藥物載體及其制備方法和藥物組合物及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種藥物載體及其制備方法和藥物組合物及其應(yīng)用。本發(fā)明所述的介孔二氧化硅包金納米棒(Au@SiO2)載體的特征是金納米棒外包裹著一層介孔二氧化硅殼。本發(fā)明中Au@SiO2載體是以十六烷基三甲基溴化銨包裹的金納米棒為原料，由正硅酸酯水解聚合制備而成，可以包載各種藥物及探針?lè)肿?，并將之輸運(yùn)到疾病部位，實(shí)現(xiàn)靶向治療。本發(fā)明中的Au@SiO2載體，或其載藥之后的納米粒子，在吸收近紅外激光后，能夠放射出熒光并將部分光能轉(zhuǎn)化為熱量，因此能夠應(yīng)用于生物成像，光控藥物釋放（化療）和熱療。本發(fā)明的Au@SiO2載體制備工藝簡(jiǎn)單，其具備的多項(xiàng)腫瘤診療功能可以聯(lián)合使用，有利于克服單一腫瘤診療方法的缺陷，尤其適合應(yīng)用于有復(fù)雜需要的腫瘤的診斷和治療。
【專利說(shuō)明】藥物載體及其制備方法和藥物組合物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及藥物載體及其制備方法和藥物組合物及其應(yīng)用。具體地，涉及一種藥物載體及其制備方法、一種在所述藥物載體上負(fù)載了藥物的藥物組合物以及所述藥物載體和所述藥物組合物在制備用于診斷和/或治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]傳統(tǒng)的癌癥治療方法，由于缺乏針對(duì)癌組織的靶向性，發(fā)揮治療效果的同時(shí)也會(huì)傷害到非病變組織，往往具有很大的副作用。近些年來(lái)，納米技術(shù)在增強(qiáng)抗癌藥物的藥理活性及降低毒性方面表現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。癌變組織中由于具有血管豐富、血管壁間隙較寬、結(jié)構(gòu)完整性差以及淋巴回流缺失的特點(diǎn)，而使大分子和脂質(zhì)顆粒具有高通透性和滯留性效應(yīng)。納米藥物也可以利用此效應(yīng)，通過(guò)血液循環(huán)選擇性地富集于癌組織周?chē)?稱為“被動(dòng)靶向性”)，這樣能夠有效地提高抗癌藥物活性并降低副作用。除此之外，帶有靶向分子的納米藥物還可以特異性地識(shí)別癌細(xì)胞或癌組織，通過(guò)主動(dòng)靶向增強(qiáng)抗癌的效果。納米技術(shù)用于腫瘤的臨床治療已于2005年被美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院列為未來(lái)10年納米醫(yī)學(xué)發(fā)展的戰(zhàn)略目標(biāo)之一 O
[0003]在最近幾年納米材料應(yīng)用于癌癥診療研究的探索中，金納米顆粒表現(xiàn)出令人矚目的性質(zhì)和優(yōu)勢(shì)。由于其可調(diào)節(jié)的表面等離子共振效應(yīng)，金納米粒子不僅在細(xì)胞成像方面具有廣闊的應(yīng)用前景，還可以通過(guò)光熱轉(zhuǎn)換效應(yīng)在激光照射時(shí)成為局域化的熱源。產(chǎn)生的熱量一方面可以用來(lái)做癌癥熱療，另一方面當(dāng)納米粒子用作抗癌藥物載體的時(shí)候，也可以觸發(fā)藥物的釋放，即實(shí)現(xiàn)化療。因此，金納米粒子有可能在一個(gè)載體中同時(shí)實(shí)現(xiàn)成像、化療和熱療三種癌癥診療功能。另外，其中的各項(xiàng)功能還可能協(xié)同作用，產(chǎn)生新的治療模式，比如成像介導(dǎo)的藥物傳輸和熱療，或者化療和熱療共同起作用的組合治療。構(gòu)建這種多功能的納米載體有利于對(duì)需要復(fù)雜處理的癌癥進(jìn)行針對(duì)性的治療。
[0004]相對(duì)于球形金納米粒子而言，金納米棒的縱向表面等離子共振效應(yīng)可以方便地通過(guò)改變其長(zhǎng)徑比而進(jìn)行控制，使得其最大吸收波長(zhǎng)位于近紅外區(qū)。由于近紅外光能夠穿透較深的人體組織，所以通過(guò)外部激光照射而實(shí)現(xiàn)各種功能的金納米棒尤其適用于乳腺癌等淺表性癌癥的診斷和治療。
[0005]盡管金納米棒在癌癥的診斷和治療中有著良好的應(yīng)用前景，但仍然面臨一個(gè)問(wèn)題:金納米棒不易攜載藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中金納米棒不易攜載藥物的問(wèn)題，提供一種新型的藥物載體及其制備方法，該新型的藥物載體含有金納米棒，并且藥物負(fù)載量大。
[0007]本發(fā)明的目的還在于提供一種含有上述新型的藥物載體的藥物組合物。
[0008]本發(fā)明的目的還在于提供上述藥物組合物在診斷和/或治療腫瘤中的應(yīng)用。
[0009]即，本發(fā)明提供了一種藥物載體，其中，該藥物載體包括金納米棒，以及包裹在金納米棒表面的介孔二氧化硅層。
[0010]本發(fā)明還提供了一種藥物載體的制備方法，其中，該方法包括以下步驟:在含有十六烷基三甲基溴化銨的金納米棒水溶液中，在PH值為8.5-11的條件下，加入硅酸酯的醇溶液進(jìn)行反應(yīng)，并進(jìn)行固液分離，得到表面包覆有介孔二氧化硅層的金納米棒。
[0011]本發(fā)明還提供 了一種藥物組合物，所述藥物組合物包括上述載體和負(fù)載在上述載體上的藥物。
[0012]本發(fā)明還提供了上述藥物載體和上述藥物組合物在制備用于診斷和/或治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
[0013]本發(fā)明提供的藥物組合物具有診斷，化療和熱療等多項(xiàng)功能，這些功能可以聯(lián)合應(yīng)用。
[0014]根據(jù)本發(fā)明所提供的新型的藥物載體，由于在金納米棒表面包裹有介孔二氧化硅層，可以有效地防止藥物載體在水溶液中發(fā)生團(tuán)聚，并且藥物負(fù)載量大。另外，在該載體上負(fù)載藥物后得到的藥物組合物，可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)腫瘤的診斷，以及化療和熱療兩種治療方式。其中，兩種治療方式的選擇以及具體的治療方法，可以根據(jù)診斷的結(jié)果有針對(duì)性地進(jìn)行；而治療的結(jié)果則可由載體的診斷功能進(jìn)行報(bào)告，以確定后續(xù)的治療方案。化療和熱療兩種治療方式的聯(lián)合運(yùn)用，有助于克服兩種治療方式各自的缺點(diǎn)，取得最優(yōu)的治療效果。
[0015]本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的【具體實(shí)施方式】部分予以詳細(xì)說(shuō)明。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0016]圖1為實(shí)施例1所得到的金納米棒的透射電子顯微鏡圖；
[0017]圖2為實(shí)施例1所得到的藥物載體的透射電子顯微鏡圖；
[0018]圖3為實(shí)施例3所得到的藥物載體的透射電子顯微鏡圖；
[0019]圖4為實(shí)施例5所涉及的溫度-照射時(shí)間曲線圖；
[0020]圖5為實(shí)施例6所涉及的包載了阿霉素的藥物載體(Au@Si02-D0X)的釋藥曲線圖；
[0021]圖6為實(shí)施例7所涉及的包載了紫杉醇的藥物載體的釋藥曲線圖；
[0022]圖7為實(shí)施例8所涉及的組合圖，其中，圖7中的A為阿霉素(DOX)與溶酶體共定位圖；圖7中的B為載體Au@Si02與溶酶體(Lyso)共定位圖；圖7中的C為載體Au@Si02與阿霉素(DOX)共定位圖；圖7中的D為載體AuOSiO2，阿霉素(DOX)與溶酶體(Lyso)共定位圖；
[0023]圖8為實(shí)施例9所涉及的組合圖，其中，圖8中的A為阿霉素與線粒體(Mito)共定位圖；圖8中的B為載體Au@Si02與線粒體(Mito)共定位圖；圖8中的C為載體Au@Si02與阿霉素(DOX)共定位圖；圖8中的D為載體AuOSiO2，阿霉素(DOX)與線粒體(Mito)共定位圖；
[0024]圖9為實(shí)施例10所涉及的組合圖，其中，圖9中的A為阿霉素與溶酶體(Lyso)共定位圖；圖9中的B為載體Au@Si02與溶酶體(Lyso)共定位圖；圖9中的C為載體Au@Si02與阿霉素(DOX)共定位圖；圖9中的D為載體AuOSiO2，阿霉素(DOX)與溶酶體(Lyso)共定位圖；
