一種肝癌靶向的多壁碳納米管載藥復(fù)合材料及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種肝癌靶向的多壁碳納米管載藥復(fù)合材料及其制備方法，所述復(fù)合材料為阿霉素DOX和含乳糖酸修飾的多壁碳納米管CNT-PEI-FI-PEG-LA的復(fù)合物。制備：多壁碳納米管復(fù)合材料CNT-PEI-FI-PEG-LA的合成；配制兩種pH值環(huán)境下的阿霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線；將多壁碳納米管復(fù)合材料溶解于水中，加入鹽酸阿霉素水溶液，并調(diào)pH值為中堿性，攪拌4小時，透析，冷凍干燥，即得；本發(fā)明的新型載藥材料具有pH敏感型釋放及肝癌細(xì)胞靶向的特點，可以用于抗腫瘤研究，有著很好的實用價值。
【專利說明】一種肝癌靶向的多壁碳納米管載藥復(fù)合材料及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于肝癌靶向納米材料及其制備領(lǐng)域，特別涉及一種肝癌靶向的多壁碳納米管載藥復(fù)合材料及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]碳納米管大致可分為單壁碳納米管(SWCNT)和多壁碳納米管(MWCNT)。他們是單層或者多層石墨按照一定的螺旋角卷曲而形成的石墨管狀晶體，根據(jù)構(gòu)型還可分為鋸齒形(zig-zag) \扶椅式(amchair)和手性分子(chiral)。碳納米管頂端多由五邊形或者七邊形的碳環(huán)組成，碳納米管外形多樣，有圓柱形，環(huán)形，線圈形和竹節(jié)形等。碳納米管由于其獨特的性質(zhì)，在生物、化學(xué)、材料等方面都表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。但由于碳納米管存在容易積聚，難以分散的特點，對碳納米管的研究也有待進(jìn)一步摸索。作為一種新型的納米級別材料，碳納米管在生物應(yīng)用方面表現(xiàn)出了良好的潛能，由于碳納米管能夠攜帶藥物分子進(jìn)入細(xì)胞，并通過對碳納米管表明連接靶向分子，特異性地靶向目標(biāo)細(xì)胞，從而降低常規(guī)的毒副作用。因此碳納米管很可能成為未來抗腫瘤藥物的理想載體，目前在基因、藥物、蛋白載體方面已經(jīng)獲得廣泛的研究。
[0003]鹽酸阿霉素(Doxorubicin, D0X)屬蒽環(huán)類抗腫瘤抗生素是一種抑制DNA和RNA合成的抗腫瘤藥物。其作用機制主要是嵌入DNA的相鄰堿基對使DNA發(fā)生錯配，從而使DNA鏈裂解，阻礙DNA和RNA合成。阿霉素對實體瘤的有效率約達(dá)70%，主要用于治療惡性淋巴瘤、急性白血病、肺癌、乳腺癌、骨及軟組織肉瘤、頭頸部腫瘤、肝癌、食道癌、胃癌等?？沽鲎V廣，應(yīng)用廣泛，鹽酸阿霉素也有著傳統(tǒng)抗癌藥物的不良反應(yīng)，主要是消化道毒性、骨髓抑制、心臟毒性、脫發(fā)等問題，少數(shù)患者有發(fā)熱、肝功能損傷與肌紅蛋白尿、紅斑以及色素沉著。
[0004]最近的研究表明，碳納米管與阿霉素之間的結(jié)合是屬于π-π堆積的作用力的非共價鍵結(jié)合。這種結(jié)合是PH依賴性的，在酸性環(huán)境下，由于去質(zhì)子作用藥物從碳納米管表明離去，達(dá)到pH敏感釋放。無論是單壁碳納米管還是多壁碳納米管都具有大約為100-1000，最高可達(dá)10000的長徑比，其優(yōu)越的結(jié)構(gòu)條件決定了碳納米管具有良好的研究前景。
