專利名稱：富含鳥嘌呤的核酸適體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種富含鳥嘌呤的核酸適體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
癌癥是一類引起人類死亡的主要疾病，每年全球因癌癥死亡人數(shù)大約為700萬。隨著細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展以及對(duì)癌癥發(fā)病機(jī)制的了解，癌癥的化學(xué)藥物治療得到了很好的發(fā)展。目前大約有90多種化學(xué)藥物發(fā)展用于殺死腫瘤細(xì)胞和癌癥治療。但是這些藥物缺乏特異性，在臨床上通常給患者帶來致命的副作用。因此需要發(fā)展特異性殺死腫瘤或抑制其生長的靶向藥物。核酸適體是通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化法從DNA/RNA文庫中篩選出來的單鏈寡核酸分子(ssDNA或ssRNA)。它通過分子內(nèi)堿基堆積、疏水、氫鍵和靜電等作用力折疊成獨(dú)特的空間結(jié)構(gòu)，從而高特異性和高親和力識(shí)別其靶標(biāo)分子。核酸適體與靶標(biāo)分子結(jié)合的特異性和親和力與抗體相似，甚至更強(qiáng)。核酸適體具有較低的分子量、無免疫原性、快速的組織通透性和良好的代謝動(dòng)力學(xué)。核酸適體一旦證實(shí)，就可以通過自動(dòng)化的固相合成的方法制備，從而保證了不同批次之間產(chǎn)品不會(huì)存在差異。核酸適體化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定和容易通過化學(xué)修飾賦予其其它功能。更重要的是，與抗體相比，核酸適體的靶標(biāo)范圍更廣。一些與疾病緊密相關(guān)的生長因子、酶、受體以及腫瘤標(biāo)志物等物質(zhì)都能成為核酸適體的靶標(biāo)。目前針對(duì)血管表皮生長因子受體的核酸適體作為治療老年濕性黃斑疾病藥物已經(jīng)被FDA批準(zhǔn)上市；同時(shí)還有八種核酸適體藥物處于不同臨床考察階段。因此針對(duì)與疾病相關(guān)分子的核酸適體作為一種潛在治療藥物吸引著研究者的注意。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種核酸適體及其衍生物。本發(fā)明所提供的核酸適體及其衍生物，所述核酸適體為如下1)-4)中的至少一種I) SEQ ID NO 1 所示的 DNA 分子；2) SEQ ID NO 2 所示的 DNA 分子；3) SEQ ID NO 3 所示的 DNA 分子；4) SEQ ID NO 4 所示的 DNA 分子。所述核酸適體的衍生物為如下a)_f)中的至少一種
a)將所述核酸適體刪除部分核苷酸或增加部分核苷酸，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體衍生物；
b)將所述核酸適體部分堿基用天然或人造核苷酸堿基替代后，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體衍生物；c)將所述核酸適體的骨架改造為硫代磷酸酯骨架，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生物；d)將所述核酸適體改造為肽核酸，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生物；e)將所述核酸適體用聚乙二醇修飾，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生物；f)將所述核酸適體與其它藥物聯(lián)用，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生物。
上述核酸適體及其衍生物在制備預(yù)防和/或治療腫瘤的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述核酸適體及其衍生物在制備抑制腫瘤細(xì)胞增殖的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。上述應(yīng)用中，所述腫瘤為肺腺癌、肝癌和/或乳腺癌。上述應(yīng)用中，所述腫瘤細(xì)胞為MCFlOCAld或乳腺腫瘤干細(xì)胞。本發(fā)明為癌癥的治療提供了一種核酸適體藥物。與其它腫瘤化療藥物相比，核酸適體藥物具有很多優(yōu)勢抑制腫瘤細(xì)胞增殖的特異性、容易合成和修飾、無免疫原性、能快速的穿透組織和良好的代謝動(dòng)力學(xué)。


圖I為不同濃度的核酸適體對(duì)肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞增殖的影響。圖2為核酸適體對(duì)不同腫瘤細(xì)胞株增殖的影響。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例I、核酸適體及其衍生物一、核酸適體S50 GGGCGGGGGGTGGGGTGGTTGG(SEQ ID NO 1)；S49 GGG GGG TGG GGT GGT TGG(SEQ ID NO 2)；Sll GGT GGG TGG GTT GGG TGG(SEQ ID NO 3)；S6 GGG TGTAGG GGT GGG GAT TGT GGG(SEQ ID NO :4)；隨機(jī)序列5'-ACG CTC GGA TGC CAC TAC AG-(N40)-C TCA TGG ACG TGC TGGTGA C-3'。A、G、C和T分別代表未經(jīng)修飾的腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶。二、核酸適體衍生物所述核酸適體的衍生物為如下a) -f)所示a)將所述核酸適體刪除部分核苷酸或增加部分核苷酸，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體衍生物；b)將所述核酸適體部分堿基用天然或人造核苷酸堿基替代后，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體衍生物；c)將所述核酸適體的骨架改造為硫代磷酸酯骨架，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生物；d)將所述核酸適體改造為肽核酸，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生物；e)將所述核酸適體用聚乙二醇修飾，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生物；f)將所述核酸適體與其它藥物聯(lián)用，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生物。