專利名稱：一種豬o型口蹄疫合成肽疫苗及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種豬0型口蹄疫合成肽疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease, FMD)是由口蹄疫病毒(Foot and mouth virus, FMDV)引起豬、牛、羊等偶蹄獸的一種急性熱性高度接觸性傳染病，嚴(yán)重危害家畜的生產(chǎn)力和畜產(chǎn)品質(zhì)量安全，被OIE列為A類重要傳染病。目前對(duì)于該病的防制發(fā)達(dá)國(guó)家主要采取屠殺政策，發(fā)展中國(guó)家采取隔離和免疫接種政策，其中疾病流行前的免疫接種是特異性保護(hù)家畜免遭感染的有效手段。我國(guó)目前通過(guò)接種滅活疫苗及合成肽疫苗等一些新型疫苗來(lái)控制該病的流行。但現(xiàn)有的這些疫苗都存在一些缺陷。如滅活疫苗主要缺點(diǎn)是生物安全性問(wèn)題及穩(wěn)定性問(wèn)題，病毒必須在高度要求的設(shè)備中生產(chǎn)，以防散毒；現(xiàn)有的合成肽苗雖然具有良好的保護(hù)效果，但生產(chǎn)工藝復(fù)雜，成本高不利于降低成本。因而一種廉價(jià)、安全、 高效的疫苗生產(chǎn)系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)具有巨大的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有合成肽疫苗中存在的生產(chǎn)工藝復(fù)雜，成本高的問(wèn)題， 提供一種廉價(jià)、安全、高效的豬0型口蹄疫合成肽疫苗。本發(fā)明另一目的在于提供上述疫苗的制備方法。本發(fā)明上述目的通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)
一種豬0型口蹄疫合成肽疫苗，其氨基酸序列如SEQ ID NO: I所示，基因序列如SEQ ID NO: 2所示；所述氨基酸序列采用的是豬0型口蹄疫VPl蛋白中具有抗原性的141-160位及 200-213位氨基酸肽段，并將其組成多拷貝的串聯(lián)結(jié)構(gòu)，在肽段連接處加入氨基酸多肽作為接頭；抗原多肽采用如下串聯(lián)結(jié)構(gòu)Y-M-X-N-Y，其中“X”和“Y”分別代表豬0型口蹄疫VPl 蛋白141-160、200-213位氨基酸肽段；“M”和“N”分別代表“Pro-Gly” 二肽接頭及i^一肽接頭，所述i^一肽接頭的氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示。本發(fā)明上述豬0型口蹄疫合成肽疫苗的制備方法包括如下步驟
(I)應(yīng)用重組DNA技術(shù)，合成編碼豬0型口蹄疫合成肽的DNA序列，構(gòu)建pGAPZ a A-SP 表達(dá)載體。(2)重組表達(dá)載體pGAPZ a A-SP轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞畢赤酵母中，構(gòu)建表達(dá)工程菌將感受態(tài) A pas tor is X33 (80 y L)與 Bln 線性化的 pGAPZ a A-SP (10 u g)相混合，I. 5 kV、200 電擊5 ms。將轉(zhuǎn)化后的酵母細(xì)胞鋪于新鮮制備的YPDS平板(含100 u g/ml Zeocin)上，將平板倒置，于30°C溫箱中培養(yǎng)至單菌落出現(xiàn)(需要3-5 d)。采用煮一凍一煮法制備PCR模板分析P. Pastoris轉(zhuǎn)化子，以引物能擴(kuò)增出約200bp的克隆子定為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。再經(jīng)不同濃度Zeocin的YPD平板篩選高拷貝克隆，以用于高效表達(dá)目的蛋白。(3)發(fā)酵培養(yǎng)重組酵母菌，進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物作SDS-PAGE及Western-blot分析鑒定；
(4)表達(dá)產(chǎn)物純化，并選用佐劑乳化制成新型的豬0型口蹄疫合成肽疫苗。作為一種優(yōu)選方案，上述方法中，所述表達(dá)載體為畢赤酵母表達(dá)載體。作為一種優(yōu)選方案，上述方法中，所述步驟(3)具體為用滅菌牙簽細(xì)挑篩選到的具有Zeocin抗性的單菌落，挑于5 mL的YPD液體培養(yǎng)基中進(jìn)行一級(jí)培養(yǎng)，28°C _30°C，200 r/min振蕩過(guò)夜，至0D600=2_6，此時(shí)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；取I mL—級(jí)培養(yǎng)液，重懸于30 mL的YPD中，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，用四層干凈的紗布外加兩層報(bào)紙包扎。培養(yǎng)72小時(shí)，3000 r/ min離心5 min,收集培養(yǎng)液上清，即得純化蛋白。 作為一種優(yōu)選方案，上述方法中，所述步驟(4)中所述佐劑為進(jìn)口油乳佐劑。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果
