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      作為組蛋白去乙酰化酶抑制劑的吡啶和嘧啶衍生物的制作方法

      文檔序號:3538911閱讀:423來源:國知局
      專利名稱:作為組蛋白去乙?;敢种苿┑倪拎ず袜奏ぱ苌锏闹谱鞣椒?br> 技術領域
      本發(fā)明涉及式(I)化合物
      其N-氧化物形式、藥學可接受的加成鹽和立體化學異構體形式,其中 X為N或CH; R1為羥基或式(a-1)的基團
      其中 R4為羥基或氨基; R5為氫、噻吩基、呋喃基或苯基并且各噻吩基、呋喃基或苯基可任選被一個或兩個以下基團取代鹵素、氨基、硝基、氰基、羥基、苯基、C1-6烷基、(二C1-6烷基)氨基、C1-6烷氧基、苯基C1-6烷氧基、羥基C1-6烷基、C1-6烷氧基羰基、羥基羰基、C1-6烷基羰基、多鹵代C1-6烷氧基、多鹵代C1-6烷基、C1-6烷基磺酰基、羥基羰基C1-6烷基、C1-6烷基羰基氨基、氨基磺?;?、氨基磺?;鵆1-6烷基、異噁唑基、氨基羰基,苯基C2-6烯基、苯基C3-6炔基或吡啶基C3-6炔基; R6、R7和R8各自獨立為氫、氨基、硝基、呋喃基、鹵素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、三氟甲基、噻吩基、苯基、C1-6烷基羰基氨基、氨基羰基C1-6烷基或-C≡C-CH2-R9; 其中R9為氫、C1-6烷基、羥基、氨基或C1-6烷氧基; R2為氨基、C1-6烷基氨基、芳基C1-6烷基氨基、C1-6烷基羰基氨基、C1-6烷基磺?;被3-7環(huán)烷基氨基、C3-7環(huán)烷基C1-6烷基氨基、戊二酰亞胺基、馬來酰亞胺基、酞酰亞胺基、琥珀酰亞胺基、羥基、C1-6烷氧基、苯氧基,其中所述苯氧基的苯基部分可任選被一個或兩個取代基取代,取代基各自獨立選自鹵素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、氰基、C1-6烷氧基羰基和三氟甲基; R3為苯基、萘基或雜環(huán)基;其中 各所述苯基或萘基可任選被一個或兩個取代基取代,取代基各自獨立選自鹵素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、多鹵代C1-6烷基、芳基、羥基、氰基、氨基、C1-6烷基羰基氨基、C1-6烷基磺酰基氨基、羥基羰基、C1-6烷氧基羰基、羥基C1-6烷基、C1-6烷氧基甲基、氨基甲基、C1-6烷基氨基甲基、C1-6烷基羰基氨基甲基、C1-6烷基磺?;被谆?、氨基磺?;?、C1-6烷基氨基磺?;碗s環(huán)基; 芳基為苯基或萘基;其中各所述苯基或萘基可任選被一個或兩個取代基取代,取代基各自獨立選自鹵素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、三氟甲基、氰基和羥基羰基;及 雜環(huán)基為呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡咯啉基、吡咯烷基、二氧雜環(huán)戊烯基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、咪唑啉基、咪唑烷基、吡唑基、吡唑啉基、吡唑烷基、異噁唑基、異噻唑基、噁二唑基、三唑基、噻二唑基、吡喃基、吡啶基、哌啶基、二噁烷基、嗎啉基、二噻烷基、硫代嗎啉基、噠嗪基、嘧啶基、吡嗪基、哌嗪基、三嗪基、三噻烷基、吲嗪基、吲哚基、吲哚滿基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、嘌呤基、喹嗪基、喹啉基、噌啉基、酞嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基或萘啶基;其中 各所述雜環(huán)基可被一個或兩個取代基取代,取代基各自獨立選自鹵素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、氰基、氨基和單或雙(C1-4烷基)氨基。
      術語“組蛋白去乙酰化酶抑制劑”或“組蛋白去乙?;傅囊种苿庇糜谥缚膳c組蛋白去乙?;缸饔貌⒁种破浠钚裕绕涫瞧涿富钚缘幕衔?。抑制組蛋白去乙?;富钚砸庵附档徒M蛋白去乙酰化酶的活性以脫除組蛋白的乙?;?。該類抑制優(yōu)選特異性抑制,即該組蛋白去乙?;缚稍诘陀诋a(chǎn)生其它一些不相關生物效應所需要的濃度下降低組蛋白乙?;傅幕钚砸悦摮M蛋白的乙?;?。
      在之前的定義和下文中,鹵素泛指氟、氯、溴和碘;C1-2烷基直鏈飽和烴基團含有1個或2個碳原子,例如甲基或乙基;C1-6烷基定義了C1-2烷基和含有3至6個碳原子的直鏈和支鏈飽和烴基團,例如丙基、丁基、1-甲基乙基、2-甲基丙基、戊基、2-甲基-丁基、己基、2-甲基戊基和類似基團;多鹵代C1-6烷基定義了含有三個相同或不同鹵素取代基的C1-6烷基,例如三氟甲基;C2-6烯基定義了含有一個雙鍵和含有2-6個碳原子的直鏈或支鏈烴,例如乙烯基、2-丙烯基、3-丁烯基、2-戊烯基、3-戊烯基、3-甲基-2-丁烯基及類似基團;C3-6炔基定義了含有一個三鍵和含有3至6個碳原子的直鏈或直鏈烴,例如2-丙炔基、3-丁炔基、2-丁炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、3-己炔基及類似基團;C3-7環(huán)烷基包括含有3至7個碳的環(huán)烴基,例如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)戊烯基、環(huán)己基環(huán)、己烯基、環(huán)庚基及類似基團。
      藥學可接受加成鹽包括藥學可接受酸加成鹽和藥學可接受堿加成鹽。下文所述藥學可接受酸加成鹽意指包括具有治療活性的無毒酸加成鹽形式,其可由式I化合物形成。具有堿性的式I化合物可經(jīng)適當?shù)乃崽幚砗筠D化為其藥學可接受酸加成鹽。適當?shù)乃岚?,例如,無機酸例如氫鹵酸,如鹽酸或氫溴酸;硫酸;硝酸;磷酸及類似的酸;或有機酸,例如醋酸、三氟乙酸、丙酸、羥基乙酸、乳酸、丙酮酸、草酸、丙二酸、琥珀酸(即丁二酸)、馬來酸、富馬酸、蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、對-甲苯磺酸、環(huán)拉酸、水楊酸、對-氨基-水楊酸、撲酸及類似酸。
