專利名稱：包含腦膜炎奈瑟氏球菌表面抗原NhhA的保守區(qū)域的蛋白質(zhì)的制作方法
包含腦膜炎奈瑟氏球菌表面抗原NhhA的保守區(qū)域的蛋白
質(zhì)本申請是申請?zhí)枮?1807183. X，申請日為2001年1月25日，發(fā)明名稱為“包含腦膜炎奈瑟氏球菌表面抗原NhhA的保守區(qū)域的蛋白質(zhì)”的中國專利申請的分案申請。 發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及組成修飾形式的腦膜炎奈瑟氏球菌表面抗原的新蛋白質(zhì)，涉及編碼這種新肽和多肽的核酸，及涉及這些物質(zhì)在診斷性，治療性和預(yù)防性疫苗中的應(yīng)用，及設(shè)計和 /或篩選藥物中的應(yīng)用。更特別地，通過缺失非保守的氨基酸，本發(fā)明的修飾的表面抗原在疫苗中比相應(yīng)的野生型表面抗原在對抗更廣譜腦膜炎奈瑟氏球菌菌株中更加有效。
背景技術(shù)：
腦膜炎奈瑟氏球菌是一種革蘭氏陰性菌，是導(dǎo)致腦膜炎奈瑟氏球菌性腦膜炎和敗血病的主要因素。其唯一已知的宿主是人，而且大約10%的人可以是無癥狀攜帶者 (Caugant等，1994，臨床微生物學(xué)雜志32 323)。腦膜炎奈瑟氏球菌可以表達(dá)一種多糖莢膜，使得可以根據(jù)表達(dá)的莢膜的性質(zhì)對此菌進(jìn)行分類。有至少12種腦膜炎奈瑟氏球菌血清型:A，B，C，29-E，H，I，K，L，W135，X，Y和 Z，其中血清型A，B，和C導(dǎo)致90%的腦膜炎奈瑟氏球菌性疾病(Poolman等，1995，感染性因素和疾病4 :13)?？梢垣@得直接抗血清型A和C的疫苗，但血清型B莢膜多糖在人體內(nèi)免疫原性很低，不能誘導(dǎo)保護(hù)作用。因此對其它膜和胞外成分是否適于包含于疫苗中進(jìn)行測試。例如測試1，2和3型 (膜孔蛋白；由por基因編碼)，和4型(Rmp)和5型(不透明性蛋白；由opa和opc基因編碼)的外膜蛋白。然而，目前這些候選物中無一能誘導(dǎo)完全的防護(hù)作用，尤其在兒童中(Romero等， 1994，臨床微生物學(xué)回顧，7559 ；Poolman等，1995，如前)。為產(chǎn)生一種有效的疫苗，必需鑒別出在多數(shù)菌株中存在的而且能誘導(dǎo)防護(hù)性免疫應(yīng)答的腦膜炎奈瑟氏球菌的成分(例如細(xì)菌抗體)。在這方面，參考國際出版物W099/24578，W099/36544和W099/57280，所述文獻(xiàn)均在此并入?yún)⒖迹㈥U述了一些可用于疫苗中以抗腦膜炎奈瑟氏球菌免疫的候選蛋白。在這方面，特別參考國際出版物W099/31132和Peak等，2000，F(xiàn)EMS免疫學(xué)醫(yī)學(xué)微生物學(xué)28329，所述文獻(xiàn)在此均并入?yún)⒖?，并闡述了一種分離自一些不同腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的新表面抗原，這些表面抗原及其等位基因變體在本說明書中稱為NhhA。發(fā)明概述本發(fā)明人揭示了 NhhA表面抗原具有在腦膜炎奈瑟氏球菌菌株之間可以變化的多肽區(qū)域，和其它在菌株之間是保守的區(qū)域。可變區(qū)域可以是免疫原性的，并趨于激發(fā)菌株特異性免疫應(yīng)答，這樣包含衍生自特定腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的NhhA抗原的疫苗趨于優(yōu)先對特定菌株有免疫作用。因此，本發(fā)明人探求產(chǎn)生一種修飾的NhhA多肽，其激發(fā)一種與由野生型NhhA激發(fā)的菌株特異性免疫應(yīng)答不同的免疫應(yīng)答。這種修飾的NhhA抗原用于產(chǎn)生抗腦膜炎奈瑟氏球菌的治療性和/或預(yù)防性疫苗，如下文所述。通過主要指導(dǎo)抗保守表位的免疫應(yīng)答，這種疫苗對廣譜腦膜炎奈瑟氏球菌的免疫作用應(yīng)比野生型NhhA的免疫作用更有效。本發(fā)明因此主要涉及分離具有NhhA多肽保守氨基酸的蛋白質(zhì)。因此本發(fā)明的蛋白質(zhì)與相應(yīng)野生型NhhA多肽相比，可以缺失一或多個非保守的
氨基酸。 本發(fā)明的第一方面提供了一種分離的蛋白質(zhì)，其包含NhhA多肽的12個或更多個連續(xù)的保守氨基酸的序列，所述分離的蛋白質(zhì)不包括野生型NhhA多肽。適當(dāng)?shù)?，本發(fā)明的蛋白質(zhì)能激發(fā)一種免疫應(yīng)答。優(yōu)選地，這種免疫應(yīng)答比所述相應(yīng)野生型NhhA多肽激發(fā)的免疫應(yīng)答的菌株特異性低。更優(yōu)選地，所述免疫應(yīng)答提供了抗一或多個腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的防護(hù)作用， 或者甚至更優(yōu)選地抗大多數(shù)腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的防護(hù)作用。野生型NhhA多肽序列示于

圖1 (SEQ ID NO :1_10)。共有氨基酸序列也示于圖1 (SEQ ID NO :11)。本發(fā)明分離的蛋白質(zhì)優(yōu)選包含NhhA多肽的一或多個保守區(qū)，在圖1中稱為C1，C2， C3, C4 禾口 C5 區(qū)。應(yīng)意識到根據(jù)本發(fā)明的這方面，與野生型NhhA多肽相比，NhhA多肽的一個可變區(qū)可缺失一或多個非保守氨基酸，所述可變區(qū)在圖1中稱為VI，V2，V3或V4區(qū)。優(yōu)選地，Vl區(qū)或至少其大部分是缺失的。在特定的實施方案中，分離的蛋白質(zhì)具有圖5_9(SEQ IDNO :23_27)所示任一種氨基酸序列，所述圖5-9 (SEQ ID NO :23_27)所示序列是“本發(fā)明修飾的NhhA多肽”的實例。 在圖14(SEQID NO 33-39)中，還提供了除去N末端信號序列所得的“成熟”多肽的實例。本發(fā)明的第二方面提供了一種編碼本發(fā)明第一方面的多肽的分離的核酸。野生型NhhA核酸序列示于圖2 (SEQ ID N0:12_21)。共有核酸序列也示于圖2 (SEQ ID NO 22)。優(yōu)選地，Cl，C2，C3，C4和C5區(qū)由圖2所示各個核苷酸序列編碼。優(yōu)選地，VI，V2，V3和V4區(qū)由圖2所示各個核苷酸序列編碼。在一個特殊的實施方案中，本發(fā)明分離的核酸序列具有圖5_9(SEQ ID NO :28_32) 所示任一種核苷酸序列，圖5-9 (SEQ IDNO 28-32)所示序列是“本發(fā)明修飾的nhhA核酸” 的特別實例。根據(jù)本發(fā)明的第一和第二方面，本發(fā)明還涵蓋了本發(fā)明分離的蛋白質(zhì)和核酸的同源物，片段，變體和衍生物。本發(fā)明不包括野生型NhhA多肽和nhhA核酸。本發(fā)明的第三方面提供了一種表達(dá)構(gòu)建體，其包含一種表達(dá)載體和本發(fā)明第二方面的核酸，其中所述序列與所述表達(dá)載體中的一或多個調(diào)節(jié)性核酸可操縱連接。本發(fā)明的第四方面提供了一種宿主細(xì)胞，其含有本發(fā)明第三方面的表達(dá)構(gòu)建體。本發(fā)明的第五方面提供了一種產(chǎn)生本發(fā)明第一方面的重組的分離的蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括以下步驟
(i)培養(yǎng)含有本發(fā)明第三方面的表達(dá)載體的宿主細(xì)胞，以使所述多肽在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)；(ii)分離所述重組的多肽。本發(fā)明的第六方面提供了一種抗體或抗體片段，其結(jié)合本發(fā)明的蛋白質(zhì)或其片段，變體或衍生物。

本發(fā)明的第七方面提供了一種檢測懷疑含有腦膜炎奈瑟氏球菌的生物學(xué)樣品中腦膜炎奈瑟氏球菌的方法，所述方法包括以下步驟(i)從個體中分離生物學(xué)樣品；(ii)將所述抗體或抗體片段與生物學(xué)樣品組合；(iii)檢測特異性結(jié)合的抗體或抗體片段，表示腦膜炎奈瑟氏球菌的存在情況。本發(fā)明的第八方面提供了一種檢測懷疑含有腦膜炎奈瑟氏球菌的生物學(xué)樣品中所述細(xì)菌的方法，所述方法包括以下步驟(i)從患者中分離生物學(xué)樣品；(ii)檢測所述樣品中本發(fā)明第二方面所述核酸序列，其表示所述細(xì)菌的存在情況。本發(fā)明的第九方面提供了一種診斷個體中腦膜炎奈瑟氏球菌感染的方法，所述方法包括以下步驟(i)將取自個體的生物學(xué)樣品與本發(fā)明的多肽，其片段，變體或衍生物接觸；(ii)測定在所述樣品中所述多肽，片段，變體或衍生物與腦膜炎奈瑟氏球菌特異性抗體之間的復(fù)合物存在與否，其中存在所述復(fù)合物表示存在所述感染。優(yōu)選地，個體是哺乳動物。更優(yōu)選地，個體是人。在本發(fā)明的第十方面，還涵蓋了上述本發(fā)明第一方面所述分離的蛋白質(zhì)，本發(fā)明第二方面所述的分離的核酸，或上述抗體或抗體片段在一試劑盒中用以檢測生物學(xué)樣品中的腦膜炎奈瑟氏球菌的用途。在本發(fā)明的第十一方面中，提供了一種藥物組合物，其含有本發(fā)明第一方面所述的分離的蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，所述藥物組合物是疫苗。在本發(fā)明的第十二方面中，提供了一種預(yù)防腦膜炎奈瑟氏球菌感染的方法，包括施用藥物學(xué)有效量的上述疫苗。在本發(fā)明的第十三方面中，提供了一種鑒別本發(fā)明第一方面所述的分離的蛋白質(zhì)，其變體或衍生物的免疫原性片段的方法，包括以下步驟(i)產(chǎn)生所述多肽，變體或衍生物的片段；(ii)將所述片段施用于個體；(iii)在所述個體中檢測免疫應(yīng)答，應(yīng)答包括產(chǎn)生特異性結(jié)合腦膜炎奈瑟氏球菌和/或所述多肽，變體或衍生物的因子，和/或抗腦膜炎奈瑟氏球菌感染的保護(hù)性作用。優(yōu)選地，個體是哺乳動物。更優(yōu)選地，個體是人。附圖及表簡述
表1 鑒別來自10個指定腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的NhhA多肽的保守區(qū)(Cl，C2， C3，C4和C5)和可變區(qū)(VI，V2，V3和V4)。還指明了相關(guān)的SEQ ID NOS0 1列是菌株名稱。SEQ ID NO 1-9是先前在W099/31132中所述的；菌株Z2491的NhhA和nhhA序列得自 http //www, sanger. ac. uk/Pro iects/Nmeningitidis/ ；2 列是 Cl 區(qū)氨基酸編號；3 列是 Vl 區(qū)氨基酸編號；4列是C2區(qū)氨基酸編號；5列是V2區(qū)氨基酸編號；6列是C3區(qū)氨基酸編號； 7列是V2區(qū)氨基酸編號；8列是C4區(qū)氨基酸編號；9列是V4區(qū)氨基酸編號；10列是C5區(qū)氨基酸編號。注意還示出了共有序列(SEQ ID NO=Il)的氨基酸編號。

表2:氨基酸取代表。圖1 10個腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的NhhA氨基酸序列(SEQ IDNO :1_10)及共有序列(SEQ ID NO=Il)的氨基酸序列對比。在此序列對比中使用的菌株名稱和多肽序列相當(dāng)于表1中1列所示菌株名稱和SEQ ID NOS0氨基酸以標(biāo)準(zhǔn)單字母縮寫表示。共有氨基酸只是在殘基是完全保守的位置示出。在共有序列之下標(biāo)明了保守區(qū)(雙下劃線的，以C1，C2， C3，C4，C5標(biāo)示)和可變區(qū)(單下劃線的，以VI，V2, V3, V4標(biāo)示)。圖2 來自10個腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的nhhA核酸的核苷酸序列對比，所述序列編碼圖1所示氨基酸序列。Cl，C2，C3，C4，C5區(qū)和VI，V2, V3, V4區(qū)如圖1和表1所述。圖3 相當(dāng)于pC014K的質(zhì)粒圖譜，該質(zhì)粒具有可操縱地連于porA啟動子的編碼野生型PMC2INhhA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(數(shù)據(jù)未示出)。(未繪出刻度)3A 實心箭頭表示pC014K 中porA和kanR基因的序列對比。示出了用于擴(kuò)增PMC21菌株的nhhA基因的寡核苷酸引物H0MP5’和H0MP3’ AN。NhhA基因是用帶點(diǎn)的箭頭表示的，porA啟動子用黑方框表示，示出了如實施例2所述用于用nhhA置換porA的EagI和NcoI限制位點(diǎn)。3B :pIP52 (PMC21) 中基因的序列排列，如實施例2所述。BglII位點(diǎn)用于構(gòu)建實施例4中所述的突變體。圖4 缺失NhhA多肽的特異區(qū)域的剪接重疊延伸PCR策略圖式。野生型nhhA基因的圖式示于圖4A-C的上部，重組nhhA的圖式在這些圖的下部，可變區(qū)用黑色表示，保守區(qū)用未填充的方框表示。箭頭表示寡核苷酸引物的大致位置。垂直陰影線表示擴(kuò)增產(chǎn)物。 來自nhhA核酸的非連續(xù)區(qū)域的寡核苷酸序列在此非連續(xù)區(qū)域之間用點(diǎn)線表示。表示的是大致的數(shù)值范圍。雙垂直線只是表示C5區(qū)的一部分。A 示出實施例6所述的策略。B:示出實施例7所述的策略。C:示出實施例8所示策略。圖5 (A)實施例4中產(chǎn)生的PMC21 NhhA缺失突變體多肽(SEQ ID NO 23)的氨基酸序列；(B)編碼核苷酸序列(SEQ IDNO 28)。圖6 (A)實施例5中產(chǎn)生的H41 NhhA缺失突變體多肽(SEQID NO 24)的氨基酸序列；(B)編碼核苷酸序列(SEQ ID NO 29)。圖7 (A)實施例6中通過剪接重疊PCR產(chǎn)生的PMC21 NhhA缺失突變體多肽(SEQ ID NO 25)的氨基酸序列；(B)編碼核苷酸序列(SEQ ID NO 30)。圖8 (A)實施例7中通過剪接重疊PCR產(chǎn)生的PMC21 NhhA缺失突變體多肽(SEQ ID NO 26)的氨基酸序列；(B)編碼核苷酸序列(SEQ ID NO 31)。圖9 (A)實施例8中通過剪接重疊PCR產(chǎn)生的PMC21 NhhA缺失突變體多肽(SEQ ID NO 27)的氨基酸序列；(B)編碼核苷酸序列(SEQ ID NO 32)。圖10 野生型和NhhA缺失突變體多肽序列的氨基酸序列對比。這些多肽是如實施例2，3，4和5所述產(chǎn)生的。氨基酸用單字母縮寫表示。相當(dāng)于表1和圖1所示區(qū)域的標(biāo)示為Cl，C2，C3，C4和C5的保守區(qū)，在H41和PMC21的全長序列中用雙下劃線表示，相當(dāng)于表1和圖1所示區(qū)域的標(biāo)示為VI，V2，V3，V4的可變區(qū)在H41和PMC21的全長序列中用單下劃線表示。

