專利名稱：：一種抗凝溶栓雙功能融合蛋白的凝膠層析復性方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及生物制藥領域，具體地說是涉及一種抗凝溶栓雙功能融合蛋白——水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白(HV12p-rPA)的凝膠層析復性方法。
背景技術：
：本發(fā)明中的復性目標水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白，是通過一個(Gly)3柔性肽基團首次將重組水蛭素HV3的C末端12肽與rPA基因融合而成的一種全新蛋白。大腸桿菌表達體系因具有低廉性、高效性和穩(wěn)定性等優(yōu)點在科研生產中被廣泛應用。然而，重組蛋白在大腸桿菌中的高水平表達經常導致蛋白聚集而形成不溶的、無活性的包涵體。目前上市的重組蛋白藥物中，54%以大腸桿菌作為表達系統(tǒng)，而大腸桿菌表達蛋白中有一半形成包涵體。本研究所構建的水蛭素12肽-瑞替普酶融合蛋白是通過大腸桿菌進行表達，以包涵體的形式存在。包涵體雖然由無活性的蛋白組成，但包涵體形成對于重組蛋白的生產也提供了幾個優(yōu)勢①以包涵體形式表達的蛋白質的濃度比較高，有時甚至可以達到細胞總蛋白含量的30%(S.A/^awfl,/義wwagOT..5/opo(v附era(^e^/ife"/e"ce人1999,57:297-307.);②如果重組蛋白質以包涵體形式存在，由于包埋了酶攻擊的位點，可以最大限度地抵抗蛋白質酶的攻擊；③包涵體表達的蛋白質沒有活性，細胞破碎和以后的純化步驟，不用考慮蛋白質的失活問題；包涵體形式表達的蛋白質與宿主細胞的其他蛋白質的分離比可溶蛋白質的分離方法簡便，造價低，使用簡單的離心或者過濾的手段就能使包涵體與宿主細胞的其他蛋白質成分進行有效的分離；有些表達的外源蛋白質對細胞有毒性或者致死，大量表達時會導致細胞的死亡，最終的細胞數量和產物相當低，而包涵體形式的蛋白質由于喪失了生物活性從而可以高效大量地表達；◎對于以包涵體形式表達的產物可以比較容易地進行在線的觀測定性。包涵體蛋白質復性是生物工程下游技術中的一個重要問題。一個有效的、理想的折疊復性方法應具備以下幾個特點①活性蛋白質的回收率高；②正確復性的產物易于與錯誤折疊蛋白質分離；③折疊復性后應得到濃度較高的蛋白質產品；④折疊復性方法易于放大；⑤復性過程耗時較少。就實際生產而言，要求折疊復性過程必須快速、低成本、高效。雖然蛋白質的折疊復性已有很多方法，但針對每一種蛋白質仍需通過實驗摸索出最佳的方法。由于蛋白質本身的復雜性和多樣性，蛋白質的復性方法也各不相同，本研究目標是對已采用第三代基因工程技術-蛋白質工程技術在分子水平上有目的設計構建的水蛭素12肽與瑞替普酶新型抗凝溶栓雙功能重組融合蛋白HV12p-rPA進行復性。対該具有9對二硫鍵的HV12p-rPA融合蛋白體外折疊復性具有相當的挑戰(zhàn)性和難度。由于融合蛋白的r-PA分子中18個Cys要形成9對二硫鍵，所以大腸桿菌表達HV12p-rPA時，因發(fā)生二硫鍵的錯配而形成致密的包涵體，溶解變性后要使其重新正確折疊和復性成活性狀態(tài)非常困難，這是由于組成九對二硫鍵的18個Cys在復性時錯誤配對造成的。蛋白質復性技術是基因工程蛋白產生的重大共性關鍵技術，直接關系到生產成本和技術能否產業(yè)化，所以，研究基因工程蛋白的復性技術不但在理論上有重大意義而且也有重大的應用價值。蛋白的體外復性被認為是一項異常艱巨的任務，目前己存在的復性方法是很多的，較常見的除了稀釋復性以外，還有透析復性、柱上復性，但普遍復性率不高，只有20%左右的目的蛋白分子(汪家政等，蛋白質技術手冊，科學出版社，2001年，p31)得到正確的空間構型，獲得生物學活性。并且，變性蛋白的體外復性受外部環(huán)境的影響較大，不同蛋白的復性過程不同，特異的復性環(huán)境，包括緩沖液的組成、蛋白濃度、溫度、pH等應根據蛋白的不同而異。