與嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶的前體藥物的改進(jìn)的治療用途相關(guān)的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本申請?jiān)斒隽耍环N嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶或編碼任意一個(gè)這些酶的表達(dá)的載體，連同被嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶裂解的前藥，在用于產(chǎn)生復(fù)制型或非復(fù)制型靶細(xì)胞的直接注射抑制方面的用途。靶細(xì)胞通常不表達(dá)引入的嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶。酶和前藥適合于混合，并且以單次量或以分次注射的方式注射或給藥到靶細(xì)胞。通過將靶細(xì)胞暴露于X射線輻射來提高藥物及前藥的效力。不管針對靶細(xì)胞的給藥途徑如何，前藥的給藥與X射線放射療法組合來殺死或是抑制靶細(xì)胞的功能是有效的。
【專利說明】與嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶的前體藥物的改進(jìn)的治療用途相關(guān)的應(yīng)用
[0001]本申請要求享有2011年2月18日提交的美國臨時(shí)申請序列號61/444，261的優(yōu)先權(quán)，該文獻(xiàn)的內(nèi)容在此通過引用的方式并入本文。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明大體上涉及通過原位控制一種前藥的體內(nèi)裂解以產(chǎn)生細(xì)胞毒性來誘發(fā)細(xì)胞死亡，且特別涉及通過與直接在原位注射前藥、放療或者它們的組合配合來實(shí)施裂解來提聞治療效果。
【背景技術(shù)】
[0003]化學(xué)療法是一種治療許多人類腫瘤的主要方法，但對于休眠的(quiescent)或是慢分裂惡性腫瘤(slowly dividing cancers)的體內(nèi)療效較差(Takimoto et al.CancerManagement Handbook(11th Edition), UBM Medica 2009;Sang et al.Trends Mol Med2010; 16(1):17-26 ;Mellor et al.Br J Cancer 2005; 93 (3): 302-9)。放射治療和全身化療(systemically administered chemotherapy)通過破壞DNA復(fù)制來獲得特異性，但這兩種方法不能切除間歇地循環(huán)的休眠的腫瘤組織。無法摧毀不分裂的腫瘤細(xì)胞(包括一個(gè)假定的腫瘤干細(xì)胞池)被公認(rèn)為是對抗常見的人類惡性腫瘤失敗的許多原因中的一個(gè)，這些常見的惡性腫瘤包括了前列腺腫，乳腺，肺和結(jié)腸的低生長比率的腫瘤(Vessella et al.Cancer Biol Ther 2007;6 (9):1496-504;Kusumbe et al.Cancer Res2009;69(24):9245_53)。即使在一種具有不尋常的高有絲分裂指數(shù)(例如:生長比率~40%)的實(shí)體腫瘤的情況中，并假設(shè)通過累積地受到傳統(tǒng)的化或放療來徹底摧毀所有分裂的癌細(xì)胞，腫瘤團(tuán)(the mass)仍然距離達(dá)到預(yù)處理尺寸的不到一個(gè)加倍。
[0004]乳腺、前列腺、喉和腦的非轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤的治療通常是采用術(shù)前放療(XRT)作為在最終手術(shù)切除之前的減瘤(debu`lking)的措施(DeVita et al.Principles andPractice of Oncology (8th Edition).Ronald A.DePinho and Robert A.ffeinbert, Eds.Lippincott Williams & Wilkins, 2008)。其他局部浸潤的非轉(zhuǎn)移性腫瘤適合于延長生命的XRT，且阻礙了內(nèi)臟(例如:胃，喉，結(jié)腸，或是呼吸道)的不能動(dòng)手術(shù)的的惡性腫瘤采用局部放療的方式進(jìn)行常規(guī)治療以減輕癥狀(Washington et al.Principles and Practice ofRadiation Therapy (3rd Edition).Mosby, 2009)。像這些腫瘤，總是呈現(xiàn)出低生長比率，并在某些時(shí)候?qū)Ψ暖熀妥罴芽捎玫幕煼椒ǘ紱]有反應(yīng)。
[0005]為了改善包括諸如上述的那些常見惡性腫瘤在內(nèi)的局部浸潤的非轉(zhuǎn)移性的腫瘤的治療，幾個(gè)更新的技術(shù)形式已經(jīng)得到改進(jìn)。例如低溫的、磁的、熱的和超聲的細(xì)胞消融技術(shù)都已經(jīng)研究取得不同程度的臨床前或者早期臨床的成功(Osada et al.Anticancer Res2009;29 (12):5203-9;Krishnan et al.1nt J Hyperthermia 2010 Sep 21 [Epub aheadof print] ;Margreiter et al.J Endourol 2010; 24(5):745-6)。實(shí)驗(yàn)性基因療法，例如⑶EPT (基因?qū)虻拿盖八幹委?；所謂的“自殺基因”策略)，已經(jīng)過廣泛測試，但是其因至少兩個(gè)原因在對抗局部浸潤的非轉(zhuǎn)移性腫瘤的治療僅獲得有限的成功(GW Both.Curr OpinMol Ther 2009;11(4):421-32;Altaner et al.Cancer Lett 2008;270(2):191-201;Dachset al.Molecules 2009; 14(11):4517-45) 0第一，使用目前可用的基因轉(zhuǎn)移載體的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較低。一小部分的表達(dá)一抗癌轉(zhuǎn)基因的惡性細(xì)胞往往不足以在瘤塊中增加一個(gè)強(qiáng)大的旁觀者效應(yīng)以對抗未轉(zhuǎn)染細(xì)胞。第二，GDEPT主要是利用單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因或原核胞嘧啶脫氨酶(CD)基因以激活瘤內(nèi)化療，并且由這兩種酶(分別是丙氧鳥苷單磷酸鹽(gancyclovir monophosphate)和5_氟尿啼卩定(FUra))所產(chǎn)生的化合物主要是有效地對抗正在分裂的腫瘤細(xì)胞。低轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，較差的旁觀者活性，以及不能殺死不分裂的癌細(xì)胞是導(dǎo)致在臨床中對抗非轉(zhuǎn)移性的實(shí)體腫瘤的第一代GDEPT方法失敗的原因。
[0006]大腸桿菌嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)基因已經(jīng)被證明能在瘤內(nèi)產(chǎn)生諸如2-氟腺票呤(F-Ade)或6_甲基_呤(MeP)的高效化合物(Ungerechts et al.CancerRes.2007;67:10939-10947;Fu et al.Cancer Gene Ther.2008;15:474-484;Fu W，Lanet al.Cancer Sc1.2008;99:1172-1179;Parker et al.Cancer Gene Therapy 2011Jun;18(6):390-8;Gadi et al.J.Pharmacol.Exp.Ther.2003;304:1280-1284)。諸如這些的嘌呤堿可以通過在所有細(xì)胞中普遍存在的易化擴(kuò)散途徑，在被轉(zhuǎn)導(dǎo)的大腸桿菌PNP和相鄰的(旁觀者)細(xì)胞之間自由地?cái)U(kuò)散，并產(chǎn)生了一個(gè)顯著的旁側(cè)殺死效應(yīng)(Hong etal.Cancer Res.2004;64:6610-6615)。這些化合物通過一種干擾RNA與蛋白質(zhì)合成的獨(dú)特機(jī)制起作用，且因此可以在體內(nèi)有效地對抗分裂和不分裂(休眠的)腫瘤細(xì)胞(Parkeret al.Biochem.Pharmacol.1998; 55:1673-1681)。F-Ade 可通過胞內(nèi)大腸桿菌 PNP 從諸如2-F-2’ -脫氧腺苷(F-dAdo)或磷酸氟達(dá)拉濱(F_araAMP)的前藥產(chǎn)生(Hong etal.Cancer Res.2004;64:6610-6615;Parker et al.Biochem.Pharmacol.1998;55:1673-1681;Martiniello-Wilks et al.Human Gene Therapy 1998;9:1617-1626;Mohr etal.Hepatology 2000;31:606-614;Voeks et al.Gene Therapy 2002;9:759-768;Martiniello-Wilks et al.J.Gene Med.2004;6:1343-1357;Parker et al.Cancer Gene Therapy2003;10:23-29;Parker et al.Human Gene Therapy 1997;8:1637-1644;Martiniel1-WiIks et al.J.Gene Med.2004; 6:43-54)。后者藥物，F(xiàn)-araAMP，在臨床中被批準(zhǔn)用于治療慢性淋巴細(xì)胞白血病，但對于非淋巴組織的惡性腫瘤沒有活性。