畢赤酵母菌作為外源基因真核表達(dá)系統(tǒng)，具有較高的表達(dá)量。用畢赤酵母基因表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)蛋白質(zhì)具有很大的發(fā)展前景，國(guó)外已有多種蛋白酶及抗體基因得到了高效表達(dá)，一些已經(jīng)商品化生產(chǎn)。酵母具有比大腸桿菌更完備的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制和對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的加工修飾及分泌能力，且不會(huì)產(chǎn)生內(nèi)毒素，是基因工程中良好的真核基因受體菌。本發(fā)明選用野生型畢赤酵母菌X33，生長(zhǎng)速度快，而且自身分泌內(nèi)源性蛋白很少，這就大大減少了我們對(duì)培養(yǎng)基中的外源基因表達(dá)產(chǎn)物的純化，有助于提高表達(dá)量。pGAPZ a A為一種非誘導(dǎo)分泌型表達(dá)載體，不需甲醇誘導(dǎo)，所表達(dá)異源蛋白直接分泌到培養(yǎng)基中，便于目的基因表達(dá)產(chǎn)物的純化，且培養(yǎng)基價(jià)格低廉，更利于實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。優(yōu)秀基因工程疫苗的出現(xiàn)往往有賴于對(duì)該病的病原物的抗原位點(diǎn)的充分研究。所以自上世紀(jì)80年代以來(lái)，人們更加重視對(duì)FMDV各抗原位點(diǎn)的分析。其中結(jié)構(gòu)蛋白VPl的研究最為普遍，并得到其為主要免疫原性抗原這一重要結(jié)論，VPl G-H環(huán)和C末端含有重要的抗原位點(diǎn)，并進(jìn)行了大量的研究?，F(xiàn)研究的口蹄疫基因工程疫苗都是基于VPl基因及其抗原表位。如化學(xué)合成VPl的141-160AA和200-213AA ;在活載體中表達(dá)VPl融合蛋白； 用編碼VPl的141-160AA和200-213A的DNA研制成核酸疫苗；用植物表達(dá)VPl蛋白，研制成植物可飼疫苗等。本研究同樣選擇141-160AA和200-213AA這兩個(gè)氨基酸肽段，并將其組成141-160AA 200-213AA 141-160AA的串聯(lián)結(jié)構(gòu)，在肽段連接處加入適當(dāng)?shù)陌被岫嚯淖鳛榻宇^。綜述所述,本發(fā)明中所述疫苗同時(shí)具有B細(xì)胞抗原表位及T細(xì)胞抗原表位,具有較好的免疫原性，另外本發(fā)明運(yùn)用真核表達(dá)系統(tǒng)(畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng))表達(dá)合成肽基因，目的基因表達(dá)后得到修飾，增強(qiáng)了肽疫苗的免疫原性。本發(fā)明應(yīng)用基因工程技術(shù)在真核細(xì)胞中高效表達(dá)了豬0型口蹄疫合成肽，經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明該表達(dá)產(chǎn)物具有較好的免疫原性。且本發(fā)明表達(dá)效率高，分離純化簡(jiǎn)單，生產(chǎn)成本低，易放大，穩(wěn)定性好，適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。因此， 本發(fā)明為臨床上的豬0型口蹄疫疾病防治和治療提供新型的疫苗制備方法，具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖I是重組質(zhì)粒pGAPZ a A-SP電泳圖，M :DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、2:重組質(zhì)粒 pGAPZa A-SP。圖2是重組酵母陽(yáng)性克隆子PCR電泳圖，M =DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1、2 :重組酵母菌pGAPZ a A-SP/X33 ；3 :重組酵母菌 pGAPZ a A /Χ33。圖3是表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析，Μ:非預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；I :重組酵母菌 pGAPZ α Α/Χ33的表達(dá)上清；2、3、4 :重組酵母菌pGAPZ a A-SP/X33菌的表達(dá)上清。圖4是表達(dá)產(chǎn)物Western-blot結(jié)果，M :非預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；1，2 :重組酵母菌pGAPZ a A-SP/X33菌的表達(dá)上清；3 :重組酵母菌pGAPZ α Α/Χ33的表達(dá)上清。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。實(shí)施例I