沒有哪種復性方法可以通用于所有的蛋白。近來，有人轉向于體內蛋白質折疊的模擬，產生了一些新的方法，例如將小分子伴侶固定化后，相當于親和層析的原理，復性蛋白質的同時使其濃縮和純化。有很大的應用前景，但是，由于這些分子伴侶均需要特別制備技術，對于大規(guī)模多種蛋白質制備，仍屬昂貴試劑。所以，要將實驗室的研究成果產業(yè)化，獲取實際的生產成果，就不得不考慮生產成本以及操作難易程度這兩個問題。因此，制約基因藥物生產的一個關鍵性難題就是復性效率、復性成本以及生產操作難易的問題。HV12p-rPA融合蛋白含有九對二硫鍵，無疑為其復性增加了更大的難度，其復性問題是下游工作的一個很大的考驗。目前，對于這種含有多對二硫鍵的蛋白的復性率普遍不高。例如同樣含有九對二硫鍵的瑞替普酶(r-PA)，Kohnert(KohnertU,effl/.ProteinEngineering，1992,5:93-100)等用稀釋復性法復性r-PA，復性率不超過5%。孫石靜(孫石靜等，中國藥科大學學報，2005，36:363-367)等運用金屬螯合柱一步復性，融合蛋白復性率也僅達10%。趙友春(趙友春等，化工科技，2003，11:15-17)等改進了Kohnert的方法，在谷胱甘肽還原體系中，用重組人二硫鍵異構酶(PDI)輔助瑞替普酶復性，其復性率達到14%以上。但PDI價格昂貴，用于工業(yè)化無疑大大提高了成本。相比于傳統(tǒng)的稀釋復性方法，凝膠層析復性有其獨特的優(yōu)點。1994年Werner(M.H.Werner,GM.Clore,R丄Fisher,erFEBSLett.1994，345:125-130.)等人第一次使用SEC復性蛋白質，最后洗脫出71±15%的活性蛋白質。為提高蛋白復性率，2002年谷等人(Z.Gu，Z.Su,J,C.Janson，eM/.ProteinExpress.Purif.2002,25:174-179.)利用Superdex30預裝柱復性scFv蛋白質，在柱內預先設置了變性劑濃度梯度和pH值的梯度，獲得了25%的活性收率。2006年劉海峰(HaifengLiu,XiangshanZhou,YuanxingZhang,Wa/'BiotechnologyLetters,2006,28:457~463)等用Sephacryl-200層析復性和兩步溫控法復性Trx-r-PA融合蛋白，收集到的樣品在25'C下復性20h，其復性率達到13.8%。本發(fā)明中的凝膠層析復性方法，與文獻方法相比，其改進在于(l)進行柱上層析復性的樣品事先進行6-12h的氧化復性處理，使GSSG與變性蛋白中的半胱氨酸形成復合物，有效降低了二硫鍵的錯配幾率，大大提高了該融合蛋白的復性率。(2)在層析復性時在層析柱內預先設置了長度為O.l—OJ個柱體積的變性劑(脲，鹽酸胍等，含有L-Arg)濃度梯度，使變性蛋白在復性過程中緩慢脫離變性劑環(huán)境進入復性環(huán)境，有效抑制其聚集及二硫鍵錯配。(3)在復性緩沖液中添加了氧化還原體系(GSSG/GSH等)以及一定濃度的L-Arg和脲，有效促進了該融合蛋白的正確折疊和分子內二硫鍵的正確配對。(4)在復性過程中簡化了調pH過程及其他操作，降低了蛋白活性的影響。改進后使復性蛋白溶液的濃度和比活有了一定程度的提高。
發(fā)明內容本發(fā)明提出了一種抗凝溶栓雙功能HV12p-rPA融合蛋白的復性方法。該技術的優(yōu)點在于復性產品比活高、收率高、濃度高、體積小便于后續(xù)處理，操作簡便、易于推廣。本發(fā)明所述抗凝溶栓雙功能HV12p-rPA融合蛋白凝膠層析復性的技術方案內容如下(1)將發(fā)酵所得的HV12p-rPA融合蛋白包涵體，使用20-50mmol/LTris-HCl、6-8mol/L的尿素或3-7mol/L胍緩沖液，pH8.5，37'C-40'C變性6-8h，使包涵體變性溶解，其中緩沖液含有還原劑DTT(0.5-lmmol/L)或p-巰基乙醇(1%-1.5%,v/v)，12000r/min，15min，除去不溶物，收集上清液。