[0007]F-Ade作為抗癌藥物比FUra大約有效1000倍。盡管有這樣的效力，很多實(shí)驗(yàn)室已表明F-Ade可以被安全地用作⑶EPT的成分。因?yàn)镮)強(qiáng)的瘤內(nèi)螯合作用到細(xì)胞核酸中；2)伴隨著腫瘤細(xì)胞的死亡而緩慢地釋放到全身腔室中，被緊鄰區(qū)域的鄰近(旁觀者)癌細(xì)胞攝??；3)從腫瘤中釋放出任何化療的廣泛稀釋(遍及寄主)，該方法在許多動(dòng)物模型體內(nèi)產(chǎn)生了安全且一致的抗腫瘤功效(Ungerechts et al.CancerRes.2007;67:10939-10947;Fu et al.Cancer Gene Ther.2008;15:474-484;Parkeret al.Cancer Gene Therapy 2011 Jun;18(6):390-8;Gadi et al.J.Pharmacol.Exp.Ther.2003;304:1280-1284;Hong et al.Cancer Res.2004;64:6610-6615;Martiniel1-Wilks et al.Human Gene Therapy 1998;9:1617-1626;Mohr et al.Hepatology2000;31:606-614;Voeks et al.Gene Therapy 2002;9:759-768;Martiniello-WiIks et al.J.Gene Med.2004;6:1343-1357;Parker et al.Cancer Gene Therapy2003;10:23-29;Parker et al.Human Gene Therapy 1997;8:1637-1644;Martiniello-Wilks et al.J.Gene Med.2004;6:43-54;Deharvengt et al.1nt.J.0ncol.2007;30:1397-1406; Kikuchi et al.Cancer Gene Ther.2007; 14:279-86)。大腸桿菌 PNP 與第一代策略(即HSV-tk和⑶)間的幾個(gè)直接的比較，通過一個(gè)基于PNP機(jī)制，表明了⑶EPT的大量增加(Martiniello-Wilks et al.Human Gene Therapy 1998; 9:1617-1626; et al.ClinCancer Res 1997;3:2075-80;Nestler et al.Gene Therapy 1997;4:1270-77;Puhlmannet al.Human Gene Therapy 1999;10:649-657)。此方法近來在美國被食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)臨床試驗(yàn)(IND#14271，批準(zhǔn)于3/19/2010)。[0008]F-Ade代謝物的延長的瘤內(nèi)半衰期，特別是通過大腸桿菌PNP伴隨產(chǎn)生的(大于24小時(shí))(Hong et al.Cancer Res.2004; 64:6610-6615;Parker et al.Biochem.Pharmacol.1998; 55:1673-1681; Parker et al.Cancer Gene Therapy 2003; 10:23-29),連同休眠腫瘤細(xì)胞和腫瘤干細(xì)胞的(通過消融RNA與蛋白質(zhì)的合成)旁觀者殺死(bystander killing),暗示了為了在腫瘤組織內(nèi)集中有效化療，PNP作為一種“定位與消融”模式的可能用途。
[0009]使用化療藥物的癌癥治療依賴于全身性給藥，即相當(dāng)于或優(yōu)于瘤內(nèi)注射?；煹闹苯恿鰞?nèi)注射不被傳統(tǒng)的現(xiàn)有技術(shù)認(rèn)為是較全身路徑在誘發(fā)抗腫瘤效果方面更有效，這是因?yàn)樵隗w內(nèi)瘤內(nèi)吸收差,化療腫瘤細(xì)胞利用率低以及微不足道的腫瘤細(xì)胞殺傷力。此外,瘤內(nèi)給藥是一個(gè)嚴(yán)格的程序，然而通過靜脈內(nèi)或其他全身路徑的全身給藥比較容易實(shí)施。
[0010]因此，目前需要提供一種更有效的對抗體內(nèi)靶細(xì)胞且尤其是腫瘤細(xì)胞的抑制療法。進(jìn)一步的，還需要改善一種對抗靶細(xì)胞的旁觀者抑制效果并且長時(shí)間保持這種效果。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本申請?jiān)斒隽?，一種嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶或編碼任意一個(gè)這些酶的表達(dá)的載體，連同被嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶裂解的前藥，在用于產(chǎn)生復(fù)制型或非復(fù)制型靶細(xì)胞的直接注射抑制方面的用途。靶細(xì)胞通常不表達(dá)引入的嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶。該酶和前藥適合于混合，并且以單次量或以分次注射的方式注射或給藥到靶細(xì)胞。該酶的胞內(nèi)表達(dá)改善了療效。本發(fā)明的藥物的使用，因旁觀者效應(yīng)，在腫瘤的治療中特別有效，在該旁觀者效應(yīng)中，鄰近轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞和含有該酶的細(xì)胞間液體與經(jīng)前藥裂解而被釋放的藥物接觸來抑制細(xì)胞功能或殺死細(xì)胞。藥物和前藥的療效通過將靶細(xì)胞暴露在X射線輻射下得到提高。
[0012]本發(fā)明也提供了一種抑制復(fù)制型或非復(fù)制型靶細(xì)胞的方法，其包括了將一種嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶遞送到靶細(xì)胞。被嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶裂解的前藥被直接注射到靶細(xì)胞的鄰近以釋放一種對靶細(xì)胞有細(xì)胞毒性的嘌呤堿基來殺死或者抑制靶細(xì)胞功能。該方法特別適合于給藥到腫瘤內(nèi)。全身性的前藥的給藥，不論是否直接給藥到靶細(xì)胞鄰近，其與X射線放射療法的組合對于殺死或是抑制靶細(xì)胞功能是有效的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1是腫瘤重量隨時(shí)間變化的函數(shù)關(guān)系圖，表明了全身性的腹膜內(nèi)(IP)磷酸氟達(dá)拉濱(F-araAMP)的不同時(shí)間對5%的細(xì)胞表達(dá)大腸桿菌PNP的D54腫瘤的影響；
[0014]圖2A是腫瘤重量隨時(shí)間變化的函數(shù)關(guān)系圖，表明了通過瘤內(nèi)注射至10%的細(xì)胞表達(dá)大腸桿菌PNP的腫瘤內(nèi)的F-araAMP的效果和產(chǎn)生的抗腫瘤活性；[0015]圖2B是腫瘤重量隨時(shí)間變化的函數(shù)關(guān)系圖，表明了在沒有細(xì)胞表達(dá)大腸桿菌PNP的活性的D54腫瘤中瘤內(nèi)注射高濃度的F-araAMP的影響；
[0016]圖2C是腫瘤重量隨時(shí)間變化的函數(shù)關(guān)系圖，表明了 F-araAMP注射至10%的細(xì)胞表達(dá)大腸桿菌PNP活性的腫瘤內(nèi)對D54腫瘤生長的影響；
[0017]圖2D是腫瘤重量隨時(shí)間變化的函數(shù)關(guān)系圖，F(xiàn)-araAMP注射至沒有細(xì)胞表達(dá)大腸桿菌PNP的活性的腫瘤內(nèi)對D54腫瘤生長的影響；
[0018]圖3是腫瘤重量隨時(shí)間變化的函數(shù)關(guān)系圖，表明了 F-araAMP的直接瘤內(nèi)注射到不表達(dá)大腸桿菌PNP的腫瘤內(nèi)(每日一次或是每日兩次)對于腫瘤生長沒有影響；
[0019]圖4是腫瘤重量隨時(shí)間變化的函數(shù)關(guān)系圖，表明了當(dāng)F-araAMP的直接瘤內(nèi)注射進(jìn)入具有10%表達(dá)大腸桿菌PNP腫瘤細(xì)胞的腫瘤時(shí)，會(huì)產(chǎn)生非常好的抗腫瘤活性，采取六次注射比三次注射活性更好；
[0020]圖5A是腫瘤重量隨時(shí)間變化的函數(shù)關(guān)系圖，表明了腺病毒載體(Ad) PNP外加F-araAMP,采用24mg瘤內(nèi)前藥的高F-araAMP劑量條件,對于D54腫瘤的影響；
[0021]圖5B是腫瘤重量隨時(shí)間變化的函數(shù)關(guān)系圖，表明了腺病毒載體(Ad) PNP外加F-araAMP，采用較低的F-araAMP劑量條件(18mg)，對于D54腫瘤的影響；
[0022]圖5C是腫瘤重量隨時(shí)間變化的函數(shù)關(guān)系圖，表明了在不同的直接瘤內(nèi)給藥順序和改變原來的PNP順序的條件下的效果；
[0023]圖6A是腫瘤重量隨時(shí)間變化的函數(shù)關(guān)系圖，表明了通過直接瘤內(nèi)注射至沒有細(xì)胞表達(dá)大腸桿菌PNP活性的腫瘤的F-dAdo對D54腫瘤生長的影響；
[0024]圖6B是腫瘤重量隨時(shí)間`變化的函數(shù)關(guān)系圖，表明了通過直接瘤內(nèi)注射至10%的細(xì)胞表達(dá)大腸桿菌PNP活性的腫瘤的F-dAdo對D54腫瘤生長的影響；
[0025]圖7A是腫瘤重量隨時(shí)間變化的函數(shù)關(guān)系圖，表明了瘤內(nèi)的F-araAMP和Ad/PNP對于DU145腫瘤的影響；
[0026]圖7B是腫瘤重量隨時(shí)間變化的函數(shù)關(guān)系圖，表明了瘤內(nèi)的F-araAMP以及Ad/PNP對NC1-H322M非小細(xì)胞肺腺癌腫瘤的影響。
[0027]圖8A是腫瘤重量隨時(shí)間變化的函數(shù)關(guān)系圖，表明了 F-araAMP的瘤內(nèi)注射加輻射對于10%的細(xì)胞表達(dá)大腸桿菌PNP的D54腫瘤的影響；
