專利名稱：Pl2l60來(lái)源的ctl表位肽及其應(yīng)用的制作方法
PL2L60來(lái)源的CTL表位肽及其應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物化學(xué)領(lǐng)域中的多肽技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種PL2L60來(lái)源的CTL 表位肽，本發(fā)明還涉及該肽在制備治療性多肽疫苗中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
PIWIL2在正常組織中僅存在于睪丸組織中，在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌以及睪丸癌等腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，尤其是在乳腺癌中表達(dá)率高達(dá)100%，而在正常乳腺組織中不表達(dá)。
PIWIL2與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，是一個(gè)非常好的腫瘤診斷和治療的靶點(diǎn)， 更重要的是，由于其特殊的組織表達(dá)特征以及與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)聯(lián)性，使其成為一個(gè)非常理想的乳腺癌免疫治療靶抗原。
最新研究發(fā)現(xiàn)，全長(zhǎng)PIWIL2在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)量比較低，在一些凋亡和正在凋亡的細(xì)胞中是檢測(cè)不到的，而在腫瘤細(xì)胞中其剪接體PL2L60是顯著表達(dá)的。
細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的抗感染與抗腫瘤效應(yīng)，主要是通過(guò)與MHC- I類分子高親和力結(jié)合的表位多肽觸發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)答來(lái)實(shí)現(xiàn)的。然而在胸腺發(fā)育過(guò)程中，許多針對(duì)高親和力表位的T細(xì)胞克隆由于陰性選擇已被清除，導(dǎo)致基于高親和力表位的多肽疫苗在體試驗(yàn)療效并不理想。因此，針對(duì)低親和力表位進(jìn)行適當(dāng)改造，可最大限度地激活體內(nèi)免疫應(yīng)答，有望構(gòu)建更為有效的多肽疫苗形式。
用CTL表位多肽疫苗免疫病人以誘導(dǎo)抗腫瘤T細(xì)胞反應(yīng)，在早期的臨床實(shí)驗(yàn)中己取得了初步的療效，但總體來(lái)說(shuō)反應(yīng)率很低。主要原因在于表位多肽的低免疫原性及易被蛋白酶分解，通過(guò)對(duì)表位多肽進(jìn)行修飾(包括單個(gè)氨基酸的替換、多肽的PMRI修飾和脂肽等)或采用多價(jià)疫苗則可有效提高其免疫原性，誘導(dǎo)更強(qiáng)的CTL活性。
CTL表位兩端錨點(diǎn)殘基的替換能夠增強(qiáng)表位與MHC-I分子的親和力。因?yàn)檫@些殘基深深地埋藏在MHC-I類分子的口袋中，它不會(huì)影響TCR對(duì)p/MHC-I復(fù)合物的識(shí)別。除此之夕卜，TCR和CTL表位主要是通過(guò)TCR的互補(bǔ)決定區(qū)3 (⑶R3)環(huán)處接觸的，而互補(bǔ)決定區(qū)3 (⑶R3)是高度可變的。在TCR識(shí)別p/MHC復(fù)合物的前兩步中，⑶R3環(huán)對(duì)表位的完全包圍是極其重要的。不同的TCRs以不同的方式和一個(gè)已知的p/MHC-I復(fù)合物進(jìn)行結(jié)合。所以替換表位中部TCR識(shí)別的殘基要依據(jù)它與TCR空間結(jié)合構(gòu)象，使表位有效地和DR3結(jié)合，這樣才能夠有效地活化T細(xì)胞增殖，并使T細(xì)胞在體內(nèi)保持較長(zhǎng)時(shí)間的免疫應(yīng)答能力。改造CTL 表位應(yīng)根據(jù)腫瘤病人各自的HLA類型及特點(diǎn)，這樣就能有助于CTL表位對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性免疫反應(yīng)。由于在中國(guó)HLA-A*02陽(yáng)性人群在我國(guó)高達(dá)50%。所以本發(fā)明選擇HLA_A*02 限制性CTL表位具有重要意義。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種對(duì)腫瘤細(xì)胞MCF-7具有一定殺傷力的PL2L60來(lái)源的 CTL表位肽，同時(shí)本發(fā)明還提供了該肽在制備腫瘤治療性多肽疫苗中的應(yīng)用。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明可采取下述技術(shù)方案本發(fā)明所述的PL2L60來(lái)源的CTL表位肽為九肽，其氨基酸序列為a -Leu-Gly-Gly-Glu -Leu-Trp-Gly-Val ；其中 a 為 D-Tyr、1-Nal、4_Cl_Phe 或 Phe。
