包含組蛋白去乙?；敢种苿┑囊呙缃臃N方法
【專利摘要】提供了一種疫苗接種方法。該方法包括給予哺乳動物組蛋白去乙酰化酶抑制劑以及能表達抗原的疫苗，所述哺乳動物對所述抗原具有預存免疫力。
【專利說明】包含組蛋白去乙?；敢种苿┑囊呙缃臃N方法
發(fā)明領域
[0001]本發(fā)明一般涉及疫苗接種方法，且具體來說，涉及這樣的疫苗接種方法，其中將病毒疫苗與組蛋白去乙?；敢种苿┕餐o予。
[0002]發(fā)明背景
[0003]組蛋白去乙?；敢种苿?HDACi)為表觀遺傳的改性劑類藥物，其由于能損害控制基因轉(zhuǎn)錄所必需的組蛋白修飾而對基因表達具有廣泛的影響。HDACi可以修飾腫瘤細胞內(nèi)的干擾素信號轉(zhuǎn)導，因此可被用作病毒激發(fā)劑來增加溶瘤作用。通過加強癌細胞的干擾素響應的固有缺陷，這些藥物能增加溶瘤病毒的效力，而不會致使正常細胞易感。因此HDACi可以改變先天免疫力來促進病毒溶瘤作用，但還沒有研究過它們在該治療設置中對獲得性免疫應答的影響。[0004]病毒溶瘤作用和癌癥免疫療法作為獨立的治療措施展現(xiàn)出臨床療效。越來越多的文獻表明，成功的溶瘤病毒療法依賴于其固有的誘導抗腫瘤免疫力的能力，這導致一些人竟將其界定為一種免疫療法形式。幾種有前景的臨床候選者為經(jīng)過工程改造以表達免疫刺激性轉(zhuǎn)基因的病毒。然而，關于刺激免疫系統(tǒng)是否對溶瘤病毒療法具有凈利益仍存在爭議。確實，如果不經(jīng)意間增強了針對溶瘤載體的免疫應答，這可能會危害病毒復制和損害腫瘤特異性反應的誘導，尤其是當通過諸如抗原競爭(其中外來的病毒抗原將具有顯著的優(yōu)勢，并且由于較少的溶瘤作用而減少抗原釋放)的機制而以自身抗原為靶標時。因此，將直接的溶瘤作用與免疫療法結(jié)合的最佳策略應當旨在增強抗腫瘤免疫和溶瘤病毒復制。
[0005]目前表明溶瘤病毒為抗腫瘤免疫應答的特別有效的加強劑。該治療方法結(jié)合了常規(guī)的病毒疫苗和溶瘤的病毒疫苗，這兩者都表達相同的腫瘤抗原。采用溶瘤疫苗加強可導致由病毒引起的腫瘤減滅和已激發(fā)的動物體內(nèi)腫瘤特異性CTL (細胞毒性T淋巴細胞)數(shù)目的大幅增加。自相矛盾的是，相比沒有腫瘤的動物，該方法實際上可在荷瘤的動物體內(nèi)產(chǎn)生更大的抗腫瘤免疫應答，因為復制型溶瘤載體在腫瘤內(nèi)擴增，導致抗原特異性TIL數(shù)目非常大幅地增加和一些情形下建立的顱內(nèi)黑色素瘤的消除。
[0006]包括丙戊酸(VPA)、辛二酰苯胺異羥肟酸(SAHA)和MS-275在內(nèi)的數(shù)種HDACi，當前正作為不同的實體惡性腫瘤和血液惡性腫瘤的抗癌藥物而進行臨床研究。已在急性骨髓性白血病、T細胞淋巴瘤和腎細胞癌中取得了初步滿意的結(jié)果。有趣的是，除了它們的直接抗腫瘤活性，這些HDACi還具有免疫調(diào)節(jié)特性。例如，已經(jīng)表明VPA、SAHA和MS-275都能增強癌細胞的免疫原性和免疫識別。
[0007]發(fā)明概述
[0008]已經(jīng)發(fā)現(xiàn)HDACi與加強性疫苗的共給予展現(xiàn)出增強效應。
[0009]因此，在本發(fā)明的一個方面，提供了疫苗接種方法，其包括給予哺乳動物組蛋白去乙?；敢种苿┖湍苓f送抗原的疫苗的步驟，所述哺乳動物對所述抗原具有預存免疫力。
[0010]在本發(fā)明的另一方面，提供了包含疫苗和組蛋白去乙?；敢种苿┑慕M合物。
[0011]參考以下附圖，本發(fā)明的這些方面和其他方面在以下的詳細描述中將變得顯而易見?！緦＠綀D】

【附圖說明】
[0012]圖1闡述了在接種后I天或5天開始，用PBS、Ad-BHG(陰性對照，IxlO8PFU IM)、Ad-hDCT (TAA 轉(zhuǎn)基因，IxlO8PFU IM)、Ad-hDCT+VSV_hDCT 或 Ad-hDCT+VSV-hDCT+MS-275 處理的癌癥模型的存活曲線(分別為A和B)；
[0013]圖2用圖表闡述了溶瘤疫苗加強劑與HDACi的共給予維持腫瘤抗原特異性應答㈧；維持腫瘤抗原特異性抗體應答⑶；維持活化的NK細胞的數(shù)目(C);增加IFNy和TNFa的共表達(D);增加在溶瘤疫苗加強后由腫瘤抗原特異性T細胞表達的IFNy的量(E)和TNF a的量(F);以及增加T細胞親和力(G)；
[0014]圖3用圖表闡述了溶瘤疫苗加強劑與HDACi的共給予產(chǎn)生了嚴重的淋巴球減少癥，這可由外周血中總淋巴細胞計數(shù)的減少得到證實，其中總淋巴細胞計數(shù)的減少是由于初始CD8+細胞⑶、初始NK細胞(C)、初始T細胞⑶和B細胞(E)的減少；
[0015]圖4用圖表闡述了溶瘤疫苗加強劑與HDACi的共給予在維持抗腫瘤應答的同時減少了抗病毒應答； [0016]圖5用圖表闡述了溶瘤疫苗加強劑與HDACi的共給予減少了 Treg頻數(shù)㈧、增加了腫瘤抗原特異性T細胞與Treg的比值(B)以及減少了 Foxp3表達水平(C)；