[0028]圖8B是腫瘤重量隨時(shí)間變化的函數(shù)關(guān)系圖，表明了 F-araAMP的腹膜內(nèi)(IP)注射加輻射對于處于不同的輻射條件下的10%D54/PNP腫瘤的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0029]本發(fā)明對抑制一種靶細(xì)胞團(tuán)有效用，以及在一個(gè)特定的實(shí)施例，對抑制活體內(nèi)腫瘤的生長有效用。人們驚奇地發(fā)現(xiàn)，對于一般情況下的前藥直接近端給藥至靶細(xì)胞且特別是經(jīng)過酶裂解的直接瘤內(nèi)注射，會(huì)在諸如腫瘤的靶細(xì)胞團(tuán)中產(chǎn)生一種細(xì)胞毒性堿，細(xì)胞團(tuán)載有或表達(dá)這種酶比包括口服，腸道外給藥(例如靜脈給藥)，肌內(nèi)給藥，腹腔內(nèi)給藥，或經(jīng)皮給藥在內(nèi)的傳統(tǒng)的全身性給藥途徑更為有效。當(dāng)這種酶在靶細(xì)胞內(nèi)被激活時(shí)，明顯更加有效果。
[0030]前藥的直接瘤內(nèi)注射照慣例被視作與全身性的前要給藥相比是沒必要的和低效率的，其原因部分是由于自然腫瘤良好的血管化特性以及上文已述的其他觀點(diǎn)。前藥的給藥，不管給藥途徑如何，當(dāng)其與腫瘤輻射照射相結(jié)合，給藥至表達(dá)或鄰近該酶的細(xì)胞更有效。人們認(rèn)為這是出人意料的，因?yàn)镻NP或NH不是已知的放射致敏劑，每個(gè)酶單獨(dú)作用，或在前藥底物的存在條件下。
[0031]本發(fā)明基于將一種前藥例如磷酸氟達(dá)拉濱注射到表達(dá)非寄主嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)或核苷水解酶(NH)的靶細(xì)胞附近，從而產(chǎn)生高水平的旁觀者抑制及殺滅作用；本發(fā)明還基于在小鼠模型活體內(nèi)大量的人類腫瘤異種移植瘤的摧毀。不論前藥的給藥速率如何，非寄主PNP或NH以及酶的前藥底物增強(qiáng)了放療效果，并通過一個(gè)獨(dú)特的機(jī)制產(chǎn)生作用。特別是，一種前藥中的2-氟腺嘌呤或其他有毒嘌呤在瘤內(nèi)產(chǎn)生改善了其效果，其特點(diǎn)是緩慢地釋放到全身倉中，并且在宿主中稀釋。使用一種表達(dá)大腸桿菌PNP的腺病毒載體對大的皮下腫瘤注射，隨后是磷酸氟達(dá)拉濱或是其他前藥，其結(jié)果是腫瘤消退及長時(shí)間抑制了腫瘤的生長。本發(fā)明提供了一種方法，其中對現(xiàn)有藥物有耐藥性的腫瘤實(shí)施重復(fù)處理(以每日為重復(fù)基準(zhǔn))的安全性滲透，賦予了 I)癌組織內(nèi)強(qiáng)效化療的捕集；2)惡性薄壁組織的滴定方式的破壞。
[0032]通過直接注射緩蝕配方形式的前藥至靶細(xì)胞，促進(jìn)延長的靶細(xì)胞抑制。前藥的延長釋放促進(jìn)低生長分?jǐn)?shù)的腫瘤的抑制。
[0033]本發(fā)明中的有效的酶是一種非人類嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)或核苷水解酶(NH)，所述非人類嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)，例如來源于大腸桿菌、陰道毛滴蟲，或任何其他可以轉(zhuǎn)變前藥底物以產(chǎn)生一種細(xì)胞毒性的嘌呤堿基的非人類PNP?？梢岳斫獾模景l(fā)明中，非寄主核苷水解酶連同一種合適的前藥也可以用于作為實(shí)施本發(fā)明的基礎(chǔ)。前藥，經(jīng)水解酶裂解，被選中以產(chǎn)生一種相對較高細(xì)胞毒性的化合物。更進(jìn)一步可以理解的，突變的PNP和諸如那些在US 7，488，598中詳述的水解酶在本發(fā)明中可以用于從前藥來產(chǎn)生細(xì)胞毒性的嘌呤堿基，并且適合于抑制諸如繁殖的細(xì)胞功能，并且甚至殺死受試人的那些已被轉(zhuǎn)染的或僅僅與酶附近的細(xì)胞?？梢岳斫獾模景l(fā)明所用的一種酶能提供足夠效力的細(xì)胞毒性嘌呤堿基以產(chǎn)生一種旁觀者效應(yīng)，從而抑制轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞，以及旁觀者細(xì)胞。
[0034]本發(fā)明中所使用的“鄰 近(proximity)”是指直接引入到諸如腫瘤塊的一確定的組織塊中，并且鄰近于一靶細(xì)胞，距離大約是50個(gè)相鄰細(xì)胞直徑的間隔或是等同的線性間隔，較佳地，距離大約是20個(gè)相鄰細(xì)胞直徑的間隔或是等同的線性間隔。
[0035]本發(fā)明中可以使用的前藥具有對于受試者細(xì)胞相對無毒的屬性，然而經(jīng)該前藥的酶裂解產(chǎn)生一種細(xì)胞毒性嘌呤堿基。代表性前藥已為本領(lǐng)域所知(Ungerechts etal.Cancer Res.2007;67:10939-10947;Fu et al.Cancer Gene Ther.2008;15:474-484;Fuet al.Cancer Sc1.2008;99:1172-1179;Parker et al.Cancer Gene Therapy Inpress;Gadi et al.J.Pharmacol.Exp.Ther.2003;304:1280-1284;Hong et al.CancerRes.2004;64:6610-6615;et al.Biochem.Pharmacol.1998;55:1673-1681;MartinieIlo-Wilks et al.Human Gene Therapy 1998;9:1617-1626;Mohr et al.Hepatology2000;31:606-614;Voeks et al.Gene Therapy 2002;9:759-768;Martiniello-WiIks et al.J.Gene Med.2004;6:1343-1357;Parker et al.Cancer Gene Therapy2003;10:23-29;Parker et al.Human Gene Therapy 1997;8:1637-1644;Martiniello-Wilks et al.J.Gene Med.2004; 6:43-54) 0 雖然以下的數(shù)據(jù)詳述了 F-dAdo 和 F-araAMP 在本發(fā)明的中的使用，應(yīng)當(dāng)理解的是，這些結(jié)果也可以擴(kuò)展到其他前藥。[0036]選擇D54人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤模型來研究大腸桿菌PNP/F-araAMP的安全性及有效性有以下幾個(gè)原因:首先，傳統(tǒng)的化療藥物難以治療小鼠體內(nèi)的D54腫瘤，所述傳統(tǒng)的化療藥物包括諸如BCNU的經(jīng)臨床批準(zhǔn)用于人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療的化合物；其次，D54模型在小鼠中生長相對較慢(體積加倍的時(shí)間為10到15天)，并提供一種測試一方法是否能同時(shí)殺死分裂腫瘤細(xì)胞和非分裂腫瘤細(xì)胞的手段。由于下面所述的F-araAMP的給藥進(jìn)度是以超過三天為一段時(shí)間，完全的消退或是治愈建立了對一種瘤塊的非增殖性隔室的破壞。第三，人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤已成為GDEPT臨床測試的一種靶。人類D54腫瘤對常規(guī)的化療，放療及基因療法為基礎(chǔ)的介入治療具有高度抵抗作用。應(yīng)當(dāng)注意的是，盡管本分析選擇了一種神經(jīng)膠質(zhì)瘤模型，由例如F-Ade或其他前藥的嘌呤堿殺死細(xì)胞(干擾RNA與蛋白質(zhì)合成)的既定機(jī)制仍對多種多樣的惡性腫瘤細(xì)胞類型有效(Parker et al.Biochem.Pharmacol.1998;55:1673-1681)。下面的實(shí)驗(yàn)描述了靜態(tài)腫瘤細(xì)胞的消融，接著發(fā)生慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)或是腺病毒基因傳遞。應(yīng)理解的是，其他的腫瘤包括DU145，以及解碼酶的許多其他基因轉(zhuǎn)移載體和前藥基質(zhì)在此都是合適的。
[0037]為了探索本發(fā)明療法的廣泛性和有效性，也要對NC1-H322M非小細(xì)胞肺腺癌的細(xì)胞株進(jìn)行研究。常規(guī)的化療和放療操作規(guī)范提供給這種癌癥的患者小于15%的五年存活率。NC1-H322M共享了 D54人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤的許多屬性，因?yàn)槌Ｒ?guī)的療法對該腫瘤難以治療。本發(fā)明能夠同時(shí)殺滅分裂與非分裂NC1-H322M細(xì)胞，這表明了要求保護(hù)的發(fā)明具有殺滅或以其他方式抑制各種類型靶細(xì)胞功能的普遍性。
[0038]本發(fā)明詳細(xì)介紹了一種方法，用以產(chǎn)生一種非常有效的細(xì)胞毒性劑，特別是在一個(gè)一般的靶細(xì)胞體積內(nèi)，特別是在腫瘤薄壁組織中。瀕臨死亡的腫瘤細(xì)胞釋放出F-Ade并帶來連貫的體內(nèi)旁觀者殺滅，基于在瘤塊內(nèi)產(chǎn)生F-Ade之后其擴(kuò)散半徑有限，以及其廣泛稀釋(稀釋到F-Ade在血清中級別不能測量出為止)半徑有限，本發(fā)明所采取的策略已被證明是安全的。本發(fā)明的抗腫瘤活性機(jī)制也從根本上不同于所有其他方法到GDEPT。F-Ade的抗腫瘤活性歸因于干擾RNA與蛋白質(zhì)合成，這導(dǎo)致了分裂與非分裂腫瘤細(xì)胞的消融(Parker et al.Biochem.Pharm`acol.1998; 55:1673-1681.) ? 三天的瘤內(nèi)治療(特別詳見圖2C,以及圖5A，5B，及7B)使生長相對較慢的D54，NC1-H322M或DU145腫瘤的質(zhì)量有所減少，該發(fā)現(xiàn)反映了其在體內(nèi)抗循環(huán)與非循環(huán)腫瘤細(xì)胞活性。
[0039]本發(fā)明的F-araAMP瘤內(nèi)注射使對前藥的全身性接觸減至最低程度，并在靶細(xì)胞瘤塊內(nèi)，例如一種腫瘤組織本身，實(shí)現(xiàn)藥物濃度最大化。F-araAMP或其他前藥的瘤內(nèi)注射后，應(yīng)注意明顯的抗腫瘤活性在PNP或NH表達(dá)中的設(shè)定。此處應(yīng)注意，在本發(fā)明中Ad/PNP與瘤內(nèi)F-araAMP注射的組合使用比先Ad/PNP后全身性F-araAMP的使用有更顯著的效用。應(yīng)當(dāng)注意的是，當(dāng)前藥注射以快速灌注的方式與PNP或NH—同給藥或以暫時(shí)地取代涉及薄壁組織中的非人類PNP或NH酶的存在的注射方式，前藥注射是有效的。