(I)構(gòu)建重組表達(dá)載體根據(jù)畢赤酵母基因的偏嗜性、合成肽SP氨基酸序列及表達(dá)載體pGAPZ a A的多克隆位點(diǎn)，設(shè)計(jì)并全基因合成SP基因，連接于質(zhì)粒Puc57載體上，雙酶切 Puc57重組載體及表達(dá)載體pGAPZ αΑ，然后連接轉(zhuǎn)化構(gòu)建重組表達(dá)載體(圖I)。另設(shè)計(jì)兩條引物用于檢測(cè)，引物如下pl: SEQ ID N0:4, p2: SEQ ID NO: 5，酶切位點(diǎn)為EcoR I和 Not I。(2)構(gòu)建基因工程菌用上述構(gòu)建好的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主菌，宿主菌為畢赤酵母 X33。(3)重組酵母菌合成肽的表達(dá)用滅菌牙簽細(xì)挑篩選到的具有Zeocin抗性的單菌落，挑于5 mL的YPD液體培養(yǎng)基中進(jìn)行一級(jí)培養(yǎng)，30°C，200 r/min振蕩過(guò)夜，至 0D600=2-6，此時(shí)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。取I mL—級(jí)培養(yǎng)液，重懸于30 mL的YPD中，繼續(xù)振蕩培養(yǎng)，用四層干凈的紗布外加兩層報(bào)紙包扎，培養(yǎng)約72小時(shí)，另取一部分菌液采用 “煮-凍-煮”處理后，作PCR檢測(cè)(圖2)。(4)純化表達(dá)上清3 000 r/min離心5 min,純化蛋白。實(shí)施例2
豬O型口蹄疫合成肽疫苗的制備對(duì)上訴表達(dá)上清進(jìn)行SDS-PAGE和Western -Blot分析(圖Γ4)，然后將青霉素、鏈霉素與分離純化的蛋白混合，將混合物PH值調(diào)至生理值，即 PH7. 0-7. 5，即制備了豬O型口蹄疫合成肽疫苗，佐劑選用進(jìn)口油乳佐劑。實(shí)施例3
豬O型口蹄疫合成肽表達(dá)量測(cè)定SP表達(dá)上清蛋白濃度測(cè)定采用Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒，由于表達(dá)上清中存在少量的菌體蛋白，故測(cè)定的濃度為總蛋白濃度，具體步驟如下
I.完全溶解蛋白標(biāo)準(zhǔn)品BSA (5mg/mL)，取10 μ L稀釋至100 μ L，使終濃度為O. 5mg/ mL。用PBS稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。2.將稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品按0，I, 2，4，8，12，16，20 μ L加到96孔板的標(biāo)準(zhǔn)品孔中，加PBS稀釋液補(bǔ)足到20 μ L03.分別將表達(dá)時(shí)間為48h、72h、96h合成肽上清10 μ L加到96孔板的樣品孔中， 加PBS稀釋液至20 μ L04.各孔加入200 μ L G250染色液，室溫放置3-5分鐘。5.用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)為595nm的吸光度。
6.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出合成肽不同表達(dá)時(shí)間上清中的蛋白濃度。上述方法測(cè)定的濃度為上清中的總蛋白濃度，再根據(jù)光密度掃描儀掃描SDS-PAGE 膠中目的條帶蛋白占總蛋白的百分比，即可算出合成肽在不同時(shí)間的表達(dá)量。I.實(shí)驗(yàn)方案結(jié)果根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白BSA在不同濃度下的0D595值，算出在48h、72h、 96h不同時(shí)間的總蛋白表達(dá)量分別為75mg/L、90mg/L、120mg/L，再經(jīng)光密度掃描儀掃描合成肽含量占總蛋白不同百分比，可算出48h、72h、96h合成肽表達(dá)量分別為40mg/L、57mg/L、 80mg/L,由此確定最佳表達(dá)時(shí)間為96h,即確定了合成肽大規(guī)模發(fā)酵的培養(yǎng)時(shí)間。