[0005]去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)又稱為肝細(xì)胞半乳糖受體，僅存在于哺乳動物的肝細(xì)胞膜上，能特異識別末端糖基為D-半乳糖或N-乙酰-D半乳糖胺的糖蛋白，是目前了解最透徹的肝細(xì)胞受體。經(jīng)過乳糖酸修飾后的碳納米管在肝癌細(xì)胞的靶向治療中具有良好的研究前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種肝癌靶向的多壁碳納米管載藥復(fù)合材料及其制備方法，該載藥方法操作簡單、反應(yīng)條件溫和，碳納米管復(fù)合載藥材料藥物裝載率高，且具有pH敏感型釋放及肝癌靶向的特性。
[0007] 本發(fā)明的一種肝癌靶向的多壁碳納米管載藥復(fù)合材料，所述復(fù)合材料為阿霉素DOX和含乳糖酸修飾的多壁碳納米管CNT-PE1-F1-PEG-LA的復(fù)合物；其中CNT-PE1-F1-PEG-LA、阿霉素 DOX 的質(zhì)量比為 1:0.5-1:2。
[0008]本發(fā)明的一種肝癌靶向的多壁碳納米管載藥復(fù)合材料的制備方法，包括:
[0009]將CNT-PE1-F1-PEG-LA溶解在水中，加入阿霉素DOX的水溶液，混合均勻，調(diào)節(jié)pH值，攪拌反應(yīng)3-4h，透析除去未連接上的D0X，冷凍干燥，得到肝癌靶向的多壁碳納米管載藥復(fù)合材料(CNT/D0X載藥復(fù)合物)。
[0010]所述調(diào)節(jié)pH值為用0.1M的氫氧化鈉溶液調(diào)pH值為5-10。
[0011]所述透析為采用透析袋，在pH = 7.4的緩沖液中透析。
[0012]所得的肝癌靶向的多壁碳納米管載藥復(fù)合材料進(jìn)行藥物釋放實驗的方法:
[0013](1)配制DOX磷酸緩沖溶液及醋酸緩沖溶液，于紫外分光光度計中檢測最大吸收值，并擬合兩種PH環(huán)境下的DOX標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0014](2)將肝癌靶向的多壁碳納米管載藥復(fù)合材料溶于磷酸緩沖溶液中，置于兩個透析袋中，然后分別將透析袋放入兩種PH值環(huán)境的溶出儀中，于不同時間點取樣，并補充緩沖液，得到藥物釋放曲線。
[0015]所述步驟(1)中磷酸緩沖溶液的pH值為7-7.5 ;醋酸緩沖溶液的pH值為5_6。
[0016]所述步驟(1)中所述DOX標(biāo)準(zhǔn)曲線DOX濃度為0.005~0.08mg/ml。
[0017]所述步驟⑵中磷酸緩沖溶液的pH值為7.4。
[0018]所述步驟⑵中兩種pH值環(huán)境分別為:pH值為7-7.4的磷酸緩沖溶液、pH值為5-6的醋酸緩沖溶液；體積均為10-15ml。
[0019]所述步驟(2)中藥物釋放所需的肝癌靶向的多壁碳納米管載藥復(fù)合材料為0.5~2mg。
[0020]將肝癌靶向的多壁碳納米管載藥復(fù)合材料(CNT/D0X載藥復(fù)合物)對兩種細(xì)胞進(jìn)行檢測，驗證其靶向性。
[0021 ] 細(xì)胞實驗CNT/D0X里DOX的濃度為0.5~4 μ M。
[0022]所述含乳糖酸修飾的多壁碳納米管CNT-PE1-F1-PEG-LA的制備方法:
[0023](I)將多壁碳納米管CNT分散在溶劑二甲基亞砜中，加入EDC活化2_3h，然后加入聚乙烯亞胺PEI的二甲基亞砜溶液，在常溫條件下反應(yīng)12-24h，透析，冷凍干燥，得到CNT-PEI ;其中多壁碳納米管與PEI的質(zhì)量比為1:1-1:2 ;CNT和EDC的質(zhì)量比為1-3:1 ；
[0024](2)將乳糖酸LA溶解在磷酸鹽緩沖液(pH值為5_6)中，加入EDC、NHS活化2_3h，加入NH2-mPEG_C00H，在常溫條件下，反應(yīng)12_24h，透析，冷凍干燥，得到PEG-LA ；
[0025](3)將上述CNT-PEI溶于水中，加入異硫氰酸熒光素FITC溶液；