      具有酸性的式I化合物可經(jīng)適當?shù)挠袡C或無機堿處理轉換成其藥學可接受堿加成鹽。適當?shù)膲A性鹽形式包括,例如銨鹽、堿或堿土金屬鹽,如鋰、鈉、鉀、鎂、鈣鹽及類似鹽;與有機堿形成的鹽,例如芐星、N-甲基-D-葡萄糖胺、海巴胺鹽,及與氨基酸形成的鹽,例如精氨酸、賴氨酸及類似氨基酸鹽。
      術語“酸或堿加成鹽”也包括式I化合物可形成的水合物和溶劑加成形式。該形式例如水合物、醇化物及類似形式。
      本文使用的術語“式I化合物立體化學異構形式”用于定義由相同鍵序列連接的相同原子組成但是具有式I化合物可能具有的不同三維結構的可能的化合物,它們之間不可相互轉變。除非另外提及或指明,一種化合物的化學命名包括所述化合物可能具有的所有可能的立體化學異構形式的混合物。該混合物可包括所述化合物基本分子結構的所有非對映體和/或對映體。式I化合物的所有立體化學異構形式的純物形式或相互形成的混合物均屬于本發(fā)明范疇。
      式I化合物的N-氧化物形式意指一個或更多個氮原子氧化至所謂的N-氧化物的式I化合物,尤其是一個或更多個哌啶-、哌嗪或噠嗪氮被N-氧化的N-氧化物。
      一些式I化合物也可以其互變異構形式存在。雖然上式中并未明確指明這些形式,但是它們也屬于本發(fā)明的范疇。
      下文中使用的術語“式I化合物”意指包括藥學可接受的加成鹽和所有的立體異構形式。
      如本文所使用的術語“組蛋白去乙?;浮焙汀癏DAC”意指可從組蛋白N-端的賴氨酸殘基上脫除乙?;鶊F的酶家族的任何一個成員。除非文中另外指明,術語“組蛋白”意指來自于任何物種的任何組蛋白蛋白質(zhì),包括H1、H2A、H2B、H3、H4和H5。人HDAC蛋白質(zhì)或基因產(chǎn)物包括但不限于HDAC-1、HDAC-2、HDAC-3、HDAC-4、HDAC-5、HDAC-6、HDAC-7、HDAC-8、HDAC-9、HDAC-10和HDAC-11。該組蛋白去乙?;敢部蓙碜杂谠鷦游锘蛘婢?br> 第一組感興趣的化合物由這樣的式I化合物組成,其中R1為羥基。
      第二組感興趣的化合物由這樣的式I化合物組成,其中R5為氫以外的基團。
      第三組感興趣的化合物由這樣的式I化合物組成,其中適用一條或更多條以下限制 a)X為N; b)R1為羥基或式(a-1)的基團,其中R4為氨基,R5為氫或噻吩基,且R6、R7和R8各為氫。
      c)R2為氨基、C1-6烷基羰基氨基、C1-6烷基磺酰基氨基、酞酰亞胺基、琥珀酰亞胺基或苯氧基,其中所述苯氧基的苯基部分可任選被鹵素取代基取代(例如氟);及 d)R3為被一個或兩個取代基任選取代的苯基,取代基各自獨立選自鹵素、C1-6烷基、C1-6烷氧基和多鹵代C1-6烷基。
      第四組感興趣的化合物由這樣的式I化合物組成,其中適用一條或更多條以下限制 a)X為N; b)R1為羥基 c)R2為氨基、C1-6烷基羰基氨基、C1-6烷基磺?;被?、酞酰亞胺基、琥珀酰亞胺基或苯氧基,其中所述苯氧基的苯基部分可任選被鹵素取代基取代(例如氟);及 d)R3為被一個或兩個取代基任選取代的苯基,取代基各自獨立選自鹵素、C1-6烷基、C1-6烷氧基和多鹵代C1-6烷基。
      另一組感興趣的化合物由這樣的式I化合物組成,其中R3為苯基或萘基,其中各所述苯基或萘基被一個或兩個各自獨立選自以下基團的取代基取代鹵素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、多鹵代C1-6烷基、芳基、羥基、氰基、氨基、C1-6烷基羰基氨基、C1-6烷基磺酰基氨基、羥基羰基、C1-6烷氧基羰基、羥基C1-6烷基、C1-6烷氧基甲基、氨甲基、C1-6烷基氨基甲基、C1-6烷基羰基氨基甲基、C1-6烷基磺?;被谆被酋;1-6烷基氨基磺?;碗s環(huán)基。
      一組優(yōu)選的感興趣的化合物由這樣的式I化合物組成,其中適用一條或更多條以下限制 a)X為N; b)R1為羥基 c)R2為氨基;及 d)R3為被選自鹵素(優(yōu)選氟)和C1-6烷氧基(優(yōu)選甲氧基)的取代基任選取代的苯基。
      尤其優(yōu)選的式I化合物為以下所指的化合物2
      可由傳統(tǒng)方法制備式I化合物、它們的藥學可接受鹽和N-氧化物及其立體化學異構形式。起始物質(zhì)和一些中間體為已知化合物并可購買獲得或根據(jù)本領域眾所周知或專利申請EP1485099、EP1485348、EP1485353、EP1485354、EP1485364、EP1485365、EP1485370和EP1485378中描述的常規(guī)反應程序制備。下文更詳細地描述了一些制備方法。實施例中描述了其它獲得最終式I化合物的方法。
      以下描述了制備式I化合物的具體程序 a)本文中式I化合物的氧肟酸(其中R1為羥基)指式(I-a)化合物,可通過將式(II)的一個中間體與一種適當?shù)乃岱磻苽?,例如三氟乙酸。所述反應在適當?shù)娜軇├缂状蓟蚨燃淄橹羞M行。

      b)本文中式(I)化合物(其中R1為式(a-1)的基團)指式(I-b)化合物,可通過將式III的一個中間體(其中M代表氫或一種堿金屬,例如鈉或鋰)與式IV的一個中間體在適當試劑(例如苯并三唑-1-基氧基三(吡咯烷-1-基)磷鎓六氟磷酸鹽(PyBOP))存在下反應制備。該反應可在一種堿(例如三乙胺)存在下,在適當?shù)娜軇?例如二氯甲烷和四氫呋喃的混合物)中進行。

      式II中間體可通過將式III的一個中間體與式(V)的一個中間體在適當試劑(例如N′-(乙基亞氨代甲酰基(ethylcarbonimidoyl))-N,N-二甲基-1,3-丙二胺,一鹽酸鹽(EDC)和1-羥基-1H-苯并三唑(HOBT))存在下反應制備。該反應可在堿(例如三乙胺)存在下,在適當?shù)娜軇?例如二氯甲烷和四氫呋喃的混合物)中進行。

      式I化合物也通過本領域已知的反應或官能團轉化相互轉變,取決于分子中其它基團的敏感性,例如將羧酸酯水解成相應的羧酸或醇;醇可轉化成酯或醚;伯胺可轉化成仲或叔胺;伯或仲胺可轉化成酰胺或磺胺類;苯基上的碘代基團可通過適當鈀催化劑存在下的一氧化碳插入轉化成酯。
      式(III)中間體可通過將式(VI)的一個中間體與適當?shù)乃崛芤?例如鹽酸)或適當?shù)膲A(例如堿金屬堿,如氫氧化鈉)在適當?shù)娜軇┲?例如醇如乙醇或丙醇或THF)反應制備。

      本文的式II中間體(其中R2為氨基)指式(II-a)中間體,可通過將式(VII)中間體與哌啶在適當?shù)娜軇├缍燃淄橹蟹磻苽洹?br>
      式(VII)中間體可通過將式(VIII)中間體與式(V)中間體在適當試劑(例如N′-(乙基亞氨代甲酰基)-N,N-二甲基-1,3-丙二胺,一鹽酸鹽(EDC)和1-羥基-1H-苯并三唑(HOBT))存在下反應制備。該反應可在堿(例如三乙胺)存在下,在適當?shù)娜軇?例如二氯甲烷和四氫呋喃的混合物)中進行。