完全溶解蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，取10 μ I稀釋至100 μ I,使終濃度為O. 5mg/ml。蛋白樣品在什么溶液中，標(biāo)準(zhǔn)品也宜用什么溶液稀釋。但是為了簡(jiǎn)便起見(jiàn)，也可以用O. 9%NaCl或PBS稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。 完全溶解蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，取10 μ I稀釋至100 μ 1，使終濃度為O. 5mg/ml。蛋白樣品在什么溶液中，標(biāo)準(zhǔn)品也宜用什么溶液稀釋。但是為了簡(jiǎn)便起見(jiàn)，也可以用O. 9%NaCl或PBS稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。實(shí)施例4
動(dòng)物實(shí)驗(yàn)(血清ELISA檢測(cè))
1.1小鼠的分組與免疫
小鼠30只，隨機(jī)分為5組，每組5只。首免、二免及三免各間隔均為14d，每次免疫前小鼠尾靜脈采血分離血清置_20°C備用。免疫組別有A: pGAPZ a A-SP進(jìn)口油乳劑組；B: pGAPZ a A-SP無(wú)佐劑組；C: pGAPZ a A組；D:陽(yáng)性對(duì)照組；E: PBS對(duì)照組。免疫方案如下
(I)各組均免疫3次，免疫間隔14日。(2)pGAPZ a A-SP進(jìn)口油乳劑組用進(jìn)口油乳佐劑與純化的合成肽制成乳劑，使合成肽蛋白濃度為50 μ g/mL，肌肉注射免疫，200 μ I /只/次。(3)pGAPZ a A-SP無(wú)佐劑組用無(wú)菌PBS與純化的合成肽制成乳劑，使合成肽蛋白濃度為50 μ g/mL，肌肉注射免疫，200 μ I /只/次。(4)pGAPZ a A組用無(wú)菌PBS與空載體蛋白混合制成乳劑，使終濃度為50 μ g/mL,肌肉注射，200 μ I /只/次。(5)商品用合成肽疫苗作為陽(yáng)性對(duì)照組，按照商品說(shuō)明動(dòng)物重量計(jì)算注射劑量為 20 μ I / 只/次。(6) PBS對(duì)照組使用無(wú)菌PBS，肌肉注射，200 μ I /只/次。I. 2疫苗對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物安全性試驗(yàn)
連續(xù)觀察免疫接種的小鼠，考察小鼠注射后局部及全身反應(yīng)情況。I. 3小鼠抗原特異性抗體檢測(cè)
每次免疫后的14日，分別斷尾采血，用O型口蹄疫ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)抗原特異抗體水平的變化。酶標(biāo)二抗用I :2500稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體。以正常小鼠血清 (PBS免疫組)作陰性對(duì)照。對(duì)血清I :100倍稀釋時(shí)的0D450nm值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，比較差異性。
2.結(jié)果
2. I實(shí)驗(yàn)動(dòng)物安全性實(shí)驗(yàn)
25只小鼠被接種后，連續(xù)觀察4天，精神、食欲正常，均未出現(xiàn)因注射疫苗引起的死亡、 明顯紅腫、局部潰瘍及全身反應(yīng)，說(shuō)明疫苗對(duì)小鼠是安全的。
2. 2抗原特異性抗體水平的檢測(cè)結(jié)果
每次免疫后的14d，分別斷尾采血，分離血清，用ELISA檢測(cè)抗原特異抗體水平的變化。 結(jié)果見(jiàn)表
表I免疫小鼠血清抗VPl蛋白抗體的ELISA檢測(cè)結(jié)果(0D450nm值)
免疫組別首免后第14d二免后第14d三免后第14dpGAPZ a A-SP進(jìn)口油乳劑組O. 433±0. 1150. 760±0. 076I. 610±0. 115pGAPZ a A-SP無(wú)佐劑組O. 510±0. 0830. 633±0. 2300. 649±0. 083pGAPZa A 組O. 323±0. 0500. 327±0. 0670. 334±0. 050陽(yáng)性對(duì)照組0. 635±0. 054I. 671±0. 0422. 764±0. 054PBS對(duì)照組0. 297±0. 0400. 305±0. 0430. 313±0. 040