(2)用20-50mmol/LTris-HCl、6-8mol/L尿素或3-7mol/L胍緩沖液將變性蛋白溶液稀釋至濃度為8-12mg/ml，該溶液中含有GSSG(0.05-0.lmol/L)、L-Arg(0.5-0.9mol/L)，pH9.0-9.5。25。C下，溫育6-12h。(3)采用平衡緩沖液(20國50mmol/LTris-HCl，0.5-0.7mol/LL-Arg，0.5-1.5mol/LUrea,l-10mmol/LGSH,1-10纖ol/LGSSG，l匪ol/LEDTA，pH8.5)以0.5ml/min的流速平衡層析柱。(4)平衡后，在層析柱內設置0.1-0.3柱體積的變性劑緩沖液(20-50mmol/LTris-HCl,6-8mol/L的尿素或3-7mol/L胍，0.5-0.7mol/LL-Arg，pH8.5)。(5)將(2)作為樣品，進樣50nl。(6)用平衡緩沖液(20-50mmol/LTris-HCl，0.5-0.7mol/LL-Arg，0.5-1.5mol/LUrea,1-10mmol/LGSH，1-10mmol/LGSSG，1mmol/LEDTA，pH8.5)以0.5ml/min的流速進行洗脫，按照280nm吸光度的變化收集目的蛋白液，并對樣品進行適當處理。(7)活性測定HV12p-rPA融合蛋白的溶栓活性測定釆用纖維蛋白-瓊脂糖平板測定法，抗凝活性采用凝血酶直接滴定法測定。本發(fā)明提供的復性抗凝溶栓雙功能HV12p-rPA融合蛋白的技術方法，復性產品比活高、收率高、體積小、濃度高便于后續(xù)處理，且操作簡便、易于推廣，下面結合具體實施方式加以說明。圖1是HV12p-rPA融合蛋白的SuperdexG75柱上復性色譜圖(實施例一)。圖2是本發(fā)明HV12p-rPA融合蛋白樣品溶栓試驗結果的平板圖。圖中標示的1、2、3、4、5分別為r-PA1000、400、10、50、200IU/ml;標示6為本發(fā)明HV12p-rPA融合蛋白樣品稀釋20倍的試樣。圖3是HV12p-rPA融合蛋白基質輔助激光解析飛行時間質譜。圖4是HV12p-rPA融合蛋白一級結構的氨基酸序列。具體實施例方式實施例一LHV12p-rPA融合蛋白復性用平衡緩沖液(50mmol/LTris-HCl，0.7mol/LL-Arg，lmol/LUrea，lmmol/LGSH，lmmol/LGSSG，lmmol/LEDTA,pH8.5)平衡柱，流速為0.5ml/min。上樣前先在層析柱內設置一個長度為0.2個柱體積的8mol/L脲的濃度梯度，使得變性劑在0.2個柱體積的長度內濃度由8mol/L逐漸降至lmol/L，由此變性蛋白在進入復性緩沖液時有一個脲濃度逐漸降低的過程。將在25'C溫度下溫育10h小時的變性蛋白溶液(10mg/ml)作為柱上復性的樣品，上樣5(V1。以平衡緩沖液(50mmol/LTris-HCl，0.7mol/LL-Arg，lmol/LUrea，lmmol/LGSH，lmmol/LGSSG,lmmol/LEDTA，pH8.5)洗脫，流速為0.5ml/min。根據蛋白質在280nm的吸光度得到如附圖l所示的吸收峰。根據出峰情況收集到三個樣品P,、P2、P3(如圖l內所示)，其中P2為目標蛋白。2.生物活性測定抗凝活性的測定(滴定法)于酶標板小孔中加200pl0.5°/。牛血纖維蛋白原(0.05mol/LTris-HCl緩沖液(pH7.4)配制)，再加入10-10(^1復性蛋白溶液，充分混勻。用微量進樣器吸取標準的凝血酶溶液(100NIH/ml)，時間間隔為lmin，若在lmin內纖維蛋白原發(fā)生凝固，即說明己達滴定終點。每消耗一個凝血酶單位(NIH)相當于一個抗凝血酶單位(ATU)。溶栓活性測定(纖維蛋白-瓊脂糖平板測定法)配制平板用溶液均為PBS(pH7.4)。