[0025]圖10為實(shí)施例11所涉及的組合圖，其中，圖10中的A為阿霉素(DOX)與線粒體(Mito)共定位圖；圖10中的B為載體AuOSiO2與線粒體(Mito)共定位圖；圖10中的C為載體AuOSiO2與阿霉素(DOX)共定位圖；圖10中的D為載體AuOSiO2，阿霉素(DOX)與線粒體(Mito)共定位圖；
[0026]圖11為實(shí)施例12所涉及的細(xì)胞攝入阿霉素(DOX)的趨勢(shì)圖；
[0027]圖12為實(shí)施例13所涉及的阿霉素(DOX)濃度與細(xì)胞活力的關(guān)系圖；
[0028]圖13為實(shí)施例13所涉及的包載了阿霉素的介孔二氧化硅包金納米棒載體(Au@SiO2-DOX,濃度以負(fù)載的阿霉素計(jì))濃度與細(xì)胞活力的關(guān)系圖；
[0029]圖14為實(shí)施例14所涉及的激光控制藥物組合物在細(xì)胞內(nèi)釋藥的效果圖；
[0030]圖15為表示實(shí)施例15所涉及激光照射誘導(dǎo)的熱療對(duì)溶酶體膜完整性的影響的圖；[0031]圖16為表示實(shí)施例16所涉及低功率激光照射引起藥物釋放的化療對(duì)7種腫瘤細(xì)胞活力的影響的圖；
[0032]圖17為表示實(shí)施例17所涉及高功率激光照射誘導(dǎo)的熱療和藥物釋放的化療協(xié)同作用對(duì)細(xì)胞活力的影響的圖；
[0033]圖18為表示實(shí)施例18所涉及的藥物組合物在動(dòng)物腫瘤組織內(nèi)的分布的圖?！揪唧w實(shí)施方式】
[0034]以下對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的【具體實(shí)施方式】?jī)H用于說(shuō)明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0035]本發(fā)明的藥物載體包括金納米棒，以及包裹在金納米棒表面的介孔二氧化硅層。
[0036]根據(jù)本發(fā)明的藥物載體，通常情況下，所述金納米棒的長(zhǎng)度可以為5-200納米，優(yōu)選情況下，所述金納米棒長(zhǎng)度為10-150納米；從有利于細(xì)胞攝入上來(lái)考慮，更優(yōu)選所述金納米棒長(zhǎng)度為15-120納米；進(jìn)一步優(yōu)選所述金納米棒長(zhǎng)度為20-100納米；更進(jìn)一步優(yōu)選所述金納米棒長(zhǎng)度為30-80納米。
[0037]更優(yōu)選地，所述金納米棒的長(zhǎng)徑比為1.5-20 ;從有利于細(xì)胞攝入并適于通過(guò)遠(yuǎn)紅外激光控制上來(lái)考慮，進(jìn)一步優(yōu)選所述金納米棒的長(zhǎng)徑比為2-10 ;更進(jìn)一步優(yōu)選所述金納米棒的長(zhǎng)徑比為2.5-6，最優(yōu)選3-4.5。
[0038]根據(jù)本發(fā)明的藥物載體，所述金納米棒的表面包裹有介孔二氧化硅層。優(yōu)選情況下，所述介孔二氧化硅層的厚度為3-50納米；從易于制備和適于細(xì)胞攝入上來(lái)考慮，更優(yōu)選所述介孔二氧化硅層的厚度為5-45納米；進(jìn)一步優(yōu)選所述介孔二氧化硅層的厚度為10-40納米；更進(jìn)一步優(yōu)選為15-35納米。
[0039]優(yōu)選情況下，所述介孔二氧化硅層的孔徑為1-20納米；從易于制備和增加穩(wěn)定性上來(lái)考慮，更優(yōu)選所述介孔二氧化硅層的孔徑為1.2-15納米；進(jìn)一步優(yōu)選所述介孔二氧化硅層的孔徑為1.5-10納米；更進(jìn)一步為2-8納米；更進(jìn)一步優(yōu)選為3-4納米。
[0040]更優(yōu)選地，所述介孔藥物載體的比表面積為1-150平方米/克，孔體積為0.05-10立方厘米/克；從易于制備增加穩(wěn)定性上來(lái)考慮，進(jìn)一步優(yōu)選所述藥物載體的比表面積為30-120平方米/克，孔體積為0.5-5立方厘米/克；更進(jìn)一步優(yōu)選所述藥物載體的比表面積為60-100平方米/克，孔體積為0.6-2立方厘米/克；更進(jìn)一步優(yōu)選所述藥物載體的比表面積為65-95平方米/克，孔體積為0.65-1.3立方厘米/克。
[0041]根據(jù)本發(fā)明的藥物載體，優(yōu)選情況下，其最大吸收峰在600-1500納米的范圍內(nèi)，更優(yōu)選650-1000納米的范圍內(nèi)。
[0042]具有上述結(jié)構(gòu)的本發(fā)明的藥物載體，在水溶液中不容易發(fā)生團(tuán)聚，并且藥物載體的藥物負(fù)載量大。
[0043]本發(fā)明還提供了一種藥物載體的制備方法，其中，該方法包括以下步驟:在含有十六烷基三甲基溴化銨的金納米棒溶液中，在PH值為8.5-11的條件下，加入硅酸酯的醇溶液進(jìn)行反應(yīng)，并進(jìn)行固液分離，得到表面包覆有介孔二氧化硅層的金納米棒。
[0044] 根據(jù)本發(fā)明的藥物載體的制備方法，制備所述金納米棒水溶液的方法可以采用本領(lǐng)域的常規(guī)方法進(jìn)行。例如可以采用種子生長(zhǎng)法來(lái)制備，其步驟為在十六烷基三甲基溴化銨的存在下，用硼氫化鈉還原氯金酸，得到金納米顆粒的種子溶液，在十六烷基三甲基溴化銨存在下將該種子溶液加入由抗壞血酸還原氯金酸得到的一價(jià)金離子溶液中生長(zhǎng)得到金納米棒。另外，在種子生長(zhǎng)中，可以通過(guò)調(diào)節(jié)硝酸銀溶液和硫酸溶液的量來(lái)控制金納米棒的長(zhǎng)度和長(zhǎng)徑比。
[0045]根據(jù)本發(fā)明的藥物載體的制備方法，所述金納米棒水溶液中含有十六烷基三甲基溴化銨。優(yōu)選情況下，所述金納米棒水溶液中的十六烷基三甲基溴化銨的濃度為0.3-8毫摩爾/升；更優(yōu)選所述金納米棒水溶液中的十六烷基三甲基溴化銨的濃度為0.5-1.2毫摩爾/升。當(dāng)通過(guò)上述方法制備得到的金納米棒水溶液中十六烷基三甲基溴化銨的濃度高于上述優(yōu)選濃度時(shí)，可以通過(guò)離心洗滌來(lái)得到所需十六烷基三甲基溴化銨濃度的金納米棒水溶液。離心洗滌的方法可以采用本領(lǐng)域所公知的方法來(lái)進(jìn)行。
[0046]根據(jù)本發(fā)明的藥物載體的制備方法，優(yōu)選情況下，所述金納米棒的水溶液中，以金元素計(jì)的金納米棒濃度為10微摩爾/升1.5毫摩爾/升；從易于制備上來(lái)考慮，更優(yōu)選所述金納米棒水溶液中，以金元素計(jì)的金納米棒濃度為0.1毫摩爾/升~I毫摩爾/升；進(jìn)一步優(yōu)選所述金納米棒水溶液中，以金元素計(jì)的金納米棒濃度為0.15^0.5毫摩爾/升。
[0047]根據(jù)本發(fā)明的藥物載體的制備方法，通常情況下，所述金納米棒的長(zhǎng)度可以為5-200納米，優(yōu)選情況下，所述金納米棒長(zhǎng)度為10-150納米；從有利于細(xì)胞攝入上來(lái)考慮，更優(yōu)選所述金納米棒長(zhǎng)度為15-120納米；進(jìn)一步優(yōu)選所述金納米棒長(zhǎng)度為20-100納米；更進(jìn)一步優(yōu)選所述金納米棒長(zhǎng)度為30-80納米。
[0048]更優(yōu)選地，所述金納米棒的長(zhǎng)徑比為1.5-20 ;從有利于細(xì)胞攝入并適于通過(guò)遠(yuǎn)紅外激光控制上來(lái)考慮，進(jìn)一步優(yōu)選所述金納米棒的長(zhǎng)徑比為2-10 ;更進(jìn)一步優(yōu)選所述金納米棒的長(zhǎng)徑比為2.5-6，最優(yōu)選3-4.5。
[0049]根據(jù)本發(fā)明的藥物載體的制備方法，所述硅酸酯的用量可以根據(jù)所述金納米棒水溶液中的金納米棒的量來(lái)選擇。優(yōu)選情況下，分別以金元素和硅元素計(jì)，所述金納米棒的水溶液中的金納米棒與所述硅酸酯的摩爾比為1:1-50 ;從增加二氧化硅層厚度和強(qiáng)度上來(lái)考慮，更優(yōu)選分別以金元素和硅元素計(jì)，所述金納米棒的水溶液中的金納米棒與所述硅酸酯的摩爾比為1:2-10 ;進(jìn)一步優(yōu)選分別以金元素和硅元素計(jì)，所述金納米棒的水溶液中的金納米棒與所述硅酸酯的摩爾比為1:3-5。
[0050]根據(jù)本發(fā)明的藥物載體的制備方法，優(yōu)選情況下，以金元素計(jì)的所述金納米棒，與十六烷基三甲基溴化銨的摩爾比為1:1-20 ;從二氧化硅層的厚度和強(qiáng)度上來(lái)考慮，更優(yōu)選以金元素計(jì)的所述金納米棒的水溶液，與十六烷基三甲基溴化銨的摩爾比為1:1.5-10 ;進(jìn)一步優(yōu)選以金元素計(jì)的所述金納米棒的水溶液，與十六烷基三甲基溴化銨的摩爾比為1:2-4.