      式(VIII)中間體可通過將式(VI-b)中間體與氫氧化鈉在適當?shù)娜軇├缢臍溥秽蟹磻?,然后用鹽酸中和,加入碳酸鈉并加入式IX的中間體制備。

      式(VI)中間體(其中R2為C1-6烷基羰基氨基)可通過將式(VI-b)中間體與適當?shù)腃1-6烷基烷化劑(例如鹵化物,如氯化物)在堿的存在下(例如三乙胺)在適當?shù)娜軇┲?例如二氯甲烷)中反應生成。
      式VI的新型中間體可由式X的中間體與偶氮二甲酸二異丙酯(DIAD),三-n-丁基膦(PBu3)和適當?shù)挠H核劑R2H(XI)在適當?shù)娜軇├缍燃淄橹蟹磻伞?br>
      式VI化合物(其中R2任選被苯氧基取代)可通過將式(X)中間體與相應的被任選取代的苯酚化合物反應制備。式(VI)化合物(其中R2為酞酰亞胺基)也可通過將式(X)中間體與酞酰亞胺反應制備?;蛘?,式(VI)化合物(其中R2為琥珀酰亞胺基)可通過將式(X)中間體與琥珀酰亞胺反應制備。
      以上式(VI-b)中間體可通過(a)將式(X)中間體與偶氮二甲酸二異丙酯(DIAD),三-n-丁基膦(PBu3)和酞酰亞胺在適當?shù)娜軇├缍燃淄橹蟹磻纬墒?VI-c)中間體;(b)將所得式(VI-c)中間體與肼一水化物在適當?shù)娜軇├缫掖贾蟹磻苽洹?br>
      或者,式(VI-c)中間體可通過將式(XII)中間體與由Synlett,2002(8)1265-1268描述的步驟制備的適當?shù)氖?XIII)環(huán)氧化物在適當?shù)娜軇├鏣HF中反應形成式(XIV)中間體,其可在與偶氮二甲酸二異丙酯(DIAD),三-n-丁基膦(PBu3)和酞酰亞胺在適當?shù)娜軇├缍燃淄橹蟹磻獣r轉化成式(VI-c)中間體。

      式(X)的新型中間體可通過將式(XII)中間體與1,4-二噁烷-2,5-二醇和適當?shù)氖?XV)硼酸(其中R3如上定義)在適當?shù)娜軇├绱贾蟹磻@一簡單步驟制備。

      式(XII)中間體可通過將式(XVI)(其中L3為離去基團,例如有機磺?;?,如甲烷磺?;?與哌嗪(XVII)在堿(例如碳酸鉀)存在下在適當?shù)娜軇├缫译嬷蟹磻苽洹?br>
      本發(fā)明也涉及以上式(II)、(III)、(VI)和(X)中間體,統(tǒng)稱為式(B)化合物,其中Q為C1-2烷氧基羰基、MO2C(其中M為氫或堿金屬)或四氫吡喃基氧基氨基羰基,R2a如對R2所定義或為羥甲基且X和R3如對式(I)所定義,及其N-氧化物形式、藥學可接受加成鹽形式和立體化學異構形式。

      根據(jù)對式(I)化合物所定義的各組,可對上述中間體的各組感興趣、優(yōu)選、更有選和最優(yōu)選的化合物做出定義。
      式(I)化合物和一些中間體的結構中可至少具有一個立體中心。該立體中心可為R或S構型。
      根據(jù)上述過程制備的式(I)化合物通常為對映異構體的消旋混合物,其可通過本領域已知的分離程序逐一制備。式I的消旋混合物可通過與適當?shù)氖中运岱磻D化為對應的非對映異構鹽形式。該非對映異構鹽可接著被分離,例如通過選擇結晶或分步結晶,且由堿釋放對應映構體。另一種分離式I化合物的對映異構形式的方法涉及用手性固定相的液相色譜法。這些純立體化學異構體也可由適當起始物質(zhì)的相應純立體化學異構形式得到,前提是該反應為立體特異性的。如果需要特異性立體異構體,優(yōu)選通過立體特異制備法合成該化合物。這些方法優(yōu)選使用對映純的起始物質(zhì)。
      式(I)化合物及其藥學可接受的酸加成鹽和立體異構形式具有重要的藥理學性質(zhì),因為他們具有組蛋白去乙?;?HDAC)抑制作用。
      本發(fā)明提供了通過給予有效量的本發(fā)明化合物抑制包括轉化細胞在內(nèi)的細胞非正常生長的方法。細胞非正常生長指不依賴于正常調(diào)節(jié)機制的細胞生長(例如失去接觸抑制)。這包括直接(引起癌細胞生長停滯、終末分化和/或凋亡)和間接(抑制腫瘤新生血管形成)抑制腫瘤生長。
      本發(fā)明也提供了通過給予受試者(例如需要進行該治療的哺乳動物(尤其是人類))有效量的本發(fā)明化合物抑制腫瘤生長的方法。本發(fā)明尤其提供了通過給予有效量的本發(fā)明化合物抑制腫瘤生長的方法??杀灰种频哪[瘤實例包括但不限于肺癌(例如腺癌瘤并包括非小細胞肺癌)、胰癌(例如胰臟癌,如外分泌胰臟癌)、結腸癌(例如結腸直腸癌,如結腸腺癌和結腸腺瘤)、前列腺癌包括晚期疾病、淋系血液腫瘤(例如急性淋巴細胞白血病、B-細胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤)、髓系白血病(例如,急性髓系白血病(AML))、甲狀腺濾泡狀癌、骨髓增生異常綜合癥(MDS)、源于間質(zhì)的腫瘤(例如纖維瘤和耳鼻咽喉部橫紋肌肉瘤)、黑色素瘤、畸胎瘤、神經(jīng)母細胞瘤。膠質(zhì)瘤、皮膚良性瘤(例如角化棘皮瘤)、乳腺癌(例如晚期乳腺癌)、腎惡性腫瘤、卵巢惡性腫瘤、膀胱惡性腫瘤和上皮惡性腫瘤。
      依據(jù)本發(fā)明的化合物也可用于其他治療目的,例如 a)通過在輻照腫瘤之前、過程中或之后給予依據(jù)本發(fā)明的化合物使腫瘤對放射療法敏感; b)治療關節(jié)病和骨病,例如風濕性關節(jié)炎、骨關節(jié)炎、幼年性關節(jié)炎、痛風、多發(fā)性關節(jié)炎、牛皮癬關節(jié)炎、強直性脊柱炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡; c)抑制平滑肌細胞增生包括血管增生紊亂、關節(jié)硬化和再狹窄; d)治療炎性疾病和皮膚病,例如潰瘍性結腸炎、克羅恩病、過敏性鼻炎、移植物抗宿主病、結膜炎、哮喘、ADRS、白塞病、移植排斥、蕁麻疹、過敏性皮炎、斑禿、硬皮病、疹、濕疹、皮膚肌炎、座瘡、糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、川崎氏病、多發(fā)性硬化、肺氣腫、囊性纖維化和慢性氣管炎; e)治療子宮內(nèi)膜異位、子宮纖維瘤、功能失調(diào)性子宮出血和子宮內(nèi)膜增生; f)治療眼部血管化包括影響視網(wǎng)膜和脈絡膜血管的血管??; g)治療心功能不全 h)抑制免疫抑制疾病例如治療HIV感染; i)治療腎功能不全 j)抑制內(nèi)分泌紊亂 k)抑制糖異生功能障礙 l)治療神經(jīng)疾病,例如帕金森并或可引起認知障礙的神經(jīng)疾病,例如阿爾茨海默氏病或多聚谷氨酰胺相關精神疾??; m)治療精神疾病,例如精神分裂、雙相情感障礙、抑郁、焦慮和精神異常; n)抑制神經(jīng)肌肉疾病,例如肌萎縮側索硬化 o)治療脊髓性肌萎縮病 p)治療順應基因潛在表達治療的疾病; q)增強基因治療 r)抑制脂肪形成 s)治療寄生蟲病例如瘧疾。