圖11 示出NhhA過表達(dá)的Western免疫印跡。將45ug總細(xì)胞蛋白在4-20%梯度的SDS-PAGE (SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳)上分離，之后移至硝基纖維素濾膜上，進(jìn)行Western 免疫印跡，如實施例9所述。泳道1 示出野生型NhhA表達(dá)水平的親代菌株。泳道2:菌株 P6 (如實施例2所述過表達(dá)PMC21 NhhA)。泳道3 菌株P(guān) Δ 6 (如實施例4所述過表達(dá)截短的 PMC21 NhhA)。泳道4 菌株Η14 (如實施例3所述過表達(dá)Η41 NhhA)。泳道5 菌株H Δ 8 (如實施例5所述過表達(dá)截短的Η41 NhhA)。泳道6 菌株2Α(如國際出版物W099/31132所述通過突變nhhA基因廢止NhhA表達(dá))。分子量標(biāo)準(zhǔn)遷移示為185kDa，119kDa，85kDa，62kDa， 51. 2kDa, 38. 2kDa, 22. 4kDa。野生型NhhA多肽在泳道1中以高分子量免疫反應(yīng)條帶呈現(xiàn)， 但在泳道6中不存在。圖12 分離的NhhA缺失突變體多肽。NhhA多肽是如實施例9所述分離的，之后在 4-20% SDS-PAGE上分離。此聚丙烯酰胺凝膠是用考馬斯藍(lán)染色的。泳道1 如實施例6所述過表達(dá)截短的PMC21 NhhA多肽的菌株的OMC制品。泳道2 純化的截短的PMC21 NhhA多肽。泳道3 如實施例4所述過表達(dá)截短的PMC21NhhA多肽的菌株的OMC制品。泳道4 純化的截短的PMC21 NhhA多肽。泳道5 如實施例2所述過表達(dá)PMC21 NhhA多肽的菌株的 OMC制品。泳道6 純化的PMC21 NhhA多肽。泳道7 分子量標(biāo)準(zhǔn)，173kDa, IllkDa, 80kDa, 61kDa，49kDa，36kDa。注意在除了 6泳道之外的所有泳道中的反應(yīng)性高分子量種類可能代表NhhA多肽的多聚體。其它條帶可能是穩(wěn)定性略差形式的NhhA或破壞產(chǎn)物。注意這些物質(zhì)在泳道6中不存在。圖13 使用抗NhhA蛋白小鼠血清進(jìn)行Western免疫印跡。在所有的實驗組中，泳道1，3，5，7含有過表達(dá)PMC21 NhhA多肽的菌株的0MC，泳道2，4，6，8含有不表達(dá)NhhA的菌株2A的OMC。A組泳道1和2 用野生型PMC21 NhhA以1 1000稀釋度接種小鼠A。 泳道3和4 用野生型PMC21 NhhA以1 10000稀釋度接種小鼠A。泳道5和6 用野生型 PMC21 NhhA L^l 1 1000 接種小鼠 B。泳道 7 和 8 用野生型 PMC21 NhhA L^l 1 10000 接種小鼠B。B組泳道1和2 用截短的PMC21 NhhA多肽(實施例4)以1 1000稀釋度接種小鼠C。泳道3和4 用截短的PMC21 NhhA多肽(實施例4)以1 10000稀釋度接種小鼠C。泳道5和6 用截短的PMC21NhhA多肽(實施例4)以1 1000稀釋度接種小鼠D。 泳道7和8 用截短的PMC21 NhhA多肽(實施例4)以1 1000稀釋度接種小鼠D。C組 泳道1和2 用截短的PMC21 NhhA多肽(實施例6)以1 1000稀釋度接種小鼠E。泳道 3和4 用截短的PMC21 NhhA多肽(實施例6)以1 10000稀釋度接種小鼠E。泳道5和 6 用截短的PMC21 NhhA多肽(實施例6)以1 1000稀釋度接種小鼠F。泳道7和8 用截短的PMC21 NhhA多肽(實施例6)以1 1000稀釋度接種小鼠F。圖14 推定的成熟NhhA多肽缺失突變體。A 實施例2中所述推定的成熟蛋白質(zhì) (SEQ ID NO 33) ；B 實施例3中所述推定的成熟蛋白質(zhì)(SEQ ID NO 34) ；C 實施例4中所述推定的成熟蛋白質(zhì)(SEQ ID NO 35) ；D 實施例5中所述推定的成熟蛋白質(zhì)(SEQID NO 36) ；Ε.實施例6中所述推定的成熟蛋白質(zhì)(SEQ ID NO 37) ；F 實施例7中所述推定的成熟蛋白質(zhì)(SEQ ID NO 38)；和G 實施例8中所述推定的成熟蛋白質(zhì)(SEQ ID NO 39)。
發(fā)明詳述在本說明書中，除非特別說明，術(shù)語“包含”意味著含有一定的整體或整體組，但不除外任何其它整體或整體組。

就術(shù)語而言，NhhA在此是指本發(fā)明的蛋白質(zhì)，nhhA是指本發(fā)明的核酸。還應(yīng)意識到NhhA/nhhA蛋白質(zhì)和核酸例如但非限制性包括W099/31132中所述的HiaNm/hianm蛋白質(zhì)和核酸。本發(fā)明通過闡明10個腦膜炎奈瑟氏球菌菌株中NhhA多肽中保守的和低保守的區(qū)域加以論述，至少部分論述。相應(yīng)區(qū)域推斷為在例證的NhhA多肽的其它等位基因變體中是保守的。應(yīng)意識到本發(fā)明的關(guān)鍵是通過缺失野生型NhhA多肽中非保守的氨基酸，形成本發(fā)明的一種修飾的NhhA多肽，基于免疫接種所述本發(fā)明多肽可以激發(fā)一種免疫應(yīng)答，通過指導(dǎo)抗保守表位的免疫應(yīng)答提供對一或多種異源腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的保護(hù)作用。本文所用術(shù)語“非保守的，，氨基酸是指在來自第一個腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的野生型NhhA多肽中存在的，但在一或多個其它菌株的野生型NhhA多肽不存在的氨基酸殘基。適當(dāng)?shù)?，本發(fā)明第一方面的多肽與相應(yīng)的野生型序列相比，缺失VI，V2，V3，或V4 區(qū)之一的至少一部分，并因此可以統(tǒng)稱為“缺失突變體”。應(yīng)意識到本發(fā)明人已經(jīng)鑒別了 ￥1^2八3，或￥4區(qū)是野生型NhhA多肽中具有與相對保守的C1-5區(qū)域相比相對高頻率的非保守的氨基酸的區(qū)域。在V區(qū)域中，Vl (高變的)和V2區(qū)具有最高頻率的非保守氨基酸，而V3和V4具有相對較低的頻率。然而，Vl區(qū)與V2區(qū)相比組成了野生型NhhA多肽更重要的部分(就總氨基酸而言)。因此，優(yōu)選本發(fā)明第一方面的分離的蛋白質(zhì)至少缺失Vl區(qū)的基本部分。技術(shù)人員還應(yīng)意識到在構(gòu)建所述缺失突變體時，在不同的腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的NhhA多肽之間的區(qū)域“改組”是可能的。例如，本發(fā)明的一個NhhA多肽可以含有一個 H41C1區(qū)域和一個PMC21 C5區(qū)域。這種“改組”特別適于重組DNA方法。在本發(fā)明中，術(shù)語“分離的”是指從其天然狀態(tài)中分離的物質(zhì)，或進(jìn)行人工操作的其它物質(zhì)。分離的物質(zhì)可以是基本或根本沒有天然狀態(tài)時通常伴隨它的成分，或可以是人工操作成為具有在其天然狀態(tài)中通常伴隨其的成分的人工狀態(tài)。分離的物質(zhì)可以是天然或
重組形式。術(shù)語“蛋白質(zhì)”是指氨基酸聚合物。氨基酸可以是本領(lǐng)域熟知的天然的或非天然
的氨基酸。術(shù)語“肽”是指具有不超過50個氨基酸的蛋白質(zhì)。多肽是指具有50個或更多個氨基酸的蛋白質(zhì)。本文所用短語“激發(fā)免疫應(yīng)答”是指本發(fā)明分離的多肽在施用其的哺乳動物體內(nèi)產(chǎn)生免疫應(yīng)答的的能力，其中應(yīng)答是針對腦膜炎奈瑟氏球菌和/或所述多肽的。優(yōu)選地，免疫應(yīng)答包括產(chǎn)生細(xì)菌抗體。更優(yōu)選地，免疫應(yīng)答是抗腦膜炎奈瑟氏球菌感染的保護(hù)性應(yīng)答。文中關(guān)于免疫應(yīng)答所用術(shù)語“菌株特異性”是指或至少主要是指自體的腦膜炎奈瑟氏球菌菌株。本文所用術(shù)語“交叉反應(yīng)”是指本發(fā)明的多肽激發(fā)針對一或多個異源腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的免疫應(yīng)答的能力。本文所用術(shù)語“交叉防護(hù)性”是指本發(fā)明的多肽激發(fā)免疫應(yīng)答，并從而提供對抗一或多個異源腦膜炎奈瑟氏球菌菌株感染的防護(hù)能力。因此，前述本發(fā)明多肽在此可以稱為“免疫原”或“免疫原性的”。盡管為本發(fā)明之目的，所述修飾的NhhA蛋白質(zhì)已經(jīng)通過圖5_9(SEQ ID NO: 23-27)和圖14所示氨基酸序列例證，但本發(fā)明還涵蓋了例證的蛋白質(zhì)的片段，衍生物和變體(如等位基因變體)。例如，圖1所示任何C1-5序列均可以缺失氨基酸，而V1-4區(qū)中不是所有的非保守氨基酸均需要缺失以降低菌株特異性免疫原性。

因此，本發(fā)明分離的蛋白質(zhì)可以包括C1-5和V1-4區(qū)的片段。事實上，如后文實施例中所述，利用常規(guī)限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，和達(dá)到高水平表達(dá)穩(wěn)定的免疫原性蛋白質(zhì)，缺失Cl，C2, C3, C4和/或C5區(qū)，或VI，V2，V3和/或V4區(qū)中的一或幾個氨基酸，對基于重組DNA產(chǎn)生本發(fā)明的多肽是有利的。在一個實施方案中，“片段”包括一種氨基酸序列，其組成少于100 %，但至少20 %， 優(yōu)選至少50%，更優(yōu)選至少80%，或者甚至至少90%的所述Cl，C2，C3，C4或C5區(qū)域。片段例如可以是這樣的肽，其包含少至12個氨基酸如C2區(qū)(SEQ ID NO :11)，或包含至少20個連續(xù)氨基酸的序列，或包含相當(dāng)于一些或所有所述Cl，C2，C3，C4和/或C5 區(qū)的100個以上連續(xù)氨基酸的序列。本文例證的其它片段是修飾的本發(fā)明的NhhA多肽，其經(jīng)過翻譯后加工形成成熟多肽，如圖14所示。在另一個實施方案中，“片段”是一種小肽，例如其長度為至少6個，優(yōu)選至少10 個，更優(yōu)選至少20個氨基酸，其包含一或多個抗原性決定簇或衍生自修飾的本發(fā)明的NhhA 蛋白的表位。也涵蓋包含一個以上肽的較大片段，并可以通過應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)重組核酸方法獲得或使用常規(guī)液相或固相合成方法合成。例如，可以參考例如由Atherton和Sh印hard 所著“肽合成”第9章中所述的液相或固相合成方法，所述文獻(xiàn)包含于由Blackwell科學(xué)出版社出版的Nicholson編輯的“合成疫苗”中?；蛘撸梢酝ㄟ^用蛋白酶如endoLys-C， endoArg-C, endoGlu-C和葡萄球菌毒素V8-蛋白酶消化本發(fā)明的多肽而產(chǎn)生所述肽。消化的片段可以通過例如高壓液相色譜(HPLC)技術(shù)純化。本文使用術(shù)語“變體”多肽是本發(fā)明的多肽，其中一或多個氨基酸已經(jīng)用不同的氨基酸置換。本領(lǐng)域熟知可以將一些氨基酸改變?yōu)榫哂邢嗨菩再|(zhì)的其它氨基酸，而不改變多肽的活性性質(zhì)(保守取代)?？梢栽诙嚯闹羞M(jìn)行表2所示保守取代。通過選擇比表2所示保守性低的取代而實質(zhì)上改變功能。其它置換可以是非保守性取代，這些置換相對較少的可以耐受。通常地，使多肽性質(zhì)可能產(chǎn)生最大變化的取代是其中(a)親水性殘基(例如Ser或Thr)取代或被疏水性殘基(例如Ala，Leu, lie, Phe或 Val)取代；(b)半胱氨酸或脯氨酸取代或被任何其它氨基酸取代；(c)具有正電側(cè)鏈的殘基 (例如Arg，His或Lys)取代或被負(fù)電殘基(例如Glu或Asp)取代；(d)具有大側(cè)鏈的殘基(例如Phe或Trp)取代或被具有較短側(cè)鏈的殘基(例如Ala，Ser)或無側(cè)鏈的殘基(如 Gly)取代。術(shù)語“變體”還包括產(chǎn)生自本說明書中例證的序列的等位基因變體的NhhA多肽。