[0051]根據(jù)本發(fā)明的藥物載體的制備方法，對(duì)所述硅酸酯與金納米棒水溶液的接觸方式?jīng)]有特別的限定，例如可以將所述硅酸酯加入到所述金納米棒水溶液中。對(duì)加入的方式也沒(méi)有特別的限定，可以是一次性加入，也可以分批加入，當(dāng)從得到的介孔二氧化硅層的均勻性上來(lái)考慮，優(yōu)選分批加入。從操作性上來(lái)考慮，優(yōu)選2-5次，更優(yōu)選各次加入的間隔時(shí)間相同。
[0052]根據(jù)本發(fā)明的藥物載體的制備方法，所述硅酸酯與金納米棒水溶液的接觸在pH值為8.5-11的條件下進(jìn)行，優(yōu)選情況下，硅酸酯與金納米棒水溶液的接觸在pH值為9-10.5的條件下進(jìn)行。PH值的調(diào)節(jié)可以采用堿性pH值調(diào)節(jié)劑來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述堿性pH值調(diào)節(jié)劑可以為本領(lǐng)域所常用的堿性化合物，例如可以使用氫氧化鈉、氫氧化鉀等。
[0053]根據(jù)本發(fā)明的藥物載體的制備方法，所述硅酸酯與金納米棒水溶液的接觸條件還包括:接觸的溫度為4-95°C，接觸的時(shí)間為0.04-10天；優(yōu)選情況下，接觸的溫度為10-50°C，接觸的時(shí)間為1-3天。
[0054]根據(jù)本發(fā)明的藥物載體的制備方法，所述硅酸酯可以為硅酸烷基酯；優(yōu)選所述烷基為碳原子數(shù)為1-4的烷基；更優(yōu)選為碳原子數(shù)為1-3的烷基。上述硅酸酯中，優(yōu)選硅酸四甲酯、娃酸四乙酯、娃酸四丙酯和娃酸四丁酯中的一種或多種。
[0055]根據(jù)本發(fā)明的藥物載體的制備方法，所述醇溶劑只要是易于溶解所述硅酸酯且易溶于水的溶劑即可。例如可以為甲醇、乙醇或其他分子量小于200、常溫常壓下為液體的醇類中的一種或多種；優(yōu)選為甲醇和/乙醇。
[0056]根據(jù)本發(fā)明的藥物載體的制備方法，該方法包括通過(guò)離心分離，得到表面包覆有介孔二氧化硅層的金納米棒。所述離心分離的條件只要能夠充分沉降表面包覆有介孔二氧化硅層的金納米棒即可。一般情況下，所述離心的速度可以為3000-15000轉(zhuǎn)/分鐘；上述離心的時(shí)間可以為5-100分鐘。
[0057]根據(jù)本發(fā)明的藥物載體的制備方法所得到的藥物載體，優(yōu)選情況下，其最大吸收峰在620-1200納米的范圍內(nèi)，更優(yōu)選650-1000納米的范圍內(nèi)。
[0058]本發(fā)明還提供一種藥物組合物，所述藥物組合物包括上述載體和負(fù)載在上述載體上的藥物。
[0059]根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，對(duì)所述載體上負(fù)載的藥物的類型沒(méi)有特別的限定，可以根據(jù)實(shí)際的需要來(lái)負(fù)載各種類型的藥物。例如可以負(fù)載親水性和疏水性的藥物。優(yōu)選情況下，所述藥物為阿霉素、紫杉醇、長(zhǎng)春堿、順鉬、喜樹(shù)堿、DNA、小干擾RNA和蛋白質(zhì)藥物中的一種或多種。
[0060]根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，優(yōu)選的情況下，以所述載體的重量為基準(zhǔn)，所述藥物組合物的載藥率為1-40重量％ ;更優(yōu)選以所述載體的重量為基準(zhǔn)，所述藥物組合物的載藥率為5-30重量％，進(jìn)一步優(yōu)選以所述載體的重量為基準(zhǔn)，所述藥物組合物的載藥率為10-20重量％。
[0061]載藥率的計(jì)算公式為:
[0062]載藥率(重量％)=(載體上藥物的重量)/載體的重量X 100%。
[0063]在本發(fā)明中，對(duì)將藥物負(fù)載在上述載體上的方法沒(méi)有特別的限定，只要是能夠?qū)⒁欢康乃幬镓?fù)載到載體上的方法均可，可以采用公知的各種方法。例如，所述將藥物負(fù)載在載體上的方法可以為將藥物溶液與所述藥物載體接觸。
[0064]將藥物溶液與所述藥物載體接觸的方法中，所述藥物溶液的用量可以根據(jù)所述藥物載體的量來(lái)選擇。具體地，所述藥物載體與所述藥物溶液中的藥物的重量比可以為1:
0.1-10 ;優(yōu)選為1:0.5-5。另外，對(duì)所述藥物溶液的濃度沒(méi)有特別的限定，但優(yōu)選為0.01-5暈克/毫升；更優(yōu)選為0.05-1.5暈克/毫升。
[0065]此外，將藥物溶液與所述藥物載體接觸的條件包括:接觸的溫度為1_50°C，接觸的時(shí)間為1-4天。優(yōu)選所述接觸在攪拌下進(jìn)行。
[0066]將藥物溶液與所述藥物載體接觸的方法中，對(duì)所述藥物溶液中的藥物的類型沒(méi)有特別的限定，可以根據(jù)實(shí)際的需要來(lái)選擇。例如可以為親水性或疏水性類型的藥物。優(yōu)選情況下，所述藥物為阿霉素、紫杉醇、長(zhǎng)春堿、順鉬、喜樹(shù)堿、DNA和小干擾RNA和蛋白質(zhì)藥物中的一種或多種。
[0067]根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物，其包括本發(fā)明上述結(jié)構(gòu)的載體，由于該載體可以生物成像，可以用于各種疾病的診斷；此外，由于該載體可以吸收近紅外區(qū)的激光，并發(fā)射出熒光和將部分光能轉(zhuǎn)化成熱量，因此，可通過(guò)近紅外激光控制藥物的釋放，從而用于各種疾病的治療，例如可以用于癌癥等疾病的化療。
[0068]本發(fā)明還提供上述藥物載體和上述藥物組合物在制備用于診斷和/或治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
[0069]本發(fā)明提供的藥物組合物具有診斷，化療和熱療等多項(xiàng)功能，這些功能可以聯(lián)合應(yīng)用。
[0070]如上所述，本發(fā)明的藥物組合物包括本發(fā)明上述結(jié)構(gòu)的載體，由于該載體可以生物成像，可以用于各種疾病的診斷；此外，由于該載體可以吸收近紅外區(qū)的激光，并發(fā)射出熒光和將部分光能轉(zhuǎn)化成熱量，因此，可通過(guò)近紅外激光控制藥物的釋放，從而用于各種疾病的治療。特別是可以將其用于診斷和/或治療腫瘤。將其用于診斷和治療腫瘤時(shí)，可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)腫瘤的診斷，以及化療和熱療兩種治療方式。
[0071]作為腫瘤的種類沒(méi)有特別的要求，只要根據(jù)腫瘤的類型負(fù)載適合的藥物即可。例如可應(yīng)用的診斷和治療的腫瘤包括:乳腺癌、肺癌、黑色素瘤、肝癌、皮膚癌、宮頸癌、膀胱癌、胰腺癌、胃癌等。
[0072]以下將通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述，但本發(fā)明并不僅限于下述實(shí)施例。
[0073]以下實(shí)施例中氯金酸、十六烷基三甲基溴化銨、硝酸銀、抗壞血酸、硼氫化鈉、正硅酸四乙酯均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。鹽酸阿霉素(DOX)購(gòu)自濟(jì)南偉都醫(yī)藥原料有限公司。如無(wú)特別說(shuō)明，本發(fā)明中所有用水均為二次蒸餾水。
[0074]以下實(shí)施例中，金納米棒的棒長(zhǎng)、金納米棒長(zhǎng)徑比、介孔二氧化硅層厚度、介孔二氧化硅層的孔徑采用透射電子顯微鏡(購(gòu)于美國(guó)FEI公司，Tecnai G2F20S-TWIN型號(hào))進(jìn)行測(cè)定。
[0075]介孔二氧化硅包金納米棒載體經(jīng)凍干以后，使用美國(guó)麥克儀器公司生產(chǎn)的Tristar II3020型全自動(dòng)比表面積分析儀測(cè)量其比表面積，孔徑和孔體積。以下實(shí)施例中，最大吸收波長(zhǎng)使用美國(guó)FEI公司生產(chǎn)的Tecan Infinite M200型連續(xù)光譜多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)量。
[0076]實(shí)施例1[0077]本實(shí)施例用于說(shuō)明藥物組合物的制備。
[0078]I)藥物載體的制備
[0079]在20毫升的燒杯中，將7.5毫升的十六烷基三甲基溴化銨水溶液的濃度為0.1摩爾/升與250微升的氯金酸水溶液(濃度為0.01摩爾/升)混合，加水至總體積為9.4毫升；然后加入冰水冷卻過(guò)的0.6毫升的硼氫化鈉水溶液(濃度為0.01摩爾/升);在25°C下攪拌3小時(shí)，得到金納米顆粒種子溶液。
[0080]在150毫升的燒瓶中，加入100毫升的十六烷基三甲基溴化銨(濃度為0.1摩爾/升)，5毫升的氯金酸水溶液(濃度為0.01摩爾/升)，0.8毫升的硝酸銀水溶液(濃度為0.01摩爾/升)，2毫升的硫酸水溶液(濃度為0.5摩爾/升)，以及800微升的抗壞血酸水溶液(濃度為0.1摩爾/升)；然后加入240微升的上述得到的金納米顆粒種子溶液，反應(yīng)在30°C下進(jìn)行24小時(shí)，得到金納米棒水溶液。通過(guò)圖1可知,金納米棒的棒長(zhǎng)大約為50納米，金納米棒長(zhǎng)徑比為3.6，最大吸收波波長(zhǎng)為759納米。
[0081]接著，將40毫升上述制備的金納米棒溶液離心洗滌2次，兩次均使殘余體積為
2.53毫升。第一次離心完成后加水至40毫升重新分散，第二次離心完成后加水至20毫升重新分散，最終得到的金納米棒水溶液中十六烷基三甲基溴化銨濃度為0.8毫摩爾/升，且以金元素計(jì)的金納米棒濃度為0.25毫摩爾/升。然后，在攪拌下加入0.1摩爾/升的氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)PH值為10，接著每隔30分鐘加入60微升的正硅酸乙酯甲醇溶液(濃度為20重量％)，總共加入三次。反應(yīng)在攪拌下于27°C下進(jìn)行2天，得到表面包覆有介孔二氧化硅層的金納米棒(即藥物載體，以下也稱為AulgSiO2)溶液，然后用水進(jìn)行離心洗滌2次以除去溶液中的十六烷基三甲基溴化銨，得到離心洗滌后的AulgSiO2，將AulgSiO2進(jìn)行凍干得到
9.5毫克干燥后的Au@Si02。通過(guò)圖2可知，介孔二氧化硅層厚度為30納米，介孔二氧化硅層的孔徑為3-4納米；此外，得到的AulgSiO2的比表面積為80平方米/克，孔體積為0.8立方厘米/克；此外，得到的藥物載體的最大吸收波長(zhǎng)為770納米。
[0082]2)藥物組合物的制備