[0017]圖6用圖表闡述了由溶瘤疫苗加強劑與HDACi的共給予誘導的淋巴球減少癥不為品系特異性的，因為Balb/c小鼠內(nèi)與C57/B6小鼠內(nèi)發(fā)生了類似的總淋巴細胞(A)、初始CD8+T細胞(B)、總NK細胞(C)、CD4+T細胞(D)和B細胞(E)的減少；
[0018]圖7用圖表闡述了 VSV誘導的短暫的淋巴球減少癥可被MS-275共給予顯著延長，這可以由總淋巴細胞計數(shù)(A)、初始CD4+細胞(B)、CD8+T細胞(C)和B細胞⑶證明。水平虛線表示未處理小鼠的平均計數(shù)；
[0019]圖8用圖表闡述了相比單獨給予聚1:C和VSV/MS-275，由聚1:C與MS-275的共給予誘導了淋巴球減少癥，這可由總淋巴細胞計數(shù)證明；以及
[0020]圖9闡述了 MS-275 (A)和無活性的MS-275類似物⑶的結(jié)構(gòu)。
[0021]發(fā)明的詳細描述
[0022]提供了疫苗接種方法，包括給予哺乳動物組蛋白去乙?；敢种苿┖瓦m合表達抗原的疫苗，所述哺乳動物對所述抗原具有預存免疫力。
[0023]本文中使用術語“疫苗”是指可誘導針對靶抗原的免疫原性應答的生物制劑。疫苗的實例包括:病毒疫苗、細菌疫苗、蛋白疫苗和核酸疫苗。術語“病毒疫苗”指可誘導針對靶抗原的免疫原性應答的病毒。
[0024]術語“哺乳動物”指人和非人的哺乳動物。
[0025]本發(fā)明方法包括給予哺乳動物能遞送或表達抗原的疫苗，所述哺乳動物對所述抗原具有預存免疫力。如本文中所使用，術語“預存免疫力”意欲包括由接種抗原誘導的免疫力，以及由先前暴露于給定抗原造成的哺乳動物內(nèi)天然存在的免疫力。
[0026]為了建立預存免疫力，本發(fā)明方法可以包括用適合誘導針對靶細胞的免疫應答的抗原為哺乳動物接種疫苗的步驟，例如，激發(fā)步驟。合適的抗原包括，腫瘤抗原、病毒抗原，且尤其是來源于病毒性病原生物體(如HIV、H印C、FIV、LCMV、伊波拉病毒)的抗原，以及諸如結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)的細菌性病原體。[0027]在一個實施方案中，抗原為諸如腫瘤相關抗原(TAA)的腫瘤抗原，例如，腫瘤細胞內(nèi)產(chǎn)生的可引起哺乳動物的免疫應答的物質(zhì)。這類抗原的實例包括:諸如甲胎蛋白(AFP)和癌胚抗原(CEA)的癌胚抗原；諸如CA-125和間皮素的表面糖蛋白；諸如Her2的致癌基因；諸如多巴色素異構(gòu)酶(DCT)、GP100和MARTl的黑色素瘤相關抗原；諸如MAGE蛋白和NY-ESOl的癌-睪丸抗原；諸如HPV E6和E7的病毒致癌基因；組織中異位表達的蛋白質(zhì)，其通常限制于諸如PLACl的胚胎組織或胚外組織。如本領域技術人員所理解的，可以基于待治療的癌癥類型，使用本發(fā)明方法選擇抗原，因為某一種或多種抗原可能特別適合用于某些癌癥的治療中。例如，對于黑色素瘤的治療，可以使用諸如DCT的黑色素瘤相關抗原。本文中使用的術語“癌癥”包括任何癌癥，包括但不限于，黑色素瘤、肉瘤、淋巴瘤、諸如腦癌、乳腺癌、肝癌、胃癌和結(jié)腸癌的癌以及白血病。 [0028]可以給予抗原本身，或優(yōu)選地，通過載體(例如彈狀病毒載體、腺病毒(Ad)載體、痘病毒載體或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體)、質(zhì)粒或負載的抗原呈遞細胞諸如樹突細胞給予。將抗原引入載體中的方法為本領域技術人員所了解。通常，將對載體進行修飾以表達抗原。就這一點而言，可使用已確立的重組技術將編碼所選抗原的核酸并入所選的載體中。
[0029]可用多種方法中的任何一種給予哺乳動物抗原，包括，但不限于:經(jīng)靜脈給予、肌內(nèi)給予或鼻內(nèi)給予。如本領域技術人員所理解的，可通過在合適的載體(諸如鹽水或其它合適的緩沖液)內(nèi)給予抗原或并入抗原的載體。在用所選的抗原接種疫苗之后，哺乳動物會在免疫應答間隔期內(nèi)產(chǎn)生免疫應答，例如至少約24小時，優(yōu)選至少約2-4天或更長，例如至少約I周，且可能延續(xù)數(shù)月、數(shù)年或可能一生。
[0030]為了建立針對抗原的免疫應答，可使用已確立的技術進行使用抗原的接種疫苗。因此，可以以足以產(chǎn)生免疫應答的量給予哺乳動物所選的抗原或表達該抗原的載體。如本領域技術人員所理解的，產(chǎn)生免疫應答所需的量將隨多種因素而不同，包括，例如，所選的抗原、用于遞送抗原的載體和待治療的哺乳動物，例如物種、年齡、大小等。就這一點而言，例如，肌肉內(nèi)給予小鼠最低至少約IO7PFU的腺病毒載體，或人體內(nèi)至少約IO9PFU,足以產(chǎn)生免疫應答。
[0031]在另一實施方案中，針對抗原的免疫應答可以是哺乳動物體內(nèi)天然存在的，并且激發(fā)疫苗接種步驟不是誘導免疫應答所必需的。天然存在的針對抗原的免疫應答可以由任何先前的抗原暴露引起。