NhhA多肽變體可包含在術(shù)語“多肽同源物”的范圍內(nèi)。多肽同源物與所述本發(fā)明修飾的NhhA多肽的氨基酸序列呈現(xiàn)至少70%，優(yōu)選至少80 %，更優(yōu)選至少90 %的序列相同性。

本文經(jīng)常使用的術(shù)語“同源物”與本發(fā)明的核酸或多肽具有一確定的核苷酸或氨基酸序列關(guān)系。例如，預(yù)期這種同源物具有不同于那些例證的氨基酸的序列，但其是免疫原性的并提供交叉保護(hù)性免疫。術(shù)語“同源物”特別不包括的是野生型NhhA多肽和nhhA核酸。包含在同源物范圍內(nèi)的是“直向同源物”，其是分離自除了腦膜炎奈瑟氏球菌之外其它細(xì)菌菌種的功能相關(guān)多肽及其編碼核酸。用于闡述各個核酸和多肽之間序列關(guān)系的術(shù)語包括“對比窗”，“序列相同性”，“序列相同性百分率”和“基本相同性”。因為各個核酸/多肽均可包含(1)只是核酸/多肽共有的完整核酸/多肽序列的一或多個部分，和(2)在核酸/多肽之間不同的一或多個部分， 序列對比典型地通過在“對比窗”上對比序列，以鑒別和對比序列局部區(qū)域的相似性。“對比窗”是指與參比序列相比典型的12個連續(xù)殘基的理論片段。對比窗與參比序列(其沒有添加或缺失)相比可以包含大約20%或更少的添加或缺失(即缺口)，以最佳對比各個序列。 對比窗的序列的最佳序列對比可以通過計算機(jī)執(zhí)行程序(IntelIigenetics的Geneworks 程序；Wisconsin Genetics Software Package Release 7. 0 的 GAP，BESTFIT，F(xiàn)ASTA 禾口 TFASTA, Genetics Computer Group, 575Science Drive Madison，WI，USA，在此并入?yún)⒖? 或通過任選的方法產(chǎn)生的檢測方法和最佳序列對比方法(即在對比窗上獲得最高同源百分率)進(jìn)行。也可以參考例如由Altschul等，1997，核酸研究253389所述的BLAST程序， 在此并入?yún)⒖肌ｊP(guān)于序列分析的詳細(xì)論述可見于分子生物學(xué)最新方法，第19. 3章，Ausubel編輯 (John ffiley&Sons Inc NY，1995-1999)。術(shù)語“序列相同性”的最廣泛的含義包括就使用標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行適當(dāng)序列對比而言精確的核苷酸或氨基酸匹配數(shù)目，就程度而言序列在對比窗上是相同的。因此，計算“序列相同性百分率”是通過在對比窗上對比兩個最佳排列的序列，測定在兩個序列中出現(xiàn)相同核酸堿基(例如A，T，C，G，I)的位置數(shù)，產(chǎn)生匹配位置的數(shù)，將匹配位置數(shù)與對比窗中總位置數(shù)(即窗口大小)相除，將結(jié)果乘100，產(chǎn)生序列相同性百分率。例如，“序列相同性“可以理解為是指通過DNASIS計算機(jī)程序(Windows Version 2. 5 ；得自日立軟件工程公司， South San Francisco，California，美國)計算的“匹配百分率”。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員能通過重組DNA技術(shù)制備本發(fā)明多肽的同源物，如前述變體。例如，本發(fā)明的核酸可以使用隨機(jī)誘變例如使用轉(zhuǎn)座子誘變，或位點(diǎn)直接誘變加以突變。然后將所得DNA片段使用常規(guī)方法克隆入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)宿主中，如大腸桿菌中，并檢測保留所需活性的克隆。在已經(jīng)用隨機(jī)誘變方法產(chǎn)生克隆后，對陽性克隆進(jìn)行測序以檢測突變情況。本文所用術(shù)語“衍生的”多肽是已經(jīng)改變的本發(fā)明多肽，例如通過本領(lǐng)域已知的綴合或復(fù)合其它化學(xué)組分，或通過翻譯后修飾方法改變。這種衍生物包括在本發(fā)明的NhhA多肽或其變體中缺失和/或添加氨基酸，或它的變體，其中所述衍生物激發(fā)一種免疫應(yīng)答。
“添加”氨基酸可以包括將多肽或其變體融合其它多肽或蛋白質(zhì)。在這方面應(yīng)意識到本發(fā)明的多肽或變體可以摻入較大的多肽中，而且這種較大的多肽也可以期望是免疫原性的。上述多肽可以融合于另外的蛋白質(zhì)中，例如不是衍生于腦膜炎奈瑟氏球菌的蛋白質(zhì)中。另外的蛋白質(zhì)例如可有助于蛋白質(zhì)的純化。例如可以使用一種聚組氨酸標(biāo)簽，或一種麥芽糖結(jié)合蛋白?；蛘?，其可以產(chǎn)生一種有效抗腦膜炎奈瑟氏球菌的免疫應(yīng) 答，或產(chǎn)生一種抗其它病原體的免疫應(yīng)答。其它可能的融合蛋白是那些產(chǎn)生免疫調(diào)制應(yīng)答的蛋白質(zhì)。這種蛋白質(zhì)例如包括A蛋白或谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)。另外，多肽可以融合于一種基于寡糖的疫苗成分，其中其作為載體蛋白。本發(fā)明涵蓋的其它衍生物包括但非限于在肽，多肽或蛋白質(zhì)合成期間修飾側(cè)鏈， 摻入非天然的氨基酸和/或其衍生物，及使用交聯(lián)劑及對本發(fā)明的多肽，片段和變體施加構(gòu)象約束影響的其它方法產(chǎn)生的衍生物。本發(fā)明涵蓋的側(cè)鏈修飾例如包括修飾氨基基團(tuán)如用乙酸酐進(jìn)行?；?，用琥珀酸酐和四氫鄰苯二甲酸酐對氨基基團(tuán)進(jìn)行酰化；用甲基亞氨逐乙酸酯進(jìn)行酰胺化；用氰酸鹽對氨基進(jìn)行甲氨?；?；用吡哆醛5磷酸對賴氨酸進(jìn)行吡哆酸化(pyridoxylation)，隨后用NaBH4還原；與醛反應(yīng)進(jìn)行還原烷化，隨后用NaBH4還原；及用 2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)對氨基進(jìn)行三硝基苯化。羧基團(tuán)可以通過活化碳二亞胺而修飾，通過形成0-酰基異脲隨后衍生化為例如相應(yīng)的酰胺。精氨酸殘基的鳥嘌呤基團(tuán)可以通過與如2，3_ 丁二酮，苯甲酰甲醛和乙二醛形成雜環(huán)縮合產(chǎn)物而修飾。巰基團(tuán)可以通過以下方法修飾，如過甲酸氧化為半胱磺酸；使用4-氯汞苯磺酸， 4_氯汞安息香酸，2-氯汞-4-硝基苯酚，苯汞氯和其它汞劑形成汞衍生物；與其它硫醇化合物形成混合的二硫化物；與馬來酰亞胺，馬來酸酐或其它代替的馬來酰亞胺反應(yīng)；用碘乙酸或碘乙酰胺進(jìn)行羧甲基化；及用氰酸鹽在堿性pH下甲氨?；?。色氨酸殘基可以例如通過用2-羥-5-硝基苯溴化物或磺?；袒锿榛胚岘h(huán)， 或通過用N-溴代琥珀酸二酰亞胺氧化而修飾。酪氨酸殘基可以通過用四硝基甲烷硝化形成3-硝基酪氨酸衍生物而修飾。組氨酸殘基的咪唑環(huán)可以通過用焦碳酸二乙酯進(jìn)行N-乙酯基化或用吲哚乙酸衍生物烷化而修飾。在肽合成期間摻入的非天然氨基酸及其衍生物包括但非限于使用4-氨基丁酸， 6-氨基己酸，4-氨基-3-羥基-5-苯戊酸，4-氨基-3-羥基-6甲基庚酸，t_ 丁基甘氨酸， 正亮氨酸，正纈氨酸，苯基甘氨酸，鳥氨酸，肌氨酸，2-噻吩丙氨酸和/或氨基酸的D-異構(gòu)體。本發(fā)明還涵蓋了用二硝基苯酚共價修飾本發(fā)明的多肽，片段或變體，以使其在人體內(nèi)是免疫原性的。本發(fā)明分離的蛋白質(zhì)(包括其片段，變體，衍生物和同源物)可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何適當(dāng)?shù)姆椒ㄖ苽?。例如，蛋白質(zhì)可以通過包括以下步驟的方法作為重組多肽制備。(i)制備一種表達(dá)構(gòu)建體，其包含一種本發(fā)明的修飾的nhhA核酸，所述核酸可操縱地連于一或多個調(diào)節(jié)性核苷酸序列；
(ii)用此表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化一種適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞；(iii)在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)此重組的多肽。在后文提供了一些實施例，具體闡述了通過PCR產(chǎn)生本發(fā)明的修飾的nhhA核酸。在一個特殊的實施方案中，PCR是一種剪接重疊PCR，對此在后文加以闡述，這種方法是基于Ho等，1989，基因7751所述的方法，和Horton等，1989，基因7761所述方法，這兩種方法均并入?yún)⒖肌ａ槍λ拗骷?xì)胞表達(dá)，重組的核酸是可操縱地連于表達(dá)載體中的一或多個調(diào)節(jié)序列?！氨磉_(dá)載體”可以是自身復(fù)制的染色體外載體如質(zhì)粒，或者是整合入宿主基因組的載體?！翱刹倏v地連接”是指所述調(diào)節(jié)核苷酸序列是根據(jù)本發(fā)明的重組核酸而定位以起始，調(diào)節(jié)或另外控制轉(zhuǎn)錄。調(diào)節(jié)性核苷酸序列一般是適于用于表達(dá)的宿主細(xì)胞的。本領(lǐng)域已知多種適于多種宿主細(xì)胞的適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體和適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列。典型地，所述一或多個調(diào)節(jié)核苷酸序列可以包括但非限于啟動子序列，前導(dǎo)或信號序列，核糖體結(jié)合位點(diǎn)，轉(zhuǎn)錄起始和終止序列，翻譯起始和終止序列，及增強(qiáng)子或激活子序列。本發(fā)明還涵蓋了本領(lǐng)域已知的組成型或可誘導(dǎo)型啟動子。啟動子可以是天然發(fā)生的啟動子，或是組合一個以上啟動子的雜合啟動子。在一個優(yōu)選的實施方案中，表達(dá)載體含有一個可選擇標(biāo)記基因，以選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞?？蛇x擇標(biāo)記基因是本領(lǐng)域熟知的，并根據(jù)所用的宿主細(xì)胞而變化。在一個實施方案中，表達(dá)載體是pC014K，其具有一個porA啟動子和卡那霉素選擇基因，在后文對其加以闡述。根據(jù)這個實施方案，宿主細(xì)胞是選自大腸桿菌和腦膜炎奈瑟氏球菌的細(xì)菌。表達(dá)載體還可以包括一個融合配偶體(典型地是由表達(dá)載體提供的)，以便本發(fā)明的重組多肽表達(dá)為具有所述融合配偶體的融合多肽。融合配偶體的主要優(yōu)點(diǎn)是其有助于鑒別和/或純化所述融合多肽。為表達(dá)所述融合多肽，必需將本發(fā)明的核苷酸序列連接入表達(dá)載體中，以使融合配偶體的翻譯讀碼框與本發(fā)明的核苷酸序列一致。熟知的融合配偶體例如包括但非限于谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)，人IgG的Fc 部分，麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)和6組氨酸(HIS6)，它們特別用于通過親和層析分離融合多肽。針對通過親和層析純化融合蛋白，親和層析的有關(guān)基質(zhì)分別是谷胱甘肽_，直鏈淀粉_， 鎳-或鈷-綴合的樹脂。許多這種基質(zhì)可以“試劑盒”形式獲得，如用于(HIS6)融合配偶體使用的 QIAexpressTM 系統(tǒng) ^liagen)及 Pharmacia GST 純化系統(tǒng)。一種優(yōu)選的配偶體是MBP，對此在實施例11中加以闡述。本領(lǐng)域熟知的另一種融合配偶體是綠色熒光蛋白(GFP)。這種融合配偶體作為熒光“標(biāo)記”，這樣可以通過熒光顯微鏡或流式細(xì)胞計量術(shù)鑒別本發(fā)明的融合多肽。當(dāng)評估本發(fā)明融合多肽的細(xì)胞定位時，或分離表達(dá)本發(fā)明融合多肽的細(xì)胞時，GFP標(biāo)記是有用的。流式細(xì)胞計量術(shù)如熒光激活細(xì)胞分選(FACS)特別用于后一情況中。
