一種用于治療肝癌的藥物及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種用于治療肝癌的藥物及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]原發(fā)性肝癌，俗稱(chēng)肝癌，是世界上第五大常見(jiàn)的惡性腫瘤，其死亡率高居第三位。據(jù)美國(guó)癌癥學(xué)會(huì)報(bào)道，在2012年，美國(guó)大約有28720例新發(fā)肝癌病例和20550例肝癌死亡病例。盡管近年來(lái)全世界在肝癌治療領(lǐng)域取得了巨大的發(fā)展，但是由于耐藥性和肝癌易轉(zhuǎn)移等問(wèn)題的存在，使得目前仍然缺乏一種行之有效的方法來(lái)治療這類(lèi)疾病，因此迫切需要發(fā)展一種全新的且能夠有效殺死肝癌細(xì)胞的藥物。近年來(lái)，植物藥由于具有來(lái)源廣泛、毒性低且生物活性高等優(yōu)點(diǎn)，因而被認(rèn)為是抗癌藥物的主要天然來(lái)源。
[0003]姜黃，是姜科姜黃屬多年生草本植物，同時(shí)也是一種常用的藥食兩用的植物。姜黃中含有大量的化學(xué)植物物質(zhì)(phytochemicals)，包括姜黃素(curcumin)、去甲氧基姜黃素(demethoxycurcumin)、雙去甲氧基姜黃素(bisdemethoxycurcumin)、姜稀(zingiberene)、姜黃酸(curcumenol)、姜黃醇(curcumol)、丁香酸(eugenol)、四氫姜黃素(tetrahydrocurcumin)、三乙基姜黃素(triethylcurcumin)、姜黃酉同(turmerones)等。其中，姜黃素、去甲氧基姜黃素和雙去甲氧基姜黃素在姜黃中的含量最高，分別達(dá)到了 77%、17%和3%，構(gòu)成了姜黃素類(lèi)化合物的三種主要成分。姜黃素類(lèi)化合物除了在姜黃(Curcumalonga L.)中存在外，還主要分布在莪術(shù)(Curcuma zedoaria)、郁金(Curcuma aromatica)、閉革肖姜(Costus spec1sus)、黃紅姜黃(Curcuma xanthorrhiza)、火炬姜(Etlingeraelat1r)和卡薩蒙納姜(Zingiber cassumunar)等姜黃屬植物的根和莖中?，F(xiàn)代研究表明，姜黃素、去甲氧基姜黃素和雙去甲氧基姜黃素這三種姜黃素類(lèi)化合物具有相似的生物活性和物理性質(zhì)。藥理研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素類(lèi)化合物具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌等多種生物活性。然而其水溶性低、血藥濃度低、生物利用度低等問(wèn)題導(dǎo)致其抗腫瘤活性低，嚴(yán)重限制了其在抗腫瘤領(lǐng)域的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種用于治療肝癌的藥物。
[0005]本發(fā)明的另一目的在于提供所述用于治療肝癌的藥物的制備方法。
[0006]本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):一種用于治療肝癌的藥物，由活性組分組成或是由活性成分和載體組成；其中，活性成分為姜黃素類(lèi)化合物與右旋龍腦。
[0007]所述的姜黃素類(lèi)化合物為姜黃素、去甲氧基姜黃素和雙去甲氧基姜黃素中的至少一種。
[0008]所述的右旋龍腦的英文名為natural borneol，分子式:C1QH170H，分子量為154.24，對(duì)人體無(wú)明顯的毒副作用。
[0009]所述的右旋龍腦和所述的姜黃素類(lèi)化合物按質(zhì)量摩爾比2?8 μ g:2?Snmol配比。
[0010]優(yōu)選地，所述的右旋龍腦和所述的姜黃素按質(zhì)量摩爾比I μ g =Inmol配比；所述的右旋龍腦和所述的去甲氧基姜黃素按質(zhì)量摩爾比I yg:2nmol配比；所述的右旋龍腦和所述的雙去甲氧基姜黃素按質(zhì)量摩爾比I yg:2nmol配比。
[0011]所述的載體是用于將所述的用于治療肝癌的藥物制備成不同劑型的藥物輔料。
[0012]所述的用于治療肝癌的藥物的劑型包括緩釋片劑、顆粒劑和凝膠劑。
[0013]所述的用于治療肝癌的藥物的制備方法，包括如下步驟:按劑型不同，將右旋龍腦、姜黃素類(lèi)化合物與載體混合，按不同劑型的制備方法制備得到；對(duì)于劑型為緩釋片劑時(shí)，制備原則是先釋放右旋龍腦，再釋放姜黃素類(lèi)化合物，更為有利于姜黃素類(lèi)化合物的吸收和利用。
[0014]本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果:通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供的藥物作用肝癌細(xì)胞H印G2后能有效的誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生G2/M細(xì)胞周期阻滯導(dǎo)致細(xì)胞凋亡以及通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)活性氧ROS的過(guò)量產(chǎn)生導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因此，本發(fā)明提供的藥物能有效的治療肝癌，且右旋龍腦和姜黃素聯(lián)合用藥對(duì)人體正常細(xì)胞毒性低，基本無(wú)明顯影響。