[0032]一旦在合適的免疫應答間隔期內(nèi)，在哺乳動物體內(nèi)產(chǎn)生了針對給定抗原的免疫應答，將適合遞送或表達該抗原的加強疫苗(諸如病毒疫苗或抗原呈遞細胞)連同HDACi給予哺乳動物。
[0033]可以使用標準重組技術，通過將編碼抗原的轉(zhuǎn)基因并入合適的病毒內(nèi)，來制備表達所選抗原的病毒疫苗。例如，可以將轉(zhuǎn)基因并入病毒的基因組中，或作為選擇，可以使用并入轉(zhuǎn)基因的質(zhì)粒將轉(zhuǎn)基因并入病毒內(nèi)?？捎糜诖说暮线m的病毒包括溶瘤病毒，以及復制型(例如痘病毒)和非復制型(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒或腺病毒)疫苗載體。本發(fā)明方法不具體限于可以被利用的溶瘤病毒，且可以包括能破壞腫瘤同時適合給予哺乳動物的任何溶瘤病毒。本發(fā)明方法中可以利用的溶瘤病毒的實例包括:棒狀病毒如水皰病毒，例如水皰性口炎病毒(VSV)和馬拉巴病毒、暫時熱病毒、質(zhì)型彈狀病毒、核型彈狀病毒和狂犬病毒，以及麻疫病毒、牛痘病毒、皰疫病毒、粘液瘤病毒、細小病毒、新城疫病毒、腺病毒和塞姆利基森林病毒。
[0034]可將表達抗原的病毒以這樣的量與HDACi聯(lián)合給予，該量適合增強由預存免疫力產(chǎn)生的免疫應答。在一個實施方案中，以適合溶瘤病毒療法的量將表達腫瘤抗原的溶瘤病毒與有效量的HDACi聯(lián)合給予。如本領域技術人員所理解的，每種病毒的量至少隨所選的病毒、所選的HDACi和待治療的哺乳動物而不同。例如，經(jīng)靜脈注射(IV)給予小鼠的最低IO8PFU的溶瘤VSV足夠用于溶瘤療法。相當?shù)牧孔銐蛴糜谌祟悺?br> [0035]可將病毒疫苗連同HDACi —起給予。依照本發(fā)明的合適的組蛋白去乙?；敢种苿?HDACi)包括，但不限于:諸如伏立諾他(SAHA)、貝林司他(belinostat) (PXDlOl)、LAQ824、曲古抑菌素A和帕比司他(LBH589)的異羥肟酸；諸如恩替諾特(MS-275)、CI994和莫西司他(mocetinostat) (MG⑶0103)的苯甲酰胺類；環(huán)四肽類(如trapoxin B);和縮肽類；親電酮類；以及諸如苯基丁酸和丙戊酸的脂肪酸類化合物。在本方法中給予了哺乳動物治療量的HDACi，例如足以增強針對病毒疫苗的免疫應答的量。可以使用任何合適的給予形式給予HDACi，包括，例如，經(jīng)口給予、皮下給予、靜脈內(nèi)給予、腹膜內(nèi)給予、鼻內(nèi)給予、經(jīng)腸給予、局部給予、經(jīng)舌下腺給予、肌肉內(nèi)給予、動脈內(nèi)給予、髓內(nèi)給予、囊內(nèi)給予、吸入法給予、經(jīng)眼給予、經(jīng)皮給予、經(jīng)陰道給予或經(jīng)直腸給予。
[0036]可以依照本發(fā)明方法單獨或在組合物內(nèi)組合在一起給予病毒疫苗和組蛋白去乙?；敢种苿?，且還可以與一種或多種藥學可接受的佐劑或載體組合。表述“藥學可接受的”是指用于藥學領域是可接受的，即不為不可接受地具有毒性，或以其他方式不適合給予哺乳動物。藥學可接受的佐劑的實例包括，但不限于，稀釋劑、賦形劑等。為了獲得關于藥物配制的一般性指導，可以參考“Remington，s:The Science and Practice of Pharmacy”，21st Ed., Lippincott Williams&Wilkins, 2005。佐劑的選擇取決于組合物的預期給予方式。在本發(fā)明的一個實施方案中，將化合物配制成用于通過輸注或通過皮下注射或靜脈注射給予，并因此將其作為無菌和無熱原形式的水溶液，和任選地緩沖性水溶液或制成等滲溶液。因此，可以在蒸餾水或更可取地，在鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水或5%葡萄糖溶液中給予化合物。使用佐劑制 備用于通過片劑、膠囊劑、錠劑、水或非水液體的溶液或懸浮液、水包油或油包水型液體乳劑、酏劑或糖漿經(jīng)口給予的組合物，所述佐劑包括:諸如乳糖、葡糖糖和蔗糖的糖類；諸如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉的淀粉；纖維素及其衍生物，包括羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和醋酸纖維素；粉狀黃芪膠；麥芽；明膠；滑石；硬脂酸；硬脂酸鎂；硫酸鈣；諸如花生油、棉籽油、芝麻油、橄欖油和玉米油的植物油；諸如丙二醇、丙三醇、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇的多元醇；瓊脂；褐藻酸；水；等滲鹽水和磷酸鹽緩沖溶液。還可以存在潤濕劑、諸如十二烷基硫酸鈉的潤滑劑、穩(wěn)定劑、制片劑、崩解劑、抗氧化劑、防腐劑、著色劑和調(diào)味劑。在另一實施方案中，可以將組合物配制成乳膏、洗液或藥膏用于局部施用。