專利名稱：一種抗栓、溶栓口服液的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗栓、溶栓口服液，具體涉及一種利用雞卵清蛋白酶解物制備抗栓、溶栓口服液的方法，屬于醫(yī)藥、保健食品生產(chǎn)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
世界上心腦血管疾病的死亡率一直居于前二位，全世界每年死于該類疾病的人數(shù)超過1500萬，其中血栓栓塞性心腦血管疾病發(fā)病率和死亡率最高。據(jù)衛(wèi)生部統(tǒng)計(jì),我國(guó)每年死于心腦血管疾病約200萬人，超過全部死亡病人的50%。心腦血管疾病中有很大比例是血栓病,并以血栓病的發(fā)病率、致殘率和死亡率最高,其病因是血栓的形成。血栓性疾病治療的最有效辦法是溶栓治療，人類每年需要為該類疾病支出巨額藥費(fèi)。 導(dǎo)致血管內(nèi)血栓形成雖有多種因素，但凝血酶誘發(fā)的血液凝固是血栓形成的主要觸發(fā)機(jī)理。血栓對(duì)血液的流動(dòng)產(chǎn)生阻礙，使相應(yīng)的組織、器官出現(xiàn)不同程度的栓塞，之后會(huì)因缺乏氧和營(yíng)養(yǎng)成分而導(dǎo)致一系列臨床癥狀的出現(xiàn)如果血管栓塞發(fā)生在腦動(dòng)脈，腦就會(huì)因?yàn)楣Ｈ蝗黄c失語，甚至死亡；如果血管栓塞發(fā)生在心臟血管的重要部位，心臟就會(huì)因血液供應(yīng)中斷而停止跳動(dòng)，導(dǎo)致猝死等等。血栓相關(guān)疾病起病隱匿，發(fā)病急驟，致殘致死率高，血栓是心腦血管疾病致人死、殘的元兇。當(dāng)前，國(guó)內(nèi)外治療血栓栓塞性心腦血管疾病主要使用肝素類產(chǎn)品。但肝素的療效不理想而且副作用較大，急需替代的產(chǎn)品。水蛭素是水蛭唾液腺內(nèi)一類相對(duì)分子質(zhì)量約7 000的多肽，研究發(fā)現(xiàn)，水蛭素是凝血酶的特效抑制劑，它主要通過靠近肽鏈C-端的由3 4個(gè)酸性氨基酸組成的活性部位與凝血酶富含堿性氨基酸的活性部位特異性結(jié)合。試驗(yàn)結(jié)果表明，水蛭素既能防止新的血栓形成，還能使已形成的血栓溶解，對(duì)多種血栓疾病都具有極好的預(yù)防和治療作用。CN1864731A公開了一種抗栓降脂降壓口服液，CN1325699也公開了一種溶栓靈口服液，由地龍、水蛭及其它中草藥成分組成，口服給藥雖然方便，但因水蛭素被患者胃腸道水解，會(huì)喪失抗栓、溶栓的效果；雖然注射給藥療效很好，但反復(fù)注射會(huì)給患者帶來很大的痛苦和不便，難以適應(yīng)大多數(shù)慢性高凝態(tài)患者長(zhǎng)期抗凝治療的需要。而且水蛭飼養(yǎng)成本較高，水蛭素提取工藝復(fù)雜、設(shè)備投入大，注射劑價(jià)格較高，患者承受的經(jīng)濟(jì)壓力大。CN102475340A公開了一種柚汁溶栓口服液，由柚子汁加工而成，由其本身所含營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生理活性起到抗栓的效果。雞蛋營(yíng)養(yǎng)豐富，卵清的蛋白質(zhì)含量約10%，在蛋白酶的作用下，蛋白質(zhì)可被水解為肽，近年研究發(fā)現(xiàn)，2 3肽能被人體完全迅速吸收，4肽、5肽甚至6肽都能被動(dòng)物直接吸收。目前，國(guó)內(nèi)一些學(xué)者進(jìn)行過雞卵清蛋白酶解物實(shí)驗(yàn)及產(chǎn)物的功能特性研究，楊萬根等發(fā)表的《膜反應(yīng)器制備的蛋清水解物的營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)》、《蛋清蛋白酶解物的抗氧化、抗凝血活性及生化特性的研究》、《酶膜反應(yīng)器制備抗凝血酶蛋清水解物的研究》分別用Alcalase 2. 4L堿性蛋白酶、Protease N蛋白酶及用Protease N蛋白酶制成的酶膜生物反應(yīng)器處理雞卵清蛋白，得到的酶解物均具有較強(qiáng)的抗凝血酶活性。