[0040]這些結(jié)果暗示了一種直接的，為在人類受試者中應(yīng)用一種可比較策略的方法，并且無需修改載體的靶向性(tropism)、增強(qiáng)旁觀者殺滅、或重新定靶。腺病毒載體和F-araAMP都在先前的臨床試驗(yàn)中進(jìn)行了深入全面的研究。此外，局部療法中為治療小鼠中300mg腫瘤所給定的F-araAMP劑量(3到24mg，分三次給藥)遠(yuǎn)低于作為人類標(biāo)準(zhǔn)臨床護(hù)理一部分的F-araAMP每日給藥量(每四周給藥一次,每次給藥為一天40mg每劑x5)。本發(fā)明提供了一種治療方法，Ad/PNP接著是F-araAMP以頻繁給藥為基礎(chǔ)(例如每天)通過重復(fù)給藥到達(dá)針頭可接近的腫瘤(前列腺，乳腺，頭頸部腫瘤，或是在放射學(xué)指導(dǎo)下的其他瘤塊)中，依次摧毀一種腫瘤中的大片區(qū)域，同時(shí)在最小程度上減少全身性接觸F-araAMP，F(xiàn)-Ade或是其他的PNP裂解前藥。由于F-Ade具有強(qiáng)效的抗腫瘤活性及較高的旁觀者活性，以及抵抗非擴(kuò)散狀態(tài)腫瘤細(xì)胞的活性，一種“定位與消融”方法是可行的，尤其是對于PNP GDEPT方法。F-Ade的瘤內(nèi)生長應(yīng)提供一種途徑，在瘤內(nèi)濃縮藥劑，并使宿主內(nèi)的全身性接觸最小化。
[0041]放療主要是以主動(dòng)分裂的腫瘤細(xì)胞為目標(biāo)，但是不能消融休眠的腫瘤組織，特別是在壞死區(qū)域(Puhlmann et al.Human Gene Therapy 1999;10:649-657)。本發(fā)明提供了一種結(jié)合了 PNP或NH前藥的放射療法的改進(jìn)，在此提供了通過一個(gè)不同于XRT的機(jī)制起作用的非常有效的抗癌藥物，用于治療實(shí)體惡性腫瘤的非循環(huán)隔室。在這一方面，F(xiàn)-Ade是優(yōu)選的化合物，能夠同時(shí)強(qiáng)效殺死分裂及非分裂腫瘤細(xì)胞。在手術(shù)切除之前進(jìn)行放療的常見腫瘤(神經(jīng)膠質(zhì)瘤，乳腺癌，前列腺癌，頭頸部癌，肺癌以及其他以根治或姑息治療為意圖的癌癥)也受益于本發(fā)明的結(jié)合治療方法。
[0042]在上述的發(fā)明方法中，需要?dú)⑺赖牟溉閯?dòng)物細(xì)胞可以是腫瘤細(xì)胞。包括任何實(shí)體腫瘤的細(xì)胞，無論惡性與否，都可以由本發(fā)明中的方法殺死，基于能夠選擇性轉(zhuǎn)移或表達(dá)PNP或NH基因到至少小部分比例的組成腫瘤的細(xì)胞中的能力。例如，攜帶DNA的脂質(zhì)體的靜脈內(nèi)注射已被證明可以介導(dǎo)某些細(xì)胞類型的基因靶向表達(dá)。將一種PNP或NH或基因表達(dá)革G向至瘤塊中一小部分的細(xì)胞接著進(jìn)行基質(zhì)給藥足以介導(dǎo)衰退。(Zhu et al.Science261:209-211, 1993)通過在實(shí)例中體現(xiàn)旁觀者效應(yīng)以及非分裂細(xì)胞的殺滅，本發(fā)明方法可以摧毀腫瘤。盡管在所例舉的方法中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞為人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤，非小細(xì)胞肺腺癌，或是前列腺細(xì)胞，應(yīng)當(dāng)理解的是本發(fā)明所教示的方法可以被應(yīng)用于其他細(xì)胞，它們對本發(fā)明方法的敏感性也可以按所教示的確定。
[0043]除了殺滅腫瘤細(xì)胞，本發(fā)明的方法也可以殺滅病毒感染的細(xì)胞。在一個(gè)殺滅病毒的實(shí)施例中，選中的基因轉(zhuǎn)移方法將根據(jù)其靶向病毒感染細(xì)胞內(nèi)PNP的表達(dá)的能力選定。舉個(gè)例子，病毒感染細(xì)胞可以利用特殊的病毒基因序列來調(diào)節(jié)并準(zhǔn)許基因表達(dá)(即病毒特異性啟動(dòng)子)。這種序列不存在于未受感染的細(xì)胞。如果大腸桿菌或其他PNP基因?qū)τ谶@樣一種病毒啟動(dòng)子的取向合適，那么PNP只會(huì)在病毒感染的細(xì)胞中被激活，而不是其他未被感染的細(xì)胞。在這種情況下，當(dāng)病毒感染細(xì)胞被傳送到靶細(xì)胞附近時(shí)，將更容易受到F-araAMP, MeP-dR或其他被設(shè)計(jì)成被PNP或NH轉(zhuǎn)換成毒性形式的底物的給藥的影響，。
[0044]在本發(fā)明的其他應(yīng)用中，提供了一種藥物，用于殺滅或抑制受試者的任何要求的靶細(xì)胞體積的功能。本發(fā)明對于殺滅或抑制細(xì)胞功能的廣泛適應(yīng)性能提供臨床醫(yī)師優(yōu)良的給藥控制，以及優(yōu)于各種傳統(tǒng)程序的強(qiáng)化治療的分析方法。本發(fā)明提供了一種化學(xué)細(xì)胞消融術(shù)，作為燒灼術(shù)，切除術(shù)程序的替代物。值得驚奇地注意到的是，本發(fā)明所提供的化學(xué)細(xì)胞消融術(shù)排除了伴隨燒灼術(shù)，射頻消融術(shù)或是切除技術(shù)產(chǎn)生的造粒及劃痕，從而在化學(xué)消融部位的周圍提供了一種優(yōu)越的愈合組織。因此，本發(fā)明在治療心律不齊，減小囊腫，神經(jīng)節(jié)治療，男性絕育，美容皮膚學(xué)程序以及黑色素瘤的治療有所應(yīng)用。應(yīng)當(dāng)理解的是，通過PNP或NH酶的給藥及表達(dá)在此所詳述的一種病毒載體的任何形式基因的給藥，并對PNP或NH實(shí)施一種前藥的近端給藥，很容易執(zhí)行根據(jù)本發(fā)明的化學(xué)細(xì)胞消融術(shù)?；趯Π屑?xì)胞實(shí)施化學(xué)細(xì)胞消融術(shù)的位置，本發(fā)明的藥物通過一根導(dǎo)管，微量注射器，套管，或是注射器，并且在膏底物中進(jìn)行給藥。較佳地，PNP或NH酶是胞內(nèi)表達(dá)。
[0045]本發(fā)明中提供了一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的編碼非人類的或轉(zhuǎn)基因的人類嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶的分離的在核酸。更具體地說，本發(fā)明提供了一種分離的在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中編碼大腸桿菌PNP的核酸。所謂的“分離”是指與發(fā)現(xiàn)于獲得了 PNP基因的天然存在的生物的其他核酸分開。
[0046]如上所述，在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本方法所使用的PNP或NH可以包括轉(zhuǎn)基因人類或非人類哺乳動(dòng)物PNP或NH，其能夠與一種待殺死的細(xì)胞中的天然PNP或NH無法識(shí)別或難以識(shí)別的底物發(fā)生反應(yīng)。因此，本發(fā)明中的編碼本發(fā)明的PNP或NH的核酸存在于其沒被天然發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞中，這要么因?yàn)樗鼈儊碜杂谝环N不同的生物，要么就是因?yàn)樗鼈兪菑淖匀粻顟B(tài)轉(zhuǎn)變而來的。對于編碼PNP或NH核酸最關(guān)鍵的要求是，它們必須編碼一種能夠識(shí)別且作用于對不能被細(xì)胞的天然PNP或NH識(shí)別的底物的功能性酶。
[0047]本發(fā)明也提供了一種包含編碼非人類的或轉(zhuǎn)基因的人類嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶的核酸的真核生物的轉(zhuǎn)移載體。載體必須能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)或轉(zhuǎn)染至少一定比例的靶細(xì)胞。轉(zhuǎn)移載體可以是任何用于傳送基因至細(xì)胞中(例如一種質(zhì)粒)核苷酸結(jié)構(gòu)，，或是作為一種傳送基因的總體策略的部分，例如作為重組逆轉(zhuǎn)錄病毒或是腺病毒的部分(Ram etal.Cancer Res.53:83-88, 1993)。實(shí)施例提供了一種含有編碼PNP核算的慢病毒載體或是腺病毒載體。
[0048]本發(fā)明的載體可以存在于一種能夠表達(dá)一種功能性PNP或NH的寄主中。本發(fā)明所述方法中所使用的寄主細(xì)胞是要被殺滅的細(xì)胞，它表達(dá)PNP或NH并且被酶與作為一酶底物的前藥反應(yīng)所產(chǎn)生的有毒產(chǎn)物殺滅。在實(shí)施例中提供了一種確定易感性的方法，給出了轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞的操作規(guī)范，并且展示了 PNP表達(dá)以及在底物存在下的對宿主細(xì)胞的毒性。另外，活性酶或及其酶原可以給藥至靶細(xì)胞腫塊中。
[0049]除了本發(fā)明中的基因轉(zhuǎn)移方法，PNP基因產(chǎn)物也可以通過許多不同的機(jī)制選擇性地給藥到腫瘤細(xì)胞中，這種PNP可以用來在腫瘤部位產(chǎn)生F-Ade。