[0083]在燒杯中，將1.6暈克干燥后的AuOSiO2分散于4毫升的阿霉素水溶液(阿霉素的濃度為0.1毫克/毫升)中，用鋁箔紙避光，并在25°C下攪拌4天，得到含有藥物組合物的溶液，然后經(jīng)過(guò)離心干燥得到藥物組合物(以下也稱為Au@Si02-D0X)。該藥物組合物的載藥率為14.5重量％。
[0084]上述載藥率采用以下方法進(jìn)行測(cè)定:在上述離心干燥前，取少量載藥溶液離心，測(cè)量上清液中阿霉素于480納米處的特征吸收，通過(guò)比對(duì)阿霉素的濃度-吸收標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到含有藥物組合物的溶液中未負(fù)載藥物的量。并通過(guò)以下公式計(jì)算得出載藥率:
[0085]載藥率(重量％)=(投入藥物的重量-未負(fù)載藥物的重量)/載體的重量X 100%。
[0086]此外，得到的藥物組合物的最大吸收波長(zhǎng)為790納米。
[0087]實(shí)施例2
[0088]本實(shí)施例用于說(shuō)明藥物組合物的制備。
[0089]I)藥物載體的制備
[0090]在20毫升的燒杯中，將7.5毫升的十六烷基三甲基溴化銨水溶液(十六烷基三甲基溴化銨的濃度為0.1摩爾/升)與250微升的氯金酸水溶液(濃度為0.01摩爾/升)混合，加水至總體積為9.4毫升；然后加入冰水冷卻過(guò)的0.6毫升的硼氫化鈉水溶液(濃度為0.01摩爾/升)；在25°C下攪拌3小時(shí)，得到金納米顆粒種子溶液。
[0091]在150毫升的燒瓶中，加入100毫升的十六烷基三甲基溴化銨(濃度為0.1摩爾/升)，5毫升的氯金酸水溶液(濃度為0.01摩爾/升)，2毫升的硝酸銀水溶液(濃度為0.01摩爾/升)，4毫升的硫酸水溶液(濃度為0.5摩爾/升)，以及800微升的抗壞血酸水溶液(濃度為0.1摩爾/升)；然后加入240微升的上述得到的金納米顆粒種子溶液金納米顆粒，反應(yīng)在30°C下進(jìn)行24小時(shí)，得到金納米棒水溶液。通過(guò)透射電子顯微鏡圖片可知，金納米棒的棒長(zhǎng)為60納米，金納米棒長(zhǎng)徑比為4 ;此外，金納米棒的最大吸收波波長(zhǎng)為800納米。
[0092]接著，將40毫升上述制備的金納米棒溶液離心洗滌2次，兩次均使殘余體積為
2.83毫升。第一次離心完成后加水至40毫升重新分散，第二次離心完成后加水至20毫升重新分散，最終得到的金納米棒水溶液中十六烷基三甲基溴化銨濃度為I毫摩爾/升，且以金元素計(jì)的金納米棒濃度為0.5毫摩爾/升。然后，在攪拌下加入0.1摩爾/升的氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)PH值為9.0，接著每隔30分鐘加入70微升的正硅酸乙酯甲醇溶液(濃度為20重量％)，總共加入三次。反應(yīng)在攪拌下于35°C下進(jìn)行2天，得到表面包覆有介孔二氧化硅層的金納米棒(即藥物載體，以下也稱為AulgSiO2)溶液，然后用水進(jìn)行離心洗滌2次以除去溶液中的十六烷基三甲基溴化銨，得到離心洗滌后的AulgSiO2，將AulgSiO2進(jìn)行凍干得到13.2毫克干燥后的Au@Si02。介孔二氧化硅層的厚度為40納米，介孔二氧化硅層的孔徑為5-7納米；此外，得到的Au@Si02的比表面積為95平方米/克，孔體積為1.05立方厘米/克。得到的藥物載體的最大吸收波波長(zhǎng)為820納米。
[0093]2)藥物組合物的制備
[0094]在燒杯中，將2.4毫克干燥后的AulgSiO2分散于4毫升的紫杉醇水溶液(紫杉醇的濃度為0.2毫克/毫升)中，用鋁箔紙避光，并在25°C下攪拌3天，得到含有藥物組合物的溶液，然后經(jīng)過(guò)離心干燥得到藥物組合物。該藥物組合物的載藥率為17重量％。
[0095]上述載藥率采用以下方法進(jìn)行測(cè)定:在上述離心干燥前，取少量載藥溶液離心，使用高效液相色譜儀測(cè)量上清液中紫杉醇的量，得到含有藥物組合物的溶液中未負(fù)載藥物的量。并通過(guò)以下公式計(jì)算得出載藥率，
[0096]載藥率(重量％)=(投入藥物的量-未負(fù)載藥物的量)/載體的重量X 100%。
[0097]此外，得到的藥物組合物的最大吸收波長(zhǎng)為840納米。
[0098]實(shí)施例3
[0099]本實(shí)施例用于說(shuō)明藥物組合物的制備。
[0100]I)藥物載體的制備
[0101]在20毫升的燒杯中，將7.5毫升的十六烷基三甲基溴化銨水溶液(十六烷基三甲基溴化銨的濃度為0.1摩爾/升)與250微升的氯金酸水溶液(濃度為0.01摩爾/升)混合，加水至總體積為9.4毫升；然后加入冰水冷卻過(guò)的0.6毫升的硼氫化鈉水溶液(濃度為
0.01摩爾/升)；在25°C下攪拌3小時(shí)，得到金納米顆粒種子溶液。
[0102]在150毫升的燒瓶中，加入100毫升的十六烷基三甲基溴化銨(濃度為0.1摩爾/升)，5毫升的氯金酸水溶液(濃度為0.01摩爾/升)，2毫升的硝酸銀水溶液(濃度為0.01摩爾/升)，4毫升的硫酸水溶液(濃度為0.5摩爾/升)，以及800微升的抗壞血酸水溶液(濃度為0.1摩爾/升)；然后加入240微升的上述得到的金納米顆粒種子溶液金納米顆粒，反應(yīng)在30°C下進(jìn)行24小時(shí)，得到金納米棒水溶液。通過(guò)透射電子顯微鏡圖片可知，金納米棒的棒長(zhǎng)為70納米，金納米棒長(zhǎng)徑比為4.2 ;此外，金納米棒的最大吸收波波長(zhǎng)為850納米。
[0103]接著，將40毫升上述制備的金納米棒溶液離心洗滌2次，兩次均使殘余體積為
2.19毫升。第一次離心完成后加水至40毫升重新分散，第二次離心完成后加水至20毫升重新分散，最終得到的金納米棒水溶液中十六烷基三甲基溴化銨濃度為0.6毫摩爾/升，且以金元素計(jì)的金納米棒濃度為0.5毫摩爾/升。然后，在攪拌下加入0.1摩爾/升的氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)PH值為10.5，接著每隔30分鐘加入50微升的正硅酸乙酯甲醇溶液(濃度為20重量％)，總共加入三次。反應(yīng)在攪拌下于26°C下進(jìn)行1.5天，得到表面包覆有介孔二氧化硅層的金納米棒(即藥物載體，以下也稱為Au@Si02)溶液，然后用水進(jìn)行離心洗滌2次以除去溶液中的十六烷基三甲基溴化銨，得到離心洗滌后的AulgSiO2，將AulgSiO2進(jìn)行凍干得到14.5毫克干燥后的Au@Si02。通過(guò)藥物載體的透射電子顯微鏡圖3可知，介孔二氧化硅層的厚度為15納米，介孔二氧化硅層的孔徑為2-5納米；此外，得到的AulgSiO2的比表面積為65平方米/克，孔體積為0.65立方厘米/克。得到的藥物載體的最大吸收波波長(zhǎng)為870納米。
[0104]2)藥物組合物的制備
[0105]在燒杯中，將3.0毫克干燥后的AulgSiO2分散于4毫升的小干擾RNA水溶液(濃度為1.0毫克/毫升)中，用鋁箔紙避光，并在25°C下攪拌2天，得到含有藥物組合物的溶液，然后經(jīng)過(guò)離心干燥得到藥物組合物。該藥物組合物的載藥率為18重量％。
[0106]上述 載藥率采用以下方法進(jìn)行測(cè)定:在上述離心干燥前，取少量載藥溶液離心，使用HPLC測(cè)量上清液中小干擾RNA的量，得到含有藥物組合物的溶液中未負(fù)載藥物的量。并通過(guò)以下公式計(jì)算得出載藥率，
[0107]載藥率(重量％)=(投入藥物的量-未負(fù)載藥物的量)/載體的重量X 100%。
[0108]此外，得到的藥物組合物的最大吸收波波長(zhǎng)為890納米。
[0109]實(shí)施例4
[0110]本實(shí)施例用于說(shuō)明藥物組合物的制備。
[0111]I)藥物載體的制備
[0112]按照實(shí)施例1中金納米棒的制備方法進(jìn)行，不同的是使用2.5毫升的硝酸銀水溶液(濃度為0.01摩爾/升)，5毫升的硫酸水溶液(濃度為0.5摩爾/升)，同樣地制備出金納米棒的棒長(zhǎng)為80納米，長(zhǎng)徑比為4.5的金納米棒溶液，其中含有0.09摩爾/升的十六烷基三甲基溴化銨，其最大吸收波長(zhǎng)為870納米。
[0113]接著，將40毫升上述制備的金納米棒溶液離心洗滌2次，兩次均使殘余體積為
3.26毫升。第一次離心完成后加水至40毫升重新分散，第二次離心完成后加水至20毫升重新分散，最終得到的金納米棒水溶液中十六烷基三甲基溴化銨濃度為1.2毫摩爾/升，且以金元素計(jì)的金納米棒濃度為0.5毫摩爾/升。然后，在攪拌下加入0.1摩爾/升的氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)PH值為11，接著每隔30分鐘加入80微升的硅酸四甲酯的甲醇溶液(濃度為20重量％)，總共加入三次。反應(yīng)在攪拌下于45°C下進(jìn)行I天，得到表面包覆有介孔二氧化硅層的金納米棒(即藥物載體，以下也稱為AulgSiO2)溶液，然后用水進(jìn)行離心洗滌2次以除去溶液中的十六烷基三甲基溴化銨，得到離心洗滌后的AulgSiO2，將AulgSiO2進(jìn)行凍干得到17毫克干燥后的Au@Si02。通過(guò)藥物載體的透射電子顯微鏡圖可知，介孔二氧化硅層的厚度為25納米，介孔二氧化硅層的孔徑為3-4納米；此外，得到的AulgSiO2的表面積為85平方米/克，孔體積為1.2立方厘米/克。得到的藥物載體的最大吸收波波長(zhǎng)為885納米。
[0114]2)藥物組合物的制備
[0115]在燒杯中，將3毫克干燥后的AulgSiO2分散于4毫升的順鉬的二甲基亞砜溶液(順鉬的濃度為0.5毫克/毫升)中，用鋁箔紙避光，并在15°C下攪拌2天，得到含有藥物組合物的溶液，然后經(jīng)過(guò)離心干燥得到藥物組合物。該藥物組合物的載藥率為12重量％。
[0116]上述載藥率采用以下方法進(jìn)行測(cè)定:在上述離心干燥前，取少量載藥溶液離心，通過(guò)高壓液相色譜測(cè)量上清液中順鉬的含量，得到含有藥物組合物的溶液中未負(fù)載藥物的量。并通過(guò)以下公式計(jì)算得出載藥率，
[0117]載藥率(重量％)=(投入藥物的量-未負(fù)載藥物的量)/載體的重量X 100%。
[0118]此外，得到的藥物組合物的最大吸收波波長(zhǎng)為895納米。
[0119]實(shí)施例5[0120]本實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明的藥物載體的光熱轉(zhuǎn)換效應(yīng)
[0121]將實(shí)施例1中制備的藥物載體分散于20毫升的水中，取200微升放入96孔板。使用光斑直徑為2毫米，功率為150毫瓦或者250毫瓦，波長(zhǎng)為780納米的激光照射。用溫敏溫度計(jì)記錄溶液的溫度，并繪制出溫度-照射時(shí)間曲線(圖4)。如圖4所示，在150毫瓦激光照射下，納米粒子溶液的溫度最高可升至38度，而在250毫瓦激光照射下，最高可升至48度。