將1BP單位/ml的凝血酶溶液貼壁加入10ml血纖蛋白原(5mg/ml)溶液中，快速混勻，傾入至完全融化且已降至45'C的10mL瓊脂糖溶液(1.0Q/Q)中，混勻，倒入直徑90mm的平皿中，凝固后打孔使用。分別吸取不同比活性的r-PA和復性后稀釋20倍的HV12p-rPA融合蛋白滴于孔中，平皿加蓋于37'C溫育14h。溶栓平板試驗結果如圖2所示。經過檢測，本發(fā)明技術復性HV12p-rPA融合蛋白后其溶栓活性可達93106IU/mg，抗凝活性達到273ATU/mg，融合蛋白溶栓活性的復性率約為18.6%。3.—級結構解析本發(fā)明采用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)準確測定了該融合蛋白的分子量，使用胰蛋白酶和糜蛋白酶將融合蛋白進行降解，LC-ESI-MS/MS液質聯(lián)用技術對酶解產物中的多肽進行了識別，使用肽序列標簽法對目標蛋白的氨基酸序列進行了分析。結果實際測定該融合蛋白的分子量(如圖3所示)為41473Da，與理論分子量41472.38Da相符；本發(fā)明采用液質聯(lián)用進行肽圖分析，識別出的多取匹配度Xcorr均超過1.5,部分多肽的Xcorr超過3.0(如表1所示)，表明本實驗測定過程中多肽識別結果準確可靠胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶酶解后進行液質聯(lián)用分析，目標蛋白的氨基酸覆蓋率超過85%(如表1所示)；對融合蛋白的N末端結構分析，采用胰凝乳蛋白酶對融合蛋白進行了酶切處理，并使用液質聯(lián)用系統(tǒng)對產生的多肽進行了識別，識別出了多肽^^ASDF5(m/z570.3)，E6PIPEDAY13(m/z933.2)，E6PIPEDAYDEGGGSY20(m/zl599.2)，Q21GNSDCY27(m/z786.5)，L364DWIRDNMRP373(m/z1315.4)(如表1所示)。從而確定了該融合蛋白的N末端MASDFEPIPEDAYDEGGGSYQGNSDCY和C末端LDWIRDNMRP的多肽序列與理論值(如圖4所示)相符。上述結果證明本發(fā)明所復性的該蛋白不僅具有雙功能的生物活性，而且結構正確。表1HV12p-rPA融合蛋白酶解后使用液質聯(lián)用系統(tǒng)識別出的多肽<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注c:Chymotrypsin酶解產物，其它為Trypsin酶解產物；d:離子帶雙電荷；t:理論平均值；o實驗檢測值實施例二用平衡緩沖液(50mmol/LTris-HCl，0.7mol/LL-Arg，lmol/LUrea,lmmol/LGSH，lmmol/LGSSG，lmmol/LEDTA，pH8.5)平衡柱，流速為0.5ml/min。上樣前先在層析柱內設置一個長度為0.1個柱體積的8mol/L脲的濃度梯度，使得變性劑在0.1個柱體積的長度內濃度由8mol/L逐漸降至lmol/L，由此變性蛋白在進入復性緩沖液時有一個脲濃度逐漸降低的過程。將在25'C溫度下溫育6h小時的變性蛋白溶液(12mg/ml)作為柱上復性的樣品，上樣50^1。以平衡緩沖液(50mmol/LTris-HCl，0.7mol/LL-Arg，lmol/LUrea，l蘭ol/LGSH，l腿ol/LGSSG，lmmol/LEDTA，pH8.5)洗脫，流速為0.5ml/min。根據蛋白質在280nm的吸光度收集目標蛋白，按照實施例一中的方法測定復性后HV12p-rPA融合蛋白的活性，結果發(fā)現其溶栓活性可達83242IU/mg，抗凝活性達到251ATU/mg，融合蛋白溶栓活性的復性率約為16.6%。實施例三用平衡緩沖液(50mmol/LTris-HCl，0.7mol/LL-Arg，lmol/LUrea，lmmol/LGSH，lmmoI/LGSSG，lmmol/LEDTA,pH8.5)平衡柱，流速為0.5ml/min。