      因此,本發(fā)明公開了作為藥物使用的式(I)化合物以及使用這些式(I)化合物生產(chǎn)治療一種或更多種上述疾病的用途。
      式(I)化合物及其藥學可接受的酸加成鹽和立體化學異構形式具有重要的診斷學性質(zhì),因為它們可用于檢測或鑒定生物樣品中的HDAC,包括檢測或測定標記化合物和HDAC之間形成的復合物。
      檢測和鑒定方法可使用被標記試劑,例如放射同位素、酶、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)等標記的化合物。這些放射同位素的實例包括125I、131I、3H和14C。通過與適當?shù)牡孜锞Y合使酶可被檢測,其可接著催化可檢測的反應。其實例包括,例如β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、堿性磷酸酶、過氧化物酶和蘋果酸脫氫酶,優(yōu)選辣根過氧化物酶。發(fā)光物質(zhì)包括,例如魯米諾、魯米諾衍生物、熒光素、光蛋白和熒光素酶。
      生物樣品可定義為身體組織或體液。體液實例為腦脊液、血液、血漿、尿液、痰及類似體液。
      鑒于他們可用的藥理學性質(zhì)可將主題化合物配制成各種藥物形式用于給藥。
      為制備本發(fā)明藥物組合物,將有效量的某種化合物的酸或堿加成鹽形式作為活性成份與藥學可接受載體充分混合,載體可為各種形式,這取決于所需給予制劑的形式。這些藥物組合物需為適于給藥的單一劑型,優(yōu)選口服、直腸給藥或腸道外注射。例如,制備該組合物的口服劑型時,可使用任何常規(guī)藥物介質(zhì),例如在口服液體制劑如混懸液、糖漿中使用水、丙二醇、油、醇及類似介質(zhì);或者在粉末、丸劑和片劑中使用固體載體,例如淀粉、糖、高嶺土、潤滑劑、粘合劑、崩解劑及類似載體。
      由于給藥方便,片劑和膠囊代表了絕大多數(shù)有利的口服劑量單位形式,其中很明顯可使用固體藥物載體。對于腸道外組合物,其載體通常包括無菌水(至少占大部分),盡管也可包括輔助溶解的其他成份。在注射溶液的制備中,其載體包括生理鹽水溶液、葡萄糖溶液或生理鹽水和葡萄糖溶液的混合物。注射混懸液也可在應用適當液體載體、混懸劑及類似試劑的情況下制備。在適用于經(jīng)皮給藥的組合物中,載體可任選含有滲透增強劑和/或適當?shù)臐櫇駝扇芜x與適當?shù)木哂腥魏涡再|(zhì)的少量輔料混合,這些輔料不會對皮膚造成有害作用。所述輔料可增強經(jīng)皮給藥和/或有助于制備所需的組合物。這些組合物可以各種方式給藥,例如透皮貼劑,例如spot-on或軟膏劑。
      將上述藥物組合物配制成劑量單位形式對于便于給藥和劑量均一性是尤其有利的。本文的說明書和權利要求中使用的劑量單位形式指適用于單一劑量的與所需要的藥物載體混合的物理不連續(xù)單位,每一單位含有經(jīng)過計算以產(chǎn)生所需要的治療作用的預定量的活性成份。該類劑量單位形式的實例為片劑(包括刻痕片或包衣片)、膠囊、丸劑、粉末包、晶片、注射溶液或混懸劑、茶匙量、湯匙量及類似形式,及其分隔開的復合形式(segregated multiples)。
      本領域技術人員可很容易地從下文列出的實驗結果確定有效量。通常認為治療有效量為0.005mg至100mg/公斤體重,具體為0.005mg至10mg/公斤體重。在一天內(nèi)將所需劑量以兩次、三次、四次或更多次的分劑量給藥也是適當?shù)?。所述分劑量可配制成單位劑量形式,例如每單位劑量形式中含?.5至500mg,具體為10至500mg的活性成份。
      另一方面本發(fā)明設計了HDAC-抑制劑和另一種抗癌藥物的組合物,尤其用作藥物,更尤其用于癌癥或相關疾病的治療。
      對于以上疾病的治療,可有利地將本發(fā)明化合物與一種或更多種其他藥物,更具體而言,與其他抗癌藥物聯(lián)合使用??拱┧幬锏膶嵗? - 鉑配位化合物例如順鉑、卡鉑或奧沙利鉑; - 紫杉烷化合物例如紫杉醇或紫杉萜; - 拓撲異構酶I抑制劑,例如喜樹堿化合物,如依立替康或托泊替康; - 拓撲異構酶II抑制劑,例如抗腫瘤鬼臼毒素衍生物,如鬼臼乙叉甙或鬼臼噻吩甙; - 抗腫瘤長春花生物堿,例如長春堿、長春新堿或長春瑞濱; - 抗腫瘤核苷酸衍生物,例如5-氟尿嘧啶、吉西他濱或卡培他濱; - 烷化劑例如氮芥或亞硝基脲,例如環(huán)磷酰胺、氯氨布西、卡氮芥或羅莫司??; - 抗腫瘤蒽環(huán)類抗生素衍生物,例如柔紅霉素、阿霉素、伊達比星或米托蒽醌; - HER2抗體例如曲妥單抗; - 雌激素受體拮抗劑或選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑,例如三苯氧胺、托瑞米芬、氟維司群或雷洛昔芬; - 芳香酶抑制劑例如依西美坦、阿納托唑、來曲唑和伏氯唑; - 分化藥劑,例如類視黃醇、維生素D和維甲酸,代謝阻斷劑(RAMBA),例如異維甲酸; - DNA甲基轉移酶抑制劑例如氮胞苷; - 激酶抑制劑,例如黃芬寧、甲磺酸伊馬替尼或吉非替尼; - 法呢?;D移霉抑制劑; - 其它HDAC抑制劑; - 泛素-蛋白酶體途徑抑制劑,例如Velcade(萬珂);或 - Yondelis。
      本文使用的術語“鉑配位化合物”指任何可抑制腫瘤細胞生長的鉑配位化合物,其提供離子形式的鉑。
      術語“紫杉烷化合物”指具有紫杉烷環(huán)系統(tǒng)并衍生自某種紫杉樹提取物或與其相關的一類化合物。
      術語“拓撲異構酶抑制劑”用于指可改變真核細胞DNA拓撲結構的酶。它們對于重要的細胞功能和細胞增值是關鍵性的。真核細胞中有兩種拓撲異構酶,即I型和II型。拓撲異構酶I為約100000分子質(zhì)量的單體酶。該酶可與DNA結合并引起暫時的單鏈斷裂,將雙螺旋解旋(或允許其解旋)然后在脫離DNA鏈之前暴露斷裂部位。拓撲異構酶II具有類似的作用機制,其可誘導DNA鏈斷裂或形成自由基。
      術語“喜樹堿化合物”用于指衍生自母體喜樹堿化合物或與其相關的化合物,前者為衍生自中國喜樹(Camptothecin acuminata)和印度臭味假柴龍樹(Nothapodytes foetida)的水溶性生物堿。