[0026](4)將上述PEG-LA加入EDC、NHS活化2_3h，然后加入步驟(3)溶液，常溫條件下，反應(yīng) 12-24h,得到 CNT-PE1-F1-PEG-LA ;其中 CNT-PEI 與 PEG-LA 的摩爾比為 1:10-1:20 ；PEG-LA, EDC、NHS 的摩爾比為 1:1:1-1:10:10 ;將上述 CNT-PE1-F1-PEG-LA 中，加入三乙胺混合30min，然后加入乙酸酐，室溫條件下反應(yīng)12-24h，透析，冷凍干燥，即得含乳糖酸修飾的多壁碳納米管復(fù)合材料；CNT-PE1-F1-PEG-LA中氨基與乙酸酐的摩爾比為1:5_1:10。
[0027]有益.效果
[0028](1)本發(fā)明利用碳納米管與阿霉素之間的π-π堆積作用，合成含阿霉素的多壁碳納米管載藥復(fù)合材料，制備方法操作簡單、實驗條件溫和；[0029](2)本發(fā)明的含阿霉素的多壁碳納米管載藥復(fù)合材料藥物裝載量高，能夠長效緩釋，且具有PH敏感型輸送，在較低pH值環(huán)境下釋放率高，適合腫瘤組織的微環(huán)境，具有應(yīng)用其做后續(xù)相關(guān)實驗分析的潛力；
[0030](3)本發(fā)明中多壁碳納米管載藥復(fù)合材料中的乳糖酸可以實現(xiàn)其對肝癌細(xì)胞的主動靶向作用，并能進(jìn)一步研究其體內(nèi)循行和代謝分布。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1為實施例1所得的含阿霉素的多壁碳納米管載藥復(fù)合材料在不同pH環(huán)境下的釋放曲線；
[0032]圖2為實施例2所得的阿霉素在不同pH環(huán)境下的標(biāo)準(zhǔn)曲線；其中a為pH = 7.4的PBS緩沖溶液、b為pH = 5.8的醋酸緩沖液；
[0033]圖3為實施例3所得的不同pH條件下的DOX的上樣率和包封率；
[0034]圖4為實施例4所得的藥物及載藥復(fù)合物對SMMC-7721的MTT結(jié)果；
[0035]圖5為實施例4所得的載體對SMMC-7721的MTT結(jié)果；
[0036]圖6為實施例5所得的載藥復(fù)合物對SMMC-7721及PIEC細(xì)胞的流式細(xì)胞儀檢測
結(jié)果;
[0037]圖7為實施例6所得的載藥復(fù)合物對SMMC-7721及PIEC細(xì)胞的激光共聚焦顯微鏡檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0038]下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0039]實施例1
[0040](I)將5mg碳納米管復(fù)合材料，溶解在5ml水中，在攪拌的情況下，逐滴加入5mL含DOX (5mg)的水溶液，用0.1M的氫氧化鈉溶液調(diào)pH = 9.0，在室溫狀態(tài)下攪拌4h。最后將含阿霉素的碳納米管溶液放入透析袋(MW = 8，000~14，000)中，用透析法將未連接上的阿霉素除去，用PBS緩沖液透析3次，每次2L。最后將產(chǎn)物冷凍干燥后獲得CNT/D0X。
[0041](2)稱取 2mg 阿霉素，分別配制 0.002Μ、0.004Μ、0.008Μ、0.016Μ、0.032Μ 的 PBS 溶液(pH = 7.4)及醋酸溶液(pH = 5.8)，對阿霉素溶液進(jìn)行紫外檢測，吸收波長設(shè)為481nm，收集數(shù)據(jù)并擬合阿霉素在兩種PH條件下的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0042](3)稱取2mg載藥復(fù)合物于2ml磷酸緩沖液(pH = 7.4)中，充分溶解，放入兩個透析袋(MW = 8，000~14，000)中，并放置在溶出儀，分別補加IOml的PBS溶液(pH = 7.4)及醋酸溶液(pH = 5.8)。溶出儀溫度設(shè)為37度，轉(zhuǎn)速90轉(zhuǎn)/分，分別于211、411、611、811、1011、24h、48h、96h、120h取出Iml透析液，并回補Iml相應(yīng)的PBS緩沖溶液和醋酸緩沖溶液。對收集的透析液進(jìn)行紫外檢測，吸收波長設(shè)為481nm，收集數(shù)據(jù)并并計算藥物釋放情況。