實(shí)施例2、核酸適體的應(yīng)用一、核酸適體的合成及其預(yù)處理用AB 3400DNA合成儀合成核酸適體S50、核酸適體S49、核酸適體SI I、核酸適體S6及隨機(jī)序列，合成的DNA經(jīng)HPLC純化、真空干燥、80%醋酸去除DMT、乙醇沉淀和真空干燥、用Tris-HCl (pH 9. 0)調(diào)節(jié)pH至7. 0，過濾滅菌后，最終用無菌的D-PBS稀釋至500 y M，于-20°C保存?zhèn)溆谩６?、?xì)胞實(shí)驗(yàn)肺腺癌A549細(xì)胞系購自ATCC，編號(hào)為CCL-185 ；人正常支氣管上皮HBE細(xì)胞系購自ATCC，編號(hào)為CRL-2078.腫瘤干細(xì)胞為乳腺腫瘤干細(xì)胞在文獻(xiàn)“Cancer Research, 2010, 70 :3005_3008”中公開過，公眾可從中國科學(xué)院化學(xué)研究所獲得。乳腺癌MCFlOCAld細(xì)胞系和人乳腺表皮MCF10A1細(xì)胞系均在文獻(xiàn)(Breast CancerResearch and Treatment, 2001,65 :101-110 ;BMC Cancer, 2002, 2 :1-7)中公開過，公眾可從中國科學(xué)院化學(xué)研究所獲得。(一 )不同濃度的核酸適體對(duì)A549細(xì)胞增殖的影響用于培養(yǎng)A549細(xì)胞的培養(yǎng)基為DMEM+10%胎牛血清。A549細(xì)胞經(jīng)胰酶-EDTA處理和離心后，按照4000個(gè)細(xì)胞/毫升重新懸浮在新鮮培養(yǎng)基中，接著以800細(xì)胞/孔的密度種植于96孔板中。將96孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)后，移除培養(yǎng)基，加入200微升37°C預(yù)熱的新鮮培養(yǎng)基。然后分別往各孔培養(yǎng)基中加入核酸適體或隨機(jī)序列，使其最終濃度分別為0 ii M、0. 5 ii M、I ii M、2 ii M、4 ii M、8 ii M、12 ii M和16yM。將96孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育。四天后，用MTS方法檢測細(xì)胞的增殖程度。每組處理均設(shè)置3組平行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞相對(duì)數(shù)目的統(tǒng)計(jì)或計(jì)算方法MTS法最后一步是在490納米下，用酶標(biāo)儀讀數(shù)，依據(jù)細(xì)胞活性狀態(tài)不同，染色程度不一樣，最后得到的數(shù)值也不同。結(jié)果如表I和圖I所示。實(shí)驗(yàn)表明5 U M的四種核酸適體均能明顯抑制A549細(xì)胞增殖，然而隨機(jī)序列不能抑制A549的增殖。表I、各組的細(xì)胞相對(duì)數(shù)目權(quán)利要求
1.核酸適體及其衍生物，所述核酸適體為SEQID NO :4所示的DNA分子。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的核酸適體及其衍生物，其特征在于所述核酸適體的衍生物為如下a)_f)中的至少一種 a)將所述核酸適體刪除部分核苷酸或增加部分核苷酸，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體衍生物； b)將所述核酸適體部分堿基用天然或人造核苷酸堿基替代后，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體衍生物； c)將所述核酸適體的骨架改造為硫代磷酸酯骨架，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生物； d)將所述核酸適體改造為肽核酸，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生物； e)將所述核酸適體用聚乙二醇修飾，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生物； f)將所述核酸適體與其它藥物聯(lián)用，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生物。
3.權(quán)利要求I或2所述核酸適體及其衍生物在制備預(yù)防和/或治療腫瘤的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求I或2所述核酸適體及其衍生物在制備抑制腫瘤細(xì)胞增殖的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的應(yīng)用，其特征在于所述腫瘤為肺腺癌、肝癌和/或乳腺癌。
6.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的應(yīng)用，其特征在于所述腫瘤細(xì)胞為MCFlOCAld或乳腺腫瘤干細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種富含鳥嘌呤的核酸適體及其應(yīng)用。核酸適體為如下1)-4)中的至少一種1)SEQ ID NO1所示的DNA分子；2)SEQ ID NO2所示的DNA分子；3)SEQ ID NO3所示的DNA分子；4)SEQ ID NO4所示的DNA分子。本發(fā)明為癌癥的治療提供了一種核酸適體藥物。與其它腫瘤化療藥物相比，核酸適體藥物具有很多優(yōu)勢抑制腫瘤細(xì)胞增殖的特異性、容易合成和修飾、無免疫原性、能快速的穿透組織和良好的代謝動(dòng)力學(xué)。
文檔編號(hào)A61K48/00GK102628046SQ20121011162
公開日2012年8月8日 申請日期2011年5月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月26日
發(fā)明者徐麗, 方曉紅, 譚蔚泓, 趙子龍 申請人:中國科學(xué)院化學(xué)研究所