      術語“鬼臼毒素化合物”用于指衍生于提取自毒參茄植物的母體鬼臼毒素或與其相關的化合物。
      術語“抗-腫瘤長春生物堿”用于指衍生自長春花植物(玫瑰長春花)或與其相關的化合物。
      術語“烷化劑”包括具有可在生理條件下向生物重要大分子例如DNA提供烷基這一共同性質(zhì)的各類化學物質(zhì)。對于絕大多數(shù)更重要的試劑例如氮芥和亞硝基脲,其烷化部分在經(jīng)復合物降解反應之后于體內(nèi)產(chǎn)生,其中一些具有酶活。烷化劑最重要的藥理作用為可干擾與細胞增殖尤其是DNA合成和細胞分裂相關的根本機制。烷化劑干擾DNA功能和摻入快速增殖組織的能力是它們的治療性應用和許多毒性的基礎。
      術語“抗腫瘤蒽環(huán)類衍生物”包括來自真菌Strep.peuticus var.caesius的抗生素及其衍生物,其特點為具有包含罕見糖、柔胺的四環(huán)素環(huán)結構,前者通過糖苷鍵與后者結合。
      研究表明原發(fā)性乳腺癌中人表皮生長因子受體2蛋白(HER 2)的擴增與一些病人臨床預后差相關。曲妥珠單抗為高度純化的重組DNA衍生的人源化單克隆抗體IgG1 κ抗體,其對HER 2受體的胞外結構域具有高度親和性。
      許多乳腺癌具有雌激素受體并且這些腫瘤的生長可被雌激素激活。術語“雌激素受體拮抗劑”和“選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑”用于指可與雌激素受體(ER)結合的雌二醇的競爭性抑制劑。當與ER結合時,選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑可誘導該受體三維形狀的改變,調(diào)節(jié)其與DNA上雌激素反應元件(ERE)的結合。
      在絕經(jīng)期婦女中,循環(huán)雌激素的主要來源為在外周組織芳香化酶的作用下由腎上腺和卵巢雄激素(雄烯二酮和睪酮)轉換形成雌激素(雌酮和雌二醇)。通過抑制芳香化酶或使其失活阻斷雌激素是對患有激素依賴型乳腺癌的絕經(jīng)期病人有效并具有選擇性的治療方法。
      本文使用的術語“抗雌激素藥物”不僅包括雌激素受體拮抗劑和選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑還包括如上所述的芳香化酶抑制劑。
      術語“分化劑”指可經(jīng)各種方式抑制細胞增殖并誘導分化的化合物。已知維生素D和類維生素A在調(diào)節(jié)各種正常和惡化細胞型的增長和分化中發(fā)揮重要作用。維甲酸代謝阻斷劑(RAMBA’s)可通過抑制維甲酸的細胞色素P450-介導的代謝提高內(nèi)源性維甲酸的濃度。
      DNA甲基化變化是人腺瘤中最常見的非正?,F(xiàn)象。所篩選基因中啟動子的高度甲基化通常與相關基因的失活有關。術語“DNA甲基轉移酶抑制劑”用于指可通過藥理學抑制DNA甲基轉移酶和重新活化腫瘤抑制因子基因的表達發(fā)揮作用的化合物。
      術語“激酶抑制劑”包括與細胞周期進程和程序性細胞死亡(凋亡)相關的激酶的強效抑制劑。
      術語“法尼基轉移酶抑制劑”用于指被設計用于阻止Ras蛋白和其他胞內(nèi)蛋白法尼基化的化合物。它們已顯示出對惡性細胞增殖和存活的作用。
      術語“其它HDAC抑制劑”包括但不限于 -羧化物,例如丁酸鹽、肉桂酸、4-丁酸苯酯或丙戊酸; -氧肟酸,例如辛二酰苯胺(suberoylanilide)氧肟酸(SAHA)、含有SAHA類似物的哌嗪、聯(lián)芳基氧肟酸A-161906及其carbozolylether-、四氫吡啶-和四氫萘酮類似物,二環(huán)芳基-N-羥基氨甲酰,pyroxamide、CG-1521、PXD-101、氨苯磺胺氧肟酸、LAQ-824、LBH-589、曲古抑菌素A(TSA)、oxamflatin、scriptaid、scriptaid相關的三環(huán)分子、m-羧基肉桂酸雙氧肟酸(CBHA),類CBHA氧肟酸、trapoxin-氧肟酸類似物、CRA-024781、R306465和相關苯甲酰和雜芳基-氧肟酸、氨基辛二酸和丙二酰二酰胺; -環(huán)四肽,例如trapoxin、apidicin、縮酚酸肽、spiruchostatin-相關化合物,RedFK-228,含巰基環(huán)四肽(SCOPs),含環(huán)四肽的氧肟酸(CHAPs),TAN-174s和azumamides; -苯酰胺類例如MS-275或CI-994,或 -depudecin。
      術語“泛醌蛋白酶體途徑抑制劑”用于定義可抑制包括細胞周期調(diào)節(jié)蛋白在內(nèi)的蛋白酶體內(nèi)胞內(nèi)蛋白的靶向破壞的化合物。
      依據(jù)本發(fā)明用于治療癌癥的化合物可以上述方法與輻射一起給予病人。輻射指電離輻射尤其是γ輻射,尤其是如今普遍使用的線性加速器或放射性核素放射的輻射。放射性核素對腫瘤的輻射可以為體外或體內(nèi)。
      本發(fā)明也涉及依據(jù)本發(fā)明的一種抗癌藥物和一種HDAC抑制劑的組合物。
      本發(fā)明也涉及用于醫(yī)學治療例如抑制腫瘤細胞生長的依據(jù)本發(fā)明的組合物。
      本發(fā)明過也涉及用于抑制腫瘤細胞生長的依據(jù)本發(fā)明的組合物。
      本發(fā)明也涉及在人類受試者中抑制腫瘤細胞生長的方法,其包括給予受試者有效量的依據(jù)本發(fā)明的組合物。
      本發(fā)明進一步提供了通過給予有效量的依據(jù)本發(fā)明的組合物抑制非正常細胞包括轉染細胞生長的方法。
      其它藥劑可與HDAC抑制劑同時(例如以分離或單一組合物)或依次給予。在后一種情況下,在一段時間內(nèi)給予兩種化合物并使給予的量和方式足以保證達到有利或協(xié)同作用??梢岳斫獾氖墙M合物中每一組份的優(yōu)選給藥方法和給藥順序及各自的劑量和給藥方案取決于被給予的特定的另一種藥物和HDAC抑制劑、它們的給藥途徑、被治療的特定腫瘤和被治療的特定宿主。本領域技術人員可使用常規(guī)方法并考慮本文中列出的信息輕而易舉地確定最佳方法和給藥順序及劑量和給藥方案。
      鉑配位化合物的有利給藥劑量為1-500mg/m2體表面積,例如50-400mg/m2,尤其是順鉑劑量約為75mg/m2,卡鉑約為300mg/m2/療程。
      紫杉烷化合物的有利給藥劑量為50-400mg/m2體表面積,例如75-250mg/m2,尤其是紫杉醇的劑量約為175-250mg/m2,紫杉萜約為75-150mg/m2/療程。