對于此類局部使用，組合物可以包含諸如甘油三酸酯基質(zhì)的合適的基質(zhì)。此類乳膏、洗液和藥膏還可以含有表面活性劑和其它諸如皮膚柔軟劑等的美容用添加劑以及香料。還可以制備氣霧劑，例如，用于經(jīng)鼻遞送，其中使用合適的推進性佐劑。本發(fā)明的組合物還可以作為大丸藥、藥糖劑或糊劑被給予。還可以包括用于經(jīng)粘膜給予的組合物，包括經(jīng)口給予、經(jīng)鼻給予、經(jīng)直腸給予或經(jīng)陰道給予用于治療感染(其對這些區(qū)域造成影響)。此類組合物通常包含一種或多種合適的無刺激性的賦形劑或載體，包括，例如，可可油、聚乙二醇、栓劑、蠟、水楊酸鹽或其他合適的載體。不管其如何被給予，都還可以加入其他的佐劑至組合物中，這些佐劑，例如，可旨在延長其保存期限。
[0037]本發(fā)明方法在哺乳動物中提供了有效的協(xié)同性疫苗接種，在所述哺乳動物中，初次免疫應答被損壞，而針對給定抗原的二次免疫應答得到增強，例如相比由病毒疫苗單獨引起的應答，增強了至少約2倍或更多、例如約4倍或更多、例如約6至8倍或更多。對該效應起作用的因素為由該方法引起的選擇性淋巴球減少癥，借此，初始淋巴細胞被所述組合選擇性地耗盡。組蛋白去乙酰化酶抑制劑與疫苗加強劑的組合還減少由針對自身抗原的疫苗接種引起的自身免疫性后遺癥，而不會減少諸如此類疫苗接種的抗腫瘤效應的效應。
[0038]在一個實施方案中，提供了增強具有預存免疫力的哺乳動物中針對抗原的免疫應答的方法，其中通過能感染B細胞的載體、通過諸如B細胞的抗原呈遞細胞、通過可誘導I型干擾素的表達的載體或通過載體與能誘導I型干擾素表達的藥劑的聯(lián)合，例如經(jīng)靜脈給予，將所述抗原給予哺乳動物，從而完成其中抗原免疫應答得到增強且初次免疫應答被損壞的疫苗接種。術語“預存免疫力”如上所定義且可以如上述所獲得。可以使用該方法增強對任何抗原的免疫力，包括例如，腫瘤抗原、病毒抗原，且尤其是來自病毒性病原生物體(如HIV、HepC, FIV、LCMV、伊波拉病毒)，以及諸如結(jié)核分枝桿菌的細菌病原體的抗原。
[0039]如本領域技術人員所理解的，可以使用已確立的重組技術制備載體來表達所選的抗原。用于將抗原遞送至哺乳動物的合適的載體優(yōu)選包括可誘導I型干擾素的表達的載體，如，例如，如上所述的棒狀病毒，包括水皰病毒和基于Maraba的病毒。突變的病毒載體也適合用于本發(fā)明的方法中。突變的減毒病毒，包括不能復制的形式，用于本發(fā)明的方法中特別有利。
[0040]可以將表達抗原的載體與可誘導I型干擾素的表達的藥劑組合。這類藥劑的實例包括toll樣受體(TLR)配 體或佐劑,包括,但不限于,咪喹莫特、聚肌苷-聚胞嘧啶核苷酸(聚1:C)、CpG 0DN、咪唑喹啉、單磷酰脂A、鞭毛蛋白、FimH和N-乙二醇化的胞壁酰二肽(N-glycolyted muramyldipeptide)。為了獲得其中抗原免疫應答得到增強且初次免疫應答被損壞的疫苗接種，將載體與這樣的量的I型干擾素誘導劑組合，該量足以誘導干擾素產(chǎn)生和導致淋巴球減少癥。
[0041]一旦制備出表達所選抗原的載體，如上所述，就將其連同HDACi —起給予(例如經(jīng)靜脈)哺乳動物，用于最佳的免疫力增強。所給予的載體的量同樣隨所選的載體以及哺乳動物而不同。關于預存免疫力，可以在預存免疫力的峰值免疫應答之前或同時，將表達抗原的載體給予哺乳動物?？稍陬A存免疫力激發(fā)的效應期之后，最佳地將表達抗原的載體給予哺乳動物來增強預存免疫力。
[0042]參考以下具體實施例描述了本發(fā)明的實施方案，不應將這些具體實施例理解為具有限制意義。
實施例
[0043]方法
[0044]小鼠
[0045]雌性、年齡相仿(實驗開始時為8-10周齡)的C57BL/6小鼠購自查爾斯河實驗室(Wilmington, MA)，且圈養(yǎng)在麥克馬斯特大學的中心動物房內(nèi)的受控環(huán)境中，提供了食物和水供自由攝取。所有的動物實驗都得到麥克馬斯特大學動物研究倫理理事會的批準，并遵守加拿大動物飼養(yǎng)協(xié)會(Canadian Council on Animal Care guideline)的準則。
[0046]病毒載體
[0047] 復制缺陷型rHuAd5-hDCT載體被刪除了 E1/E3、可表達全長hDCT基因，在293細胞內(nèi)增殖，且在CsCl梯度上純化?？蓮椭菩蛂VSV-hDCT和rVSV-GFP已有描述(Stojdl etal.(2003).Cancer Cell, 4 (4), 263-275) ? rHuAd5_BHG 和 rVSV_MT 為缺少轉(zhuǎn)基因的對照載體。
[0048]激發(fā)加強方案
[0049]通過肌肉內(nèi)注射IxlO8Pfu的rHuAd5來激發(fā)小鼠。為了加強，在14天的間隔期時經(jīng)靜脈注射了 IxlO9Pfu的rVSV。對于HDACi處理，將MS-275 (溶于DMSO中且在鹽水中稀釋)與VSV給予共給予，且在隨后的4天，經(jīng)腹腔注射給予0.1mg0