由表I可見(jiàn)，三免后第14d，陽(yáng)性對(duì)照組與其它各組抗體水平有顯著差異(P < O. 05)； pGAPZ a A-SP進(jìn)口油乳劑組從二免后抗體水平上升較快，三免后與pGAPZ a A-SP無(wú)佐劑組、 空載體組及PBS對(duì)照組均有顯著差異；pGAPZ a A-SP無(wú)佐劑組產(chǎn)生了一定水平的抗體，但是三次免疫數(shù)值變化不大；pGAPZ a A組及PBS對(duì)照組無(wú)豬O型口蹄疫特異性抗體產(chǎn)生。以上結(jié)果說(shuō)明，本發(fā)明中所提供的豬O型口蹄疫合成肽疫苗生產(chǎn)過(guò)程無(wú)需接觸任何口蹄疫活毒，安全可靠。同時(shí)，所采用的佐劑副作用小，能大幅度提高機(jī)體對(duì)合成肽的特異性免疫應(yīng)答?？傊?，該疫苗免疫原性良好，安全性高，生產(chǎn)成本低廉，具有很好的應(yīng)用價(jià)值和推廣前景。
權(quán)利要求
1.一種豬O型口蹄疫合成肽疫苗，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示，基因序列如SEQ ID NO:2所示；所述氨基酸序列采用的是豬O型口蹄疫VPl蛋白中具有抗原性的141-160位及200-213位氨基酸肽段，并將其組成多拷貝的串聯(lián)結(jié)構(gòu)，在肽段連接處加入氨基酸多肽作為接頭；抗原多肽采用如下串聯(lián)結(jié)構(gòu)Y-M-X-N-Y，其中“X”和“Y”分別代表豬 O型口蹄疫VPl蛋白141-160、200-213位氨基酸肽段；“M”和“N”分別代表“Pro-Gly”二肽接頭及十一肽接頭，所述十一肽接頭的氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示。
2.權(quán)利要求I所述豬O型口蹄疫合成肽疫苗的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1)應(yīng)用重組DNA技術(shù)，合成編碼豬O型口蹄疫合成肽的DNA序列，構(gòu)建pGAPZa A-SP 表達(dá)載體；(2)重組表達(dá)載體pGAPZa A-SP轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞畢赤酵母中，構(gòu)建表達(dá)工程菌；(3)發(fā)酵培養(yǎng)重組酵母菌，進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物作SDS-PAGE及Western-blot分析鑒(4)表達(dá)產(chǎn)物純化，并選用佐劑乳化制成新型的豬O型口蹄疫合成肽疫苗。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述豬O型口蹄疫合成肽疫苗的制備方法，其特征在于所述表達(dá)載體為畢赤酵母表達(dá)載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述豬O型口蹄疫合成肽疫苗的制備方法，其特征在于所述步驟(3)具體為用滅菌牙簽細(xì)挑篩選到的具有Zeocin抗性的單菌落，挑于5mL的YPD液體培養(yǎng)基中進(jìn)行一級(jí)培養(yǎng)，28°C-30°C，200 r/min振蕩過(guò)夜，至0D600=2_6，此時(shí)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；取I mL—級(jí)培養(yǎng)液,重懸于30 mL的YPD中，繼續(xù)振蕩培養(yǎng),用四層干凈的紗布外加兩層報(bào)紙包扎。
5.培養(yǎng)72小時(shí)，3000r/min離心5 min，收集培養(yǎng)液上清，即得純化蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述豬O型口蹄疫合成肽疫苗的制備方法，其特征在于所述步驟(4)中所述佐劑為進(jìn)口油乳佐劑。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種豬O型口蹄疫合成肽疫苗及其制備方法。本發(fā)明是通過(guò)選擇真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)合成肽基因，然后將表達(dá)產(chǎn)物乳化成疫苗，應(yīng)用了基因工程技術(shù)高效穩(wěn)定表達(dá)了豬O型口蹄疫合成肽，生產(chǎn)成本低，易放大，且沒(méi)有毒副作用和生物安全方面的擔(dān)憂，適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，為臨床上口蹄疫防控及治療提供一種價(jià)格便宜的新型豬O型口蹄疫疫苗。
文檔編號(hào)A61K39/135GK102580076SQ20111043730
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2011年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月23日
發(fā)明者何俊, 劉德輝 申請(qǐng)人:廣州自遠(yuǎn)生物科技有限公司