當(dāng)a 為 D-Tyr 時(shí)，記為 P281 I-D-Tyr,其氨基酸序列為=D-Tyr-Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val。
當(dāng) a 為 I-Nal 時(shí)，記為 P281 I-I-Nal，其氨基酸序列為I-Nal-Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val。
當(dāng) a 為 4-Cl-Phe 時(shí)，記為 P281 l-4-Cl-Phe，其氨基酸序列為4-Cl-Wie -Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val。
當(dāng)a 為 Phe 時(shí)，記為 P281 IF。
其氨基酸序列為Phe-Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val。
上述的PL2L60來(lái)源的CTL表位肽在制備腫瘤治療性多肽疫苗中的應(yīng)用。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于針對(duì)低親和力表位進(jìn)行改造，篩選出能活化T細(xì)胞增殖，更有效的能激活體內(nèi)免疫應(yīng)答的改造肽。鑒定的九肽未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，為研制基于抗原PL2L60的腫瘤治療性多肽疫苗提供了理論基礎(chǔ)，并為后續(xù)多價(jià)的抗原肽疫苗、長(zhǎng)肽疫苗、多表位疫苗等的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。


圖 1-5 依次是表位肽 P281、P^1 l-D-Tyr,P281 1-1-Nal、l-4-Cl-Phe 和 M81 IF 的質(zhì)譜分析圖。
圖6、7是本發(fā)明表位肽誘導(dǎo)的特異性CTL對(duì)腫瘤細(xì)胞MCF-7(HLA-A*0201-陽(yáng)性， PL2L60-陽(yáng)性)的殺傷作用。
圖8是本發(fā)明表位肽誘導(dǎo)的特異性CTL分泌IFN-γ的能力。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明所述的PL2L60來(lái)源的CTL表位肽為九肽，基礎(chǔ)肽為P^l，氨基酸序列為 Lys -Leu-Gly-Gly-Glu -Leu-Trp-Gly-Val,分子量為 958. 1 ；當(dāng)將第一位氨基酸改造為D-Tyr，記為P281 I-D-Tyr,氨基酸序列為=D-Tyr-Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val，分子量為 993. 2。
當(dāng)將第一位氨基酸改造為I-Nal，記為P281 l_l_Nal，氨基酸序列為I-Nal-Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val，分子量為 1026. 15。
當(dāng)將第一位氨基酸改造為4-Cl-Phe，記為P281 l-4-Cl-Phe，氨基酸序列為 4-Cl-Phe -Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val，分子量為 1011.46。
當(dāng)將第一位氨基酸改造為Wie，記為P281 1F，氨基酸序列為 Phe -Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val，分子量為 977. 1。
所述的PL2L60來(lái)源的CTL表位肽在制備腫瘤治療性多肽疫苗中的應(yīng)用。