      喜樹堿化合物的有利給藥劑量為0.1-400mg/m2體表面積,例如1-300mg/m2,尤其是依立替康的劑量約為100 to 350mg/m2,托泊替康約為1-2mg/m2/療程。
      抗腫瘤鬼臼毒素衍生物的有利給藥劑量為30-300mg/m2體表面積,例如50-250mg/m2,尤其是鬼臼乙叉甙的劑量約為35-100mg/m2,鬼臼噻吩甙約為50-250mg/m2/療程。
      抗腫瘤長春花生物堿的有利給藥劑量為2-30mg/m2體表面積,尤其是長春堿的劑量約為3-12mg/m2,長春新堿約為1-2mg/m2,長春瑞濱的劑量約為10-30mg/m2/療程。
      抗腫瘤核苷衍生物的有利給藥劑量為200-2500mg/m2體表面積,例如200-2500mg/m2,尤其是5-FU的劑量為200-500mg/m2,吉西他濱的劑量約為800-1200mg/m2,卡培他濱約為1000-2500mg/m2/療程。
      烷化劑例如氮芥或亞硝基脲的有利給藥劑量為100-500mg/m2體表面積,尤其是環(huán)磷酰胺的劑量約為100-500mg/m2,氯氨布西的劑量約為0.1-0.2mg/m2,卡氮芥的劑量約為150-200mg/m2,環(huán)己亞硝脲的劑量約為100-150mg/m2/療程。
      抗腫瘤蒽環(huán)類抗生素衍生物的有利給藥劑量為10-75mg/m2體表面積,例如15-60mg/m2,尤其是多柔比星的劑量約為40-75mg/m2,柔紅霉素的劑量約為25-45mg/m2,伊達比星的劑量約為10-15mg/m2/療程。
      曲妥單抗的有利給藥劑量為1-5mg/m2體表面積,尤其是2-4mg/m2/療程。
      抗雌激素藥物的有利給藥劑量約為1-100mg/天,取決于特定的藥物和被治療的病癥。
      他莫昔芬的有利口服給藥劑量為5-50mg,優(yōu)選10-20mg/兩天,將治療持續(xù)足夠長的時間直至達到并維持治療效果。托瑞米芬的有利口服給藥劑量約為60mg/天,將治療持續(xù)足夠長的時間直至達到并維持治療效果。阿那曲唑的有利口服給藥劑量約為20-100mg/天。雷洛昔芬的有利口服給藥劑量約為60mg/天。依西美坦的有利口服給藥劑量約為25mg/天。
      這些劑量可以給予例如一次、兩次或更多次每療程,可每7、14、21或28天重復療程。
      鑒于它們的可用藥理學性質(zhì),依據(jù)本發(fā)明的組合物中的組份,例如其它藥物和HDAC抑制劑可配制成各種藥物形式用于給藥目的。這些組份可分別配制成單獨的藥物組合物或含有兩種組份的單一藥物組合物。
      因此本發(fā)明也涉及含有其它藥物和與一種或更多藥物載體一起的HDAC抑制劑的藥物組合物。
      本發(fā)明也涉及含有抗癌藥物和依據(jù)本發(fā)明與一種或更多種藥物載體一起的HDAC抑制劑的藥物組合物形式的依據(jù)本發(fā)明的組合物。
      本發(fā)明進一步涉及使用依據(jù)本發(fā)明的組合物生產(chǎn)用于抑制腫瘤細胞生長的藥物組合物。
      本發(fā)明進一步涉及含有依據(jù)本發(fā)明的HDAC抑制劑作為第一活性成份和一種抗癌藥物作為第二活性成份的產(chǎn)品,作為聯(lián)合制劑同時、單獨或順序用于治療患有癌癥的病人。
      試驗部分 在下文中,“K2CO3”指碳酸鉀,“Na2CO3”指碳酸鈉,“CH2Cl2”指二氯甲烷,“MgSO4”指硫酸鎂,“DIPE”指二異丙醚,“DIAD”指偶氮二甲酸雙(1-甲基乙基)酯,“THF”指四氫呋喃,“HOBT”指1-羥基-1H-苯并三唑,“EDC”指N′-(乙基亞氨代甲酰基)-N,N-二甲基-1,3-丙烷二胺單鹽酸鹽,“EtOAc”指乙酸乙酯、“Et3N”指三乙胺,“NH4OH”指氫氧化銨。
      中間體的制備 實施例A1 a)中間體1的制備
      將2-(1-哌嗪基)-5嘧啶甲酸乙酯(0.0169mol)、(2-苯乙烯基)-硼酸(0.0169mol)和1,4-二噁烷-2,5-二醇(0.0169mol)在乙醇(250ml)中的混合物在室溫下攪拌2天,然后蒸發(fā)溶劑(真空)。用CH2Cl2和H2O溶解殘留物,將有機相分離,干燥(MgSO4)、過濾并蒸發(fā)溶劑。在硅膠上(15-40μm)(洗脫劑CH2Cl2/CH3OH 97/1)用柱色譜技術純化殘留物。將純流分蒸發(fā),得到4g(61%)中間體1(M.P.128℃;E-構型)。
      b)中間體2的制備
      于5℃向中間體1(0.0026mol)和1H-異吲哚-1,3(2H)-二酮(0.0039mol)的CH2Cl2(50ml)溶液中在氮氣流中逐滴依次加入三丁基膦(0.0039mol)和DIAD(0.0039mol)。在室溫下將該混合物攪拌15小時。于5℃加入三丁基膦(0.0039mol)和DIAD(0.0039mol)。在室溫下將該混合物攪拌24小時,傾倒至冰上并用CH2Cl2萃取。在硅膠上(洗脫劑CH2Cl2/CH3OH97/1;15-40μm)用柱色譜技術純化殘留物。收集純流分并蒸發(fā)溶劑,得到0.84g(52%)中間體2(M.P50℃;E-構型)。
      c)中間體3的制備
      將中間體2(0.0072mol)和溴化一水合肼(0.0021mol)在乙醇(10ml)中的混合物于65℃攪拌3小時。用CH2Cl2萃取殘留物。用H2O洗滌有機相,干燥(MgSO4)、過濾并蒸發(fā)溶劑,得到2.7g中間體3(E-構型)。
      d)中間體4的制備
      將乙酰氯(0.0023mol)的CH2Cl2(1ml)溶液于5℃在氮氣流下逐滴加入中間體3(0.0015mol)和N,N-二乙基乙胺(0.0031mol)的CH2Cl2(13ml)溶液。將混合物于5℃攪拌30分鐘,然后在室溫下攪拌1小時30分鐘。用水洗滌有機相、干燥(MgSO4)、過濾并蒸發(fā)溶劑。在硅膠上(洗脫劑CH2Cl2/CH3OH/NH4OH 99/1/0.1;10μm)用柱色譜技術純化殘留物。收集純流分并蒸發(fā)溶劑,得到0.33g(40%)中間體4(E-構型)。
      e)中間體5的制備
      將中間體4(0.0007mol)和氫氧化鋰(0.0015mol)在THF(25ml)和H2O(8ml)中的混合物于室溫下攪拌15小時并用1N HCl酸化。蒸發(fā)THF。將沉淀過濾,然后依次用水、DIPE洗滌,干燥,得到0.32g(83%)中間體5的鹽酸鹽(E-構型)。
      f)中間體6的制備