[0122]實(shí)施例6
[0123]本實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明的藥物組合物的釋藥。
[0124]取實(shí)施例1中制備的藥物組合物，分兩組進(jìn)行釋藥實(shí)驗(yàn)。
[0125]第一組:將實(shí)施例1中制備的藥物組合物3份(每份0.5毫克)分別用pH=7.4,6.0、4.5的磷酸鹽緩沖溶液1.0毫升分散，置于37°C搖床中開(kāi)始釋藥實(shí)驗(yàn)。每隔I小時(shí)取出一次，離心，收集上清，并通過(guò)480納米處的特征吸收，測(cè)算已釋放出的阿霉素質(zhì)量。殘余物用相同的緩沖溶液分散，放回?fù)u床，繼續(xù)進(jìn)行藥物釋放實(shí)驗(yàn)。釋藥實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行12小時(shí)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，計(jì)算出每小時(shí)的釋藥量占總藥物包載量的比例，按照累計(jì)釋藥率-釋藥時(shí)間畫(huà)出釋藥曲線，具體如圖5所示。
[0126]第二組:將實(shí)施例1中制備的藥物組合物3份(每份0.5毫克)分別用pH=7.4,6.0、
4.5的磷酸鹽緩沖溶液1.0毫升分散,用波長(zhǎng)為760納米,功率為250暈瓦,光斑直徑為2暈米的激光照射，使溶液溫度升至48°C，進(jìn)行釋藥實(shí)驗(yàn)。每隔I小時(shí)取出一次，離心，收集上清，并通過(guò)480納米處的特征吸收，測(cè)算已釋放出的阿霉素質(zhì)量。殘余物用相同的緩沖溶液分散，重新用激光照射，繼續(xù)進(jìn)行藥物釋放實(shí)驗(yàn)。釋藥實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行12小時(shí)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，計(jì)算出每小時(shí)的釋藥量占總藥物包載量的比例，按照累計(jì)釋藥率-釋藥時(shí)間畫(huà)出釋藥曲線，具體如圖5所示。
[0127]通過(guò)圖5可知，在37 °C時(shí)，藥物釋放速度很慢，雖然在低pH比中性條件下釋藥速度稍快，但是并無(wú)明顯差異。但對(duì)比第一組釋藥實(shí)驗(yàn)可知，在激光照射使溶液溫度升高后，釋藥速度大大加快；PH越低，釋藥速度加快的更多，因此，本發(fā)明所述的藥物組合物可通過(guò)外在的激光照射控制其釋藥的速度，并能響應(yīng)于腫瘤組織內(nèi)部特有的弱酸性環(huán)境。
[0128]實(shí)施例7
[0129]本實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明的藥物組合物的釋藥。[0130]取實(shí)施例2中制備的藥物組合物，分兩組進(jìn)行釋藥實(shí)驗(yàn)。
[0131]第一組:將實(shí)施例2中制備的藥物組合物3份(每份0.5毫克)分別用pH=7.4,6.0、4.5的磷酸鹽緩沖溶液1.0毫升分散，置于37°C搖床中開(kāi)始釋藥實(shí)驗(yàn)。每隔I小時(shí)取出一次，離心，收集上清，并使用高效液相色譜儀，測(cè)算已釋放出的紫杉醇的質(zhì)量。殘余物用相同的緩沖溶液分散，放回?fù)u床，繼續(xù)進(jìn)行藥物釋放實(shí)驗(yàn)。釋藥實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行12小時(shí)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，計(jì)算出每小時(shí)的釋藥量占總藥物包載量的比例，按照累計(jì)釋藥率-釋藥時(shí)間畫(huà)出釋藥曲線，具體如圖6所示。
[0132]第二組:將實(shí)施例2中制備的藥物組合物3份(每份0.5毫克)分別用pH=7.4,6.0、4.5的磷酸鹽緩沖溶液1.0毫升分散,用波長(zhǎng)為840納米,功率為250暈瓦,光斑直徑為2暈米的激光照射，使溶液溫度升至48°C，進(jìn)行釋藥實(shí)驗(yàn)。每隔I小時(shí)取出一次，離心，收集上清，并使用高效液相色譜儀測(cè)算已釋放出的紫杉醇質(zhì)量。殘余物用相同的緩沖溶液分散，重新用激光照射，繼續(xù)進(jìn)行藥物釋放實(shí)驗(yàn)。釋藥實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行12小時(shí)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，計(jì)算出每小時(shí)的釋藥量占總藥物包載量的比例，按照累計(jì)釋藥率-釋藥時(shí)間畫(huà)出釋藥曲線，具體如圖6所示。
[0133]通過(guò)圖6可知，在37 °C時(shí)，藥物釋放速度很慢，雖然在低pH比中性條件下釋藥速度稍快，但是并無(wú)明顯差異。但對(duì)比第一組釋藥實(shí)驗(yàn)可知，在激光照射使溶液溫度升高后，釋藥速度大大加快；PH越低，釋藥速度加快的更多，因此，本發(fā)明所述的藥物組合物可通過(guò)外在的激光照射控制其釋藥的速度，并能響應(yīng)于腫瘤組織內(nèi)部特有的弱酸性環(huán)境。
[0134]實(shí)施例8
[0135]本實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明的藥物載體及藥物組合物用于癌細(xì)胞成像。
[0136]I)人肺癌A549細(xì)胞的培養(yǎng)
[0137]將人肺癌A549細(xì)胞接種于35毫米共聚焦成像培養(yǎng)皿中，使用DMEM液體培養(yǎng)基(含有10重量％胎牛血清、I重量％青霉素、100單位/毫升的鏈霉素、2毫摩爾/升的谷氨酰胺)于37°C，5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，磷酸鹽緩沖溶液洗滌兩次。然后分別加入含有5微摩爾/升等效阿霉素的Au@Si02-D0X (實(shí)施例1制備)和含有Au@Si02 (實(shí)施例1制備，其用量與5微摩爾/升等效阿霉素的Au@Si02-D0X中所含有的Au@Si02相同)的完全培養(yǎng)基(DMEM液體培養(yǎng)基，其含有10重量％胎牛血清、I重量％青霉素、100單位/毫升的鏈霉素、2毫摩爾/升的谷氨酰胺)，并分別處理細(xì)胞12小時(shí)。
[0138]2)溶酶體內(nèi)共定位
[0139]丟棄細(xì)胞培養(yǎng)基,加入含100納摩爾/升的溶酶體染料(LysoTracker Green)的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基于37°C孵育細(xì)胞45分鐘。用磷酸鹽緩沖溶液洗滌細(xì)胞三次，加入無(wú)血清DMEM液體培養(yǎng)基，顯微鏡下觀察。單光子模式成像:488納米激光激發(fā)，收集530納米熒光信號(hào)為細(xì)胞器定位信息，并在580-610納米通道區(qū)域原位收集DOX的紅色熒光信號(hào)。雙光子模式成像:將激發(fā)光源調(diào)節(jié)到雙光子模式，780納米飛秒激光(fs-pulse, Maitai of SpectraPhysics in USA)，收集530納米發(fā)射光信號(hào)。由此，得到組合圖7。其中，圖7中的A為阿霉素(D0X)與溶酶體(Lyso)共定位圖，同一細(xì)胞內(nèi)的阿霉素(D0X，用紅色表示)照片與溶酶體(Lyso，用綠色表示)照片重疊后，可以觀察到黃色的斑點(diǎn)，表明細(xì)胞內(nèi)的阿霉素定位于溶酶體內(nèi)；圖7中的B為Au@Si02載體與溶酶體(Lyso)共定位圖，同一細(xì)胞內(nèi)的Au@Si02載體(用藍(lán)色表示)照片與溶酶體(Lyso，用綠色表示)照片重疊后，可以觀察到藍(lán)綠色的斑點(diǎn)，表明細(xì)胞內(nèi)的Au@Si02定位于溶酶體內(nèi)；圖7中的C為Au@Si02與阿霉素(DOX)共定位圖，同一細(xì)胞內(nèi)的AulgSiO2載體(用藍(lán)色表示)照片與阿霉素(D0X，用紅色表示)照片重疊后，可以觀察到粉紅色的斑點(diǎn)，表明細(xì)胞內(nèi)的Au@Si02與阿霉素在細(xì)胞內(nèi)處于同一位點(diǎn)；圖7中的D為AuOSiO2、阿霉素(DOX)及溶酶體(Lyso)三者共定位圖，同一細(xì)胞內(nèi)的AuOSiO2載體(用藍(lán)色表示)照片、阿霉素(D0X，用紅色表示)照片與溶酶體(Lyso，用綠色表示)重疊后，可以觀察到白色的斑點(diǎn)，表明細(xì)胞內(nèi)的Au@Si02與阿霉素一起定位于溶酶體內(nèi)。由圖7可以看出，通過(guò)納米載體Au@Si02本身的雙光子致熒光效應(yīng)確定其進(jìn)入A549細(xì)胞后會(huì)蓄積于溶酶體(Lyso)中。
[0140] 實(shí)施例9
[0141 ] 本實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明的藥物載體及藥物組合物用于癌細(xì)胞成像。
[0142]1)人肺癌A549細(xì)胞的培養(yǎng)
[0143]將人肺癌A549細(xì)胞接種于35毫米共聚焦成像培養(yǎng)皿中，使用DMEM液體培養(yǎng)基(含有10重量％胎牛血清、I重量％青霉素、100單位/毫升的鏈霉素、2毫摩爾/升的谷氨酰胺)于37°C，5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，磷酸鹽緩沖溶液洗滌兩次。然后分別加入含有5微摩爾/升等效阿霉素的Au@Si02-D0X (實(shí)施例1制備)和含有Au@Si02 (實(shí)施例1制備，其用量與5微摩爾/升等效阿霉素的Au@Si02-D0X中所含有的Au@Si02相同)的完全培養(yǎng)基(DMEM液體培養(yǎng)基，其含有10重量％胎牛血清、I重量％青霉素、100單位/毫升的鏈霉素、2毫摩爾/升的谷氨酰胺)，并分別處理細(xì)胞12小時(shí)。
[0144]2)線粒體內(nèi)共定位