本發(fā)明采用理論與實(shí)踐相結(jié)合的方法，根據(jù)抗原的一級(jí)結(jié)構(gòu)，采用免疫信息學(xué)手段，運(yùn)用 SYFPEITHI、BIMAS、NetCTL 1. 2 和 IEDB 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì) PL2L60 蛋白抗原的 HLA_A*0201 限制性CTL表位進(jìn)行了預(yù)測(cè)分析。分析預(yù)測(cè)的篩選，選擇相對(duì)免疫活性較好的CTL表位P281，然后對(duì)P281進(jìn)行了進(jìn)一步的改造，得到了 CTL表位P281 1-D-Tyr, P281 I-I-Nal, P281 l-4-Cl-Phe和P281 IF0即使用Tyr的類似物來(lái)替換抗原肽1位氨基酸殘基，在設(shè)計(jì) Tyr類似物時(shí)保留其側(cè)鏈的芳環(huán)，著重研究酚羥基的電荷特性、形成氫鍵的能力以及芳環(huán)大小在增強(qiáng)母體抗原肽結(jié)合力和免疫原性中的作用，為以后表位疫苗的構(gòu)建打下基礎(chǔ)。
所述表位JftP281l-D_Tyr、P281 l_l_Nal、P281 l-4-Cl-Phe 和 P281 IF 采用標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc方案進(jìn)行合成，經(jīng)HPLC純化后，其純度大于90%，質(zhì)譜分析并證實(shí)其分子量符合理論值。表位肽 P281 及 M81 l-D-Tyr、P281 l-l-Nal,P281 l-4-Cl-Phe 和 M81 IF 的質(zhì)譜鑒定圖見(jiàn)圖1-5。
上述表位肽的合成及制備采用固相合成法。基本流程如下首先將一個(gè)氨基被 Fmoc基團(tuán)保護(hù)的氨基酸連接在不溶性固相載體Wang樹(shù)脂上，然后脫掉氨基的保護(hù)基，第一個(gè)氨基酸即連接至固相載體上；其次將氨基被Fmoc基團(tuán)保護(hù)的第二個(gè)氨基酸的羧基用縮合劑活化，活化后的氨基酸再與已接在固相載體的第一個(gè)氨基酸的氨基反應(yīng)形成肽鍵，此時(shí)在固相載體上就生成了一個(gè)帶有保護(hù)基的二肽。重復(fù)上述的肽鍵形成反應(yīng)，使肽鏈從C 端向N端生長(zhǎng)，直至達(dá)到所需要的肽鏈長(zhǎng)度，最后切割得到目的肽。經(jīng)HPLC純化后，其純度大于90%，質(zhì)譜分析并證實(shí)其分子量符合理論值。(參見(jiàn)①黃惟德、陳常慶著，多肽合成，科學(xué)出版社，1985年。②.N.休厄德、H. D.賈庫(kù)布克著，劉克良等譯，肽化學(xué)與生物學(xué)，科學(xué)出版社，2005年)本發(fā)明表位肽的人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)的分離與ELISP0T實(shí)驗(yàn)檢測(cè) 抽取健康供者的外周血經(jīng)密度梯度離心分離，獲得PBMCs，添加白細(xì)胞介素2 (IL-2， Peprotech公司)和人β 2微球蛋白誘導(dǎo)分化CTL細(xì)胞，進(jìn)一步在體外LDH和ELISP0T實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。方法如下UPBMCs的分離與誘導(dǎo)⑴以40ml PBSCPH 7. 2)稀釋抗凝處理后的外周血40ml ； (2) 離心管中加入鈿1 Lymphoprep分離液(Axis-Shield公司);(3)加8ml步驟(1)中稀釋后的外周血于鈿1 Lymphoprep分離液液面上；(4)20°C離心(2000rmpX20min); (5)離心后， 分為四層，棄去最上層，用玻璃吸管吸取第二層即白膜層(富含PBMCs) ;(6)吸出的白膜層用PBS CpH 7. 2)離心洗滌兩次；(7)用M孔板鋪板，細(xì)胞的濃度為1X10 6/ml，每孔Iml ； (8)第二天每孔加入3 μ g人β 2微球蛋白和10 μ g表位肽，同時(shí)設(shè)立PBS組(以PBS替代表位肽)作為陰性對(duì)照組；(9)第三天每孔加入50u IL-2;每2 3天換液，于七天后進(jìn)行第二輪荷肽(即每孔補(bǔ)加50u IL-2U0 PgAi^2微球蛋白和10 μ g表位肽/PBS)，十四天后進(jìn)行第三輪荷肽。第三輪荷肽后3天，得到效應(yīng)細(xì)胞CTL，然后進(jìn)行LDH實(shí)驗(yàn)和ELISP0T 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)待測(cè)肽的作用。