但是，由于他們?cè)诿附膺^程中，每個(gè)酶解體系只使用I種蛋白酶，所以蛋白質(zhì)的水解度不高，水解物中含2 4個(gè)氨基酸殘基的肽(2 4肽)含量較低(約為71%)，雞卵清蛋白中具有抗栓、溶栓活性的肽段未能充分釋放出來。為了克服此不足，本發(fā)明人模擬蛋白質(zhì)在人體內(nèi)消化的條件，利用胃蛋白酶、胰蛋白酶這兩種酶組成的混合酶解體系水解雞卵清蛋白制備抗凝血酶活性肽，并以此為主要原料，加上一些輔料制備抗栓、溶栓口服液。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，模擬蛋白質(zhì)在人體內(nèi)消化的條件，利用胃蛋白酶、胰蛋白酶這兩種酶組成的混合酶解體系水解雞卵清蛋白制備抗凝血酶活性肽，并以此為主要原料，加上一些輔料制備抗栓、溶栓口服液，該口服液抗血栓及溶解血栓效果好、使用方便快捷、價(jià)格低、安全可靠，可以消除血栓栓塞性心腦血管疾病患者痛苦。本發(fā)明的另一個(gè)目的是在克服現(xiàn)有酶解法處理卵清蛋白不足，在其基礎(chǔ)上進(jìn)一步 改進(jìn)，提供一種抗栓、溶栓口服液的制備方法。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明的目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下
(O取卵清將新鮮雞蛋破殼，慢慢倒出內(nèi)容物，小心取出卵黃，收集卵清，稱重；按卵清的質(zhì)量加入I倍無菌水，300 r · mirT1攪拌l(Tl5 min制成卵清稀釋液；
(2)上調(diào)pH值用O.5 mo I · L—1的食品級(jí)NaOH溶液調(diào)整卵清稀釋液的pH值至9 11，得到高PH值的卵清稀釋液；
(3)高pH值卵清稀釋液熱變性將高pH值卵清稀釋液于300r ^mirT1攪拌加熱到88 90 °C，維持25 35min使卵清蛋白質(zhì)充分變性，取出，自然冷卻至室溫；
(4)下調(diào)pH值將已充分變性、自然冷卻至室溫的高pH卵清稀釋液使用O.5 mo I · Γ1的食品級(jí)HCl溶液調(diào)整至pH值為7 8，得到變性卵清稀釋液；
(5)酶解根據(jù)變性卵清稀釋液體積加入胃蛋白酶及胰蛋白酶的混合物酶解，按每升變性卵清稀釋液加胃蛋白酶40 000 U、胰蛋白酶50 000 U ;兩種酶混合均勻后加入適量無菌水調(diào)成稀糊狀，倒入預(yù)熱至50 V的變性卵清稀釋液中，一邊加熱一邊以“順、反轉(zhuǎn)，間歇式”500 r · mirT1攪拌,按“順一停一反一停一順一停一反一停一”方式重復(fù)攪拌，即攪拌機(jī)以順轉(zhuǎn)5 min,停I min,反轉(zhuǎn)5 min,停I min的方式重復(fù)攪拌；酶解期間，適時(shí)補(bǔ)充50°C的無菌水維持酶解體系體積不變；酶解2. 5^3. 5h后，迅速升溫至100 °C，保持l(Tl5min以滅活酶，得酶解液；酶解液放冷至室溫后，于10 000 r · mirT1離心l(Tl5min去除沉淀收集清液，得卵清酶解清液；用凝血酶滴定改進(jìn)法測(cè)定酶解清液的抗凝血酶活力，以谷胱甘肽(3肽)為對(duì)照品進(jìn)行高效液相色譜定量測(cè)定；
(6)真空濃縮將酶解清液于85 90Kpa濃縮成活力390 400抗凝血酶活力單位(ATU) · ml/1的抗栓、溶栓口服液母液；
(7)配制口服液根據(jù)所需配制的抗栓、溶栓口服液的質(zhì)量，在抗栓、溶栓口服液母液中加入質(zhì)量比為O. 1%0 ^0. 3%。的甜蜜素和1%。 2%。的檸檬酸，溶解，再加入適量無菌水調(diào)至370 380 ATU · mL—1，混合均勻，即得抗栓、溶栓口服液。與現(xiàn)有的技術(shù)相比，本發(fā)明的突出實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步是
(I)以胃蛋白酶及胰蛋白酶組成的雙酶混合酶解替代單酶(Protease N)水解顯著提高酶解效果，原材料利用率高，產(chǎn)品中2 4肽含量高，本發(fā)明的3批酶解液中抗凝血酶活力平均365. 33 ATU · mL—1 ；3肽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均93. 82%,3批酶解液技術(shù)數(shù)據(jù)如下表I。