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優(yōu)選地，融合配偶體還具有蛋白酶裂解位點(diǎn)，如Xa因子或凝血酶，這使相關(guān)的蛋白酶部分消化本發(fā)明的融合多肽，并從而從中釋放本發(fā)明的重組多肽。然后可以將釋放的多肽通過隨后的層析分離從融合配偶體中分離。本發(fā)明的融合配偶體的范圍內(nèi)還包括“附加表位”，其通常是短肽序列，可以獲得其特異性抗體。熟知的可以用于獲得特異性單克隆抗體的附加表位例如包括c-myc，流感病毒血凝素和FLAG標(biāo)記。如上所述，本發(fā)明的多肽可以通過培養(yǎng)一種宿主細(xì)胞而產(chǎn)生，所述宿主細(xì)胞是用包含編碼本發(fā)明多肽或多肽同源物的核酸的所述表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的。適于蛋白質(zhì)表達(dá)的條件根據(jù)所選擇的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞而變化。這可易于由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過常規(guī)實驗確定。進(jìn)行表達(dá)的適當(dāng)宿主細(xì)胞可以是原核或真核細(xì)胞。表達(dá)本發(fā)明多肽的一種優(yōu)選的宿主細(xì)胞是細(xì)菌。所用的細(xì)菌可以是大腸桿菌或腦膜炎奈瑟氏球菌。在一個優(yōu)選的實施方案中，宿主細(xì)胞是腦膜炎奈瑟氏球菌，對其已經(jīng)加以修飾以不表達(dá)PorA，Opa, Opc或莢膜多糖，但表達(dá)一種所需的脂多糖表型?；蛘?，宿主細(xì)胞可以是昆蟲細(xì)胞如SF9細(xì)胞，其可以與桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)一起使用。重組的蛋白質(zhì)可以常規(guī)地由本領(lǐng)域技術(shù)人員通過標(biāo)準(zhǔn)方法制備，例如Sambrook 等，分子克隆實驗手冊(冷泉港實驗室出版社，1989)，尤其是第16和17章；分子生物學(xué)通用方法，Ausubel等編輯(John Wiley&Sons，1995-1999)，尤其是第10和16章；及蛋白質(zhì)科學(xué)通用方法，Colign等編輯(John Wiley&Sons，1995-1999)，尤其是第1，5和6章。在此均并入?yún)⒖?。表達(dá)本發(fā)明的重組修飾的NhhA蛋白的優(yōu)選方法，檢測表達(dá)的蛋白質(zhì)的方法在后文的實施例中加以闡述。核酸序列本發(fā)明提供了一種分離的核酸，其編碼一種本發(fā)明中的修飾的NhhA蛋白。優(yōu)選地，所述分離的核酸具有這樣的核苷酸序列，其編碼如圖1和2中所示的一或多個NhhA多肽的恒定區(qū)(C區(qū))。此分離的核酸還可編碼如在圖1和2中鑒別的一或多個非保守氨基酸(V區(qū))，。這種分離核酸的特殊實施方案示于SEQ ID NO :28-32及圖5_9。本文所用術(shù)語“核酸”是指單鏈或雙鏈的mRNA，RNA, cRNA和DNA，所述DNA包含 cDNA和基因組DNA?！岸嗪塑账帷笔且环N具有80個或更多個連續(xù)核苷酸的核酸，而“寡核苷酸”是具有少于80個連續(xù)核苷酸的核酸?！疤结槨笨梢允菃捂溁螂p鏈的寡核苷酸或多核苷酸，經(jīng)適當(dāng)標(biāo)記以在例如Northern 或Southern印跡中檢測互補(bǔ)序列?！耙铩蓖ǔＪ菃捂湹墓押塑账幔瑑?yōu)選15-50個連續(xù)的核苷酸，其能退火為一個互補(bǔ)核酸“模板”，并可以通過DNA聚合酶如Taq聚合酶，RNA依賴的DNA聚合酶或測序酶的作用，以模板依賴性方式被延伸。本發(fā)明還涵蓋了如上述本發(fā)明的核酸的同源物。
這種核酸同源物不包括編碼全長野生型NhhA多肽的核酸。例如，核酸同源物編碼與本發(fā)明的NhhA V和C區(qū)結(jié)構(gòu)相關(guān)的肽和多肽，通過免疫接種可提供對腦膜炎奈瑟氏球菌的交叉保護(hù)免疫性。在一個實施方案中，核酸同源物編碼本發(fā)明的多肽同源物，包括其變體，片段和衍生物。在另一個實施方案中，核酸同源物與本發(fā)明的核酸具有至少60%，優(yōu)選至少 70%，更優(yōu)選至少80%，甚至優(yōu)選至少90%的序列相同性。在另一個實施方案中，核酸同源物在至少低嚴(yán)格雜交條件下，優(yōu)選在至少中等嚴(yán)格雜交條件下，更優(yōu)選在高度嚴(yán)格雜交條件下，與本發(fā)明的核酸雜交?！半s交”是指至少部分互補(bǔ)的核苷酸序列配對，以產(chǎn)生DNA-DNA，RNA-RNA,或 DNA-RNA雜合體。本領(lǐng)域熟知在互補(bǔ)的嘌呤和嘧啶之間通過堿基配對，可以產(chǎn)生包含互補(bǔ)核苷酸序列的雜合體序列。在這點(diǎn)上，應(yīng)意識到修飾的嘌呤(例如肌苷，甲基肌苷和甲基腺苷)和修飾的嘧啶 (硫尿嘧啶和甲基胞嘧啶)也可以參與堿基配對?！皣?yán)格性"是指在雜交期間的溫度和離子濃度條件，及存在或不存在某些有機(jī)溶劑和/或去污劑.嚴(yán)格性越高，雜交的核苷酸序列之間所要求的互補(bǔ)水平越高.“嚴(yán)格條件”是指在這樣的條件下，只有具有高頻率互補(bǔ)堿基的核酸雜交。低嚴(yán)格條件包括并涵蓋了以下內(nèi)容(i)至少大約ν/ν至至少大約15% ν/ν甲酰胺，和至少大約IM至至少大約2Μ 鹽，在42°C雜交，及至少大約IM至至少大約2M鹽在42°C沖洗；及(ii)l% 牛血清白蛋白(BSA), ImM EDTA，0.5M NaHPO4 (pH7. 2)，7% SDS，在 65°C 雜交，及用(i) 2XSSC,0. 1% SDS ；或(ii)0. 5% BSA, ImM EDTA,40mM NaHPO4(ρΗ7· 2) ,5% SDS,
在室溫沖洗。中等嚴(yán)格雜交條件包括并涵蓋了以下內(nèi)容(i)至少大約16% ν/ν至至少大約30% ν/ν甲酰胺，和至少大約0. 5Μ至至少大約 0. 9Μ鹽，在42°C雜交，及用至少大約0. 5M至至少大約0. 9M鹽在42°C沖洗；及(ii)l%牛血清白蛋白(BSA), ImM EDTA，0. 5M NaHPO4(pH7. 2)，7% SDS，在 65°C雜交，及用(a) 2XSSC,0. 1% SDS -M (b)0. 5% BSA, ImM EDTA,40mM NaHPO4 (pH7. 2) ,5% SDS, 在42°C沖洗。高度嚴(yán)格雜交條件包括并涵蓋了以下內(nèi)容(i)至少大約31% ν/ν至至少大約50% ν/ν甲酰胺，和至少大約0. OlM至至少大約0. 15Μ鹽，在42°C雜交，及用至少大約0. OlM至至少大約0. 15M鹽在42°C沖洗；及(ii)l% 牛血清白蛋白(BSA), ImM EDTA，0.5M NaHPO4 (pH7. 2)，7% SDS，在 65°C 雜交，及用(a)0. 1XSSC，0. 1% SDS ；或(b)0. 5% BSA, ImM EDTA, 40mMNaHP04 (pH7. 2), 1% SDS, 在65°C以上的溫度下沖洗大約1小時；及(iii)用0.2XSSC，0. SDS在68°C或之上溫度沖洗大約20分鐘。通常地，沖洗是在以下溫度進(jìn)行Tm = 69. 3+0. 41 (G+C) % _12°C。通常地，隨著錯配的堿基數(shù)每增加1 %，雙螺旋DNA的Tm降低大約1V。盡管如上所述，但本領(lǐng)域已經(jīng)熟知嚴(yán)格條件，如Ausubel等，如前述，在第2. 9和 2. 10章中所述，在此將其并入?yún)⒖?。技術(shù)人員也意識到可以對各種因素加以修改，以最適應(yīng)特異性雜交。對最后沖洗的嚴(yán)格性進(jìn)行最佳化，以保證高度雜交。特別的，通過把核苷酸固定在基質(zhì)上(優(yōu)選一種合成膜如硝基纖維素)的步驟，一個雜交步驟和一個檢測步驟的印跡技術(shù)可以鑒別互補(bǔ)核苷酸序列。Southern印跡用于鑒別一個互補(bǔ)DNA序列；Northern印跡用于鑒別一個互補(bǔ)RNA序列。斑點(diǎn)印跡和狹線印跡可用于鑒別互補(bǔ)DNA/DNA，DNA/RNA,或RNA/RNA多核苷酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知這種方法， 并見于Ausubel等(前述)在2. 9. 1至2. 9. 20頁所述。根據(jù)這種方法，Southern印跡包括通過用凝膠電泳根據(jù)大小分離DNA分子，將根據(jù)大小分離的DNA移至一個合成膜上，并將這種結(jié)合DNA的膜與互補(bǔ)核苷酸序列雜交。在斑點(diǎn)印跡和狹線印跡中，直接將DNA樣品用于合成膜，之后如上述進(jìn)行雜交。當(dāng)在cDNA或基因組DNA文庫中鑒別互補(bǔ)核酸時，使用另一種斑點(diǎn)印跡步驟，如通過噬斑或集落雜交方法。這種方法的其它典型例子見于Sambrook等(前述)在第8_12章中所述，在此并入?yún)⒖?。典型地，以下一般步驟可用于確定雜交條件。如上述將核酸印跡/移至一個合成膜上。將本發(fā)明的野生型核苷酸序列如上述標(biāo)記，并分析此標(biāo)記的核酸與一個固定的核苷酸序列雜交的能力。技術(shù)人員可以意識到有許多因素可以影響雜交。放射性標(biāo)記的多核苷酸序列的特異活性應(yīng)典型地高于或等于大約108dpm/ug，以提供可檢測到的信號。特異性活性為 108-109dpm/ug的放射標(biāo)記的核苷酸序列可檢測大約0. 5pg的DNA。本領(lǐng)域熟知在膜上必須固定足夠的DNA以便檢測。最好可以具有超量的DNA，通常為Ι-lOug。在雜交期間加入一個惰性聚合物如10% (w/v)葡聚糖硫酸酯(MW500，000)或聚乙二醇6000，也可以提高雜交的靈敏度(見Ausubel等，如前，在2. 10. 10所述)。為從固定在膜上的核酸與標(biāo)記的核酸之間的雜交中獲得有意義的結(jié)果，在沖洗后必須有足夠量的標(biāo)記的核酸與固定的核酸雜交。沖洗是保證標(biāo)記的核酸只與與其有所希望互補(bǔ)程度的固定核酸雜交。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知檢測標(biāo)記的核酸與固定的核酸雜交的方法。這種方法包括放射自顯影術(shù)，化學(xué)發(fā)光分析法，熒光和比色檢測。在另一個實施方案中，本發(fā)明的核酸同源物可以根據(jù)以下方法制備(i)從適當(dāng)宿主中獲得一種核酸提取物；(ii)產(chǎn)生是隨意簡并的引物，其中包含本發(fā)明核苷酸序列的一部分；及(iii)使用所述引物通過核酸擴(kuò)增方法，擴(kuò)增來自所述核酸提取物的一或多個擴(kuò)增產(chǎn)物。適當(dāng)?shù)?，宿主是?xì)菌。優(yōu)選地，宿主是奈瑟氏菌屬。更優(yōu)選地，宿主是腦膜炎奈瑟氏球菌或乳酰胺奈瑟氏球菌。用于核酸序列擴(kuò)增方法中的引物包括以下詳述的SEQ IDN0:40_51。技術(shù)人員熟知適當(dāng)?shù)暮怂釘U(kuò)增方法，并包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，如在此并入?yún)⒖嫉腁usubel等(如前)在第15章中所述；鏈置換擴(kuò)增(SDA)，如在此并入?yún)⒖嫉拿绹鴮：蘄j No. 5，422，252所述；滾環(huán)復(fù)制(RCR)，如在此并入?yún)⒖嫉腖iu等，1996，在J. Am. Chem. Soc. 118 1587中所述，及國際出版物WO 92/01813和Lizardi等(國際出版物WO97/19193)所述；基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)，例如在此并入?yún)⒖嫉腟ooknanan等，1994， 生物技術(shù)171077所述；Q-β復(fù)制酶擴(kuò)增，例如在此并入?yún)⒖嫉腡yagi等，美國科學(xué)院院報 935395 所述。本文所用術(shù)語“擴(kuò)增產(chǎn)物”是指通過核酸擴(kuò)增方法產(chǎn)生的核酸產(chǎn)物。抗體本發(fā)明還涵蓋了對抗本發(fā)明分離的蛋白質(zhì)片段，變體和衍生物的抗體。本發(fā)明的抗體可以是單克隆或多克隆的。熟知的適用于抗體產(chǎn)生，純化和使用的方法見例如Coligan 等，免疫學(xué)通用方法(John ffiley&Sons NY, 1991-1994)的第2章，和!^1~1(^』.&1^1^，0.抗體實驗手冊，冷泉港，冷泉港實驗室，1988，在此并入?yún)⒖?。通常地，本發(fā)明的抗體結(jié)合或綴合于本發(fā)明的多肽，片段，變體或衍生物。例如，抗體可以包含多克隆抗體。這種抗體可以例如通過將本發(fā)明的多肽，片段，變體或衍生物注射入生產(chǎn)物種中，以獲得多克隆抗血清，所述生產(chǎn)物種包括小鼠或兔。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知生產(chǎn)多克隆抗體的方法?？梢允褂玫姆椒ɡ缫娪贑oligan等，免疫學(xué)通用方法，如前，和 Harlow&Lane，1988，如前所述。