      將EDC(0.0011mol)和HOBT(0.0011mol)于室溫下在氮氣流中加入中間體5(0.0007mol)、O-(四氫-2H-吡喃-2-基)羥胺(0.0011mol)和N,N-二乙基乙胺(0.0022mol)的CH2Cl2/THF(50/50)(40ml)溶液中。將該混合物于室溫下攪拌36小時,倒入H2O中并用CH2Cl2萃取。將有機相分離、干燥(MgSO4)、過濾并蒸發(fā)溶劑。從乙醚中結晶殘留物。將沉淀過濾并干燥,得到0.34g(92%)中間體6(M.P.198℃;E-構型)。
      實施例A2 a)中間體7的制備
      將中間體3(0.0026mol)和氫氧化鋰(0.0039mol)在THF(30ml)和H2O(15ml)中的混合物在室溫下攪拌15小時,然后加入1N HCl至中性。蒸發(fā)THF。過濾沉淀,依次用H2O和乙醚洗滌,然后干燥,得到0.9g中間體7(E構型)。
      b)中間體8的制備
      將Na2CO3(0.0076mol)加入中間體7(0.0025mol)在THF(30ml)和H2O(30ml)中的混合物中。攪拌10min。分次加入1-[[(9H-芴-9-基甲基)羰基]氧]-2,5-吡咯烷二酮(0.0025mol)。室溫攪拌混合物18小時,然后冷卻至5℃。加入1N HCl至中性。蒸發(fā)THF。過濾沉淀,依次用H2O和乙醚洗滌,得到1.2g(82%)中間體8(E構型)。
      c)中間體9的制備
      在室溫下,將HOBT(0.0031mol)和EDC(0.0031mol)加入中間體8(0.002mol)、O-(四氫-2H-吡喃-2-基)羥胺(0.0031mol)和N,N-二乙基乙胺(0.0062mol)的CH2Cl2/THF(50/50)溶液(130ml)中。室溫攪拌混合物48小時,傾入H2O中,用CH2Cl2提取。分離有機相,干燥(MgSO4),過濾,然后蒸發(fā)溶劑。用硅膠柱層析法純化殘留物(洗脫劑CH2Cl2/CH3OH 98/2;15-40μm)。收集純流分并蒸發(fā)溶劑,得到1.07g(76%)中間體9(E構型)。
      d)中間體10的制備
      將哌啶(0.0039mol)加入中間體9(0.0012mol)的CH2Cl2溶液(25ml)中。室溫攪拌混合物24小時。用H2O洗滌有機相,干燥(MgSO4),過濾,然后蒸發(fā)溶劑。用硅膠柱層析法純化殘留物(洗脫劑CH2Cl2/CH3OH/NH4OH 96/4/0.2;15-40μm)。收集所需流分,蒸發(fā)溶劑,得到0.32g(56%)中間體10(E構型)。
      實施例A3 a)中間體11的制備
      于5℃將三丁基膦(0.0047mol)和DIAD(0.0047mol)依次加入中間體2(0.0015mol)和2,5-吡咯烷二酮(0.0047mol)的CH2Cl2溶液(30ml)中。室溫攪拌混合物48小時。加入吡咯烷二酮、三丁基膦和DIAD。室溫攪拌混合物15小時,傾至冰上,用CH2Cl2提取。分離有機相,干燥(MgSO4),過濾,然后蒸發(fā)溶劑。用硅膠柱層析法純化殘留物(洗脫劑CH2Cl2/CH3OH 99/1;15-40μm)。收集純流分,蒸發(fā)溶劑。用硅膠柱層析法純化所得殘留物(洗脫劑CH2Cl2/EtOAc 80/20;15-40μm)。收集純流分,蒸發(fā)溶劑,得到0.55g(76%)中間體11(熔點158℃;E構型)。
      b)中間體12的制備
      將中間體11(0.0008mol)和氫氧化鋰(0.0022mol)的THF(40ml)與H2O(20ml)的混合物在室溫下攪拌15小時,然后用3N HCl中和。過濾沉淀,依次用H2O和乙醚洗滌,干燥,得到0.26g(65%)中間體12(E構型)。
      c)中間體13的制備
      將中間體12(0.0005mol)在乙酸(4ml)中的混合物于100℃下攪拌7小時。加入H2O和冰。過濾沉淀,依次用H2O和乙醚洗滌,干燥,得到0.22g(77%)中間體13(E構型)的乙酸鹽(CH3COOH)。
      d)中間體14的制備
      在N2氣流下,將HOBT(0.0006mol)和EDC(0.0006mol)依次加入中間體13(0.0004mol)、O-(四氫-2H-吡喃-2-基)羥胺(0.0006mol)和N,N-二乙基乙胺(0.0017mol)的CH2Cl2/THF(50/50)溶液(30ml)中。在室溫下攪拌混合物15小時,傾入H2O中,用CH2Cl2提取。分離有機相,干燥(MgSO4),過濾,然后蒸發(fā)溶劑。用硅膠柱層析法純化殘留物(洗脫劑CH2Cl2/CH3OH/NH4OH 99/1/0.1到90/10/0.5;3-5μm)。收集純流分,蒸發(fā)溶劑,得到0.19g(83%)中間體14(E構型)。
      實施例A4 a)中間體15的制備
      于5℃在N2氣流下,將三丁基膦(0.0031mol)和DIAD(0.0031mol)依次加入中間體1(0.0015mol)和4-氟苯酚(0.0031mol)的CH2Cl2溶液(30ml)中。室溫攪拌混合物15小時。再次加入4-氟苯酚(0.0031mol)、三丁基膦(0.0031mol)和DIAD(0.0031mol)。室溫攪拌混合物24小時,傾入冰水中,用CH2Cl2提取。分離有機相,干燥(MgSO4),過濾,然后蒸發(fā)溶劑。用硅膠柱層析法純化殘留物(洗脫劑CH2Cl2/CH3OH99/1;15-40μm)。收集純流分,蒸發(fā)溶劑。用硅膠柱層析法純化殘留物(洗脫劑環(huán)己烷/EtOAc 75/25;15-40μm)。收集純流分,蒸發(fā)溶劑,得到0.54g(72%)中間體(油狀;E構型)。
      b)中間體16的制備
      將中間體15(0.001mol)和氫氧化鋰(0.0026mol)的THF(50ml)和H2O(25ml)中的混合物在室溫下攪拌15小時,用3N HCl酸化。蒸發(fā)THF。過濾沉淀,依次用H2O和乙醚洗滌,干燥,得到0.47g(92%)中間體16(E構型)的鹽酸鹽(HCl)。
      c)中間體17的制備
      在室溫、N2氣流下,將HOBT(0.0014mol)和EDC(0.0014mol)依次加入中間體16(0.0009mol)、O-(四氫-2H-吡喃-2-基)羥胺(0.0014mol)和N,N-二乙基乙胺(0.0038mol)的CH2Cl2/THF(50/50)溶液(60ml)中。攪拌混合物15小時,傾入H2O中,用CH2Cl2提取。分離有機相,干燥(MgSO4),過濾,蒸發(fā)溶劑。用硅膠柱層析法純化殘留物(洗脫劑CH2Cl2/CH3OH/NH4OH 99/1/0.1到90/10/0.5;3-5μm)。收集純流分,蒸發(fā)溶劑,得到0.2g(38%)中間體17(E構型)。