[0050]例如，可以將PNP或NH酶附著在任何所需的單克隆抗體上，并且將其注射到患者體內(nèi)，無論是通過全身性注射還是在靶細(xì)胞附近注射。當(dāng)患者有足夠時(shí)間清除所有與未束縛于靶細(xì)胞的單克隆抗體結(jié)合的PNP或NH之后，可以通過直接注射前藥治療患者，例如只在目標(biāo)位置分裂成F-Ade的前藥F-araAMP。這種過程只需要保證一種合適的單克隆抗體可用。下面的參考文獻(xiàn)是這種技術(shù)應(yīng)用于對腫瘤組織靶向特定蛋白質(zhì)的實(shí)施例(Senter et al.Bioconjugate Chem.2:447-451，1991; Bagshawe et al.Br.J.Cancer 60:275-281, 1989;Bagshawe et al.Br.J.Cancer 58:700-703, 1988;Senter etal.Bioconjugate Chem.4:3—9，1993;BattelIi et al.Cancer Tmmunol.Tmmunother.35:421-425, 1992;Pietersz and McKenzie Immunolog.Reviews 129:57-80，1992;and Roffleret al.Biochem.Pharmacol 42:2062-2065,1991)。除了單克隆抗體之外，其他配體可以根據(jù)它們對靶細(xì)胞的特異性進(jìn)行選擇，并且根據(jù)本發(fā)明中所傳授的方法進(jìn)行測試。
[0051]另外，也可以將蛋白質(zhì)包埋在脂質(zhì)體中并將它們靶向特定的組織。從而可以利用靶向脂質(zhì)體將PNP或NH基因產(chǎn)物選擇性地傳送到一種瘤塊中。將所有非靶向脂質(zhì)體從血液中清除后，可以使用只在目標(biāo)位置分裂成F-Ade的前藥F-araAMP治療患者。再一次地，這種過程只需要保證一種合適的靶向載體可用。下面的參考文獻(xiàn)是這種技術(shù)應(yīng)用于對腫瘤組織革巴向特定蛋白質(zhì)的實(shí)施例(Hughes et al.Cancer Research 49:6214-62210，1989; andLitzinger and Huang Biochimica et Biophysica Acta 1104:179-187,1992)。
[0052]代表了非寄主PNP或NH的酶底物的前藥，例如通過一種藥學(xué)上可以接受的載體例如生理鹽水或DMSO直接瘤內(nèi)注射至靶細(xì)胞腫塊，或者裝入膠囊用以改變前藥的穩(wěn)定性及/或治療特性。本發(fā)明的前藥易于以一種凝膠，糊劑或是將微粒裝在膠囊中給藥。可以理解的是，這樣的前藥載體，與在生理鹽水中溶解相比，易于被用在提供前藥的緩釋，靶細(xì)胞腫塊內(nèi)的改進(jìn)的擴(kuò)散，和貯存穩(wěn)定性。借助于微粒，一種本發(fā)明的前藥的釋放速率易于被延長至超過一周，超過兩周，甚至在六周以上(Zentner et al., J.controlrelease 72 (1-3): 203-215，2001)。本發(fā)明的前藥易于制備，并且在一種聚乳酸，聚(ε -己內(nèi)酯)或是它們的混合物的糊劑中進(jìn)行注射(Jackson et al., Cancer research60(15):4146-4151, 2000)。前藥也適合于封裝在各種材料的微球中，這些材料包括了聚乳酸，聚(ε -己內(nèi)酯)，聚乙烯基吡咯烷酮，羥丙基纖維素，甲基纖維素，以及其他多糖(Harper et al, Clin.Cane.Res.5:4242-4248, 1999;Dordunno et al., Cancer Chemother.Pharmacol.36:279-282, 1995; Bert et al., Cancer Lett.88:73-78，1995;)?？梢岳斫獾氖?，通過前藥的控釋配方，注射較大劑量的前藥至靶細(xì)胞腫塊可以減少注射頻率以實(shí)現(xiàn)一種延長的抑制細(xì)胞效果以及旁觀者效應(yīng)。
[0053]可以對帶有不良生長或功能的靶細(xì)胞的受試者履行將酶和前藥注射至諸如腫瘤的靶細(xì)胞塊內(nèi)來補(bǔ)償其金錢付出，同時(shí)，受試者補(bǔ)償本發(fā)明注射的提供者在抑制細(xì)胞功能甚至殺死靶細(xì)胞方面所作出的努力。
[0054]本發(fā)明就以下的非限制性實(shí)施例進(jìn)行進(jìn)一步的詳述。這些實(shí)施例并非旨在限制所附權(quán)利要求書的范圍。
[0055]實(shí)施例1:人類移植瘤在小鼠體內(nèi)的研究。親代和表達(dá)大腸桿菌PNP的D54MG (人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤)腫瘤細(xì)胞(2xl07個(gè)細(xì)胞),通過皮下注射至購自Charles River實(shí)驗(yàn)室(威爾明頓，馬薩諸塞州)的裸鼠(nu/nu)脅腹中。穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)了大腸桿菌PNP的D54腫瘤細(xì)胞采用前述(Parker et al.Cancer Gene Therapy 2011 Jun; 18 (6): 390-8)的方法進(jìn)行制備。使用測徑規(guī)測量腫瘤，其重量的估計(jì)通過下式計(jì)算:(長度X寬度2) /2=mm3并經(jīng)假設(shè)的單位密度轉(zhuǎn)換成mg。除非另有說明，治療性藥物以及表達(dá)大腸桿菌PNP (Ad/PNP)的腺病毒載體通過8次單獨(dú)注射，每次大約20 μ 1，將150 μ I的體積注射至D54腫瘤中，努力做到平均地分配給藥藥劑。每組的每個(gè)治療組包含至少六只小鼠。每天測定小鼠體重的減輕，每周兩次測定腫瘤尺寸。T-C (腫瘤生長延遲)被認(rèn)為是藥物治療組與生理鹽水治療組之間的差異,在幾天至腫瘤體積2個(gè)加倍的時(shí)間內(nèi)。每個(gè)動(dòng)物(腫瘤體積2個(gè)加倍)評測點(diǎn)的時(shí)間在學(xué)生的t檢定,Mann-Whitney (曼-懷氏)秩和法檢驗(yàn),或是一種壽命表中被用作終點(diǎn)，以從統(tǒng)計(jì)學(xué)上比較治療組之間的生長數(shù)據(jù)。所有的過程都根據(jù)由南方研究所的IACUC批準(zhǔn)的操作標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。F-araAMP從Schering A.-G.(Berlin, Germany)得到。在這個(gè)及隨后的實(shí)施例中，F(xiàn)-Ade 是從General Intermediates of Canada, Inc.(Edmonton, Alberta, Canada)得到。當(dāng)腫瘤在250到300mg (~動(dòng)物總重量的I到1.5%)時(shí)啟動(dòng)治療。
[0056]實(shí)施例2:大腸桿菌PNP活性的測暈。通過測量在藥物治療第一天從小鼠中取出的代表性癌癥中大腸桿菌PNP活性，可以驗(yàn)證瘤塊中的慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞所占比例。從小鼠脅腹中切除腫瘤后，粗提取物如前面所述方法制備(Parker et al.Human Gene Therapy1997;8:1637-1644)。提取物在50mM的P04，100 μ M的6-甲基嘌呤-2 '-脫氧核苷(MEP-dR)，以及IOOmM的HEPES緩沖劑(pH為7.4)中培養(yǎng)，保持提取物在一定濃度使其在培育期可以發(fā)生一種線性反應(yīng)。利用反相HPLC監(jiān)測MeP的形成。按照慣例，單位PNP活性被定義為在一個(gè)小時(shí)時(shí)間內(nèi)裂解lnmole/mg蛋白質(zhì)的MeP-dR所需要的提取物的量。
[0057]實(shí)施例3:監(jiān)測F-araAPM的瘤內(nèi)代謝?？偟姆派湫匀Q于向300mg的D54脅腹腫瘤注射 3mg[8_3H]F-araAMP (10 μ Ci)0 [8_3H]F-araAMP 從 Moravek Biochemicals Inc.(Brea, CA)得到。在注射后的10分鐘或4小時(shí)的時(shí)候，將腫瘤從小鼠體內(nèi)移除，并在55°C下培養(yǎng)四小時(shí)的條件下將其溶解在Iml Soluene 350 (Packard Instrument, Meriden, CT)中。將每種提取物的一部分與閃爍液混合，并確定了放射性。
[0058]實(shí)施例4:磷酸氟汰柃鑌(F-araAMP)的不同時(shí)間對5%的細(xì)朐表汰大腸桿菌PNP的D54腫瘤的影響。將親本D54腫瘤細(xì)胞與通過慢病毒穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)大腸桿菌PNP的D54腫瘤細(xì)胞混合，以使得5%的混合物表達(dá)PNP轉(zhuǎn)基因。這種95/5比例的混合物通過皮下注射進(jìn)入裸鼠的脅腹。使用F-araAMP的腹膜內(nèi)的治療從第17天開始(250mg/kg,連續(xù)三天,每天一次；167mg/kg,連續(xù)三天,每天三次；100mg/kg,連續(xù)三天,每天五次；或者是載體控制,一天5次X 3天)，當(dāng)腫瘤大約是250mg時(shí)。在治療的時(shí)候(第17天)，腫瘤中大腸桿菌PNP的活性為2500±400個(gè)單位。所有F-araAMP治療組中的腫瘤生長與載體治療組P〈0.001中的腫瘤生長有著顯著的不同。(圖1)
[0059]圖1描繪了大腸桿菌PNP加上磷酸氟達(dá)拉濱(F-araAMP)的抗腫瘤活性，當(dāng)5%的腫瘤細(xì)胞(轉(zhuǎn)導(dǎo)了植入前基因的)表達(dá)重組酶時(shí)，。F-araAMP的腹膜內(nèi)(全身性)給藥(15次100mg/kg的給藥；9次167mg/kg的給藥,或3次250mg/kg的給藥)導(dǎo)致所有腫瘤的完全消退和所有小鼠痊愈。以往的事實(shí)表明，親本D54腫瘤(即無大腸桿菌PNP)對于使用F-araAMP的療法不敏感，而且使用F-araAMP的腫瘤消退在設(shè)定中表現(xiàn)出劑量對于表達(dá)大腸桿菌 PNP 的腫瘤細(xì)胞分?jǐn)?shù)的依賴(Hong et al.Cancer Res.2004; 64:6610-6615; Parkeret al.Human Gene Therapy 1997; 8:1637-1644; also see below)。細(xì)胞 100% 轉(zhuǎn)導(dǎo)了大腸桿菌PNP的腫瘤與不轉(zhuǎn)導(dǎo)的(`親本的)腫瘤以相似的速率生長(Hong et al.CancerRes.2004;64:6610-6615)，這表明了在整個(gè)腫瘤模型的擴(kuò)張中將會(huì)保持一個(gè)~5%的轉(zhuǎn)導(dǎo)水平。為了驗(yàn)證這個(gè)說法，在藥物療法的第一天，小鼠體中得到的三種代表性腫瘤中制備腫瘤提取物，并且將大腸桿菌PNP的活性水平定為2500±400個(gè)單位。126000個(gè)單位的大腸桿菌PNP活性存在于這個(gè)系中100%表達(dá)PNP細(xì)胞的腫瘤中(Hong et al.CancerRes.2004;64:6610-6615)。因此研究結(jié)果表明在這個(gè)特定的實(shí)驗(yàn)中，親本(無PNP表達(dá))細(xì)胞比活體內(nèi)PNP被轉(zhuǎn)導(dǎo)系小幅生長更快，并且確認(rèn)了在圖1中所述的轉(zhuǎn)導(dǎo)百分比小于等于5%，也許更接近2%到3%。