[0043] (4) DOX在兩種pH環(huán)境下的釋放曲線如圖1所示。在120h后，DOX在pH = 5.8的緩釋液中約釋放50%。而在PBS環(huán)境中僅釋放10%，兩者釋放存在顯著差異，腫瘤組織較正常組織細(xì)胞相比其pH要低，該載藥材料的釋放正好符合這一特性。表明該載藥復(fù)合材料是一種可以用于腫瘤治療的pH敏感型材料。
[0044]實施例2
[0045](I)將10.3mg碳納米管復(fù)合材料，溶解在10.3ml水中，在攪拌的情況下，逐滴加入13mL含DOX (6mg)的水溶液，用0.1M的氫氧化鈉溶液調(diào)pH = 9.0,在室溫狀態(tài)下攪拌4h。最后將含阿霉素的碳納米管溶液放入透析袋(MW = 8，000~14，000)中，用透析法將未連接上的阿霉素除去，用PBS緩沖液透析3次，每次2L。最后將產(chǎn)物冷凍干燥后獲得CNT/D0X。
[0046](2)稱取 2mg 阿霉素，分別配制 0.0025Μ、0.005Μ、0.01Μ、0.02Μ、0.04Μ 的 PBS 溶液(pH = 7.4)及醋酸溶液(pH = 5.8)，對阿霉素溶液進(jìn)行紫外檢測，吸收波長設(shè)為481nm，收集數(shù)據(jù)并擬合阿霉素在兩種PH條件下的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0047](3)稱取4.5mg載藥復(fù)合物于4.5ml磷酸緩沖液(pH = 7.4)中，充分溶解,放入兩個透析袋(MW = 8，000~14，000)中，并放置在溶出儀，分別補加15ml的PBS溶液(pH =
7.4)及醋酸溶液(pH= 5.8)。溶出儀溫度設(shè)為37度，轉(zhuǎn)速90轉(zhuǎn)/分，分別于2h、4h、6h、8h、10h、24h、48h、96h、120h取出2ml透析液，并回補2ml相應(yīng)的PBS溶液和醋酸溶液。對收集的透析液進(jìn)行紫外檢測，吸收波長設(shè)為481nm，收集數(shù)據(jù)并計算藥物釋放情況。
[0048](4)D0X在兩種pH值環(huán)境下的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，選擇481nm處的吸光度為縱坐標(biāo)與橫坐標(biāo)(D0X濃度)制做標(biāo)準(zhǔn)曲線。當(dāng)DOX在PBS (pH = 7.5)(圖2_a)中的濃度范圍在
0.0025-0.04mg/mL時，DOX的濃度-吸光度線性相關(guān)系數(shù)為R2 = 0.99983說明其有著很好的線性關(guān)系。當(dāng)DOX在醋酸鹽緩沖液(pH = 5.8)(圖2-b)中的濃度范圍在0.0025-0.04mg/mL時，線性相關(guān)系數(shù)為R2 = 0.9995，說明該pH值下DOX的濃度-吸光度依然有著很好的線性關(guān)系。
[0049]實施例3
[0050](I)將IOmg碳納米管復(fù)合材料，溶解在IOml水中，在攪拌的情況下，逐滴加入5mL含DOX(IOmg)的水溶液，用0.1M的氫氧化鈉溶液分別調(diào)pH = 5.5、6.5、7.5、8.5和9.5，在室溫狀態(tài)下攪拌4h。最后將不同pH值下含阿霉素的碳納米管溶液放入透析袋(MW = 8，000~14，000)中，用透析法將未連接上的阿霉素除去，用PBS緩沖液透析3次，每次2L。最后將產(chǎn)物冷凍干燥后獲得CNT/D0X。