[0145]丟棄細(xì)胞培養(yǎng)基，加入含100納摩爾/升的線粒體染料(MitoTracker Green)的無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基37°C孵育細(xì)胞45分鐘。用磷酸鹽緩沖溶液洗滌細(xì)胞三次，加入無(wú)血清DMEM液體培養(yǎng)基，顯微鏡下觀察。單光子模式成像:488納米激光激發(fā)，收集530納米熒光信號(hào)為細(xì)胞器定位信息，并在580-610納米通道區(qū)域原位收集阿霉素的紅色熒光信號(hào)。雙光子模式成像:將激發(fā)光源調(diào)節(jié)到雙光子模式，780納米飛秒激光(fs-pulse, Maitai ofSpectra Physics in USA),收集530納米發(fā)射光信號(hào)。由此,得到組合圖8。其中，圖8中的A為阿霉素(DOX)與線粒體(Mito)共定位圖，同一細(xì)胞內(nèi)的阿霉素(D0X，用紅色表示)照片與線粒體(Mito，用綠色表示)照片重疊后，未觀察到黃色的斑點(diǎn)，表明細(xì)胞內(nèi)的阿霉素不定位于線粒體內(nèi)；圖8中的B為Au@Si02載體與線粒體(Mito)共定位圖，同一細(xì)胞內(nèi)的AuOSiO2載體(用藍(lán)色表示)照片與線粒體(Mito，用綠色表示)照片重疊后，僅觀察到少量藍(lán)綠色的斑點(diǎn)，表明細(xì)胞內(nèi)只有少量Au@Si02定位于線粒體內(nèi)；圖8中的C為Au@Si02與阿霉素(DOX)共定 位圖，同一細(xì)胞內(nèi)的Au@Si02載體(用藍(lán)色表示)照片與阿霉素(D0X，用紅色表示)照片重疊后，可以觀察到粉紅色的斑點(diǎn)，表明細(xì)胞內(nèi)的AuigSiO2與阿霉素在細(xì)胞內(nèi)處于同一位點(diǎn)；圖8中的D為Au@Si02，阿霉素(DOX)及線粒體(Mito)三者共定位圖，同一細(xì)胞內(nèi)的AuiSiO2載體(用藍(lán)色表示)照片、阿霉素(D0X，用紅色表示)照片與線粒體(Mito，用綠色表示)重疊后，可以觀察到明顯的粉紅色斑點(diǎn)和極少量白色斑點(diǎn)，表明細(xì)胞內(nèi)的AulgSiO2與阿霉素處于同一位點(diǎn)，而僅有極少量Au@Si02與阿霉素一起定位于線粒體內(nèi)。由圖8可以看出，通過(guò)納米載體AulgSiO2本身的雙光子效應(yīng)可確定其進(jìn)入A549細(xì)胞后會(huì)有少量蓄積于線粒體中。
[0146]實(shí)施例10[0147]本實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明的藥物載體及藥物組合物用于癌細(xì)胞成像。
[0148]將實(shí)施例8中的肺癌細(xì)胞更換為人乳腺癌細(xì)胞MCF-7，其他步驟相同，得到組合圖9，其中，圖9中的A為阿霉素(DOX)與溶酶體(Lyso)共定位圖，同一細(xì)胞內(nèi)的阿霉素(D0X，用紅色表示)照片與溶酶體(Lyso，用綠色表示)照片重疊后，可以觀察到黃色的斑點(diǎn)，表明細(xì)胞內(nèi)的阿霉素定位于溶酶體內(nèi)；圖9中的B為Au@Si02載體與溶酶體(Lyso)共定位圖，同一細(xì)胞內(nèi)的AulgSiO2載體(用藍(lán)色表示)照片與溶酶體(Lyso，用綠色表示)照片重疊后，可以觀察到藍(lán)綠色的斑點(diǎn)，表明細(xì)胞內(nèi)的Au@Si02定位于溶酶體內(nèi)；圖9中的C為Au@Si02與阿霉素(DOX)共定位圖，同一細(xì)胞內(nèi)的Au@Si02載體(用藍(lán)色表示)照片與阿霉素(D0X，用紅色表示)照片重疊后，可以觀察到粉紅色的斑點(diǎn)，表明細(xì)胞內(nèi)的AulgSiO2與阿霉素在細(xì)胞內(nèi)處于同一位點(diǎn)；圖9中的D為Au@Si02，阿霉素(DOX)及溶酶體三者共定位圖，同一細(xì)胞內(nèi)的AulgSiO2載體(用藍(lán)色表示)照片、阿霉素(D0X，用紅色表示)照片與溶酶體(Lyso，用綠色表示)重疊后，可以觀察到白色的斑點(diǎn)，表明細(xì)胞內(nèi)的AulgSiO2與阿霉素一起定位于溶酶體內(nèi)。由圖9可以看出，通過(guò)納米載體Au@Si02本身的雙光子效應(yīng)可確定其進(jìn)入人乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞后會(huì)富集于溶酶體中。
[0149]實(shí)施例11
[0150]本實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明的藥物載體及藥物組合物用于癌細(xì)胞成像。
[0151]將實(shí)施例8中的肺癌細(xì)胞更換為人乳腺癌細(xì)胞MCF-7，其他步驟相同，得到組合圖10，其中，圖10中的A為阿霉素(DOX)與線粒體(Mito)共定位圖，同一細(xì)胞內(nèi)的阿霉素(D0X，用紅色表示)照片與線粒體(Mito，用綠色表示)照片重疊后，僅觀察到黃色的斑點(diǎn)，表明細(xì)胞內(nèi)的阿霉素僅有少量進(jìn)入線粒體內(nèi)；圖10中的B為Au@Si02載體與溶酶體(Mito)共定位圖，同一細(xì)胞內(nèi)的AulgSiO2載體(用藍(lán)色表示)照片與線粒體(Mito，用綠色表示)照片重疊后，僅觀察到少量藍(lán)綠色的斑點(diǎn)，表明細(xì)胞內(nèi)只有少量AulgSiO2S位于線粒體內(nèi)；圖10中的C為Au@Si02與阿霉素(DOX)共定位圖，同一細(xì)胞內(nèi)的Au@Si02載體(用藍(lán)色表示)照片與阿霉素(D0X，用紅色表示)照片重疊后，可以觀察到粉紅色的斑點(diǎn)，表明細(xì)胞內(nèi)的AulgSiO2與阿霉素在細(xì)胞內(nèi)處于同一位點(diǎn)；圖10中的D為AuOSiO2，阿霉素(DOX)及線粒體(Mito)三者共定位圖，同一細(xì)胞內(nèi)的AulgSiO2載體(用藍(lán)色表示)照片、阿霉素(D0X，用紅色表示)照片與線粒體(Mito，用綠色表示)重疊后，可以觀察到明顯的粉紅色斑點(diǎn)和極少量白色斑點(diǎn)，表明細(xì)胞內(nèi)的Au@Si02與阿霉素處于同一位點(diǎn)，而僅有極少量Au@Si02與阿霉素一起定位于線粒體內(nèi)。由圖10可以看出，通過(guò)納米載體Au@Si02本身的雙光子效應(yīng)可確定其進(jìn)入A549細(xì)胞后會(huì)有少量富集于線粒體中。
[0152]通過(guò)上述實(shí)施例8-11可知，由于金納米棒可被780納米的近紅外飛秒脈沖激光激發(fā)，發(fā)射熒光信號(hào)在450-600納米，但不被單光子488納米激光激發(fā)，可以區(qū)別金納米棒和染料的信號(hào)。并可利用軟件對(duì)細(xì)胞器、DOX和金納米棒共定位。
[0153]實(shí)施例12
[0154]本實(shí)施例用于說(shuō)明癌細(xì)胞對(duì)本發(fā)明的藥物組合物的攝入。
[0155]1)人肺癌A549細(xì)胞的培養(yǎng)
[0156]將人肺癌A549細(xì)胞接種于35毫米共聚焦成像培養(yǎng)皿中，使用DMEM液體培養(yǎng)基(含有10重量％胎牛血清，I重量％青霉素和100單位/毫升的鏈霉素，2毫摩爾/升的谷氨酰胺)于37°C, 5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。[0157]2)細(xì)胞攝入量測(cè)定
[0158]將步驟I中培養(yǎng)的細(xì)胞接種于6孔板中，8萬(wàn)細(xì)胞/孔，加入2毫升完全培養(yǎng)基(DMEM液體培養(yǎng)基，其含有10重量％胎牛血清、I重量％青霉素、100單位/毫升的鏈霉素、2毫摩爾/升的谷氨酰胺)，置于37°C，5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。然后在新配制的DMEM液體培養(yǎng)基中，分別加入5微摩爾/升的DOX和5微摩爾/升等效DOX濃度的AuOSiO2-DOX (實(shí)施例1制備)，混勻后各取2毫升加入6孔板中，每種濃度設(shè)置4個(gè)平行孔，37 °C, 5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在不同時(shí)間點(diǎn)(3、6、12、24小時(shí))分別用胰蛋白酶消化細(xì)胞，800g離心，0.5毫升hanks緩沖液重懸配制細(xì)胞懸液，然后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)熒光值。檢測(cè)參數(shù):實(shí)驗(yàn)過(guò)程中采取固定的流式激光電壓，488納米激光激發(fā)，收集FL2通道檢測(cè)信號(hào)。采集I萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的平均熒光值，將幾個(gè)平行樣計(jì)算平均值，為該時(shí)間點(diǎn)該細(xì)胞攝入阿霉素(DOX)和Au@Si02-D0X的熒光定量值。取熒光定量值，Origin軟件作圖，分析細(xì)胞攝入阿霉素(DOX)的趨勢(shì)，如圖11。
[0159]通過(guò)圖11可以看出相對(duì)于單獨(dú)使用抗癌藥物阿霉素，用本發(fā)明所述的載體AuOSiO2包載阿霉素可以將細(xì)胞攝入量增加大約5倍。
[0160]實(shí)施例13
[0161]本實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明的藥物載體及藥物組合物對(duì)細(xì)胞活力的影響。
[0162]1)細(xì)胞培養(yǎng)
[0163]將人肺癌A549細(xì)胞分別培養(yǎng)于完全培養(yǎng)基(DMEM液體培養(yǎng)基，其含有10重量％胎牛血清、I重量％青霉素、100單位/毫升的鏈霉素、2毫摩爾/升的谷氨酰胺)中，置于37°C，5% 二氧 化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。
[0164]2)細(xì)胞活力測(cè)定