[0050]癌癥模型
[0051]為了建立腦瘤，小鼠接受了顱內(nèi)注射IxlO3個B16-F10細胞(于IylPBS中)。將小鼠放置在立體定位儀(Xymotech Biosystems Inc, Quebec, Canada)內(nèi)，并在麻醉下用解剖刀片在頭皮中切個切口，以暴露頭蓋骨。在注射部位穿過頭蓋骨鉆出小的鉆孔。用安裝在10 μ I Hamilton注射器(Hamilton Company, Reno,NV)上的26號針頭，在大腦右半球內(nèi)的以下位點處(相對于前囪)注射細胞:前0.62mm、側(cè)2.25mm和深4.0mm。在I分鐘的時間內(nèi)注射細胞，并在撤回針頭前將針頭留在原處2分鐘，以使沿著注射通道的回流減到最小。用不銹鋼夾子閉合頭皮切口，7-10天后去除夾子。
[0052]肽
[0053]通過PepScan Systems (Lelystad, The Netherlands)合成了來自 DCT 的能與H-2Kb結(jié)合的免疫優(yōu)勢肽(DCT18(i_188，SVYDFFVWL)。來自VSV的N蛋白的H_2Kb限制性表位(RGYVYQGL)購自 Biomer Technologies (Hayward, CA) ?
[0054]抗體/四聚物
[0055]將可識別以下靶標的單克隆抗體用于流式細胞術分析:⑶16/⑶32(Fc Block)、CD3(145-2C11)、 CD4(RM4-5)、 CD8(53_6.7)、 IFN-y (XMG1.2)、 TNF-α (ΜΡ6-ΧΤ22)、CD19 (1D3)、B220 (RA3-6B2)、NKl.1 (ΡΚ136)、KLRG-1、CD44(IM7)、CD62L (MEL-14)、CD107a(lD4B)、H-2Kb(AF688.5)和 1-Ab (25-9-17)(購自 BD Biosciences,Mississauga, ON, Canada)和 Foxp3(FJK_16s)(eBioscience, San Diego, CA, USA)。
[0056]抗原特異性T細胞應答的檢測
[0057]在37°C下用肽(I μ g/ml)再次刺激由不同組織制備的單細胞懸液5小時，并在最后4小時的孵育期間加入布雷菲德菌素A (Golgi Plug, I μ g/ml; BD Biosciences)。用Feblock處理細胞并針對表面表達的⑶3和⑶8進行染色。隨后將細胞固定、透化(Cytofix/Cytoperm, BD Biosciences)并針對胞內(nèi) IFN-Y 和 TNF-α 進行染色。使用 FACSCanto 用FACSDiva 軟件(BD Biosciences)獲取數(shù)據(jù)并用 FlowJo 軟件(Tree Star, Ashland, OR)分析。
[0058]T細胞功能親和力測定
[0059]將脾細胞暴露于SVY肽的稀釋系列中，以提供越來越低的濃度。在該刺激過程中用Golgi plug處理細胞，并通過流式細胞術進行評估，以通過如上的胞內(nèi)染色測量IFN Y。
[0060]DCT特異性抗體的定量[0061]將經(jīng)工程改造用來表達DCT的U20S細胞涂布在多孔板內(nèi)并使其生長至匯集。然后將細胞固定并透化。將來自接受處理的小鼠的血清連續(xù)稀釋，并用于探測這些固定的單層。孵育后沖洗掉未結(jié)合的抗體并用具有熒光標簽的抗小鼠二抗檢測結(jié)合的DCT特異性抗體。檢測熒光信號來測量存在于血清中的抗DCT抗體的滴度。
[0062]統(tǒng)計分析
[0063]使用Windows 下的 GraphPad Prism(GraphPad Software, San Diego, CA, USA)繪圖。對于統(tǒng)計分析，使用了 GraphPad Prism 和 Minitab Statistical Software (MinitabInc.，State College, PA, USA)。如有需要,通過log轉(zhuǎn)化對數(shù)據(jù)進行標準化。使用了學生氏雙尾t檢驗、單因素或雙因素ANOVA或一般線性模型來查詢免疫應答數(shù)據(jù)。在P < 0.05時認為均值間的差異顯著。顯示了均值加標準誤棒。使用Kaplan-Meier法和時序檢驗分析了存活數(shù)據(jù)。
[0064]結(jié)果
[0065]MS-275聯(lián)合溶瘤加強劑疫苗顯著改善了治療結(jié)果