[0051](2)稱取 2mg 阿霉素，分別配制 0.001Μ、0.002Μ、0.004Μ、0.012Μ、0.036Μ 的 PBS 溶液(pH = 7.4)及醋酸溶液(pH = 5.8)，對阿霉素溶液進(jìn)行紫外檢測，吸收波長設(shè)為481nm，收集數(shù)據(jù)并擬合阿霉素在兩種PH條件下的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0052](3)各稱取0.5mg載藥復(fù)合物于Iml磷酸緩沖液(pH = 7.4)中，充分溶解，放入兩個透析袋(MW = 8，000~14，000)中，并放置在溶出儀，分別補加IOml的PBS溶液(pH =
7.4)及醋酸溶液(pH= 5.8)。溶出儀溫度設(shè)為37度，轉(zhuǎn)速90轉(zhuǎn)/分，分別于2h、4h、6h、8h、10h、24h、48h、96h、120h取出Iml透析液，并回補Iml相應(yīng)的PBS溶液和醋酸溶液。對收集的
[0053]透析液進(jìn)行紫外檢測，吸收波長設(shè)為481nm，收集數(shù)據(jù)并并計算藥物釋放情況。
[0054](4)不同pH條件下，DOX的上樣率和包封率如圖3所示。在碳納米管復(fù)合物與DOX質(zhì)量比為1:1是，上樣率恰等于包封率。PH值環(huán)境越高越有利與藥物的上載，這是由于，由于去質(zhì)子作用，堿性環(huán)境中阿霉素更容易和碳納米管產(chǎn)生J1-Ji堆積效應(yīng)。[0055]實施例4
[0056](I)在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中種入SMMC-7721細(xì)胞，每孔細(xì)胞密度大約為10，000個，并補足每孔200 μ L的培養(yǎng)液，在5% CO2,的條件下于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。
[0057](2)第二天倒掉舊培養(yǎng)基，加入含有不同濃度的CNT-PE1-F1-PEG-LA、DOX和CNT/DOX的20 μ L的PBS溶液，并補足180 μ L新鮮培養(yǎng)基，使每孔總體積仍為200 μ L。孵育24h。
[0058](3)孵育24h后，每孔加20 μ L的0.5%的MTT溶液，置37°C恒溫箱中靜止4h，吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，并添加200 μ L DMSO,置搖床上避光低速振蕩15-20min，使用酶聯(lián)免疫檢測儀570nm處各孔的紫外吸收值。
[0059](4)載藥復(fù)合物及純藥DOX對細(xì)胞的MTT分析如圖4所示。DOX濃度在0.5-4 μ M的情況下均對SMMC-7721細(xì)胞產(chǎn)生了較大的毒性。進(jìn)一步驗證復(fù)合載藥材料對細(xì)胞的殺傷作用僅與其中的DOX有關(guān)，同時對藥物載體進(jìn)行了 MTT檢測，結(jié)果如圖5所示。與載藥復(fù)合物中CNT濃度相同的載體材料均不產(chǎn)生細(xì)胞毒性，也驗證了載藥復(fù)合物對細(xì)胞的殺傷僅與其中的DOX有關(guān)。 [0060]實施例5
[0061](I)在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中種入SMMC-7721細(xì)胞，每孔細(xì)胞密度大約為200，000個，并補足每孔ImL的培養(yǎng)液,在5% CO2,的條件下于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。
[0062](2)第二天倒掉舊培養(yǎng)基，加入含4 μ MDOX的CNT/D0X的100 μ L的PBS溶液，并補足900 μ L新鮮培養(yǎng)基，孵育2h。
[0063](3)吸去含材料的培養(yǎng)液，并用PBS沖洗三次，胰酶消化，離心收集細(xì)胞,棄上清，將細(xì)胞懸浮于PBS中。用流式細(xì)胞儀檢測其中DOX的熒光變化。