表I 3批酶解液清液中3肽占水解物總量的比例以及抗凝血酶活力強(qiáng)度
權(quán)利要求
1.一種抗栓、溶栓口服液的制備方法，其特征在于包括以下幾個(gè)步驟 (1)卵清稀釋液的準(zhǔn)備將新鮮雞蛋破殼，慢慢倒出內(nèi)容物，小心取出卵黃，收集卵清，稱重，加入無菌水，300 r · mirT1攪拌l(Tl5 min制成卵清稀釋液； (2)上調(diào)pH值用O.5 mol · L—1的食品級(jí)NaOH溶液調(diào)整卵清稀釋液的pH值為9 11，得到高PH值的卵清稀釋液； (3)高pH值卵清稀釋液熱變性將高pH值卵清稀釋液于300r ·mirT1攪拌加熱到88 90 °C，維持25 35 min使卵清蛋白質(zhì)充分變性，取出，自然冷卻至室溫； (4)下調(diào)pH值將已充分變性、自然冷卻至室溫的高pH值卵清稀釋液使用O.5 mo I -Γ1的食品級(jí)HCl溶液調(diào)整至pH值為7 8，得到變性卵清稀釋液； (5)酶解將胃蛋白酶和胰蛋白酶按比例混合均勻后加入適量無菌水調(diào)成稀糊狀，倒入預(yù)熱至50 °C的變性卵清稀釋液中，一邊加熱一邊攪拌，酶解期間，適時(shí)補(bǔ)充50 °C的無菌水維持酶解體系體積不變；酶解2. 5^3. 5h后，迅速升溫至100 °C，保持l(Tl5min以滅活酶，得酶解液；酶解液放冷至室溫后，于10000 r · mirT1離心l(Tl5min去除沉淀收集清液，得卵清酶解清液； (6)真空濃縮將酶解清液于85 90Kpa的真空條件下濃縮成活力390 400抗凝血酶活力單位(ATU) · mL—1的抗栓、溶栓口服液母液； (7)配制口服液在抗栓、溶栓口服液母液中加入質(zhì)量比為O.1%。、.3%。的甜蜜素和1% 2%。的檸檬酸，溶解，再加入適量無菌水調(diào)至370 380 ATU · mL—1，混合均勻，即得抗栓、溶栓口服液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗栓、溶栓口服液的制備方法，其特征在于步驟(1)所述的無菌水的加入量為卵清質(zhì)量的I倍。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗栓、溶栓口服液的制備方法，其特征在于步驟(5)所述的胃蛋白酶和胰蛋白酶的加入量為根據(jù)變性卵清稀釋液體積加入，按每升變性卵清稀釋液加胃蛋白酶40 000 U、胰蛋白酶50 000 U。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種抗栓、溶栓口服液的制備方法，其特征在于步驟(5)所述攪拌的攪拌方式以“順、反轉(zhuǎn)，間歇式”500 r· min—1攪拌，按“順一停一反一停一順一停—反一停一”方式重復(fù)攪拌，即攪拌機(jī)以順轉(zhuǎn)5 min,停I min,反轉(zhuǎn)5 min,停I min的方式重復(fù)攪拌。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗栓、溶栓口服液的制備方法，是將新鮮雞蛋去卵黃取卵清，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH，加熱使卵清變性，用HCl溶液降低pH，加入胃蛋白酶、胰蛋白酶的混合物酶解變性卵清蛋白，期間采用“順、反轉(zhuǎn)，間歇式”方式以500r·min-1速度攪拌，酶解完成之后滅活蛋白酶，冷卻至室溫；酶解清液真空濃縮后，加適量甜蜜素、檸檬酸及無菌水制成產(chǎn)品；本方法簡(jiǎn)單易行，生產(chǎn)周期較短，節(jié)省設(shè)備投資；雞卵清經(jīng)過胃蛋白酶、胰蛋白酶的混合酶酶解，產(chǎn)生的抗凝血酶活性小肽量明顯增加，有利于產(chǎn)品質(zhì)量的提高。
文檔編號(hào)A61K38/01GK102872446SQ20121039802
公開日2013年1月16日 申請(qǐng)日期2012年10月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月19日
發(fā)明者方富永, 苗艷麗, 王宏波, 蘆志剛, 廖艷, 宋文東 申請(qǐng)人:廣東海洋大學(xué)