[0165]以6000細(xì)胞/孔密度，將細(xì)胞接種于96孔板中。貼壁24小時(shí)后，分別加入含濃度為0.1、1.0,5.0、10微摩爾/升的阿霉素和Au@Si02-D0X(實(shí)施例1制備，濃度以負(fù)載的阿霉素計(jì))的完全培養(yǎng)基(DMEM液體培養(yǎng)基，其含有10重量％胎牛血清、I重量％青霉素、100單位/毫升的鏈霉素、2毫摩爾/升的谷氨酰胺)。在處理24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)后，撤掉培養(yǎng)基；每孔加入110微升，含10% (體積比)CCK-8的細(xì)胞培養(yǎng)液，在培養(yǎng)箱中孵育2小時(shí)后；在酶標(biāo)儀上測(cè)定在450納米處吸光度，600納米處吸光值為參比波長(zhǎng)。每組吸光值扣除空白溶液吸光值后，每孔對(duì)應(yīng)值除以對(duì)照組作為細(xì)胞活力。每組設(shè)置6個(gè)平行孔，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。細(xì)胞活力測(cè)定結(jié)果如圖12和圖13所示。圖12為阿霉素濃度與細(xì)胞活力的關(guān)系圖；圖13為Au@Si02-D0X濃度(濃度以負(fù)載的阿霉素計(jì))與細(xì)胞活力的關(guān)系圖。對(duì)比圖12和圖13，可以看出，相對(duì)于單獨(dú)使用等濃度的抗癌藥物阿霉素，本發(fā)明所述載體AulgSiO2具有減緩阿霉素降低細(xì)胞活力的作用，說(shuō)明阿霉素從載體中緩慢釋放的效果。此特點(diǎn)說(shuō)明該載體特別適用于要求藥物緩釋的治療需要。
[0166]實(shí)施例14
[0167]本實(shí)施例用于說(shuō)明激光照射后的細(xì)胞活力。
[0168]I)細(xì)胞培養(yǎng)
[0169]將人肺癌A549細(xì)胞以3000細(xì)胞/孔密度，接種于96孔板中。使用DMEM液體培
養(yǎng)基(含有10重量％胎牛血清、I重量％青霉素、100單位/毫升的鏈霉素、2毫摩爾/升的谷氨酰胺)于37°C，5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中，貼壁24小時(shí)后，分別加入含有5微摩爾/升等效阿霉素的Au@Si02-D0X (實(shí)施例1制備)和含有Au@Si02 (實(shí)施例1制備，其用量與5微摩爾/升等效阿霉素的Au@Si02-D0X中所含有的Au@Si02相同)的完全培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基為DMEM液體培養(yǎng)基，其含有10重量％胎牛血清、I重量％青霉素、100單位/毫升的鏈霉素、2毫摩爾/升的谷氨酰胺)，并分別處理細(xì)胞12小時(shí)。
[0170]2)細(xì)胞存活率測(cè)定
[0171]激光照射前，細(xì)胞用磷酸鹽緩沖溶液洗滌2次，用波長(zhǎng)為780納米、功率為24瓦/平方厘米的激光照射8分鐘。照射后，繼續(xù)培養(yǎng)12小時(shí)、24小時(shí)，用LIVE-DEAD試劑盒(Invitrogen公司)對(duì)細(xì)胞染色，死細(xì)胞染為紅色，活細(xì)胞染為綠色，檢測(cè)細(xì)胞存活率，結(jié)果如圖14。
[0172]通過(guò)圖14可以看出，對(duì)照組與空白載體AuOSiOdi經(jīng)激光照射后，細(xì)胞存活率無(wú)明顯下降；而包載藥物的載體Au@Si02-D0X經(jīng)激光照射后12小時(shí)和24小時(shí)，細(xì)胞存活率將逐漸下降。這說(shuō)明載體Au@Si02-D0X在激光照射后，將包載的阿霉素釋放，起到了殺死癌細(xì)胞的作用。對(duì)照組為不給任何藥物處理的細(xì)胞，空白載體Au@Si02組為Au@Si02處理的細(xì)胞，載體組為5微摩爾/升等效濃度的Au@Si02-D0X處理的細(xì)胞。
[0173]實(shí)施例15
[0174]本實(shí)施例用于說(shuō)明激光照射細(xì)胞后細(xì)胞膜完整性評(píng)價(jià)
[0175]I)細(xì)胞培養(yǎng)
[0176]將人肺癌A549細(xì)胞接種于35毫米共聚焦成像培養(yǎng)皿中，使用DMEM液體培養(yǎng)基(含有10重量％胎牛血清、I重量％青霉素、100單位/毫升的鏈霉素、2毫摩爾/升的谷氨酰胺)于37°C，5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，磷酸鹽緩沖溶液洗滌兩次。
[0177]2)細(xì)胞膜完整性檢測(cè)
[0178]雙光子共聚焦顯微鏡用于研究溶酶體膜的完整性。
[0179](I)加入含實(shí)施例1中制備的5微摩爾/升等效阿霉素濃度的Au@Si02-D0X的DMEM液體培養(yǎng)基(含有10重量％胎牛血清、I重量％青霉素、100單位/毫升的鏈霉素、2毫摩爾/升的谷氨酰胺)處理細(xì)胞12小時(shí)；
[0180](2)用含5微克/毫升吖啶橙(AO)的DMEM液體培養(yǎng)基于37°C孵育細(xì)胞15分鐘，磷酸鹽緩沖溶液洗滌3次，然后加入無(wú)血清DMEM液體培養(yǎng)基；
[0181](3)利用雙光子熒光顯微鏡的近紅外激光(780納米波長(zhǎng)，飛秒脈沖Maitai激光器，顯微鏡為01ympusBX61Wl，Japan)照射，激光功率密度為24和48瓦/平方厘米，照射時(shí)間為0、3、8分鐘；
[0182](4)共聚焦顯微鏡下觀察，488納米激發(fā)，分別在537納米和615納米收集發(fā)射信號(hào)。紅色膜泡結(jié)構(gòu)為完整的溶酶體；如果胞漿內(nèi)膜泡狀結(jié)構(gòu)的紅色信號(hào)減弱，同時(shí)在溶酶體周?chē)霈F(xiàn)紅綠相間或者綠色膜狀結(jié)構(gòu)，表明溶酶體膜結(jié)構(gòu)受到損傷。此外，觀察細(xì)胞膜邊緣的冒泡結(jié)構(gòu)，分析細(xì)胞膜的完整性程度，如圖15。
[0183]通過(guò)圖15可以看出，攝入Au@Si02-D0X的癌細(xì)胞經(jīng)高功率(48瓦/平方厘米)激光照射后，溶酶體膜破裂，細(xì)胞死亡；低功率(24瓦/平方厘米)以下激光對(duì)溶酶體膜無(wú)明顯影響，說(shuō)明本發(fā)明中所述載體能將激光轉(zhuǎn)化為熱，通過(guò)破壞溶酶體膜殺死癌細(xì)胞。
[0184]實(shí)施例16
[0185]本實(shí)施例用于說(shuō)明細(xì)胞內(nèi)的低功率激光控制藥物釋放對(duì)腫瘤細(xì)胞活力的影響。本實(shí)施例選擇不同類型腫瘤細(xì)胞、不同低功率的激光、不同照射時(shí)間考察激光熱療和藥物釋放誘導(dǎo)的化療效果。
[0186]I)細(xì)胞培養(yǎng)
[0187]選擇多種人源腫瘤細(xì)胞包括人肺癌細(xì)胞(A549)、人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)、人乳腺癌細(xì)胞(MDA-MB-231)、人黑色素瘤細(xì)胞(A375)、人宮頸癌細(xì)胞(HeLa)、人肝癌細(xì)胞(!fepG2)和人前列腺癌細(xì)胞(LNCap)，以3000細(xì)胞/孔密度，將這些細(xì)胞分別接種于96孔板中，使用DMEM液體培養(yǎng)基(含有10重量％胎牛血清、I重量％青霉素、100單位/毫升的鏈霉素、2暈?zāi)?升的谷氨酰胺)于37°C，5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，磷酸鹽緩沖溶液洗滌兩次。分別加入含有5微摩爾/升等效阿霉素的Au@Si02-D0X(實(shí)施例1制備)和含有Au@Si02(實(shí)施例1制備，其用量與5微摩爾/升等效阿霉素的Au@Si02-D0X中所含有的Au@Si02相同)的完全培養(yǎng)基(DMEM液體培養(yǎng)基，其含有10重量％胎牛血清、I重量％青霉素、100單位/毫升的鏈霉素、2毫摩爾/升的谷氨酰胺)，并分別處理細(xì)胞12小時(shí)。
[0188]2)激光照射
[0189]丟棄細(xì)胞培養(yǎng)基，加入完全培養(yǎng)基(DMEM液體培養(yǎng)基，其含有10重量％胎牛血清、I重量％青霉素、100單位/毫升的鏈霉素、2暈?zāi)?升的谷氨酰胺)。選擇A549細(xì)胞、MCF-7細(xì)胞、MDA-MB-231細(xì)胞、A375細(xì)胞進(jìn)行照射，近紅外激光器照射孔板中的細(xì)胞(飛秒激光780納米，功率密度:24瓦/平方厘米)，照射時(shí)間為3、5、8分鐘。選擇HeLa細(xì)胞、!fepG2細(xì)胞、HNCap細(xì)胞進(jìn)行照射，近紅外激光器照射孔板中的細(xì)胞(飛秒激光780納米，功率密度:12瓦/平方厘米)，照射時(shí)間為5、lOmin。各設(shè)一實(shí)驗(yàn)組為攝入藥物組(分別為上述5微摩爾/升等效阿霉素的Au@Si02-D0X處理的細(xì)胞組和Au@Si02處理的細(xì)胞組)，攝入藥物并激光照射組，并有對(duì)照組(無(wú)藥物處理和無(wú)激光照射組)，另設(shè)一實(shí)驗(yàn)組為加I微摩爾/升阿霉素。
[0190]3)細(xì)胞活力測(cè)定
[0191]照射后24小時(shí)分別利用CCK-8試劑盒測(cè)試細(xì)胞的活力。每孔加入110微升混合液，混合液含90體積％完全培養(yǎng)基(DMEM液體培養(yǎng)基，其含有10重量％胎牛血清、I重量％青霉素、100單位/毫升的鏈霉素、2暈?zāi)?升的谷氨酰胺)和10體積％CCK_8的細(xì)胞培養(yǎng)液，在培養(yǎng)箱中孵育2小時(shí)后。在酶標(biāo)儀上測(cè)定在450納米處吸光度，600納米處吸光值為參比波長(zhǎng)；每組吸光值扣除空白溶液吸光值后，每孔對(duì)應(yīng)值除以對(duì)照組作為細(xì)胞活力。每組設(shè)置6個(gè)平行孔，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
[0192]評(píng)價(jià)激光照射后，AuiSiO2和Au@Si02-D0X對(duì)細(xì)胞活力的影響；分析細(xì)胞活力變化是否為藥物釋放引起。通過(guò)圖16 (A，B)可看出，Au@Si02組經(jīng)低功率(24瓦/平方厘米和12瓦/平方厘米)激光照射后，細(xì)胞活力均無(wú)明顯下降，表明載體將兩種功率的激光轉(zhuǎn)化成的熱量不足以殺死癌細(xì)胞；而411略102-0(?組經(jīng)兩種功率激光照射后，細(xì)胞活力在后續(xù)的24小時(shí)內(nèi)均逐漸下降，說(shuō)明其中包載的阿霉素在激光照射后逐漸釋放，造成了細(xì)胞活力的下降，達(dá)到化療的效果。
[0193]實(shí)施例17
[0194]本實(shí)施例用于說(shuō)明高功率激光同時(shí)實(shí)現(xiàn)熱療和細(xì)胞內(nèi)藥物釋放的化療雙重模式對(duì)腫瘤細(xì)胞活力的影響。