代替在生產(chǎn)物種中獲得的多克隆抗血清，單克隆抗體可以使用標(biāo)準(zhǔn)方法生產(chǎn)，例如Kohler&Milstein，1975，自然256，495所述方法，或通過最近對其加以修改的方法，例如 Coligan等，免疫學(xué)通用方法，如前所述，通過將衍生自生產(chǎn)物種的脾細(xì)胞或其它生產(chǎn)抗體細(xì)胞永生增殖化并接種本發(fā)明的多肽，片段，變體或衍生物而產(chǎn)生單克隆抗體。本發(fā)明的抗體范圍內(nèi)還包括上述單克隆或多克隆抗體的Fc或Fab片段?；蛘?， 抗體可以包含抗本發(fā)明肽的單鏈Fv抗體(scFvs)。這種scFvs可以例如根據(jù)美國專利 No. 5，091, 513 和歐洲專利 No. 239，400 所述方法，或 Winter&Milstein，1991，自然；349293 所述方法制備，所述文獻(xiàn)在此并入?yún)⒖?。本發(fā)明的抗體可以用于親和層析以分離天然或重組的腦膜炎奈瑟氏球菌多肽。例如，可以參考Coligan等，免疫學(xué)通用方法，如前，第9. 5章中闡述的免疫親和層析方法?？贵w可以用于(i)篩選表達(dá)文庫以鑒別本發(fā)明的變體多肽；(ii)鑒別免疫反應(yīng)性片段或免疫反應(yīng)性表位；和/或(iii)檢測腦膜炎奈瑟氏球菌感染。這些用途在后文加以闡述，但非限于這些特殊用途。檢測腦膜炎奈瑟氏球菌確定個體中是否存在腦膜炎奈瑟氏球菌可以通過從所述個體中分離一種生物學(xué)樣品，將上述抗體或抗體片段與此生物學(xué)樣品混合，檢測特異性結(jié)合的抗體或抗體片段，表示樣品中是否存在腦膜炎奈瑟氏球菌。術(shù)語“生物學(xué)樣品”是指一種樣品，其可以是從個體如患者中提取的，未處理的，處理的，稀釋的或濃縮的樣品。適當(dāng)?shù)?，生物學(xué)樣品選自全血，血清，血漿，唾液，尿液，汗液，腹水，腹膜液，滑液，羊水，腦脊液，皮膚活檢組織等?？梢允褂么_定復(fù)合物形成的任何適當(dāng)方法。例如，在免疫分析中可以使用具有伴隨標(biāo)記的本發(fā)明抗體或抗體片段。這種免疫分析可以包括但非限于放射性免疫分析 (RIAs)，酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISAs)和免疫層析方法(ICTs)，這些是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。例如，可以參考Coligan等，免疫學(xué)通用方法，第7章如前所述的根據(jù)本發(fā)明可以使用的各種免疫分析方法。免疫分析可以包括本領(lǐng)域已知的競爭性分析。與抗體或抗體片段伴隨的標(biāo)記可以包括以下標(biāo)記(A)與抗體或抗體片段直接附著的標(biāo)記；(B)與抗體或抗體片段間接附著的標(biāo)記，即標(biāo)記與另一種分析試劑附著，所述分析試劑隨后結(jié)合抗體或抗體片段；和(C)附著于抗體或抗體片段的隨后反應(yīng)產(chǎn)物的標(biāo)記。標(biāo)記可以選自生色劑，催化劑，酶，熒光團(tuán)，化學(xué)發(fā)光分子，鑭離子如銪(Eu34)，放射性同位素和直接觀測標(biāo)記。在直接觀測標(biāo)記中，使用的可以是由膠體金屬或非金屬顆粒，染料顆粒，酶或底物，有機(jī)聚合物，乳膠顆粒，脂質(zhì)體，或含有產(chǎn)生信號物的囊炮等。大量用作標(biāo)記的酶見于美國專利說明書U. S. 4，366，241, U. S. 4，843，000，和 U. S. 4，849，338所揭示，在此將其并入?yún)⒖?。用于本發(fā)明的酶標(biāo)記包括堿性磷酸酶，辣根過氧化物酶，熒光素酶，半乳糖苷酶，葡糖氧化酶，溶菌酶，蘋果酸脫氫酶等。酶標(biāo)記可以單獨(dú)使用或在溶液中與另一種酶組合使用。適當(dāng)?shù)?，熒光團(tuán)是選自異硫氰酸熒光素(FITC)，四甲基羅丹明異硫氰酸鹽 (TRITL)或R-藻紅蛋白(RPE)。本發(fā)明還涵蓋了一種檢測腦膜炎奈瑟氏球菌感染的患者的方法，所述方法包括如下步驟，將取自患者的生物學(xué)樣品與本發(fā)明的多肽，片段，變體或衍生物接觸，并檢測所述血清中是否存在所述多肽，片段，變體或衍生物與腦膜炎奈瑟氏球菌特異性抗體之間的復(fù)合物，其中存在所述復(fù)合物表示存在所述感染。在一個優(yōu)選的實施方案中，檢測上述復(fù)合物可通過用本領(lǐng)域熟知的適當(dāng)標(biāo)記可檢測地修飾所述多肽，片段，變體或衍生物，并將這種修飾的化合物用于例如上述免疫分析中。另一方面，本發(fā)明提供了一種在懷疑含有所述細(xì)菌的生物學(xué)樣品中檢測腦膜炎奈瑟氏球菌的方法，所述方法包括如下步驟，從患者體內(nèi)分離生物學(xué)樣品，在所述樣品中檢測到本發(fā)明的核酸序列，表示存在所述細(xì)菌。可以使用任何適當(dāng)?shù)姆椒ù_定所述核酸序列的檢測情況。例如，本發(fā)明標(biāo)記的核酸在對得自患者的核酸提取物進(jìn)行的Southern印跡分析中用作探針，這已經(jīng)為本領(lǐng)域所熟知?；蛘?，本發(fā)明標(biāo)記的核酸可以在對得自患者的RNA提取物進(jìn)行的Northern印跡分析中用作探針。優(yōu)選地，得自患者的核酸提取物與相當(dāng)于本發(fā)明核酸序列的有義和反義序列或其側(cè)翼序列的寡核苷酸引物，一起用于核酸擴(kuò)增反應(yīng)中，如PCR，或連接酶鏈反應(yīng)(LCR)，如在此并入?yún)⒖嫉膰H申請W089/09385所述。許多自動固相檢測方法也是適用的。例如，用超大規(guī)模固定引物列陣(VLSIPS ) 檢測核酸，如I7Qdor等，1991 ；科學(xué)251767和Kazal等，1996，自然醫(yī)學(xué)2573所述。上述一般方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。藥物組合物本發(fā)明的另一個特點(diǎn)是使用本發(fā)明的多肽，片段，變體或衍生物(“免疫原性劑”)，在藥物配方中作為活性配料，以防護(hù)腦膜炎奈瑟氏球菌感染。適當(dāng)?shù)?，此藥物組合物包含一種藥物適當(dāng)?shù)妮d體，稀釋劑或賦形劑?！八幬镞m當(dāng)?shù)妮d體，稀釋劑或賦形劑”是指一種可以安全地系統(tǒng)施用的固體或液體充填劑，稀釋劑或膠囊化物質(zhì)。根據(jù)特殊的施用途徑，可以施用本領(lǐng)域熟知的各種載體。這些載體可以選自蔗糖，淀粉，纖維素及其衍生物，麥芽，明膠，滑石，硫酸鈣，植物油，合成油， 多醇，藻酸，磷酸鹽緩沖液，乳化劑，等滲鹽水和鹽如無機(jī)酸鹽包括鹽酸鹽，溴化鹽和硫酸鹽，有機(jī)酸鹽如乙酸鹽，丙酸鹽和丙二酸及無熱原水。關(guān)于藥物適當(dāng)載體，稀釋劑和賦形劑的論述參見Remington’ s藥物科學(xué)(Mack出版公司，N. J.美國，1991)，在此并入?yún)⒖??？梢允褂萌魏伟踩氖┯猛緩剑瑸榛颊咛峁┍景l(fā)明的組合物。例如可以通過口服， 直腸，非腸道，舌下，口腔，靜脈內(nèi)，動脈內(nèi)，肌內(nèi)，皮內(nèi)，皮下，吸入，眼內(nèi)，腹膜內(nèi)，腦室內(nèi)，經(jīng)皮等方式施用。肌內(nèi)和皮下注射適于例如施用免疫原性組合物，疫苗和DNA疫苗。劑型包括片劑，分散系，懸浮液，注射液，溶液，糖漿，含片，藥片，膠囊，栓劑，氣霧劑，皮膚貼片等。這些劑型還可以包括為此特別設(shè)計的注射或植入控制釋放設(shè)備，或以這種方式發(fā)揮作用的其它形式的修改的植入體。治療劑的控制釋放可以通過例如用疏水性聚合物包被而實現(xiàn)，所述疏水性聚合物包括丙烯酸樹脂，蠟，高級脂肪醇，聚乳酸和聚乙醇酸及一些纖維素衍生物如羥丙甲基纖維素。另外，控制釋放可以通過使用其它聚合物基質(zhì)，脂質(zhì)體和/或微粒而實現(xiàn)。適于口服或非腸道施用的本發(fā)明藥物組合物，可以是例如均含有預(yù)定數(shù)量的一或多種本發(fā)明治療劑的分散單位如膠囊，小藥囊或片劑，及例如是粉末或顆粒，或是水相、非水相溶液或懸浮液，水包油乳狀液或油包水液相乳狀液。這種組合物可以通過任何制藥學(xué)方法制備，但所有方法均包括將上述的一或多種免疫原性劑與載體締合，組成一或多種必需成分。通常地，制備組合物是通過將本發(fā)明的免疫原性劑與液體載體或充分分開的固體載體或二者均衡及密切混合，然后如果需要，將產(chǎn)物制成所需形狀。上述組合物可以以一種與劑型相容的方式施用，并且以防護(hù)腦膜炎奈瑟氏球菌感染的有效免疫原性的數(shù)量施用。在本發(fā)明中，施用于患者的劑量應(yīng)足以在過一段時間后，在患者體內(nèi)產(chǎn)生一種有益的應(yīng)答，如降低腦膜炎奈瑟氏球菌的水平，或抑制腦膜炎奈瑟氏球菌感染。施用的免疫原性劑的數(shù)量可以根據(jù)治療對象的年齡，性別，體重和一般健康狀態(tài)而定。在這點(diǎn)上，需要施用的免疫原性劑的精確數(shù)量根據(jù)醫(yī)生的判斷而定。在確定用于治療或預(yù)防腦膜炎奈瑟氏球菌感染的免疫原性劑的有效量中，醫(yī)生可以結(jié)合循環(huán)血漿水平，疾病進(jìn)展和抗洪腦膜炎奈瑟氏球菌抗體的產(chǎn)生的情況加以確定。在任何情況中，本領(lǐng)域技術(shù)人員易于確定本發(fā)明免疫原性劑的適當(dāng)數(shù)量。這種劑量可以是納克至毫克范圍的本發(fā)明免疫原性劑。上述組合物可以用作治療或預(yù)防疫苗。因此，本發(fā)明涉及生產(chǎn)含有本發(fā)明一或多種免疫原性劑作為活性成分的疫苗?？梢允褂酶鞣N適當(dāng)?shù)姆椒ㄉa(chǎn)這種疫苗。所述方法例如包括“新生疫苗”(1997，Levine 等，Marcel Dekker 公司，紐約，Basel Hong Kong)所述， 在此并入?yún)⒖?。本發(fā)明的免疫原性劑可以與其它抗原混合，綴合或融合，包括其它抗原的B或T細(xì)胞表位。另外，其可以綴合于下述載體。
當(dāng)使用本發(fā)明的一種半抗原肽時(即與關(guān)聯(lián)抗體反應(yīng)反應(yīng)，但不能自身激發(fā)免疫應(yīng)答的肽)，其可以與免疫原性載體綴合。本領(lǐng)域熟知有效的載體，包括例如甲狀腺球蛋白；白蛋白如人血清白蛋白；來自破傷風(fēng)桿菌，白喉桿菌，百日咳桿菌，假單胞菌，大腸桿菌，葡萄球菌和鏈球菌的毒素，類毒素或任何毒素突變交叉反應(yīng)物(CRM)；聚氨基酸如聚 (賴氨酸谷氨酸)；流感病毒；輪狀病毒VP6，細(xì)小病毒VPl和VP2 ；乙型肝炎病毒核心蛋白；乙型肝炎病毒重組疫苗等。或者，可以使用載體蛋白或其它免疫原性蛋白的片段或表位。例如，本發(fā)明的半抗原肽可以偶聯(lián)于細(xì)菌毒素，類毒素或CRM的T細(xì)胞表位。在這點(diǎn)上， 可以參考美國專利No. 5，785，973所述，在此將其并入?yún)⒖?。另外，本發(fā)明的多肽，片段，變體或衍生物在直接抗奈瑟氏菌屬菌，或抗其它細(xì)菌或病毒的疫苗組合物中，可以作為載體蛋白。本發(fā)明的免疫原性劑可以與腦膜炎奈瑟氏球菌抗原，或其它有機(jī)體抗原組合作為多價亞單位疫苗而施用，所述其它抗原包括病原性細(xì)菌流感桿菌，黏膜炎微球菌，淋球菌， 大腸桿菌，肺炎鏈球菌等?；蛘呋蛄硗猓鼈兛梢耘c腦膜炎奈瑟氏球菌的寡糖或多糖組分一起施用。疫苗還可以含有如前述的一種藥物適當(dāng)?shù)妮d體，稀釋劑或賦形劑。疫苗或免疫原性組合物免疫包括本領(lǐng)域熟知的一種佐劑。本發(fā)明涵蓋的佐劑包括但非限于表面活性物質(zhì)如十六胺，十八烷胺，十八烷氨基酸酯，溶血卵磷脂，二甲基雙 (十八烷基)溴化銨，N, N-雙(十八烷基)_N’，N’雙(2-羥乙基-丙二胺)，甲氧基十六烷基甘油和普流羅尼類多元醇；多胺如吡喃，葡聚糖硫酸酯，聚肌胞聚羰乙烯；肽如胞壁酰二肽和衍生物，二甲基甘氨酸，促吞噬肽；油乳狀液和無機(jī)物凝膠如磷酸鋁，氫氧化鋁或鋁； 淋巴因子，QuilA和免疫刺激復(fù)合物(ISCOMS)。關(guān)于佐劑的例子，參見于國際出版物W099/36544所述，在此將其并入?yún)⒖肌Ｍㄟ^DNA輸送進(jìn)行接種本發(fā)明包含修飾的NhhA蛋白的表達(dá)構(gòu)建體，可以施用于人，以預(yù)防和/或治療宿主。在這點(diǎn)上，表達(dá)構(gòu)建體可以編碼一或多個修飾的NhhA肽，多肽，其片段或衍生物，在此統(tǒng)稱為“免疫原性劑”。表達(dá)構(gòu)建體還包括基因治療構(gòu)建體，其特別使用基因治療載體如牛痘，和用于基因治療的病毒載體。后者包括腺病毒和腺病毒伴隨病毒(AAV)，如Franceschi等，2000，細(xì)胞生物化學(xué)雜志，78476，Braun-Falco等，1999，基因治療6432所述，逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒屬載體如Buchshacher等，2000，血液95M99所述，和衍生自單純皰疹病毒和細(xì)胞巨化病毒的載體。關(guān)于基因治療載體和輸送方法參見于RcAbins等，1998，生物技術(shù)趨勢1635所述。 例如國際出版物W099/36544闡述了潛在適用于使用奈瑟氏菌屬菌蛋白進(jìn)行基因治療的許多載體及輸送方法。本發(fā)明的免疫原性劑可以由減毒病毒的宿主表達(dá)?！皽p毒病毒的宿主”是指天然的或已經(jīng)使其基本無毒的病毒載體。病毒可以通過任何適當(dāng)?shù)奈锢?