[0066]為了確定MS-275與如W02010/105347A1中描述的激發(fā)-加強方案的潛在的協(xié)同效應，將侵襲性腦黑色素瘤模型與確定的黑色素瘤相關抗原——多巴色素異構(gòu)酶(DCT) —起使用，其中DCT由黑色素瘤細胞系B16-F10和正常黑色素細胞(Bridle JI/MT)表達。顱內(nèi)接種B16-F10細胞后I天或5天，用表達人DCT的重組人5型腺病毒載體(rHuAd5_hDCT)和表達相同抗原的溶瘤重組VSV(rVSV-hDCT)以14天的間隔期相繼處理小鼠。為了增加溶瘤作用，在用rVSV加強的情況下給予MS-275。這也與rVSV的持久性和加強的CTL應答的峰值相符。圖1a和圖1b中的數(shù)據(jù)表明，未接受處理的動物的平均存活期為15天，這證實該模型的侵襲性具 有小的治療窗。在I天和5天治療模型中，單獨用rHuAd5-hDCT疫苗接種將動物存活期分別延長到了 28和25天的中值。隨后遞送溶瘤疫苗——rVSV-hDCT顯著提高了動物存活期(圖la)。盡管改善了存活率，然而，用激發(fā)加強方案處理的多數(shù)動物最終都死于腫瘤發(fā)展，尤其是在荷5天大的腫瘤的小鼠內(nèi)(圖1b)，這與以前的觀察結(jié)果一致。在遞送rVSV-hDCT時，同時用MS-275治療顯著提高了聯(lián)合治療的功效，且在治療啟動時，分別治愈了 85%(n=13)和64%(n=ll)的荷I天大或5天大的腫瘤的小鼠。MS-275單獨對該癌癥模型中的功效沒有影響，盡管其在體外可抑制B16-F10細胞生長。
[0067]在MS-275存在時NK細胞和二次腫瘤特異性CTL和抗體應答的幅度得到保持
[0068]該模型中，激發(fā)加強疫苗接種的功效與腫瘤特異性CD8+T細胞應答的幅度直接相關。考慮到還沒有研究過溶瘤病毒治療期間HDAC抑制對免疫應答的影響，需要確定該重要的治療組分是否被提高，導致功效的顯著提高。基于先前的觀察結(jié)果(其中由rVSV誘導的二次T細胞應答在第5天時達到其峰值并在12天后下降)，在rVSV加強劑疫苗接種后的第5天和第12天，對循環(huán)中的DCT特異的、產(chǎn)生IFN-Y的⑶8+T細胞進行了定量。DCT特異性⑶8+T細胞應答的量沒有受到MS-275的影響(圖2a)。平行地，使用細胞內(nèi)Western印跡分析測量了血漿中的DCT特異性IgG抗體(圖2b)。這些結(jié)果揭示出治療的一個以前不受重視的方面；即，腫瘤特異性抗體，像T細胞，被顯著增加。與T細胞類似，二次抗體應答不受MS-275影響。還發(fā)現(xiàn)采用rVSV的加強劑疫苗接種增加了能產(chǎn)生IFN-Y并經(jīng)歷脫粒(基于⑶107a表達)的循環(huán)NK細胞的數(shù)目，但MS-275對此沒有影響(圖2c)。總之，這些發(fā)現(xiàn)表明MS-275的改善的治療效果并不歸因于更高幅度的效應物應答的誘導。[0069]MS-275增加的功效與改善的CTL品質(zhì)相關
[0070]與單獨的rHuAd5/rVSV相比，加入MS-275增加了共表達TNF- α的CD8+T細胞的頻數(shù)(圖2d)及其TNF-α產(chǎn)生(圖2e)和IFN-Y產(chǎn)生(圖2f)的強度。這表明MS-275可以改善活化的CD8+T細胞的品質(zhì)。較好品質(zhì)的T細胞通常與和MHC肽復合物的較高親和力同種相互作用相關(ref)。因此，測定了來自用MS-275處理或沒用MS-275處理的小鼠的T細胞的功能親和力。為了獲得用于該分析的足夠多的細胞，使用了脾細胞。將這些細胞暴露于來自DCT的免疫優(yōu)勢肽的連續(xù)稀釋液中(DCT18ch188 ;濃度范圍:1 μ g/ml至10pg/ml)。令人關注的是，當小鼠接受HDACi處理時，5.6倍多的CD8+T細胞可以對最低濃度的肽作出應答(圖2g)。
[0071]在VSV加強劑疫苗接種期間MS-275導致淋巴球減少癥
[0072]令人吃驚的是，盡管腫瘤特異性CTL和活化NK細胞的數(shù)目沒有受到MS-275處理的影響，然而在接受處理的小鼠體內(nèi)觀察到了短暫但嚴重的淋巴球減少癥(圖3a)。確實，更加密切的檢查表明，MS-275引起了循環(huán)中的初始⑶8+T細胞(⑶8*⑶44TD62L+KLRG-D的大量減少(圖3b)，且靜息NK細胞(⑶107a_IFN- Y _)在用MS-275處理期間被大幅減少(圖3c)。此外，在相同的時間點觀察到總⑶4+T細胞減少77%(圖3d)。這些受影響的細胞群在加強的CTL應答的峰值一周后開始恢復，這可能是由于MS-275處理和VSV清除的停止。最引人注意的是，97%的B細胞被清除且它們的恢復比其他細胞群要慢得多(圖3e)。該淋巴球減少效應不依賴于腫瘤的存在(數(shù)據(jù)沒有顯示)，其也不為品系特異性的(圖6)，這表明其為普遍現(xiàn)象。這些結(jié)果揭示出MS-275的新的特性，其允許⑶8+T細胞和抗體的二次擴增，而同時也會清除其他的淋巴細胞群，包括初始T細胞、B細胞和NK細胞。該淋巴球減少環(huán)境不僅可以為促進效應細胞的擴增和功能提供更多的實體空間和生長因子，還可以調(diào)節(jié)針對VSV的免疫應答的結(jié)果及其溶瘤效應。
[0073]用HDACi即C1-994獲得了類似的結(jié)果。