[0195]I)細(xì)胞培養(yǎng)[0196]選擇三種人源腫瘤細(xì)胞包括人肺癌細(xì)胞(A549)、人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)、人黑色素瘤細(xì)胞(A375)等細(xì)胞，以3000細(xì)胞/孔密度，將這些細(xì)胞分別接種于96孔板中，使用完全培養(yǎng)基(DMEM液體培養(yǎng)基，其含有10重量％胎牛血清、I重量％青霉素、100單位/毫升的鏈霉素、2毫摩爾/升的谷氨酰胺)于37°C，5% 二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，磷酸鹽緩沖溶液洗滌兩次。分別加入含有5微摩爾/升等效阿霉素的Au@Si02-D0X (實(shí)施例1制備)和含有Au@Si02 (實(shí)施例1制備，其用量與5微摩爾/升等效阿霉素的Au@Si02-D0X中所含有的Au@Si02相同)的完全培養(yǎng)基(DMEM液體培養(yǎng)基，其含有10重量％胎牛血清、I重量％青霉素、100單位/毫升的鏈霉素、2毫摩爾/升的谷氨酰胺)，并分別處理細(xì)胞12小時(shí)。
[0197]2)激光照射
[0198]丟棄細(xì)胞培養(yǎng)基，加入完全培養(yǎng)基(DMEM液體培養(yǎng)基，其含有10重量％胎牛血清、I重量％青霉素、100單位/毫升的鏈霉素、2暈?zāi)?升的谷氨酰胺)，選擇A549、MCF-7、A375細(xì)胞，使用近紅外激光器照射孔板中的細(xì)胞(飛秒激光780納米，功率密度:48瓦/平方厘米)，照射時(shí)間為12分鐘。各設(shè)一實(shí)驗(yàn)組為攝入藥物組(分別為上述5微摩爾/升等效阿霉素的Au@Si02-D0X處理的細(xì)胞組和Au@Si02處理的細(xì)胞組)，攝入藥物并激光照射組，并有對(duì)照組(無(wú)藥物處理和無(wú)激光照射組)。[0199]3)細(xì)胞活力測(cè)定
[0200]照射后12小時(shí)分別利用CCK-8試劑盒測(cè)試細(xì)胞的活力。每孔加入110微升混合液，混合液含90體積％完全培養(yǎng)基(DMEM液體培養(yǎng)基，其含有10重量％胎牛血清、I重量％青霉素、100單位/毫升的鏈霉素、2暈?zāi)?升的谷氨酰胺)和10體積％CCK_8的細(xì)胞培養(yǎng)液，在培養(yǎng)箱中孵育2小時(shí)后。在酶標(biāo)儀上測(cè)定在450納米處吸光度，600納米處吸光值為參比波長(zhǎng)；每組吸光值扣除空白溶液(只加入90體積％完全培養(yǎng)基和10體積％CCK，無(wú)細(xì)胞)的吸光值后，每孔對(duì)應(yīng)值除以對(duì)照組(無(wú)藥物處理、無(wú)激光照射的細(xì)胞組)作為細(xì)胞活力。每組設(shè)置6個(gè)平行孔，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
[0201]評(píng)價(jià)高功率激光照射后，AuiSiO2和Au@Si02-D0X對(duì)細(xì)胞活力的影響；分析細(xì)胞活力變化是否為熱療、熱輔助藥物釋放的協(xié)同作用引起。通過(guò)圖17可看出，AulgSiO2組經(jīng)48瓦/平方厘米高功率激光照射后，細(xì)胞活力明顯下降，表明載體將此功率激光轉(zhuǎn)化成的熱可殺死大部分的癌細(xì)胞；同時(shí)經(jīng)激光照射后，相比載體，Au@Si02-D0X組細(xì)胞活力在后續(xù)12小時(shí)內(nèi)顯著下降，說(shuō)明其殺死腫瘤細(xì)胞方式是光熱和藥物釋放化療的協(xié)同效應(yīng)，一方面載體能夠光熱轉(zhuǎn)換，殺死大部分腫瘤細(xì)胞，起主導(dǎo)作用；另一方面包載的阿霉素在激光照射后迅速釋放，也降低了細(xì)胞活力。
[0202]實(shí)施例18
[0203]本實(shí)施例用于說(shuō)明Au@Si02-D0X在腫瘤動(dòng)物模型上抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。
[0204]I)動(dòng)物接種
[0205]取6、7周齡，體重為17-19克的雄性Balb C小鼠。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞個(gè)數(shù)(大約IO6個(gè))人類乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)接種于小鼠上肢腋部皮下，每日觀察并記錄腫瘤生長(zhǎng)狀況。接種腫瘤10-14天后，待腫瘤塊生長(zhǎng)至直徑在2毫米~20毫米較為合適。
[0206]2)激光照射
[0207]通過(guò)尾靜脈注射向荷瘤小鼠的腫瘤部位給予實(shí)施例1中制備的Au@Si02-D0X (用藥量相當(dāng)于50毫克/千克體重)，然后用波長(zhǎng)780納米，功率600毫瓦，光斑2毫米的激光掃描性均勻照射腫瘤部位，每處部位照射15分鐘。
[0208]2)激光照射后腫瘤生長(zhǎng)抑制情況
[0209]激光照射后，分別在攝入藥物24小時(shí)、72小時(shí)、120小時(shí)，測(cè)定腫瘤平均直徑分別為8毫米、5毫米和2毫米。而未用藥小鼠對(duì)照組(接種腫瘤，給予生理鹽水注射)的腫瘤平均直徑分別為10暈米、12暈米和15暈米。然后,按本地動(dòng)物處置規(guī)范處死小鼠,取出腫瘤組織，稱重，通過(guò)觀察確認(rèn)腫瘤壞死。將部分腫瘤組織在10%福爾馬林中固定24小時(shí)，用石蠟包埋，切片(5微米厚度)，在倒置顯微鏡下觀察腫瘤組織切片中Au@Si02-D0X的聚集狀況，如圖18。
[0210]通過(guò)圖18可以看出本發(fā)明所述載體Au@Si02-D0X進(jìn)入荷瘤小鼠體內(nèi)后，能夠蓄積在腫瘤組織中；并且在激光照射后，能夠造成載體周邊的腫瘤組織壞死。
[0211]以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實(shí)施方式中的具體細(xì)節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡(jiǎn)單變型，這些簡(jiǎn)單變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0212]另外需要說(shuō)明的是，在上述【具體實(shí)施方式】中所描述的各個(gè)具體技術(shù)特征，在不矛盾的情況下，可以通過(guò)任何合適的方式進(jìn)行組合，為了避免不必要的重復(fù)，本發(fā)明對(duì)各種可能的組合方式不再另行說(shuō)明。
[0213]此外 ，本發(fā)明的各種不同的實(shí)施方式之間也可以進(jìn)行任意組合，只要其不違背本發(fā)明的思想，其同樣應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明所公開(kāi)的內(nèi)容。
【權(quán)利要求】
1.一種藥物載體，其特征在于，該藥物載體包括金納米棒，以及包覆在金納米棒表面的介孔二氧化硅層。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的藥物載體，其中，所述金納米棒的長(zhǎng)度為5-200納米；所述金納米棒的長(zhǎng)徑比為1.5-20。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的藥物載體，其中，所述介孔二氧化硅層的厚度為3-50納米。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的藥物載體，其中，所述介孔二氧化硅層的孔徑為1-20納米，所述藥物載體的比表面積為1-150平方米/克，孔體積為0.05-10立方厘米/克。
5.一種藥物載體的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟:在含有十六烷基三甲基溴化銨的金納米棒水溶液中，在PH值為8.5-11的條件下，加入硅酸酯的醇溶液進(jìn)行反應(yīng)，并進(jìn)行固液分離，得到表面包覆有介孔二氧化硅層的金納米棒。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述金納米棒的水溶液中，以金元素計(jì)的金納米棒濃度為10微摩爾/升1.5毫摩爾/升，所述金納米棒的長(zhǎng)度為5-200納米；所述金納米棒的長(zhǎng)徑比為1.5-20。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其中，分別以金元素和硅元素計(jì)，所述金納米棒的水溶液中的金納米棒與所述硅酸酯的摩爾比為1:1-50 ;以金元素計(jì)的所述金納米棒與十六烷基三甲基溴化銨的摩爾比為1:1_20。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述反應(yīng)的條件還包括:接觸的溫度為4-95°C，接觸的時(shí)間為0.04-10天。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述硅酸酯為硅酸四甲酯、硅酸四乙酯，硅酸四丙酷和娃酸四丁酷中的一種或多種。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述醇為甲醇、乙醇或其他分子量小于200、常溫常壓下為液體的醇類中的一種或多種。
11.一種藥物組合物，所述藥物組合物包括載體和負(fù)載在載體上的藥物，其特征在于，所述載體為權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的藥物載體，或者為通過(guò)權(quán)利要求5-10中任意一項(xiàng)所述方法所制備的藥物載體。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的藥物組合物，其中，所述藥物為阿霉素、紫杉醇、長(zhǎng)春堿、順鉬、喜樹(shù)堿、DNA和小干擾RNA中的一種或多種。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或12所述的藥物組合物，其中，以所述載體的重量為基準(zhǔn)，所述藥物組合物的載藥率為1-40重量％。
14.權(quán)利要求1-4中任意一項(xiàng)所述的藥物載體和/或權(quán)利要求11-13中任意一項(xiàng)所述的藥物組合物在制備用 于診斷和/或治療腫瘤的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K47/04GK103893764SQ201210572112
【公開(kāi)日】2014年7月2日 申請(qǐng)日期:2012年12月25日 優(yōu)先權(quán)日:2012年12月25日
【發(fā)明者】陳春英, 仉振江, 王靜, 王黎明, 吳曉春 申請(qǐng)人:國(guó)家納米科學(xué)中心