【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1是右旋龍腦與姜黃素的不同處理方式對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響結(jié)果圖；不同字母表示統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異(P〈0.05)，相同字母表示統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒(méi)有顯著性差異。
[0016]圖2是右旋龍腦與姜黃素的不同處理方式對(duì)!fepG2細(xì)胞周期的影響結(jié)果圖。
[0017]圖3右旋龍腦與姜黃素的不同處理方式對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS變化的影響結(jié)果圖。
[0018]圖4是右旋龍腦與去甲氧基姜黃素的不同處理方式對(duì)H印G2細(xì)胞存活率的影響結(jié)果圖；不同字母表示統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異(P〈0.05)，相同字母表示統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒(méi)有顯著性差異。
[0019]圖5是右旋龍腦與去甲氧基姜黃素的不同處理方式對(duì)H印G2細(xì)胞周期的影響結(jié)果圖。
[0020]圖6是右旋龍腦與去甲氧基姜黃素的不同處理方式對(duì)IfepG2細(xì)胞內(nèi)ROS變化的影響結(jié)果圖。
[0021]圖7是右旋龍腦與雙去甲氧基姜黃素的不同處理方式對(duì)H印G2細(xì)胞存活率的影響結(jié)果圖；不同字母表示統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異(P〈0.05)，相同字母表示統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒(méi)有顯著性差異。
[0022]圖8是右旋龍腦與雙去甲氧基姜黃素的不同處理方式對(duì)H印G2細(xì)胞周期的影響結(jié)果圖。
[0023]圖9是右旋龍腦與雙去甲氧基姜黃素的不同處理方式對(duì)IfepG2細(xì)胞內(nèi)ROS變化的影響結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0024]下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0025]實(shí)施例1右旋龍腦聯(lián)合姜黃素對(duì)IfepG2細(xì)胞的影響
[0026]—、體外細(xì)胞存活率檢測(cè)
[0027](I)實(shí)驗(yàn)材料
[0028]本實(shí)驗(yàn)中所用的肝癌細(xì)胞H印G2購(gòu)自于美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(ATCC，Manassas, VA);姜黃素(Cur)，購(gòu)于Sigma公司；右旋龍腦(NB)，購(gòu)于中國(guó)藥品與生物制品檢定所；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)粉末及二甲基亞砜(DMSO)，購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；DMEM培養(yǎng)液及胰酶，購(gòu)于美國(guó)Invitrogen(Carlsbad, CA)公司。
[0029](2)實(shí)驗(yàn)方法
[0030]取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H印G2細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞傳代，調(diào)整細(xì)胞密度，以2X 104cellS/ml接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μ I ;24h后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同方式處理，對(duì)照組為不添加姜黃素和/或右旋龍腦處理，實(shí)驗(yàn)組如下:一組加入100 μ I濃度分別為20、40、80 μΜ的姜黃素處理24小時(shí)，一組加入100 μ I濃度分別為20、40、80 μ g/ml的NB處理24小時(shí)，第三組先用50 μ I濃度分別為20、40、80 μ g/ml的NB處理12小時(shí)后再加入50 μ I濃度分別為20、40、80 μ M的姜黃素繼續(xù)處理24小時(shí)；24h后，每孔加入MTT (5mg/ml) 20 μ I，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h。4h后小心吸去孔內(nèi)的上清液。之后每孔加入150 μ I DMSO溶解難溶性甲瓚，震蕩10min，570nm測(cè)吸光值。計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率=(0D實(shí)驗(yàn)-OD空自)/咖對(duì)照-OD空白)X 100%。每實(shí)驗(yàn)重復(fù)二次。