上樣前先在層析柱內設置一個長度為0.3個柱體積的8mol/L脲的濃度梯度，使得變性劑在0.3個柱體積的長度內濃度由8mol/L逐漸降至lmol/L，由此變性蛋白在進入復性緩沖液時有一個脲濃度逐漸降低的過程。將在25'C溫度下溫育8小時的變性蛋白溶液(10mg/ml)作為柱上復性的樣品，上樣50pl。以平衡緩沖液(50縣oI/LTris-HCI，0.7mol/LL-Arg，lmol/LUrea，lmmol/LGSH，lmmol/LGSSG，lmmol/LEDTA，pH8.5)洗脫，流速為0.5ml/min。根據蛋白質在280nm的吸光度收集目標蛋白，按照實施例一中的方法測定復性后HV12p-rPA融合蛋白的活性，結果發(fā)現其溶栓活性可達87574IU/mg，抗凝活性達到262ATU/mg，融合蛋白溶栓活性的復性率約為17.5%。權利要求1.一種抗凝溶栓雙功能融合蛋白的凝膠層析復性方法，其特征在于以水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白的包涵體為原料，變性溶解后得到融合蛋白的變性溶液，變性蛋白先在氧化復性緩沖液中進行氧化復性，然后在具有脲濃度梯度的凝膠層析柱中進行層析復性，最后經過適當后續(xù)操作得到具有抗凝溶栓雙功能的融合蛋白。2.按照權利要求1所述的凝膠層析復性法，其特征在于復性對象為水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白包涵體，復性后的蛋白具有抗凝溶栓雙功能。3.按照權利要求1所述的抗凝溶栓雙功能融合蛋白凝膠層析復性方法，其特征在于變性溶解包涵體的緩沖溶液組成為20-50mmol/LTris-HCl、6-8mol/L脲或3-7mol/L胍，含0.5-1mmol/LDTT或ni.5X(v/v)p-巰基乙醇，pH8.5，變性溫度為37。C一40。C，變性時間為6隱8h。4.按照權利要求1所述抗凝溶栓雙功能融合蛋白凝膠層析復性方法，其特征在于氧化復性緩沖液組成為20-50mmol/LTris-HCl，6-8mol/L尿素或3-7mol/L胍，0.05-0.1mol/LGSSG、0.5隱0.9mol/LL隱Arg，pH9.0-9.5，氧化復性溫度為25。C，時間為6-12h。5.按照權利要求l所述抗凝溶栓雙功能融合蛋白凝膠層析復性方法，其特征在于所用層析介質為SuperdexG75。6.按照權利要求1所述雙功能抗凝溶栓HV12p-rPA融合蛋白凝膠層析復性方法，其特征在于柱平衡及洗脫所用的緩沖液為20-50mmol/LTris-HCl，0.5-0.7mol/LL-Arg，0.5-1.5mol/LUrea，1-10mmol/LGSH，1-10mmol/LGSSG，lmmol/LEDTA，pH8.5。7.按照權利要求15所述新型抗凝溶栓雙功能HV12p-rPA融合蛋白凝膠層析復性方法，其特征在于在層析柱中構建了0.1-0.3柱體積長度的變性劑緩沖液梯度。全文摘要本發(fā)明屬于生物制藥領域，具體涉及一種抗凝溶栓雙功能融合蛋白即水蛭素12肽和瑞替普酶融合蛋白包涵體的凝膠層析復性方法。該方法特征在于先將變性蛋白進行一定時間氧化復性，然后采用Superdex75進行層析復性。層析復性時先在Superdex75柱內預設一段變性劑濃度梯度，融合蛋白在變性劑濃度梯度降低的過程中恢復其空間構象。同時在緩沖液中添加氧化還原體系和分子伴侶輔助蛋白構象轉變。該方法得到的雙功能融合蛋白經過一定處理后復性效果更好。該方法的優(yōu)點在于操作簡單，易于放大，復性后蛋白濃度較高，復性率較高。文檔編號C07K1/00GK101386639SQ20081010496公開日2009年3月18日申請日期2008年4月25日優(yōu)先權日2008年4月25日發(fā)明者蓉余,劉永東,張貴峰,蘭梁,蘇志國,凈陳,玲高申請人:中國科學院過程工程研究所