2、LDH 檢測(cè)使用 CytoiTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay (細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒，Promega公司)進(jìn)行LDH試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞毒活性。步驟如下(詳見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū))1)設(shè)立檢測(cè)板(100 μ 1/孔)(1)設(shè)立實(shí)驗(yàn)組以腫瘤細(xì)胞EC-9706(ATCC公司)作為靶細(xì)胞(最優(yōu)靶細(xì)胞數(shù)5000) 按不同效靶比10:1、20:1、40:1加入上述效應(yīng)細(xì)胞CTL ；(2)設(shè)立效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放組；(3)設(shè)立靶細(xì)胞自發(fā)釋放組；(4)設(shè)立靶細(xì)胞最大釋放組；(5)設(shè)立體積校正對(duì)照組；(6)設(shè)立背景對(duì)照組。
2)細(xì)胞裂解及收獲上清(1)37 °C、5%C02 孵育檢測(cè)板(5h )；(2)靶細(xì)胞最大釋放組和體積校正對(duì)照組中加入裂解液，每100μ 1培養(yǎng)基中加入 10 μ 1裂解液(10 X )，收獲上清前45min加入裂解液；(3)250g離心4min,收獲上清。
3) LDH 檢測(cè)(1)轉(zhuǎn)移50μ 1上清至另一孔板；(2)50 μ 1/孔迅速添加稀釋的底物混合液，室溫避光孵育30min ；(3)添加50μ 1終止溶液;(4)將孔中含有的氣泡去除，一小時(shí)內(nèi)檢測(cè)490nm吸收值0D。
細(xì)胞殺傷率計(jì)算公式如下(%) = [ (0D實(shí)驗(yàn)組_0D效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放組—ODm細(xì)胞自發(fā)釋放組)/( OD ^細(xì)胞最大釋放組—OD^細(xì)胞自發(fā)釋放組)]X 100%(注所有實(shí)驗(yàn)組、效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放組、靶細(xì)胞自發(fā)釋放組的吸收值均應(yīng)減去背景平均吸收值；靶細(xì)胞最大釋放組吸收值應(yīng)減去體積校正對(duì)照組的平均吸收值)結(jié)果見(jiàn)圖6、7，由圖6、7可知，表位肽誘導(dǎo)的特異性CTL對(duì)腫瘤細(xì)胞MCF-7 (HLA-A*0201-陽(yáng)性，PL2L60-陽(yáng)性)均顯示出一定的殺傷率。
3、ELISP0T實(shí)驗(yàn)具體實(shí)驗(yàn)步驟如下(1)封閉取出所需板條，用含5% FCS RPMI 1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)基封閉，200 μ L /孔，室溫下(25°C)靜置5 10 min后將其扣出(FCS可以封閉所包被抗體的FCS受體以降低非特異性反應(yīng))；(2)細(xì)胞上板誘導(dǎo)的CTL作為效應(yīng)細(xì)胞(IX IO5/孔)，荷肽的T2A2細(xì)胞作為刺激細(xì)胞(IX IO5/孔)鋪板。100 μ L/孔。細(xì)胞在孔中的分布要盡量均勻(加入細(xì)胞之后，不要再震動(dòng)或者拍擊ELISP0T板)；·正對(duì)照細(xì)胞濃度為IX IO5/孔、加入10 UL ΡΗΑ，該濃度能有效刺激IFN-γ的分泌；·背景負(fù)對(duì)照加入100 μ L的含5%FCS的RPMI 1640培養(yǎng)基；(3)加完所有的樣品之后，蓋上板蓋，放入0)2培養(yǎng)箱，37 °C培養(yǎng)18h; (4)裂解細(xì)胞傾倒孔內(nèi)的細(xì)胞及培養(yǎng)基，200 μ L/孔加入冰冷的去離子水，4 ！冰浴反應(yīng)10 min(低滲法裂解細(xì)胞)；(5)洗滌傾倒孔內(nèi)的液體，IX的Washing Buff er，200 μ L/孔，洗滌5 7次，每次停留30 60 s，最后一次，在吸水紙上扣干；(6)加入檢測(cè)抗體孵育每孔加入100 μ L稀釋好的生物素標(biāo)記檢測(cè)抗體，37 °C孵育Ih ； (7)洗滌傾倒孔內(nèi)的液體，1 X的Washing Buffer, 200 μ L/孔，洗滌5次，每次停留時(shí)間為3(T60 s，最后一次，在吸水紙上扣干；(8)酶聯(lián)親和素孵育將稀釋好的酶聯(lián)親和素工作液加入到實(shí)驗(yàn)孔，100 μ L/孔，37 °C孵育Ih; (9)洗滌傾倒孔內(nèi)的液體， IX的Washing Buffer，200uL/孔，洗滌5次，每次停留時(shí)間為30 60 s，最后一次，在吸水紙上扣干；(10)顯色解凍已配好的AEC顯色液。每孔加入100 PL的顯色液，室溫靜置 15-45min (在20 -25° C，顯色25min較合適)，注意避光；(11)終止顯色傾倒孔內(nèi)液體， 揭開(kāi)板底座，以去離子水洗滌3飛遍，終止顯色過(guò)程。將板倒扣在吸水紙上，拍干細(xì)小的水珠，之后取下保護(hù)層，放在通風(fēng)的地方，室溫靜置10-30min，讓膜自然晾干；用ELISP0T圖6象分析儀計(jì)數(shù)96孔板中每孔形成的斑點(diǎn)數(shù)。