[0031](3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0032]如圖1 (圖1中的濃度表示不同處理組中NB和/或Cur在細(xì)胞中的終濃度；柱形圖上的a、b、c、d分別表示兩組之間對(duì)比統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著性分析)所示，當(dāng)先加入20 μ g/mlNB處理12h再加20 μ M Cur處理24h之后對(duì)肝癌細(xì)胞毒性最大。當(dāng)姜黃素(Cur)濃度為20 μ M時(shí)，IfepG2細(xì)胞存活率為91.87%，然而當(dāng)先加入20 μ g/ml NB處理12h再加20 μ MCur處理24h之后，其細(xì)胞存活率從91.87 %下降到54.25 %，下降了 37.62 %。表明，添加NB之后，能顯著提高姜黃素對(duì)HepG2細(xì)胞的細(xì)胞毒性。
[0033]二、流式細(xì)胞分析
[0034](I)實(shí)驗(yàn)材料
[0035]PI 染料
[0036](2)實(shí)驗(yàn)方法
[0037]取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H印G2細(xì)胞，經(jīng)胰酶(常規(guī)操作，工作液濃度為0.25%，下同)消化，計(jì)數(shù)，以2X 14個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板，置于培養(yǎng)箱中(37°C，5% CO2)培養(yǎng)24h，接著分別加入 20 μ g/ml NB 100μ1、20μΜ Cur 100 μ I 和 50 μ 120 μ g/ml ΝΒ+50 μ I 20 μMCur (NB先處理12h，再加入Cur處理24h)處理24h，再抽去培養(yǎng)基，加入ImL PBS (0.01M、PH7.2，下同)清洗細(xì)胞3遍除去細(xì)胞外的右旋龍腦和姜黃素，然后加入胰酶消化，1500rpm離心5min，收集細(xì)胞，加入_20°C預(yù)冷的70%乙醇lmL，混勾，4°C過(guò)夜固定，次日，1500rpm離心5min，去上清，用PBS洗2遍，加500 μ I 50 μ g/ml PI染液，混勻后避光靜置20min后，過(guò)300目篩，上機(jī)檢測(cè)。每個(gè)樣品至少分析10000個(gè)細(xì)胞。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
[0038](3)結(jié)果與分析
[0039]如圖2所示，相比對(duì)照組(不用NB和/或Cur處理)而言，NB組內(nèi)并沒(méi)有出現(xiàn)明顯的凋亡細(xì)胞峰，其SubG-1僅為0.6%，且G2/M期細(xì)胞數(shù)目為11.7% ；Cur組處理后凋亡細(xì)胞峰為1.8%，且62肩期細(xì)胞數(shù)目為31.3%，相比Cur組，NB+Cur組中的細(xì)胞凋亡峰并沒(méi)有顯著提高，僅為4.1 %，而G2/M期細(xì)胞從31.3%提高到44.6%，表明加入NB后，能顯著提高Cur誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的G2/M期細(xì)胞阻滯，而SubGl峰的數(shù)目并沒(méi)有顯著增加，表明NB和Cur并不是通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來(lái)抑制細(xì)胞增殖。
[0040]三、ROS活性檢測(cè)
[0041](I)實(shí)驗(yàn)材料
[0042]DHE熒光探針
[0043](2)實(shí)驗(yàn)方法
[0044]收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)期HepG2細(xì)胞，用PBS洗2次，離心去上清，加無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為10X104cells/ml，然后加入一定量的DHE使之終濃度為10μM，于37°C培養(yǎng)箱孵育 30min，每隔5min搖晃一次，到達(dá)時(shí)間后，取出細(xì)胞離心，倒掉上清液，加等量的PBS重懸，用PBS配制不同濃度的NB、Cur和NB+Cur (該組先用50 μ I NB處理，再用50 μ I Cur處理，總體積為100 μ I)，以每孔100