[0060]圖1所示的結(jié)果確立了，大型腫瘤(大約占動(dòng)物總體重的1%)的完全消退或痊愈可以被安全地實(shí)現(xiàn)通過一種腹膜內(nèi)基于PNP的GDEPT策略。研究結(jié)果還展示了優(yōu)異的體內(nèi)旁觀者活性。僅有三種F-araAMP瞬時(shí)(非緩釋性)腹膜內(nèi)注射導(dǎo)致了大型腫瘤的摧毀，盡管小于等于5%的細(xì)胞表達(dá)活化基因。此外，使用F-araAMP的治療導(dǎo)致體重僅有10%到20%的減輕，在F-araAMP療程完成后體重可以迅速恢復(fù)。不管大幅延長了壽命，在直接圍繞著腫瘤的區(qū)域沒有嚴(yán)重的組織損傷，或是顯示其他不希望有的后遺癥。3x劑量在聚乳酸微栓中占30%重量的F-araAMP的單獨(dú)的IP注射可獲得一個(gè)相似的效果。[0061]實(shí)施例5:D54腫瘤的F-araAMP瘤內(nèi)許射。圖2A中，親本D54腫瘤細(xì)朐與P,經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)了大腸桿菌PNP的D54腫瘤細(xì)胞混合，直到最終的比例為其中10%表達(dá)了轉(zhuǎn)基因。這種90/10比例的混合物通過皮下注射到裸鼠的脅腹。從第14天開始，連續(xù)三天每天一次向腫瘤中注射150 μ I生理鹽水，1.5mg F-araAMP被溶解在生理鹽水中，或3mg F-araAMP被溶解在生理鹽水中。在治療的時(shí)候(第14天)，腫瘤中大腸桿菌PNP的活性為14300±2600個(gè)單位。3mg治療組中的腫瘤生長與載體治療組(P〈0.001)中的相比有著顯著不同，但與1.5mg治療組(P=0.458)的相比并無顯著不同。圖2B中，親本D54腫瘤細(xì)胞(無大腸桿菌PNP表達(dá))通過皮下注射至裸鼠的脅腹。從第14天起，連續(xù)三天每天一次，使用150 μ I生理鹽水對腫瘤進(jìn)行注射，3mg F-araAMP被溶解在生理鹽水中，0.15mg F-Ade被溶解在生理鹽水中，1.26mg的F-Ade被溶解在150mLDMS0中，0.63mgF_Ade被溶解在DMSO中，或是DMSO。通過單次注射30%的在鹽水中有著相似結(jié)果的聚乳酸微栓重量的F-araAMP 9mg重復(fù)進(jìn)行此實(shí)驗(yàn)。使用在DMSO溶解0.63或1.26mg的F-Ade進(jìn)行治療的小鼠的腫瘤生長比起DMSO載體治療組(分別為P=0.011和0.002)中的有著顯著的不同。
[0062]在圖2A中，說明了 F-araAMP被注射至有10%細(xì)胞表達(dá)大腸桿菌PNP的腫瘤中有一個(gè)很強(qiáng)的抗腫瘤效果。注意，此實(shí)驗(yàn)中F-araAMP的劑量大大低于最大耐受量，并且附加的注射被賦予更大的抗腫瘤活性。在低劑量的F-araAMP中，腫瘤中PNP活性在使用F-araAMP治療后45天后為1250個(gè)單位,而在治療的時(shí)候腫瘤中PNP活性為14300個(gè)單位。這一結(jié)果表明F-araAMP療法優(yōu)先殺滅表達(dá)大腸桿菌PNP的細(xì)胞，這表明抗腫瘤活性依賴于大腸桿菌PNP的表達(dá)。被注射的F-araAMP的量為120mg/kg，這遠(yuǎn)小于這個(gè)日程表的最大耐受量(750mg/kg, qldx3)。更高劑量的F-araAMP當(dāng)被溶解在DMSO時(shí),可以看到更好的結(jié)果:圖2C0
[0063]實(shí)施例6:俥用或不俥用PNP在D54腫瘤細(xì)朐中的F-araAMP瘤內(nèi)灃射。在圖2B，圖2D以及圖3中中顯示了 F-araAMP的直接瘤內(nèi)注射到?jīng)]有表達(dá)大腸桿菌PNP活性的細(xì)胞的腫瘤不會(huì)影響腫瘤的生長。這一結(jié)果表明了在圖2A，圖2C及圖4中所示的F-araAMP抗腫瘤活性歸因于在亞腫瘤細(xì)胞中大腸桿菌PNP的表達(dá)。F-Ade的抗腫瘤活性(F-araAMP的活性代謝物)也以和F-araAMP相同的方式被注射至腫瘤。溶解于水中的0.15ml的Img/mlF-Ade (溶解度極限)顯示無抗腫 瘤效果。溶解在DMSO中的0.15ml的8.6mg/ml F-Ade被注射至腫瘤；一個(gè)輕微的抗腫瘤效果被可以觀察到。
[0064]這些結(jié)果表明，同時(shí)包含一種載體(以傳送大腸桿菌PNP)以及定時(shí)釋放的F-araAMP在不然無法治療的局部癌癥的治療中很有效。本品至少一次的注射將抑制代謝，甚至殺滅任何表達(dá)大腸桿菌PNP的細(xì)胞加上許多與F-araAMP相關(guān)的帶有降低全身毒性的旁觀者細(xì)胞。有必要重復(fù)多次這個(gè)操作以除去瘤塊。舉個(gè)例子，在門診基礎(chǔ)上一周一次對患者進(jìn)行帶有降低毒性的注射直至腫瘤被完全消除。F-araAMP的多次瘤內(nèi)注射會(huì)導(dǎo)致更強(qiáng)的抗腫瘤活性(圖4)。
[0065]由于只有小部分IP注射的F-araAMP實(shí)質(zhì)上在活體內(nèi)灌注了一種惡性腫瘤，需要測試向瘤塊中直接注射F-araAMP是否可以增強(qiáng)效力。初步的研究顯示了(以及上面所介紹的)10%表達(dá)大腸桿菌PNP細(xì)胞的腫瘤(圖2A)。每次注射3mg F-araAMP的瘤內(nèi)注射(總共三次注射)可以賦予顯著的抗腫瘤效果(P〈0.001)，伴隨很少或沒有重量減輕；然而，當(dāng)將F-araAMP注射到親本(無表達(dá)大腸桿菌PNP的)腫瘤時(shí)，沒有這樣的效果(圖2B)。由于一只小鼠的重量大約是0.025kg, 3mg F-araAMP的注射相當(dāng)于120mg/kg F-araAMP的劑量，是圖1中所研究的全身總量的百分之二十五到百分之五十。F-Ade (F-araAMP的活性代謝物)向腫瘤的注射也不能引發(fā)抗腫瘤活性，當(dāng)以盡可能最高溶解度在生理鹽水中被測試時(shí)(圖 2B)。F-Ade 也被溶解在 DMSO 中，1.26mg F-Ade(在 F-araAMP 3mg 的注射的 F-Ade 的近似摩爾當(dāng)量)對腫瘤的三次注射，導(dǎo)致最小抗腫瘤活性(圖2B ；p=0.011就使用DMSO載體注射的小鼠)，但會(huì)造成在體重上有10%的減輕。無論是2.5mg或5mg F-Ade (被溶解在DMSO中)的三次瘤內(nèi)注射分別導(dǎo)致了 6只小鼠中3只死亡以及6只小鼠中4只死亡，這表明了
1.26mg非常接近其最大耐受量(MTD)。因此，這個(gè)結(jié)果因此展示了，不像大腸桿菌PNP的瘤內(nèi)注射表達(dá)后的跟隨的，IT F-araAMP, F-Ade的直接IT注射有極小的抗腫瘤療效。
[0066]如前所述，被瘤內(nèi)注射給予的F-araAMP量(圖2A中)小于圖1中所述整個(gè)腹腔內(nèi)注射劑量。為了研究較高劑量F-araAMP的影響，F(xiàn)-araAMP被溶解在DMSO中，并被給予耐受IT良好的濃度，但當(dāng)IP給藥遠(yuǎn)高于最大耐受劑量(Hong et al.CancerRes.2004;64:6610-6615)。三種6或24mg的劑量通過IT注射給藥到10%的細(xì)胞表達(dá)大腸桿菌PNP的腫瘤(圖2C)。親本D54腫瘤細(xì)胞或是10%表達(dá)大腸桿菌PNP細(xì)胞的D54腫瘤細(xì)胞混合物通過皮下注射至裸鼠脅腹。從第17天起，連續(xù)三天每日一次使用150μ I的DMSO對腫瘤注射，24mg F-araAMP在DMSO中，或6mg F-araAMP在DMSO中。大腸桿菌PNP在有10%表達(dá)大腸桿菌PNP的D54腫瘤中的活性(在第17天)為8，600±620個(gè)單位。帶有PNP腫瘤并使用6或24mg的F-araAMP治療的小鼠的腫瘤生長相比載體治療組(分別是P=0.014和P〈0.001)有著顯著的不同,但在本實(shí)驗(yàn)中彼此并無明顯的不同。使用24mg的F-araAMP治療的六個(gè)腫瘤中的三個(gè)變得潰爛(在第17天，第21天和第24天)，這就需要更多研究動(dòng)物。剩下的三個(gè)腫瘤完全消退，且小鼠保持免除腫瘤，直到實(shí)驗(yàn)在第70天結(jié)束。使用6mg的F-araAMP治療的腫瘤中沒有潰爛現(xiàn)象，并且這種療法中的單獨(dú)過程導(dǎo)致大型的腫瘤消退并伴隨有一個(gè)延長的抗腫瘤效果。在最高劑量時(shí)F-araAMP的注射導(dǎo)致了體重有一個(gè)適度的(7%)的減輕，這一體重的減輕可以在藥物治療后迅速地恢復(fù)。F-araAMP在這些劑量時(shí)的注射至親本腫瘤(無PNP表達(dá))不會(huì)導(dǎo)致抗腫瘤活性。