[0064](4)為了對材料靶向性進(jìn)行檢測，選取非靶向細(xì)胞PIEC，操作過程與SMMC-7721相同。
[0065](5)載藥材料對兩種細(xì)胞的流式細(xì)胞儀分析，結(jié)果如圖6所示，含有去唾液酸糖蛋白受體的SMMC-7721細(xì)胞經(jīng)過復(fù)合材料的孵化后，DOX熒光強度提升(p〈0.05)，而非靶向細(xì)胞則變化不大，說明材料已經(jīng)主動識別SMMC-7721細(xì)胞。
[0066]實施例6
[0067](I)在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中放入蓋玻片，并種入SMMC-7721細(xì)胞，每孔細(xì)胞密度大約為30，000個，并補足每孔ImL的培養(yǎng)液，在5% CO2,的條件下于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。
[0068](2)第二天倒掉舊培養(yǎng)基，加入含4 μ MDOX的CNT/D0X的100 μ L的PBS溶液，并補足900 μ L新鮮培養(yǎng)基，孵育2h。
[0069](3)吸去含材料的培養(yǎng)液，并用PBS沖洗，加lml2.5%的戊二醛固定15min。
[0070](4)吸去戍二醒，并用 PBS 沖洗,加 Iml Hoescht33342 染色 15min。
[0071](5)吸去Hoescht33342，并用PBS沖洗，將蓋玻片取出，滴一滴熒光封閉劑，置于載玻片上，進(jìn)行激光共聚焦顯微鏡檢測。為了對材料靶向性進(jìn)行檢測，選取非靶向細(xì)胞PIEC，操作過程與SMMC-7721相同。
[0072](6)載藥復(fù)合物對SMMC-7721及PIEC細(xì)胞的激光共聚焦顯微鏡結(jié)果如圖7所示。可以發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過材料孵化后的SMMC-7721細(xì)胞的FITC熒光強度和DOX熒光強度均比PIEC細(xì)胞高，說明材料對肝癌細(xì)胞均有一定的靶向性。
【權(quán)利要求】
1.一種肝癌靶向的多壁碳納米管載藥復(fù)合材料，其特征在于:所述復(fù)合材料為阿霉素DOX和含乳糖酸修飾的多壁碳納米管CNT-PE1-F1-PEG-LA的復(fù)合物；其中CNT-PE1-F1-PEG-LA、阿霉素 DOX 的質(zhì)量比為 1:0.5-1:2。
2.一種如權(quán)利要求1所述的肝癌靶向的多壁碳納米管載藥復(fù)合材料的制備方法，包括:將CNT-PE1-F1-PEG-LA溶解在水中，加入阿霉素DOX的水溶液，混合均勻，調(diào)節(jié)pH值，攪拌反應(yīng)3-4h，透析，冷凍干燥，得到肝癌靶向的多壁碳納米管載藥復(fù)合材料。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種肝癌靶向的多壁碳納米管載藥復(fù)合材料的制備方法，其特征在于:所述調(diào)節(jié)pH值為用0.1M的氫氧化鈉溶液調(diào)pH值為5-10。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種肝癌靶向的多壁碳納米管載藥復(fù)合材料的制備方法，其特征在于:所述透析為 采用透析袋，在pH = 7.4的緩沖液中透析。
【文檔編號】A61K47/04GK103990143SQ201410222305
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年5月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月23日
【發(fā)明者】朱利民, 陶磊 申請人:東華大學(xué)