(gè)FITC 分子，90個(gè)乙?；?. 7個(gè)乳糖酸分子。因此，已成功制備了設(shè)計(jì)合成的功能化的樹狀大分子 G5-FI-Ac-La。實(shí)施例2根據(jù)實(shí)施例1和對比例1的方法合成兩種材料G5-FI-Ac-La與G5_FI_AC，進(jìn)行介質(zhì)輔助的激光脫附離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)測試，結(jié)果如附圖2所示。結(jié)果表明修飾了乳糖酸的化合物G5-FI-Ac-La的分子量較未修飾乳糖酸的化合物G5_FI_Ac的分子量有顯著增加。通過計(jì)算發(fā)現(xiàn)G5-FI-Ac-La表面修飾有4個(gè)乳糖酸分子。雖然這一測試結(jié)果與NMR結(jié)果有一定差異，但是考慮到MALDI-TOF MS的測試結(jié)果不能反映材料的平均分子量，只能給出一個(gè)寬泛的分子量分布范圍，因此這一結(jié)果仍能很好的證明乳糖酸已成功修飾在樹狀大分子表面，制備得到了 G5-FI-Ac-La納米載體。實(shí)施例3以人肝癌細(xì)胞H印G2為模型細(xì)胞來檢驗(yàn)實(shí)施例1和對比例1合成的兩種材料 G5-FI-Ac-La與G5-FI_Ac的細(xì)胞毒性。將模型細(xì)胞分別在不同濃度的含有G5-FI_AC-La、 G5-FI-Ac的培養(yǎng)液中培養(yǎng)M小時(shí)后，用MTT法來測試模型細(xì)胞的存活情況，結(jié)果見附圖3。 結(jié)果分析表明，濃度范圍在0-2000nM時(shí)，!fepG2細(xì)胞經(jīng)G5_FI-Ac_La與G5_FI_Ac處理M小時(shí)后，MTT法測試的細(xì)胞的存活率仍高于95%以上，證明依據(jù)本發(fā)明合成的載體材料具有良好的生物相容性，在一定濃度范圍內(nèi)沒有體外細(xì)胞毒性。實(shí)施例4以具有較強(qiáng)ASGPR表達(dá)的人肝癌細(xì)胞IfepG2為模型細(xì)胞來檢驗(yàn)實(shí)施例1和對比例 1合成的兩種材料G5-FI-Ac-La與G5_FI_Ac對肝癌細(xì)胞的靶向效果。將模型細(xì)胞分別在含有不同濃度的G5-FI-Ac-La和G5_FI_Ac的培養(yǎng)液中培養(yǎng)2小時(shí)后，用流式細(xì)胞術(shù)測定模型細(xì)胞的熒光強(qiáng)度，結(jié)果見附圖4。測試結(jié)果顯示在選定濃度范圍內(nèi)，與G5-FI-Ac-La共培養(yǎng)的H印G2細(xì)胞均具有比與G5-FI-AC共培養(yǎng)的細(xì)胞更強(qiáng)的熒光信號。在500nM濃度時(shí)，與 G5-FI-Ac-La共培養(yǎng)的H印G2細(xì)胞的熒光強(qiáng)度是與G5_FI_Ac共培養(yǎng)的細(xì)胞的5倍以上，這表明G5-FI-Ac-La可以特異性地與H印G2細(xì)胞結(jié)合，而未修飾乳糖酸的樹狀大分子對H印G2 細(xì)胞沒有結(jié)合或只存在少量的非特異性吸附。實(shí)施例5分別以具有較強(qiáng)ASGPR表達(dá)的人肝癌細(xì)胞IfepG2和低ASGPR表達(dá)的人乳腺癌細(xì)胞MCF-7為模型細(xì)胞，用濃度各為500nM的實(shí)施例1所得的G5-FI_AC-La和對比例1所得的G5-FI-AC材料處理2小時(shí)后進(jìn)行激光共聚焦顯微鏡觀察，結(jié)果見附圖5。對于具有較強(qiáng) ASGPR表達(dá)的H印G2細(xì)胞，與乳糖酸修飾的材料G5-FI_AC-La共培養(yǎng)后，細(xì)胞具有較強(qiáng)的熒光信號；而與未修飾乳糖酸的材料G5-FI-AC培養(yǎng)后，細(xì)胞幾乎沒有熒光信號，與PBS緩沖液對照組相似。這一結(jié)果證明只有乳糖酸修飾的G5-FI-Ac-La對肝癌細(xì)胞具有特異性的靶向和結(jié)合，未修飾的材料對肝癌細(xì)胞沒有靶向效果。對于低ASGI5R表達(dá)的人乳腺癌細(xì)胞 MCF-7，與G5-FI-Ac-La共培養(yǎng)后的細(xì)胞與G5_FI_Ac、PBS對照組的相似，都幾乎沒有熒光信號。這也證明了乳糖酸修飾的G5-FI-Ac-La僅對具有高ASGPR表達(dá)的肝癌細(xì)胞有特異性的靶向效果，對其它細(xì)胞沒有靶向效果。
對比例1(1)聚酰胺胺樹狀大分子的異硫氰酸熒光素FITC修飾在含有20mg聚酰胺胺樹狀大分子G5. NH2的IOmL的DMSO溶液中逐滴加入含有 1. 5mg FITC的IOmL DMSO溶液，室溫下強(qiáng)磁力攪拌24小時(shí)，隨后將反應(yīng)產(chǎn)物用截留分子量為10000的纖維素透析膜逐次在PBS緩沖溶液4LX3和超純水4LX3中透析3天，最后經(jīng)冷凍干燥得到產(chǎn)物G5. NH2-FI0(2)聚酰胺胺樹狀大分子的完全乙?；幚韺5. NH2-FI溶解在IOmL的DMSO溶液中，與12. 8 μ L三乙胺充分混合后，逐滴加入含9. 5mg醋酸酐的DMSO溶液5mL，強(qiáng)磁力攪拌下反應(yīng)M小時(shí)，經(jīng)透析純化和冷凍干燥得到樹狀大分子表面氨基完全乙?；漠a(chǎn)物G5-FI-AC。對得到的產(chǎn)品G5-FI-AC進(jìn)行核磁表征，結(jié)果見附圖la。核磁結(jié)果表明G5_FI_Ac 樹狀大分子表面修飾了 5個(gè)FITC分子，剩余氨基被全部乙酰化。