體外ELISP0T 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示候選肽 M81 1-D-Tyr、P281 1-1-Nal, P281 1-4-Cl-Phe、P281 IF均能夠在2名健康供者的外周血中誘導(dǎo)獲得CTL，且獲得的CTL經(jīng)刺激后分泌較高量的IFN- γ (如圖8)。
本發(fā)明鑒定出的腫瘤抗原的表位肽為研制基于抗原PL2L60的腫瘤治療性多肽疫苗提供了理論基礎(chǔ)，通過(guò)對(duì)表位多肽進(jìn)行修飾有效提高其免疫原性，誘導(dǎo)出更強(qiáng)的CTL活性，并為后續(xù)多價(jià)的抗原肽疫苗、長(zhǎng)肽疫苗、多表位疫苗等的構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。
權(quán)利要求
1.PL2L60來(lái)源的CTL表位肽，其特征在于所述的表位肽為九肽，其氨基酸序列為a -Leu-Gly-Gly-Glu -Leu-Trp-Gly-Val ；其中 a 為 D_Tyr、l-Nal、4-Cl_Phe 或 Phe。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PL2L60來(lái)源的CTL表位肽，當(dāng)a為D-Tyr時(shí)，其氨基酸序列為:D-Tyr-Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PL2L60來(lái)源的CTL表位肽，當(dāng)a為I-Nal時(shí)，其氨基酸序列為I-Nal-Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PL2L60來(lái)源的CTL表位肽，當(dāng)a為4_C1-Phe時(shí)，其氨基酸序列為4-Cl-Phe -Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的PL2L60來(lái)源的CTL表位肽，當(dāng)a為Phe時(shí)，其氨基酸序列為 Phe-Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一所述的PL2L60來(lái)源的CTL表位肽在制備腫瘤治療性多肽疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了PL2L60來(lái)源的CTL表位肽，氨基酸序列為a-Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val；a為D-Tyr時(shí)，氨基酸序列為D-Tyr-Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val；a為1-Nal時(shí)，氨基酸序列為1-Nal-Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val；a為4-Cl-Phe時(shí)，氨基酸序列為4-Cl-Phe-Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val；a為Phe時(shí)，氨基酸序列為Phe-Leu-Gly-Gly-Glu-Leu-Trp-Gly-Val；本發(fā)明還公開(kāi)了PL2L60來(lái)源的CTL表位肽在制備腫瘤治療性多肽疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于針對(duì)低親和力表位進(jìn)行改造,篩選出能活化T細(xì)胞增殖，更有效的激活體內(nèi)免疫應(yīng)答的改造肽，為研制基于抗原PL2L60的腫瘤治療性多肽疫苗提供了理論基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)A61K39/00GK102516363SQ20121000155
公開(kāi)日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2012年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月5日
發(fā)明者劉偉, 時(shí)冉冉, 祁元明, 翟明霞, 高艷鋒 申請(qǐng)人:鄭州大學(xué)