[0074]圖7闡述了 30天的時間內(nèi)在小鼠的外周血中測量的總淋巴細胞計數(shù)。在處理后30天的時間內(nèi)測定了每微升血液中的細胞數(shù)目。病毒單獨誘導了非常短暫的淋巴球減少癥，其通過共給予HDACi藥物(MS-275)可顯著延長，而單獨的藥物具有適度的效應。重要的是，這里缺少HDAC抑制特性的藥物類似物沒有效果，這表明需要HDAC抑制。這些效應延伸到⑶4+和⑶8+T細胞以及B細胞。
[0075]MS-275損害初次免疫應答的能力促使需要確定其是否可以減弱針對rVSV加強載體的免疫應答。為了評估這一點，在rVSV接種后第7天測量了 CD8+T細胞針對來自rVSV的N蛋白的Kb限制性免疫優(yōu)勢表位的應答。如圖4a中所顯示，盡管DCT特異性CTL的數(shù)目沒有受到MS-275處理的影響，但是rVSV反應性CTLs被顯著減少，這表明MS-275有區(qū)別地影響記憶⑶8+T細胞和初始⑶8+T細胞的擴增。
[0076]總之，這些結(jié)果表明了將MS-275與基于溶瘤病毒的加強劑疫苗聯(lián)合的極大好處，其導致針對腫瘤的集中的免疫應答，同時延遲針對溶瘤病毒的應答，這允許延長的病毒溶瘤作用。
[0077]能誘導i型干擾素表達的藥劑誘導的淋巴球減少癥可被MS-275共給予延長
[0078]通過腹腔內(nèi)注射，用單一劑量的聚1:C(200yg溶于100 μ I的磷酸鹽緩沖鹽水，Sigma)處理雌性小鼠(8-10周齡C57BL/6)，并用0.1mg的MS-275每天處理一次，處理5天，作為聚1:C聯(lián)合MS-275處理組。聚1:C為I型干擾素表達的經(jīng)典誘導物。僅用單一劑量的聚1:C處理的小鼠被稱為聚1:C處理組，而用5種劑量的MS-275處理5天的小鼠表示僅用藥物的處理組。從眶周竇采集血液，并用ACK裂解緩沖液裂解血紅細胞。在聚1:C注射后2h、6h、24h、48h、72h和120h時評估外周血淋巴細胞計數(shù)(N=3)，如圖8中所示。通過FACSCanto流式細胞分析儀用FACSDiva5.0.2軟件(BD Pharmingen)收集數(shù)據(jù)，并用FlowJoMac (Treestar, Ashland, OR)進行分析。在沒有病毒時，聚1: C產(chǎn)生了相同的可被藥物延長的淋巴球減少癥。因此，藥物在存在干擾素誘導物的情況下誘導這些效應。
[0079]MS-275降低Tregs、尤其是可表達高水平Foxp3的Tregs,并上調(diào)腫瘤細胞上的MHC表達
[0080]模型內(nèi)由MS-275誘導的淋巴球減少癥，尤其是總CD4+T細胞的減少導致需要評估其對CD4+Foxp3+Tregs的直接影響。圖5a中的數(shù)據(jù)表明在加強劑免疫期間Tregs的數(shù)目顯著減少(減少75%)，盡管其看起來比其他細胞群恢復更快(圖3a-e)。這導致DCT特異性CD8+與Treg細胞的比值增加3倍多(圖5b)。顯然，接受MS-275處理的小鼠體內(nèi)Tregs表達Foxp3的強度顯著偏低(圖5c)，表明藥物可以選擇性地去除具有較強抑制功能的高表達Foxp3的Tregs?？傊?這些數(shù)據(jù)證明了 MS-275可以直接下調(diào)Treg活性,至少在溶瘤加強劑疫苗的情況中如此，這允許大量的二次CD8+T細胞應答在嚴格調(diào)控較少的環(huán)境中發(fā)揮功倉泛。
[0081]MS-275預防疫苗誘導的自身免疫性白癜風
[0082]這里利用的溶瘤疫苗載體可引起非常有效的針對正常黑色素細胞內(nèi)表達的自身抗原的免疫應答，在用rHuAd5-hDCT和rVSV-hDCT處理的那些小鼠體內(nèi)引起嚴重的自身免疫性白癜風(圖6，來自4個試驗的每組中的多只小鼠的代表)?？紤]到MS-275共給予顯著減少了那些小鼠體內(nèi)的Treg頻數(shù)，可能會預測到，藥物會加劇該自身免疫病理現(xiàn)象。值得注意的是，通過用MS-275 同時處理幾乎完全消除了由激發(fā)加強疫苗接種誘導的系統(tǒng)性白癜風，這與其對抗腫瘤功效的增強形成鮮明對比。這表明藥理學藥物可以在針對自身腫瘤抗原的疫苗接種治療期間實現(xiàn)不需要的自身免疫性后遺癥與抗腫瘤免疫力的分離。
[0083]VSV和MS-275的共給予耗盡了骨髓和胸腺內(nèi)未成熟的淋巴細胞前體
[0084]用VSV的單一尾靜脈注射(1.V.)劑量(2x109PFU VSV溶于200 μ I的磷酸鹽緩沖鹽水)感染小鼠，并用腹腔內(nèi)注射0.1mg的MS-275，每天注射I次，注射3天來治療，作為VSV聯(lián)合MS-275處理組。僅用單一劑量的VSV感染的小鼠被稱為VSV處理組，而用3種劑量的MS-275或MS-275類似物(如圖9中所示)處理3天的小鼠分別為僅用藥物處理組或僅用類似物處理組，初始小鼠沒有接受病毒或藥物處理。VSV注射后3天收集來自胸腺或骨髓(股骨和脛骨)的淋巴細胞(Ν=3)。隨后用抗⑶16/32和通過⑶4/⑶8或B220/IgM的抗體熒光標記的表面標志物(BD Pharmingen)處理細胞。胸腺(未成熟的T細胞)和骨髓(未成熟的B細胞)中的淋巴細胞前體都被聯(lián)合治療耗盡。因此，延長的淋巴球減少癥部分是由于可替換外周血中耗盡的淋巴細胞的前體的減少。