權(quán)利要求
1.一種肝癌細(xì)胞靶向的聚酰胺胺樹狀大分子載體的制備方法，包括(1)在8-12mL含有15-25mg端基為氨基的第5代聚酰胺胺樹狀大分子G5.NH2的無水 DMSO溶液中逐滴加入5-15mL異硫氰酸熒光素FITC的DMSO溶液，室溫下攪拌M小時(shí)，然后經(jīng)透析純化，最后冷凍干燥得到G5. NH2-FI ；(2)將上述G5.NH2-FI溶解在8-13mL的DMSO溶液中，加入三乙胺混合均勻后，逐滴加入3-8mL含醋酸酐的DMSO溶液，攪拌反應(yīng)24小時(shí)，然后經(jīng)透析純化和冷凍干燥得到樹狀大分子表面氨基部分乙?；漠a(chǎn)物G5-FI-Ac-NH2 ；(3)將乳糖酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽和N-羥基琥珀酰亞胺溶解在3-8mL磷酸鹽緩沖溶液中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)2-5小時(shí)，然后滴加到上述G5-FI-Ac_NH2 的10-15mL水溶液中，室溫?cái)嚢?-5天，最后經(jīng)透析純化和冷凍干燥后得到G5-FI_AC-La。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種肝癌細(xì)胞靶向的聚酰胺胺樹狀大分子載體的制備方法， 其特征在于步驟(1)中所述的異硫氰酸熒光素FITC與樹狀大分子G5. NH2的摩爾比為 3 1 10 1。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種肝癌細(xì)胞靶向的聚酰胺胺樹狀大分子載體的制備方法， 其特征在于步驟O)中所述的醋酸酐與三乙胺的摩爾比為1 1 1 1.2。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種肝癌細(xì)胞靶向的聚酰胺胺樹狀大分子載體的制備方法， 其特征在于步驟(2)中所述的醋酸酐與樹狀大分子G5. NH2的摩爾比為80 1 100 1。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種肝癌細(xì)胞靶向的聚酰胺胺樹狀大分子載體的制備方法， 其特征在于步驟(3)中所述乳糖酸與樹狀大分子G5. NH2的摩爾比為3 1 20 1。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種肝癌細(xì)胞靶向的聚酰胺胺樹狀大分子載體的制備方法， 其特征在于步驟(3)中所述的乳糖酸與1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽的摩爾比1 3 1 10 乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽與N-羥基琥珀酰亞胺的摩爾比為2 1 1 1。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種肝癌細(xì)胞靶向的聚酰胺胺樹狀大分子載體的制備方法， 其特征在于步驟(3)中所述的磷酸鹽緩沖溶液的pH值為6. 0。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種肝癌細(xì)胞靶向的聚酰胺胺樹狀大分子載體的制備方法， 其特征在于步驟(1) C3)所述的透析為用截留分子量為10000的纖維素透析膜逐次在 PBS緩沖溶液4LX 3和超純水4LX 3中透析3天。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種肝癌細(xì)胞靶向的聚酰胺胺樹狀大分子載體的制備方法，包括(1)用異硫氰酸熒光素修飾聚酰胺胺樹狀大分子，得到G5.NH2-FI；(2)將上述G5.NH2-FI部分乙?；玫綐錉畲蠓肿颖砻姘被糠忠阴；漠a(chǎn)物G5-FI-Ac-NH2；(3)用乳糖酸修飾上述的G5-FI-Ac-NH2，得到具有肝癌細(xì)胞靶向與熒光示蹤功能的G5-FI-Ac-La。本發(fā)明的制備方法簡單，反應(yīng)條件溫和，且所用的聚合物為環(huán)境友好的高分子材料，具有產(chǎn)業(yè)化實(shí)施的前景；本發(fā)明制備的功能化樹狀大分子材料具有良好的生物相容性，并且能夠特異性地靶向結(jié)合到肝癌細(xì)胞上，可用于藥物、基因或診斷分子探針的負(fù)載與靶向輸送。
文檔編號A61K47/34GK102302782SQ20111019113
公開日2012年1月4日 申請日期2011年7月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月8日
發(fā)明者史向陽, 郭睿 申請人:東華大學(xué)