`[0067]實(shí)施例7:瘤內(nèi)F-araAMP以及Ad/PNP對D54腫瘤的影響。一種表汰大腸桿菌PNP(Ad/PNP)的復(fù)制缺陷型腺病毒載體的隨后跟著F-araAMP的全身性療法的瘤內(nèi)(IT)注射所產(chǎn)生的適度的抗腫瘤活性被證實(shí)了 (Hong et al.Cancer Res.2004;64:6610-6615)。基于圖2C中所展示的強(qiáng)活性，當(dāng)F-araAMP以高劑量IT給藥時(shí)，研究Ad/PNP加上F araAMP的抗腫瘤活性當(dāng)這兩種組分都直接注射至瘤塊(圖5A)。在所示實(shí)驗(yàn)中，2xlOnVP的Ad/PNP被IT給藥三天(第15，，16和17天)每天兩次，總共6次注射。隨后在第20，21和22天使用24mg的F-araAMP每天一次對腫瘤注射。腫瘤內(nèi)大腸桿菌PNP的活性在第20天(F-araAMP治療的第一天)為7，500±2，000個(gè)單位，這與在有5%到10%穩(wěn)定表達(dá)酶的細(xì)胞的腫瘤內(nèi)所觀察到的(2，500，14，300，or 8，600個(gè)單位)很相似，并且在預(yù)計(jì)的由瘤內(nèi)F-araAMP所引起的強(qiáng)抗腫瘤活性范圍內(nèi)。盡管使用Ad/PNP加上F-araAMP治療的10只小鼠中有兩只死亡，在8只治療中經(jīng)歷了 17%體重?fù)p失存活的小鼠中仍然表現(xiàn)出優(yōu)異的抗腫瘤效果。由于毒性跡象在如圖5A所示的實(shí)驗(yàn)中被指出，研究以減少的劑量(每次注射18mg)的F-araAMP重復(fù)進(jìn)行。有了這個(gè)日程表，治療組中不會(huì)出現(xiàn)與藥品相關(guān)的死亡，并且盡管小鼠的體重沒有下降，在植入后第71天應(yīng)指出延長的抗腫瘤活性(圖5B)。此實(shí)驗(yàn)的腫瘤中的大腸桿菌PNP活性為1，900± 1，500個(gè)單位。結(jié)果確立了被瘤內(nèi)F-araAMP緊隨的Ad/PNP的瘤內(nèi)注射可以引起在其他方式的難治性實(shí)體瘤有大幅的優(yōu)于在瘤內(nèi)F-araAMP之前的Ad/PNP瘤內(nèi)注射之后可見的消退效果(Hong et al.Cancer Res.2004;64:6610-6615)。
[0068]同時(shí)使用Ad/PNP加上更高劑量F-araAMP的腫瘤注射對腫瘤生長有著巨大的優(yōu)于使用Ad/PNP加上全身性F-araAMP對腫瘤生長的影響(圖5A和圖5B)。
[0069]實(shí)施例8:F~dAfo與F-araAMP相對的影響。F_dAdo或F-araAMP被注射至D54月中瘤三次，每次150 μ I體積分八次每次大約是20 μ I的注射。圖5Α中，利用載體(實(shí)心圓)，Ad/PNP (空心圓)，F(xiàn)-araAMP (實(shí)心三角形)或Ad/PNP加上F-araAMP (空心三角形)對親本D54人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤IT治療。從第15天起，連續(xù)三天每天兩次注射Ad/PNP(2xl011VP)。從第20天起,連續(xù)三天每天一次注射溶解在DMSO中的24mg F-araAMP。載體治療小鼠中的腫瘤使用緊跟著DMSO三次注射的生理鹽水注射六次(否則就如上文所述XD54腫瘤中的大腸桿菌PNP活性(在第20天時(shí))為7，500 ±2，000個(gè)PNP單位。每個(gè)治療組包含10只小鼠。在組合治療組中，十只小鼠中的兩只在結(jié)束前死亡。八只剩余小鼠中的四只在第65天時(shí)免除腫瘤了，兩只小鼠有小的腫瘤(63mg和288mg),另兩只小鼠有生長中的腫瘤(1666mg和1584mg)。使用Ad/PNP加上F-araAMP治療的小鼠中的腫瘤生長比起僅僅使用F-araAMP或是Ad/PNP (分別是P=0.010和P=0.002)治療的小鼠有著顯著的區(qū)別。圖5B中，小鼠按圖5A所述的進(jìn)行治療，除了 F-araAMP的劑量是每次注射18mg。此實(shí)驗(yàn)中大腸桿菌PNP在第18天時(shí)的活性為1900±1500PNP單位。使用Ad/PNP加上F-araAMP治療的小鼠中的腫瘤生長比起僅僅使用F-araAMP或是Ad/PNP (分別是P=0.001和P=0.011)治療的小鼠有著顯著的區(qū)別。圖5C顯示使用了 T.Vaganalis(TV)-PNP供替換的來源的數(shù)據(jù)。
[0070]使用F-araAMP比起使用F_dAdo可以觀察到更好的結(jié)果(圖6A和圖6B)盡管當(dāng)細(xì)胞表達(dá)為PNP時(shí)F-dAdo對于大腸桿菌PNP是一個(gè)比F-araAMP更好的基質(zhì)。
[0071]實(shí)施例9:瘤內(nèi)灃射的F-araAMP和Ad/PNP對于DU145 (人類前列腺)腫瘤以及NC1-H322M(人類非小細(xì)胞腺癌)腫瘤的影響。F-araAMP和Ad/PNP的注射如上文所述執(zhí)行，除了腫瘤現(xiàn)在是有著相似結(jié)果的DU145(圖7A)。F-araAMP和Ad/PNP的注射如上文所述執(zhí)行，除了腫瘤現(xiàn)在是有著相似結(jié)果的H322M (圖7B)。
[0072]實(shí)施例10:F-araAMP的瘤內(nèi)注射加上放射對D54腫瘤的影響。局部晚期實(shí)體瘤常常對放射治療有抵抗。作為在該設(shè)定中輔助性大腸桿菌PNP的一個(gè)測試，F(xiàn)-araAMP注射與外照射一起被研究。圖8A中，對有10%細(xì)胞表達(dá)了大腸桿菌PNP的腫瘤進(jìn)行放射給藥(為了預(yù)先對D54腫瘤細(xì)胞賦予一個(gè)可測量的效果)，通過三次3mg或沒有的F-araAMPIT注射(其劑量為導(dǎo)致腫瘤的抑制而沒有無腫瘤幸存，圖2A)，。圖8B中，對有10%細(xì)胞表達(dá)了大腸桿菌PNP的腫瘤進(jìn)行放射給藥(為了預(yù)先對D54腫瘤細(xì)胞賦予一個(gè)可測量的效果)，通過三次3mg或無的F-araAMP的全身性IP注射(其劑量為導(dǎo)致腫瘤的抑制而沒有無腫瘤幸存，圖2A)。結(jié)合了大腸桿菌PNP或F-araAMP與放射療法可以導(dǎo)致一個(gè)顯著的抗腫瘤活性，這比單獨(dú)采取任一療法更強(qiáng)。在所有的治療組中可以觀察到百分之十到十四的重量減輕(這在治療結(jié)束后可迅速恢復(fù))，表明了這兩種干擾措施的毒性不是附加的。使用實(shí)施例5的緩釋F-araAMP可以得到相似的結(jié)果。
[0073]含有10%表達(dá)大腸桿菌PNP細(xì)胞的D54腫瘤細(xì)胞通過皮下注射至裸鼠脅腹?？梢允褂幂椛洌現(xiàn)-araAMP或是F-araAMP加上輻射對腫瘤進(jìn)行治療。在兩個(gè)治療組中，使用150 μ I的生理鹽水或3mg的F-araAMP生理鹽水溶液,連續(xù)三天每天一次對腫瘤進(jìn)行注射。在另外兩個(gè)治療組中，在注射了 150 μ I生理鹽水(實(shí)心方塊)或是3mg F-araAMP的生理鹽水溶液(空心方塊)之后，連續(xù)三天每天一次進(jìn)行3小時(shí)的輻射(4Gy)給藥。D54腫瘤中大腸桿菌PNP的活性(在第16天)為12，000±3，000個(gè)單位。使用輻射加上F-araAMP治療的小鼠體內(nèi)的腫瘤生長相比單單使用F-araAMP或輻射治療的小鼠中的(分別是P=0.004和P〈0.001)有著顯著地區(qū)別，并且IT注射(圖8A)更加優(yōu)于全身性IP注射(圖8B)。
[0074]實(shí)施例11:F_araAMP瘤內(nèi)灃射后D54腫瘤中的放射件。為了要理解瘤內(nèi)(IT)F-araAMP的藥效，親本(D54)腫瘤以及有著10%表達(dá)大腸桿菌PNP細(xì)胞的腫瘤中前藥的活化水平需要被監(jiān)測(表1)。在3mg[3H]-F-araAMP的IT注射10分鐘或4小時(shí)之后采集腫瘤組織，可以確定留在腫瘤中放射性的含量。在F-araAMP注射后十分鐘，親本和有著10%表達(dá)大腸桿菌PNP細(xì)胞的D54腫瘤之間并沒有差異。經(jīng)過四小時(shí)，表達(dá)大腸桿菌PNP的D54腫瘤細(xì)胞中的放射性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于親本腫瘤，表現(xiàn)了了 F-araAMP轉(zhuǎn)換為F-Ade代謝物的量。這個(gè)實(shí)驗(yàn)表明了 3mg F-araAMP瘤內(nèi)注射后，每克腫瘤組織會(huì)產(chǎn)生并保留190納摩爾的F-Ade代謝物。三毫克的F-araAMP相當(dāng)于8200納摩爾，因此本實(shí)驗(yàn)中的腫瘤大約為0.3克，大約在腫瘤組織中保留了 57納摩爾的F-Ade，或者說總的F-araAMP中的0.7%注射到腫瘤中。
[0075]表1
F-araAM P瘤內(nèi)注射后D54腫瘤中的放射性納摩爾 (nmoles ) F-araAMP/克組織
10分鐘4小時(shí)
[0076]
D54 腫瘤980 ±73031 士 6
10% PNP 的 D54 腫瘤 11 00 ± 990220 ± 75*
[0077]將三毫克(8200納摩爾)的[3H]F_araAMP (每次注射10 μ Ci)注射到D54腫瘤或者有10%細(xì)胞表達(dá)大腸桿菌PNP的D54腫瘤，如圖2所示。在使用F-araAMP和一定量的放射后的10分鐘以及4小時(shí)，移除腫瘤(大約300mg)。每組有4個(gè)腫瘤。重復(fù)這個(gè)實(shí)驗(yàn)可以得到相似的結(jié)果。*與D54腫瘤有著顯著的不同:P〈0.02，配有學(xué)生的t測試。
[0078]本說明書中提及的專利文獻(xiàn)及出版物指示了本發(fā)明所涉及領(lǐng)域中的技術(shù)人員的水平。這些文件及出版物再次引用作為相同程度的參考文獻(xiàn)，就好像每篇文件及出版物被具體地單獨(dú)地在此引用作為參考。