[0085]討論
[0086]當結(jié)合溶瘤疫苗療法使用時，MS-275(1型HDAC的苯甲酰胺抑制劑)不僅增加了病毒復制和腫瘤內(nèi)的MHC表達，還對免疫系統(tǒng)的獲得性能力具有極大的影響。該聯(lián)合療法引起選擇性的淋巴球減少癥，其損害針對溶瘤病毒的細胞和體液免疫應答，同時顯著減少Tregs，從而產(chǎn)生針對腫瘤的集中的和脫阻遏的免疫應答。通過去除不需要的免疫細胞和維持有益的免疫細胞，該組合提供了兩者之優(yōu)點，其中免疫系統(tǒng)響應治療性病毒的能力受損，但是會繼續(xù)攻擊腫瘤，從而極大地加強了治療，在非常具有挑戰(zhàn)性的癌癥模型中產(chǎn)生60-80%的持久治愈率。這首次表明抗黑色素瘤功效得到極大增強，而白癜風得到同時且同等的顯著減少。
[0087]總之，將溶瘤疫苗療法與HDACi聯(lián)合，以損害先天免疫力并介導抗病毒獲得性免疫力和抗腫瘤獲得性免疫力的顯著改變。通過延遲抗病毒應答同時將免疫應答集中到腫瘤上，病毒溶瘤作用得到延長、抗腫瘤功效得到增強且自身免疫后遺癥得到減少。
[0088]本文中參考的所有文獻都通過弓丨用并入。
【權利要求】
1.一種疫苗接種方法，包括給予哺乳動物組蛋白去乙?；敢种苿┖湍苓f送抗原的疫苗，所述哺乳動物對所述抗原具有預存免疫力。
2.如權利要求1所述的方法，其中所述抗原選自:腫瘤抗原、來自病毒性病原體的抗原和來自細菌性病原體的抗原。
3.如權利要求2所述的方法，其中所述腫瘤抗原選自:甲胎蛋白(AFP)、癌胚抗原(CEA)、CA 125、Her2、多巴色素異構(gòu)酶(DCT)、GP100、MARTU MAGE 蛋白、NY-ESOl、HPV E6 和HPV E7。
4.如權利要求1所述的方法，其中所述抗原來自選自以下的病原生物體:HIV、HepC,FIV、LCMV、伊波拉病毒和結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)。
5.如權利要求1所述的方法，其中所述組蛋白去乙?；敢种苿┻x自:異羥肟酸、苯酰胺類、環(huán)四肽類、縮肽類、親電酮類和脂肪酸類化合物。
6.如權利要求5所述的方法，其中所述異羥肟酸選自:伏立諾他(SAHA)、貝林司他(PXDlOl)、LAQ824，曲古抑菌素A和帕比司他(LBH589);所述苯甲酰胺類選自:恩替諾特(MS-275)、CI994和莫西司他(MGCD0103);所述環(huán)四肽類為trapoxin B ;且所述脂肪酸類化合物可以為苯基丁酸或丙戊酸。
7.如權利要求1所述的方法，其中所述疫苗為表達抗原的病毒疫苗。
8.如權利要求1所述的方法，其中所述病毒疫苗為溶瘤病毒。
9.如權利要求8所 述的方法，其中所述溶瘤病毒選自:棒狀病毒、麻疹病毒、牛痘病毒、皰疫病毒、粘液瘤病毒、細小病毒、新城疫病毒、腺病毒和塞姆利基森林病毒。
10.如權利要求8所述的方法，其中所述溶瘤病毒為選自以下的水皰病毒:水皰性口炎病毒(VSV)、馬拉巴病毒、暫時熱病毒、質(zhì)型彈狀病毒、核型彈狀病毒和狂犬病毒。
11.如權利要求1所述的方法，其中所述疫苗可誘導I型干擾素的表達。
12.如權利要求1所述的方法，其中所述疫苗為抗原呈遞B細胞。
13.如權利要求1所述的方法，其中所述疫苗與可誘導I型干擾素的表達的藥劑聯(lián)合給予。
14.一種組合物，其包含疫苗和組蛋白去乙酰化酶抑制劑。
15.如權利要求14所述的組合物，其中所述疫苗為病毒疫苗。
16.如權利要求14所述的組合物，其中所述疫苗可誘導I型干擾素。
17.如權利要求14所述的組合物，其中所述組蛋白去乙?；敢种苿┻x自:異羥肟酸、苯甲酰胺類、環(huán)四肽類、縮肽類、親電酮類和脂肪酸類化合物。
18.如權利要求17所述的組合物，其中所述異羥肟酸選自:伏立諾他(SAHA)、貝林司他(PXDlOl)、LAQ824，曲古抑菌素A和帕比司他(LBH589);所述苯甲酰胺類選自:恩替諾特(MS-275)、CI994和莫西司他(MGCD0103);所述環(huán)四肽類為trapoxin B ;且所述脂肪酸類化合物可以為苯基丁酸或丙戊酸。
19.如權利要求14所述的組合物，其還包含可誘導I型干擾素的表達的藥劑。
20.如權利要求19所述的組合物，其中所述藥劑選自:toll樣受體配體、咪喹莫特、聚肌苷-聚胞嘧啶核苷酸(聚1:C)、CpG 0DN、咪唑喹啉、單磷酰脂A、鞭毛蛋白、FimH和N-乙二醇化的胞壁酰二肽。
【文檔編號】A61K35/76GK103619350SQ201280020513
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2012年3月9日 優(yōu)先權日:2011年3月11日
【發(fā)明者】布萊厄姆·布利多, 布萊恩·利克蒂, 萬永紅, 簡-西蒙·蒂厄羅, 昌塔爾·勒梅, 約翰·貝爾 申請人:麥克馬斯特大學, 渥太華醫(yī)院研究所