例如熱處理)或化學(xué)方法(例如通過甲醛處理)使其基本無毒?！盎緹o毒”是指一種病毒，其感染性已經(jīng)被破壞。 理想的是病毒的感染性被破壞但不影響攜帶病毒免疫原性的蛋白質(zhì)。如上所述，應(yīng)意識到減毒病毒的宿主包含活病毒或滅活的病毒。用于本發(fā)明疫苗中的減毒病毒的宿主可以包含病毒載體，包括腺病毒，細(xì)胞巨化病毒及優(yōu)選痘病毒如牛痘(見例如I^aoletti和Panicali，美國專利No. 4，603，112所述) 和減毒的沙門氏菌株(見例如Mocker，美國專利No. 4，550，081所述)?；钜呙缡翘貏e有利的，因為它們產(chǎn)生延長的刺激，可以具有充分的長期持續(xù)的免疫性。闡述潛在適用于使用奈瑟氏菌屬菌蛋白進(jìn)行免疫接種的多種病毒載體及輸送方法的參考文獻(xiàn)例如是國際出版物 W099/36M4。多價疫苗可以從一或多種微生物中制備，所述微生物表達(dá)腦膜炎奈瑟氏球菌的不同表位(例如腦膜炎奈瑟氏球菌的其它表面蛋白或表位)。另外，其它病原性微生物的表位可以摻入疫苗中。在一個優(yōu)選的實施方案中，包括構(gòu)建一種重組牛痘病毒，以表達(dá)本發(fā)明的核酸序列。在導(dǎo)入宿主的基礎(chǔ)上，此重組的牛痘病毒表達(dá)免疫原性劑，從而激發(fā)宿主CTL應(yīng)答。例如可參考美國專利No. 4722848，其闡述了用于免疫接種的牛痘載體和方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員通過本文揭示，將知曉各種用于治療性施用或接種免疫原性劑的其它載體。在另一個實施方案中，核苷酸序列可以用作疫苗，以本領(lǐng)域已知的“裸DNA”疫苗形式。例如，本發(fā)明的表達(dá)載體可以導(dǎo)入哺乳動物中，導(dǎo)致一種多肽在體內(nèi)產(chǎn)生，與這種多肽相對抗，宿主產(chǎn)生一種免疫應(yīng)答，例如Barry，M.等(1995，自然，377 :632-635)，在此并入?yún)⒖?。檢測試劑盒本發(fā)明還提供了檢測生物學(xué)樣品中腦膜炎奈瑟氏球菌的試劑盒。根據(jù)應(yīng)用的測試方法的性質(zhì)，這些試劑盒含有上述一或多種特殊制劑。在這點(diǎn)上，此試劑盒可以包括一或多個本發(fā)明的多肽，片段，變體，衍生物，抗體，抗體片段或核酸。此試劑盒還任選地包括適當(dāng)?shù)脑噭┮詸z測標(biāo)記，陽性和陰性對照，沖洗溶液，稀釋液等。例如基于核酸的檢測試劑盒可以包括(i)本發(fā)明的核酸(其可用作陽性對照)，(ii)本發(fā)明的寡核苷酸引物，及根據(jù)應(yīng)用的核酸擴(kuò)增方法，任選一種DNA聚合酶，DNA連接酶等。制備免疫反應(yīng)性片段本發(fā)明還涉及一種鑒別本發(fā)明多肽，變體或衍生物的一種免疫反應(yīng)性片段的方法。這種方法包含產(chǎn)生一種多肽，其變體或衍生物的片段，將此片段施用于哺乳動物；并檢測此哺乳動物體內(nèi)的免疫應(yīng)答。這種應(yīng)答包括產(chǎn)生特異性結(jié)合腦膜炎奈瑟氏球菌和/或所述多肽，變體或衍生物的成分，和/或產(chǎn)生一種抗腦膜炎奈瑟氏球菌感染的防護(hù)作用。在上述方法中測試特殊片段的免疫反應(yīng)性之前，可以使用各種預(yù)測方法以推導(dǎo)一種特殊的片段是否可以用于獲得與天然抗原交叉反應(yīng)的抗體。這些預(yù)測的方法可以是基于氨基端或羧基端序列的，例如Ausubel等，如前，第11. 14章中所述。或者，這些預(yù)測的方法可以是基于親水性的預(yù)測，例如Kyte&Doolittle，1982，分子生物學(xué)雜志157105和 Hopp&ffoods, 1983，分子免疫學(xué)2048 所述，或者基于二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測，例如Choo&Fasman， 1978，Ann. Rev. Biochem. 47251)所述，所述文獻(xiàn)均并入?yún)⒖肌Ａ硗?，“表位作圖”使用本發(fā)明的單克隆抗體以鑒別交叉反應(yīng)性表位，通過首先測試其提供交叉保護(hù)性的能力，隨后鑒別由所述抗體識別的表位。這種方法例如由Coligan 等，免疫學(xué)通用方法所揭示，如前。通常地，由10-15個殘基組成的肽片段提供最佳結(jié)果。少如6個或大如20個殘基的肽也可以成功應(yīng)用。這種肽片段然后可以化學(xué)偶聯(lián)于一個載體分子如匙孔嘁血藍(lán)蛋白 (KLH)或牛血清白蛋白(BSA) JnAusubel等，如前，第11. 14和11. 15所述。也應(yīng)意識到，肽可以是合成環(huán)化的，例如Hoogerhout等，1995，感染免疫學(xué)633473 所述，在此并入?yún)⒖?。可以將肽如上述用于免疫動物。然后可以通過放射性免疫分析或ELISA確定抗體的滴度，所述抗體是對抗從中選擇所述肽的天然或親代多肽的抗體，所述分析例如Ausubel 等，如前，在第11. 16和114章節(jié)中所述。然后可以將抗體從動物的相關(guān)生物學(xué)體液中純化，通過本領(lǐng)域熟知的硫酸銨分級分離或通過層析純化。抗體純化方法例如Ausubel等，如前，第10. 11和11. 13章節(jié)所述， 在此并入?yún)⒖肌固烊换蛴H代多肽的抗體的免疫反應(yīng)性，可以通過任何相關(guān)方法確定，如 Western 印跡。功能阻斷劑確信W099/31132中揭示的野生型NhhA/HiaNm多肽具有粘著性。它們事實上與流感桿菌的粘著素有一些相似，這些粘著素是表面抗原。特別的，它們與流感桿菌的Hia 蛋白有大約67%的同源性(Barenkamp&St. Geme III，1996，分子微生物學(xué)19 1215)，與流感桿菌的Hsf蛋白有大約74%的同源性(St. Geme III，J.等，1996，細(xì)菌學(xué)雜志178 6281 ；和美國專利No. 5646259)。針對這些對比，使用GAP程序，使用缺口重為3，長度重為 0. 01 (Deveraux, 1984，如前)。因此，阻斷這些多肽的功能具有顯著的治療益處，因為這樣可以阻止腦膜炎奈瑟氏球菌粘著及侵入細(xì)胞。功能的阻斷可以通過許多方式進(jìn)行。例如，可以施用這樣的組分，如阻斷與本發(fā)明多肽相互作用的細(xì)胞表面受體的化學(xué)試劑或多肽。這些組分與感染性有機(jī)體競爭受體位點(diǎn)。這種組分可以包含例如本發(fā)明的多肽，尤其其片段或功能等價物以及模擬物。術(shù)語“模擬物”是指一種化合物，將其設(shè)計為具有相似于蛋白質(zhì)或肽的特殊功能區(qū)。也可以使用抗上述抗體產(chǎn)生的抗獨(dú)特型抗體，所述抗體阻斷細(xì)菌結(jié)合在細(xì)胞表面?；蛘?，與本發(fā)明多肽的受體結(jié)合位點(diǎn)相互作用的組分，可以有效地預(yù)防細(xì)胞感染腦膜炎奈瑟氏球菌。這種組分可包含阻斷抗體，肽或其它化學(xué)試劑。本發(fā)明的另一方面是涉及所有這些組分，藥物組合物，其中已經(jīng)組合了藥物合適的載體，以及通過施用這種組分或組合物治療腦膜炎奈瑟氏球菌感染的患者的方法。本發(fā)明的多肽可以用于篩選用于上述方法中的化合物。例如，本發(fā)明的多肽可以組合一個標(biāo)記，并暴露于存在測試試劑的細(xì)胞培養(yǎng)物中。然后觀測試劑抑制標(biāo)記的多肽結(jié)合細(xì)胞表面的能力。在這種篩選中，標(biāo)記的多肽可以直接在有機(jī)體如大腸桿菌上使用。或者，可對腦膜炎奈瑟氏球菌自身進(jìn)行工程化，以表達(dá)一種修飾的和可檢測形式的多肽。在這種方法中使用工程化的腦膜炎奈瑟氏球菌是優(yōu)選的，因為蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)更可能與在野生型細(xì)菌中表達(dá)的相似。通過以下非限制性實施例闡述的優(yōu)選的實施方案，可使本發(fā)明易于理解并投入應(yīng)用。實施例1 鑒別NhhA多肽的恒定區(qū)和可變區(qū)本發(fā)明人闡明了 NhhA氨基酸序列，其在腦膜炎奈瑟氏球菌的10個菌株之間是保守和/或非保守的。非保守的區(qū)域分成4個可變區(qū)作1，￥2，￥3和￥4)，保守區(qū)分為(1^2， C3，C4和C5(如圖1和表1所示；SEQ ID NO: 1-11)。相應(yīng)的核苷酸序列示于圖2 (SEQID NO 12-22)。實施例2 =PMC 2 INhhA多肽過表達(dá)由腦膜炎奈瑟氏球菌菌株P(guān)MC21的nhhA基因編碼的NhhA蛋白，通過產(chǎn)生一種表達(dá)構(gòu)建體而過表達(dá)，所述構(gòu)建體中nhhA基因可操縱地連于一個啟動子。以下核苷酸引物用于通過PCR擴(kuò)增腦膜炎奈瑟氏球菌PMC21菌株nhhA核酸開放讀框H0MP5 ‘ 5 ‘ -CAA TTA ACG GCC GAA TAA AAG GAA GCC GAT ATG AAC AAA ATA TAC CGC ATC-3' (SEQ ID NO :40)；其含有一個 EagI 限制位點(diǎn)(下劃線處)，和編碼NhhA的前7個氨基酸的序列(黑體)H0MP3 ‘ AN 5 ‘ -TGG AAT CCA TGG AAT CGC CAC CCT TCC CTT C -3 ‘ (SEQ ID NO 41)；其含有一個NcoI限制位點(diǎn)(下劃線處)，和越過菌株Φ 3的nhhA開放讀框末端的48-61位核苷酸序列的反向互補(bǔ)序列(黑體)擴(kuò)增的產(chǎn)物含有限制位點(diǎn)，其隨后用fegl和NcoI限制性內(nèi)切酶消化。用于亞克隆的質(zhì)粒是pC014K，這個質(zhì)粒含有編碼強(qiáng)表達(dá)腦膜炎奈瑟氏球菌1型外膜蛋白的基因的一個PorA啟動子上游，和腦膜炎奈瑟氏球菌菌株四96的側(cè)翼序列，及一個可選擇的卡那霉素抗性基因，如Rouppe van der Voort等，感染免疫學(xué)1996642745所述。然后將消化的擴(kuò)增產(chǎn)物連接于fegl和NcoI限制性內(nèi)切酶消化的PC014K中。這種連接導(dǎo)致PorA開放讀框的大部分由nhhA擴(kuò)增產(chǎn)物置換(圖幻。這產(chǎn)生一種重組的核酸表達(dá)構(gòu)建體(開放讀框示于SEQ ID N0:12)，其編碼SEQ ID NO 1所示的591個氨基酸的多肽。在強(qiáng)porA啟動子控制下表達(dá)本發(fā)明的nhhA核酸。在H0MP5’的第31位起始的ATG 密碼子處開始翻譯。為防止PorA和nhhA之間形成融合體，H0MP5’序列在所述起始ATG之前含有一個TAA終止密碼子。將所得質(zhì)粒pIP52(PMC21)通過限制性消化線性化，并用于轉(zhuǎn)化腦膜炎奈瑟氏球菌菌株7G2，使用如Janik等，1976，臨床微生物學(xué)雜志471所述方法。通過在37°C在5% CO2下，在含有l(wèi)OOug/ml卡那霉素的固體培養(yǎng)基上溫育過夜，選擇轉(zhuǎn)化體。選擇卡那霉素抗性集落，傳代培養(yǎng)過夜，并針對NhhA多肽的過表達(dá)進(jìn)行篩選，所述篩選是在10% SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳上分離總細(xì)胞蛋白，隨后使用kmi-Dry印跡儀(BioRad)移至硝基纖維素膜上。然后將此膜相繼用兔抗NhhA血清(如國際出版物W099/31132所述)和堿性磷酸酶綴合的抗兔IgG(Sigma)溫育，之后用NBT/BCIP(Sigma)比色檢測。分離一個與親代菌株相比高水平表達(dá)NhhA多肽的一個克隆(圖11)。使用計算機(jī)程序SIGCLEAVE(www. angis. org. au.所示程序的eGCG組的一部分)對預(yù)測的氨基酸序列進(jìn)行分析，表明前51個氨基酸將裂解產(chǎn)生成熟多肽(圖14 ；SEQ ID NO 33)。質(zhì)粒構(gòu)建體pIP52(PMC21)可以轉(zhuǎn)化入任何轉(zhuǎn)化感受態(tài)腦膜炎奈瑟氏球菌中。實施例3 :H41NhhA多肽過表達(dá)使用與實施例2所述相同方法過表達(dá)由腦膜炎奈瑟氏球菌菌株H41的nhhA基因編碼的NhhA蛋白。這產(chǎn)生一種重組的核酸表達(dá)構(gòu)建體(開放讀框示于SEQ ID N0:13)，其編碼SEQ ID NO 2所示591個氨基酸的一種多肽。在這個實施例中，將所得質(zhì)粒pIP52(H41) 線性化，并轉(zhuǎn)化入腦膜炎奈瑟氏球菌菌株7G2中。分析卡那霉素抗性克隆并選擇一個克隆，所述克隆當(dāng)通過Western免疫印跡檢測證明NhhA過表達(dá)(圖11)。使用計算機(jī)程序 SIGCLEAVE (www. angis. org. au.所示程序的eGCG組的一部分)對預(yù)測的氨基酸序列進(jìn)行分析，表明前51個氨基酸將裂解產(chǎn)生成熟多肽(圖14 ；SEQ ID NO 34)。這種策略可以用于產(chǎn)生含有其它腦膜炎奈瑟氏球菌菌株的野生型nhhA序列的表達(dá)構(gòu)建體。實施例4 使用常規(guī)限制位點(diǎn)構(gòu)建NhhA缺失突變體為了方便，由菌株P(guān)MC21的nhhA核酸編碼的NhhA多肽的氨基酸序列示于SEQ ID NO :1。本發(fā)明人產(chǎn)生了野生型PMC21nhhA的一種缺失突變體，其中缺失了菌株最可能變化的區(qū)域。使用以下引物從nhhA核酸模板中通過PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生一種編碼野生型PMC21NhhA 多肽的I-M位氨基酸的擴(kuò)增產(chǎn)物。H0MP5‘ 5' -CM TTA ACG GCC GM TAA AAG GAA GCCGAT ATG MC AM ATA TAC CGC ATC-3' (SEQ ID NO 40)；其是與用于產(chǎn)生過表達(dá)構(gòu)建體pIP52的寡核苷酸相同的寡