[0079]以上的描述對于本發(fā)明中的特定的實(shí)施例有說明性，但并不表示限定了本發(fā)明的實(shí)施。權(quán)利要求包括其所有的等同實(shí)施方式旨在確定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶或一種編碼其表達(dá)的載體,和一種被所述的嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶裂解的前藥，在用于制備功能性抑制或殺死復(fù)制型或非復(fù)制型靶細(xì)胞的直接注射藥劑方面的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中，所述嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶與所述前藥混合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中，所述前藥與一種緩釋載體一起配制。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中，所述嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶與含有編碼所述嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶的核酸的病毒載體一同被遞送。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其中，所述病毒載體是腺病毒載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中，所述嘌呤核苷磷酸化酶來源于大腸桿菌或陰道毛滴蟲。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其中，所述嘌呤核苷磷酸化酶是大腸桿菌的一突變體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其中，所述突變體是一加尾的突變體。
9.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任意一項(xiàng)所述的用途，其中，所述的前藥是磷酸氟達(dá)拉濱。
10.根據(jù)權(quán)利要求1至8中任意一項(xiàng)所述的用途，其中，復(fù)制型或非復(fù)制型靶細(xì)胞是癌細(xì)胞。
11.一種嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶或一種編碼其表達(dá)的載體的藥物和一種被所述嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶裂解的前藥的藥物，用于復(fù)制型或非復(fù)制型靶細(xì)胞的直接前藥注射的抑制。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的藥物，其中，靶細(xì)胞確定了一腫瘤。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的藥物，其中，所述嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶與含有編碼所述嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶的核酸的病毒載體一同被遞送。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的藥物，其中，所述病毒載體是一種腺病毒載體。
15.根據(jù)權(quán)利要求11所述的藥物，其中，所述嘌呤核苷磷酸化酶來源于大腸桿菌或陰道毛滴蟲。
16.根據(jù)權(quán)利要求11所述的藥物，其中，所述嘌呤核苷磷酸化酶是大腸桿菌的一突變體。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的藥物，其中，所述突變體是一加尾的突變體。
18.根據(jù)權(quán)利要求12所述的藥物，其中，所述前藥是經(jīng)瘤內(nèi)注射到所述腫瘤內(nèi)。
19.根據(jù)權(quán)利要求11至18中任意一項(xiàng)所述的藥物，其中，抑制靶細(xì)胞是指殺死靶細(xì)胞。
20.根據(jù)權(quán)利要求11至18中任意一項(xiàng)所述的藥物，其進(jìn)一步包括輻射照射以抑制功能或殺死復(fù)制型或非復(fù)制型靶細(xì)胞。
21.—種抑制復(fù)制型或非復(fù)制型靶細(xì)胞的方法，其包括: 將一種嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶或一種編碼其表達(dá)的載體遞送到靶細(xì)胞；和 將一種被所述嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶裂解的前藥直接注射到靶細(xì)胞附近，以釋放對靶細(xì)胞有細(xì)胞毒性的嘌呤堿基來殺死或者抑制靶細(xì)胞。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中，靶細(xì)胞確定一腫瘤。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中，所述嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶與含有編碼所述嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶的核酸的病毒載體一同被遞送。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中，所述病毒載體是一種腺病毒載體。
25.根據(jù)權(quán)利要求21至24中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述嘌呤核苷磷酸化酶來源于大腸桿菌或陰道毛滴蟲。
26.根據(jù)權(quán)利要求21至24中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述嘌呤核苷磷酸化酶是大腸桿菌的一突變體。
27.根據(jù)權(quán)利要求21至24中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述突變體是一加尾的突變體。
28.根據(jù)權(quán)利要求21至24中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述前藥是經(jīng)瘤內(nèi)注射到所述腫瘤內(nèi)。
29.根據(jù)權(quán)利要求21至24中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，抑制靶細(xì)胞是指殺死靶細(xì)胞。
30.根據(jù)權(quán)利要求21至24中任意一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括了抑制旁觀者細(xì)胞生長至靶細(xì)胞。
31.根據(jù)權(quán)利要求21至24中任意一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括了將靶細(xì)胞暴露于X射線輻射。
32.根據(jù)權(quán)利要求21至24中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述前藥是磷酸氟達(dá)拉濱。
33.根據(jù)權(quán)利要求21至24中任意一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括了一種凝膠、糊劑或微粒的緩釋載體。
34.抑制復(fù)制型或非復(fù)制型靶細(xì)`胞的方法，其包括: 將一種嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶遞送到確定了一腫瘤的靶細(xì)胞； 將一種被所述嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶裂解的前藥給藥以釋放對靶細(xì)胞有細(xì)胞毒性的嘌呤堿基；和 將靶細(xì)胞暴露于X射線輻射以殺死或抑制靶細(xì)胞功能。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中，所述前藥是通過瘤內(nèi)注射的方式給藥到所述腫瘤中。
36.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中，所述嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶與含有編碼所述嘌呤核苷磷酸化酶或核苷水解酶的核酸的病毒載體一同被遞送。
37.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法,其中,所述病毒載體是一種腺病毒載體。
38.根據(jù)權(quán)利要求34至37中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述嘌呤核苷磷酸化酶來源于大腸桿菌或陰道毛滴蟲。
39.根據(jù)權(quán)利要求34至37中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述嘌呤核苷磷酸化酶是大腸桿菌的一突變體。
40.根據(jù)權(quán)利要求34至37中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述突變體是一加尾的突變體。
41.根據(jù)權(quán)利要求34至37中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述前藥是經(jīng)瘤內(nèi)注射到所述腫瘤內(nèi)。
42.根據(jù)權(quán)利要求34至37中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，抑制靶細(xì)胞是指殺死靶細(xì)胞。
43.根據(jù)權(quán)利要求34至37中任意一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括了抑制旁觀者細(xì)胞生長至靶細(xì)胞。
44.根據(jù)權(quán)利要求34至37中任意一項(xiàng)所述的方法，其中，所述前藥是磷酸氟達(dá)拉濱。
45.根據(jù)權(quán)利要求34至37中任意一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括了一種凝膠、糊劑或微粒的緩釋載體。
【文檔編號】A61P35/00GK103501824SQ201280018791
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2012年2月20日 優(yōu)先權(quán)日:2011年2月18日
【發(fā)明者】威廉·B·帕克, 埃里克·J·索爾舍爾 申請人:Uab研究基金會(huì), 南方研究所