核苷酸。NH3，BG:5' -GGT CAG ATC TGT TTC ATT GTT AGC ACTtqc -3' (SEQ ID NO 42)；其含有一個Bgl II限制位點(diǎn)(下劃線處)，和編碼野生型PMC21 NhhA的134 位(雙劃線處)和49巧4位氨基酸的反向互補(bǔ)序列(黑體)。所得擴(kuò)增產(chǎn)物包括一個fegl和BglII限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。pIP52 (PMC21)包括一個在nhhA開放讀框(ORF)起始處上游的20bp處的單一的fegl位點(diǎn)和一個位于ORF內(nèi)的單一 BglII位點(diǎn)(見圖:3B)。因此，將pIP52(PMC21)和擴(kuò)增產(chǎn)物用fegl和BglII進(jìn)行限制性內(nèi)切酶消化，連接并用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5 α菌株；用PCR產(chǎn)物置換pIP52 (PMC21) 的fegl/Bglll片段。這樣產(chǎn)生了一種重組的核酸表達(dá)構(gòu)建體(開放讀框示于圖5 ;SEQ ID NO: 28)，其編碼圖5 (SEQ ID NO :23)所示的512個氨基酸的一種多肽。這個氨基酸序列包括野生型序列的I-M和134-592位氨基酸，因此缺失野生型PMC21NhhA多肽的Vl區(qū)的大部分，所有V2和C2區(qū)，及部分C3區(qū)。將這個質(zhì)粒通過限制性消化而線性化，并轉(zhuǎn)化入腦膜炎奈瑟氏球菌菌株7G2中。 使用實施例1所述方法，分離一個過表達(dá)截短的PMC21NhhA的克隆(圖11)。使用計算機(jī)程序SIGCLEAVE (www. angis. org. au.所示程序的eGCG組的一部分) 對預(yù)測的氨基酸序列進(jìn)行分析，表明前51個氨基酸將裂解產(chǎn)生成熟多肽(圖14 ；SEQ ID NO :35)。為證實存在可裂解的信號序列，及證實過表達(dá)的蛋白質(zhì)的相同性，將外膜蛋白通過分離在去污劑肌氨酰中不溶的組分而半純化。將分離的膜蛋白經(jīng)電泳分離，之后移至尼龍膜上。過表達(dá)的蛋白質(zhì)的位置通過考馬斯藍(lán)染色顯示。切除此膜的這個區(qū)域，并對蛋白質(zhì)進(jìn)行N末端測序。這個蛋白質(zhì)的前11 個氨基酸是XXETDLTSVGT(SEQ ID NO :52)，其相當(dāng)于推測由此實施例中所述過表達(dá)構(gòu)建體表達(dá)的氨基酸序列的第52-62位氨基酸殘基。這是一個使用切除多核苷酸序列內(nèi)限制位點(diǎn)進(jìn)行缺失的實施例。這個構(gòu)建體可以轉(zhuǎn)化入任何轉(zhuǎn)化感受態(tài)腦膜炎奈瑟氏球菌中。實施例5 使用常規(guī)限制位點(diǎn)構(gòu)建NhhA缺失突變體
如實施例2所述產(chǎn)生一種含有H41的野生型nhhA序列的表達(dá)構(gòu)建體。此所得構(gòu)建體稱為pIP52(H41)。使用這個實施例中描述的策略產(chǎn)生一種缺失突變體。在這種情況下使用的寡核苷酸引物是H0MP5‘ 5' -CM TTA ACG GCC GM TAA AAG GAA GCCGAT ATG MC AM ATA TAC CGC ATC-3' (SEQ ID NO 40)；其是與用于產(chǎn)生過表達(dá)構(gòu)建體pIP52的寡核苷酸相同的寡
核苷酸。NH3' STU 5' -GAT CAG GCCTGT ATC TTC ATC GGT AGCatt-3' (SEQ ID NO 43)；其含有一個StuI限制位點(diǎn)(下劃線處)，和編碼野生型H4INhhA的134位(雙劃線處)和49巧4位氨基酸的反向互補(bǔ)序列(黑體)。所得擴(kuò)增產(chǎn)物包括一個fegl和MuI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)。表達(dá)構(gòu)建體pIP52(H41) 含有這些限制位點(diǎn)。因此，將pIP52(H41)和擴(kuò)增產(chǎn)物用fegl* MuI進(jìn)行限制性內(nèi)切酶消化，連接并用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5ci菌株；這種連接是用PCR產(chǎn)物置換pIP52(H41) 的fegl/StuI片段。這樣產(chǎn)生了一種重組的核酸表達(dá)構(gòu)建體(開放讀框示于圖6 ;SEQ ID NO :29)，其編碼圖6和SEQ ID NO : 所示的513個氨基酸的一種多肽。這個氨基酸序列包括野生型序列的I-M和134-593位氨基酸，因此缺失野生型H41 NhhA多肽的Vl區(qū)的大部分，所有V2和C2區(qū)，及部分C3區(qū)。將這個質(zhì)粒通過限制性消化而線性化，并轉(zhuǎn)化入腦膜炎奈瑟氏球菌菌株7G2中。 使用實施例1所述方法，分離一個過表達(dá)截短的H41 NhhA的克隆(圖11)。使用計算機(jī)程序SIGCLEAVE(www. angis. org. au.所示程序的eGCG組的一部分) 對推測的氨基酸序列進(jìn)行分析，表明前51個氨基酸將裂解產(chǎn)生成熟多肽(圖14 ；SEQ ID NO 36)。這個構(gòu)建體可以轉(zhuǎn)化入任何感受態(tài)腦膜炎奈瑟氏球菌中。
實施例6 使用剪接重疊PCR構(gòu)建NhhA缺失突變體除了使用常規(guī)的限制位點(diǎn)從編碼NhhA的核苷酸中缺失可變區(qū)之外，還可以通過使用“剪接重疊延伸”PCR構(gòu)建突變體，如Ho等，1989，如前，和Horton, R. M.，等，1989，如前所述。在這種方式中，可以產(chǎn)生這樣的多核苷酸，其編碼恒定區(qū)，但可變區(qū)缺失(見圖5A， 5B，5C)。在這個實施例中，產(chǎn)生一種含有Cl和C5區(qū)，但所有其它區(qū)域均缺失的構(gòu)建體(見圖 5A)。以下寡核苷酸引物用于PCR反應(yīng)，以從PMC21菌株的染色體DNA中擴(kuò)增相當(dāng)于的 Cl區(qū)(見圖1)的DNA。H0MP5， 5， -CAA TTA ACG GCC GAA TAA AAG GAA GCCGAT ATG AAC AAA ATA TAC CGC ATC-3，(SEQ ID NO :40)；其是與用于產(chǎn)生過表達(dá)構(gòu)建體pIP52 (PMC21)的寡核苷酸相同的寡核苷酸。SO-C :5，-GAC GAA ATC AAC GTT ΓΤΤ AGC ACT TGC CTG
AAC CGT TGC -3，(SEQ ID NO :44)；這個序列是編碼野生型PMC21菌株NhhA的C5區(qū) (下劃線處)起始的237-M1位氨基酸和Cl區(qū)末端(黑體)的45-52位氨基酸序列的反向互補(bǔ)序列。這個反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物是H0MP5’ /SO-C0
以下寡核苷酸引物用于PCR反應(yīng)中，以從PMC21菌株的染色體DNA中擴(kuò)增C5區(qū)SO-D :5，-AAC GTT GAT TTC GTC CGC ACT TAC-3，(SEQ IDNO :45)；其編碼在 C5 區(qū)起始處的237-244位氨基酸(下劃線處表示引物SO-C的反向互補(bǔ)序列)，H03，AN :5，-TGG AAT CCA TGG AAT CGC CAC CCT TCCCTT C_3，(SEQ ID NO 41)； 其與構(gòu)建PIP52使用的引物相同。這個反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物是S0-D/H03，AN。將擴(kuò)增產(chǎn)物H0MP5，/SO-C和S0-D/H03，AN從瓊脂糖凝膠中純化，隨后通過電泳分離，混合并使用引物H0MP5’和H03’ AN進(jìn)行進(jìn)一步擴(kuò)增。所得擴(kuò)增產(chǎn)物編碼PMC21的野生型NhhA的1-52位和337-591位氨基酸。將此擴(kuò)增產(chǎn)物用fegl和NcoI限制性消化，并克隆入pC014K中，如實施例1所述。這個重組的分子含有Cl和C5區(qū)，這樣缺失V1-V4區(qū)和 C2-C4區(qū)。開放讀框的核苷酸序列示于圖7和SEQ ID NO :30，衍生自此核苷酸序列的推測的多肽序列示于圖7和SEQ ID NO :25ο將這個質(zhì)粒通過限制性消化而線性化，并轉(zhuǎn)化入腦膜炎奈瑟氏球菌菌株7G2中。 使用實施例2所述方法，分離一個過表達(dá)截短的PMC21 NhhA的克隆。使用計算機(jī)程序SIGCLEAVE(www. angis. org. au.所示程序的eGCG組的一部分) 對預(yù)測的氨基酸序列進(jìn)行分析，表明前51個氨基酸可被裂解產(chǎn)生成熟多肽(圖14 ；SEQ ID NO 37)。這個質(zhì)?？梢赞D(zhuǎn)化入任何感受態(tài)腦膜炎奈瑟氏球菌菌株中。實施例7 使用剪接重疊PCR構(gòu)建NhhA缺失突變體應(yīng)意識到可以使用相似的策略產(chǎn)生編碼NhhA的各種區(qū)域的重組多核苷酸?？梢允褂靡韵路椒óa(chǎn)生一種包含Cl，C4，V4和V5區(qū)的構(gòu)建體(見圖5B)使用以下寡核苷酸引物擴(kuò)增Cl區(qū)H0MP5， 5， -CAA TTA ACG GCC GAA TAA AAG GAA GCCGAT ATG AAC AAA ATA TAC CGC ATC-3，(SEQ ID NO :40)；SO-E : 5，- AAC GCT TGC CGC ACG CTT AGC ACT TGC CTG CAA CGT TGC-3’ (SEQ ID NO :46)；這個序列是編碼PMC21菌株的C4區(qū)(下劃線處)起始的211-215位氨基酸和Cl區(qū)末端(黑體)的氨基酸序列的反向互補(bǔ)序列。這個反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物是H0MP5’ /S0-E。以下寡核苷酸引物用于PCR反應(yīng)中，以從PMC21菌株的染色體DNA中擴(kuò)增 C4-V4-C5 區(qū)SO-F :5，-CGT GCG GCAAGC GTT AAA GAC GTA-3，(SEQ IDNO :47)；其編碼在 C4 區(qū)起始處的211-218位氨基酸(下劃線處表示引物SO-E的反向互補(bǔ)序列)，H03，AN :5，-TGG AAT CCA TGG AAT CGC CAC CCT TCCCTT C_3，(SEQ ID NO :41)。這個反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物是S0-F/H0MP3，。將擴(kuò)增產(chǎn)物H0MP5’ /SO-E和S0-F/H0MP3’從瓊脂糖凝膠中純化，隨后通過電泳分離，混合并使用引物H0MP5’和H03’ AN進(jìn)行進(jìn)一步擴(kuò)增。所得擴(kuò)增產(chǎn)物編碼PMC21的野生型NhhA的1-52位氨基酸和211-591位氨基酸。將此擴(kuò)增產(chǎn)物用fegl和NcoI限制性消化， 并克隆入PC014K中。這個重組的分子含有C1，C4，V4和C5區(qū)，這樣缺失V1-V3區(qū)和C2-C3 區(qū)。開放讀框的核苷酸序列示于圖8和SEQ ID NO :31，衍生自此核苷酸序列的推測的多肽序列示于圖8和SEQ ID NO :26ο使用計算機(jī)程序SIGCLEAVE(www. angis. org. au.所示程序的eGCG組的一部分) 對預(yù)測的氨基酸序列進(jìn)行分析，表明前51個氨基酸可裂解產(chǎn)生成熟多肽(圖14 ；SEQ ID NO 38)。這個質(zhì)?？梢赞D(zhuǎn)化入任何感受態(tài)腦膜炎奈瑟氏球菌菌株中。實施例8 使用剪接重疊PCR構(gòu)建NhhA缺失突變體應(yīng)意識到可以使用相似的策略產(chǎn)生編碼NhhA的各種區(qū)域的重組多核苷酸?？梢允褂靡韵路椒óa(chǎn)生一種包含Cl，C2，C3，C4，和C5區(qū)的構(gòu)建體(見圖5C)使用以下寡核苷酸引物擴(kuò)增Cl和C2區(qū)H0MP5， 5， -CAA TTA ACG GCC GAA TAA AAG GAA GCCGAT ATG AAC AAA ATA TAC CGC ATC-3，(SEQ ID NO :40)；SO-G 5 ‘ -CAG CGA GTA GGT GAA TTG TTT GAT TTT
CTGAAC CGT-3’(SEQ ID NO 48)；這個序列是編碼PMC21菌株C3區(qū)起始的125-129 位氨基酸(下劃線處)，所有C2區(qū)域(109-120位氨基酸，黑體和雙劃線處)和Cl區(qū)末端 (46-52位氨基酸，黑體)氨基酸序列的反向互補(bǔ)序列。這個反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物是H0MP5’ /S0-G。使用以下寡核苷酸引物擴(kuò)增C3和部分C4區(qū)SO-H :5，-TTC ACC TAC TCG CTG AAA AAA GAC-3，(SEQ IDNO :49)；其編碼在 C3 區(qū)起始處的125-132位氨基酸(下劃線處表示引物SO-G的反向互補(bǔ)序列)，SO-I 5，- GCC AGC GTT TAA TAC GTC TTT AAC GCT TGC
CGC ACG ATC GGT CAA AGT CGA ACC AAT-3，(SEO ID NO 50)；其編碼在 C3 區(qū)末端的 182-188位氨基酸(下劃線處)和C4區(qū)211-222位氨基酸(黑體)的反向互補(bǔ)序列。這個反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物是S0-H/S0-I。擴(kuò)增產(chǎn)物H0MP5’/S0-G和S0-H/S0-I從瓊脂糖凝膠中純化，隨后通過電泳分離，混合并使用引物H0MP5，和SO-I進(jìn)行進(jìn)一步擴(kuò)增，所得擴(kuò)增產(chǎn)物編碼1-52，103-114，125-188 和211-222為氨基酸，也就是Cl，C2，C3和部分C4區(qū)。這個反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物是H0MP5’ / SO-I。使用以下寡核苷酸引物擴(kuò)增C5和部分C4區(qū)SO-T 5 - GTATTAAAC GCTGGC TGG AAC ATT AAA GGCGTT AAA .AAC GTT GAT TTC GTC CGC ACT-3，(SEQ IDNO :51)；其編碼菌株 PMC21的野生型NhhA的C4區(qū)218-2 位氨基酸(下劃線處)和C5區(qū)的237-243位氨基酸 (黑體)。(黑體下劃線處表示SO-I的反向互補(bǔ)序列)H03，AN :5，-TGG AAT CCA TGG AAT CGC CAC CCT TCCCTT C_3，(SEQ ID NO :41)。這個反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物是S0-J/H03，AN。將擴(kuò)增產(chǎn)物H0MP5’ /SO-I和S0-J/H03’ AN從瓊脂糖凝膠中純化，隨后通過電泳分離，混合并使用引物H0MP5’和H03’ AN進(jìn)行進(jìn)一步擴(kuò)增所得產(chǎn)物編碼PMC21菌株的野生型 NhhA的1-52，103—114，125-188，211-229和237—591位氨基酸。將所得擴(kuò)增產(chǎn)物用EagI和
26NcoI限制性消化，并克隆入PC014K中。這個重組的分子含有Cl，C2，C3，C4和C5區(qū)，這樣缺失VI，V2，V3和V4區(qū)。開放讀框的核苷酸序列示于圖9和SEQ ID N0:32，衍生自此核苷酸序列的推測的多肽序列示于圖9和SEQ ID N0:27。使用計算機(jī)程序SIGCLEAVE(www. angis.org.au.所示程序的eGCG組的一部分)對預(yù)測的氨基酸序列進(jìn)行分析，表明前49個氨基酸可裂解產(chǎn)生成熟多肽(圖14 ；SEQ ID NO 39)。這個構(gòu)建體可以轉(zhuǎn)化入任何感受態(tài)腦膜炎奈瑟氏球菌菌株中。實施例9 純化過表達(dá)的NhhA多肽前述實施例中闡述的重組的NhhA多肽可以通過以下步驟分離。將細(xì)菌在37°C在 5% CO2環(huán)境中生長過夜(12-14小時)。(在這個實施例中，培養(yǎng)基是補(bǔ)加Levevthal堿的 BHI瓊脂。其它生長培養(yǎng)基是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的)。收集10個25ml瓊脂平板中的細(xì)菌， 并懸浮于25ml用HCl將pH調(diào)節(jié)為8. O的IOmM Tris中。加入等體積的含有2%肌氨酰的 IOmM Tris(pH8. 0)，并將此混合物在4°C輕輕混合1小時。在20°C以100000X g離心70分鐘，并棄去上清。將沉淀通過25號針管重懸浮于25ml含有肌氨酰的IOmM Tris (pH8. 0) 中。在20°C以100000Xg離心70分鐘，并棄去上清。將沉淀通過25號針管重懸浮于IOml 的IOmM Tris (pH8. 0)中。此部分含有不溶解于肌氨酰的細(xì)胞成分，而且多是外膜蛋白。(可以加上另外一個步驟以除去殘余的肌氨酰去污劑，這是將蛋白質(zhì)溶液經(jīng)過100-1000體積的例如IOmM Tris. Cl或PBS (磷酸鹽緩沖鹽水)，在4°C透析4-8小時，循環(huán)4次。)在已經(jīng)通過^Onm波長的吸光度，或通過使用一個BCA試劑盒(Pierce)確定了懸浮液中蛋白質(zhì)的濃度后，將大約Iml含有SDS (十二烷基硫酸鈉)，2% β-巰基乙醇及 IOmg蛋白質(zhì)的溶液在BioRad袖珍多變II型儀器中的1. 5mm厚的6% SDS-PAGE上分離。使用BioRad的“袖珍整體凝膠儀”從凝膠中洗脫高分子量的NhhA。將大約10%的每種洗脫級分通過SDS-PAGE分離，隨后通過考馬斯藍(lán)染色進(jìn)行檢測。集合基本沒有其它蛋白質(zhì)的含有NhhA的級分，進(jìn)行這種步驟以分離如實施例2所述的過表達(dá)的成熟NhhA(SEQ IDNO 1)， 如實施例4所述的過表達(dá)的BglI缺失成熟的NhhA(SEQ IDNO 23)和如實施例6所述的過表達(dá)的NhhA缺失突變體(SEQ IDNO :25)。分離的蛋白質(zhì)示于圖12。實施例10 純化的NhhA缺失突變多肽的免疫原性將小鼠用前述實施例所述的純化的野生型NhhA多肽和缺失突變體接種。第一組， 將每個Balb/C小鼠在第0天用130ug和在第14天用115ug具有MPL+TDM 佐劑(得自 Sigma-Aldrich)的PMC21NhhA皮下接種。第二組，將每個小鼠用具有MPL+TDM 佐劑(得自 Sigma-Aldrich)的大約120ug蛋白在第0天接種，在第14天用190ug接種。在第三組，將每個小鼠用具有MPL+TDM 佐劑(得自Sigma-Aldrich)的大約^Oug蛋白在第0天接種， 在第14天用1240ug接種。在第21天取血液樣品并提取血清。通過Western免疫印跡測試這些血清中全長PMC21 NhhA的抗體的存在情況(圖13)。將P6(過表達(dá)PMC21 NhhA)和菌株2A (廢除NhhA表達(dá))的OMC制品(5mg)，使用BioRad袖珍多變II型電泳設(shè)備，通過6% SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳分離。將蛋白質(zhì)電泳移至硝基纖維素膜上，并將濾膜切成3mm的條帶，然后在5%脫脂奶的PBS中封閉。將小鼠血清在5%脫脂奶粉中稀釋為1 1000和 1 10000，并和硝基纖維素膜孵育。使用堿性磷酸酶綴合的抗小鼠IgG(Sigma)檢測抗體結(jié)合，之后用NBT/BCIP (Sigma)進(jìn)行比色檢測。從圖13中可以看出，通過用NhhA缺失突變體或用全長成熟的NhhA多肽接種，可以激發(fā)抗全長成熟PMC21 NhhA多肽的免疫應(yīng)答。
實施例11 在大腸桿菌中表達(dá)缺失突變體多肽除了在腦膜炎奈瑟氏球菌中表達(dá)本發(fā)明的突變體多肽之外，也可將其在大腸桿菌中表達(dá)。實施例4-8所述的任何重組nhhA缺失突變體均可以用作PCR擴(kuò)增的模板。使用的寡核苷酸引物可以是如國際出版物W099/31132所述引物(如該文獻(xiàn)中所述的SEQ IDNO 24和SEQ ID NO 25)。擴(kuò)增產(chǎn)物可以用BamHI/Hindlll酶限制性消化，并和BamHI/Hindlll 酶限制性消化的質(zhì)粒PMALC2連接(New England BioLabs)，將所得質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)的大腸桿菌DH5ci菌株中。使用PMALC2生產(chǎn)者推薦的條件，可以誘導(dǎo)所得菌株以高水平表達(dá)重組的蛋白質(zhì)。所得重組的蛋白質(zhì)是一種麥芽糖結(jié)合蛋白和本發(fā)明缺失突變體NhhA多肽的融合體。其可以是通過在SDS-PAGE上分離，隨后使用袖珍凝膠電洗脫儀(BioRad)根據(jù)生產(chǎn)者的指導(dǎo)進(jìn)行電洗脫而半純化。然后將半純化的融合蛋白用PBS透析，之后用蛋白酶因子)(a消化，以從重組的NhhA蛋白中裂解麥芽糖結(jié)合蛋白組分。重組的NhhA蛋白可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法純化，例如R. K. kopes，蛋白質(zhì)純化(Springer-Verlag，紐約，NY USA, 1993)。通過本說明書，闡述了本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，但無限制本發(fā)明之意。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)意識到，在不偏離本發(fā)明精神的范圍內(nèi)可以對本發(fā)明舉例說明的實施方案加以各種修改和變化。本文所引用的所有的計算機(jī)程序，公式，專利和科學(xué)文獻(xiàn)在此均并入?yún)⒖肌?br> 權(quán)利要求
1.一種分離的蛋白質(zhì)，其由選自SEQ ID N0:23和SEQ IDNO :35的氨基酸序列組成。
2.一種分離的蛋白質(zhì)，其與權(quán)利要求1的分離的蛋白質(zhì)具有至少90%的序列相同性， 該分離的蛋白質(zhì)不是野生型NhhA多肽。
3.權(quán)利要求1或2的分離的蛋白質(zhì)的免疫原性片段，該免疫原性片段由至少20個氨基酸組成并包含一或多個抗原性決定簇或表位。
4.一種藥物組合物，其包含藥物學(xué)有效量的一或多種權(quán)利要求1或2的分離的蛋白質(zhì)或權(quán)利要求3的免疫原性片段，以及一種藥物學(xué)可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
5.權(quán)利要求4的藥物組合物，其是一種疫苗。
6.編碼權(quán)利要求1或2的分離的蛋白質(zhì)的分離的核酸。
7.權(quán)利要求6的分離的核酸，其由SEQID NO 28組成。
8.—種表達(dá)載體，其包括權(quán)利要求6或7的分離的核酸，所述核酸可操縱地連接于一種啟動子。
9.一種宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求8的表達(dá)載體。
10.權(quán)利要求9的宿主細(xì)胞，其是一種細(xì)菌。
11.權(quán)利要求10的宿主細(xì)胞，其是腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)。
12.—種生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的方法，其包括以下步驟(i)培養(yǎng)權(quán)利要求10的宿主細(xì)胞以使得所述重組蛋白質(zhì)在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)；并 ( )分離所述重組蛋白質(zhì)。
13.權(quán)利要求1或2的分離的蛋白質(zhì)在生產(chǎn)一種用于治療或預(yù)防人的腦膜炎奈瑟氏球菌感染的藥物中的用途。
14.權(quán)利要求6或7的分離的核酸在生產(chǎn)一種用于檢測人的腦膜炎奈瑟氏球菌感染的診斷劑中的用途。
15.權(quán)利要求1或2的分離的蛋白質(zhì)在生產(chǎn)一種用于檢測人的腦膜炎奈瑟氏球菌感染的診斷劑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了含有修飾的腦膜炎奈瑟氏球菌表面抗原的新蛋白質(zhì)和編碼核酸。所述修飾的表面蛋白質(zhì)的非保守氨基酸缺失，因而可以引起抗腦膜炎奈瑟氏球菌的交叉保護(hù)免疫反應(yīng)。本發(fā)明還涵蓋了所述修飾的表面蛋白在診斷、治療和預(yù)防性疫苗以及設(shè)計和/或篩選藥物中的應(yīng)用。所述修飾的表面抗原特別用于疫苗中，其比相應(yīng)的野生型表面抗原可以更有效地免疫接種而對抗更廣譜的腦膜炎奈瑟氏球菌。
文檔編號A61K35/76GK102417537SQ201110281109
公開日2012年4月18日 申請日期2001年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2000年1月25日
發(fā)明者伊恩·理查德·安塞爾姆·皮克, 邁克爾·保羅·詹寧斯 申請人:昆士蘭大學(xué)