      實施例A5 a)中間體18的制備
      將中間體2(0.0011mol)和氫氧化鋰(0.0023mol)在THF(30ml)和H2O(15ml)中的混合物在室溫下攪拌15小時,用3N HCl中和。過濾沉淀,干燥,得到0.51g中間體18(E構型)。
      b)中間體19的制備
      將中間體18(0.0019mol)與乙酸(15ml)的混合物于100℃攪拌5小時,然后蒸發(fā)。將殘留物加入H2O中,然后用K2CO3中和。過濾沉淀,依次用H2O和乙醚洗滌,干燥,得到0.8g(86%)中間體19(E構型)。
      c)中間體20的制備
      在室溫下,向中間體19(0.0002mol)的CH2Cl2溶液(4ml)中滴加亞硫酰氯(0.0021mol)?;亓鲾嚢杌旌衔?5小時,然后蒸發(fā),得到中間體20的鹽酸鹽(.HCl)(E構型)。
      d)中間體21的制備
      于5℃向[2-氨基-4-(2-噻吩基)苯]-1,1-二甲基乙基酯氨基甲酸(0.0003mol)的吡啶溶液(6ml)中滴加中間體20(0.0002mol)的CH2Cl2(2ml)溶液。室溫攪拌混合物15小時。蒸發(fā)吡啶。將殘留物加入CH2Cl2中。用H2O洗滌有機相,干燥(MgSO4),過濾,蒸發(fā)溶劑。所得殘留物(0.2g)用硅膠柱層析純化(洗脫劑CH2Cl2/CH3OH 98/2;15-40μm)。收集所需流分,蒸發(fā)溶劑,得到0.12g中間體21(E構型)。
      實施例A6 a)中間體22的制備
      將1,4-二氧雜環(huán)己烷-2,5-二醇(0.0093mol)加入[2-(4-氟代苯基)乙烯基]硼酸(0.0093mol)的乙醇溶液(200ml)中。加入6-(1-哌嗪基)-3-吡啶甲酸乙酯(0.0085mol)。室溫攪拌混合物15小時,然后過濾。蒸發(fā)濾液。將殘留物加入EtOAc中。用飽和氯化鈉溶液洗滌有機相,干燥(MgSO4),過濾,蒸發(fā)溶劑。將該流分(3.3g)溶于乙醚。于5℃滴加5-6N HCl(2ml)。過濾沉淀,用乙醚洗滌、干燥。將該流分(3g)加入H2O中,然后加入K2CO3。用CH2Cl2提取混合物。分離有機相,干燥(MgSO4),過濾,蒸發(fā)溶劑,得到2.7g(79%)中間體22(E構型)。
      b)中間體23的制備
      在5℃、N2氣流下,向中間體22(0.004mol)和1H-異吲哚-1,3(2H)-二酮(0.006mol)的CH2Cl2溶液(80ml)中依次滴加三苯膦(0.006mol)和DIAD(0.006mol)。室溫攪拌混合物15小時。于5℃依次加入1H-異吲哚-1,3(2H)-二酮(0.006mol)、三苯膦(1.5eq)和DIAD(1.5eq)。室溫攪拌混合物15小時,傾入冰中,用CH2Cl2提取。分離有機相,干燥(MgSO4),過濾,蒸發(fā)溶劑。用硅膠柱層析純化該流分(11.4g)(洗脫劑環(huán)己烷/EtOAc 70/30;15-40μm)。收集純流分,蒸發(fā)溶劑。將該流分(3.7g)加入甲苯/異丙醇(96/4)中。過濾沉淀,干燥。從(1.2g,57%)DIPE/乙醚中結晶該流分。過濾沉淀,干燥,得到0.93g(熔點132℃;E構型)中間體23。
      c)中間體24的制備
      于65℃將中間體23(0.0018mol)、一氫硼酸肼(0.0056mol)在乙醇(100ml)中的混合物攪拌4小時。蒸發(fā)乙醇。將殘留物加入CH2Cl2。用H2O洗滌有機相,干燥(MgSO4),過濾,蒸發(fā)溶劑。用硅膠柱層析純化該流分(0.95g)(洗脫劑CH2Cl2/CH3OH/NH4OH 96/4/0.1;15-40μm)。收集純流分,蒸發(fā)溶劑,得到0.54g(72%)中間體24(E構型)。
      d)中間體25的制備
      在5℃下,向中間體24(0.0004mol)和Et3N(0.0013mol)的CH2Cl2(10ml)溶液中滴加甲磺酰氯(0.0006mol)。室溫下攪拌混合物15小時。用H2O洗滌有機相,干燥(MgSO4),過濾,蒸發(fā)溶劑。用硅膠柱層析純化該流分(0.25g)(洗脫劑CH2Cl2/CH3OH 99/1;15-40μm)。收集純流分,蒸發(fā)溶劑,得到0.2g中間體25(E構型)。
      e)中間體26的制備
      在室溫將中間體25(0.0003mol)和氫氧化鋰(0.0018mol)的THF(18ml)溶液與H2O(9ml)的混合物攪拌24小時并用3N HCl酸化。蒸發(fā)THF。過濾沉淀,依次用H2O和乙醚洗滌,干燥,得到0.11g中間體26的鹽酸鹽(.HCl)(E構型)。
      f)中間體27的制備
      在室溫下,將HOBT(0.0003mol)和EDC(0.0003mol)依次加入中間體26(0.0002mol)、O-(四氫-2H-吡喃-2-基)羥胺(0.0003mol)和Et3N(0.0009mol)的CH2Cl2/THF(15ml)溶液中。室溫攪拌混合物15小時,傾入H2O中,用CH2Cl2提取。分離有機相,干燥(MgSO4),過濾,蒸發(fā)溶劑。用硅膠柱層析純化該流分(0.15g)(洗脫劑CH2Cl2/CH3OH 98/2;10μm)。收集純流分,蒸發(fā)溶劑,獲得0.07g(56%)中間體27(E構型)。
      實施例A7 a)中間體28的制備
      于100℃將中間體18(0.0007mol)與乙酸(5ml)的混合物攪拌7小時,然后蒸發(fā)。將殘留物加入H2O中。過濾沉淀,依次用H2O和乙醚洗滌,干燥,得到0.25g(64%)中間體28的乙酸鹽(.CH3COOH)(E構型)。
      b)中間體29的制備
      在室溫下將HOBT(0.0006mol)和EDC(0.0006mol)依次加入中間體28(0.0004mol)、O-(四氫-2H-吡喃-2-基)羥胺(0.0006mol)和Et3N(0.0018mol)的CH2Cl2/THF(40ml)溶液中。室溫攪拌混合物24小時,然后傾入H2O中,用CH2Cl2提取。分離有機相,干燥(MgSO4),過濾,蒸發(fā)溶劑。用硅膠柱層析純化該流分(0.4g)(洗脫劑CH2Cl2/CH3OH 98/2;15-40μm)。收集純流分,蒸發(fā)溶劑。從DIPE/乙醚中結晶該流分(0.24g)。過濾沉淀,干燥,得到0.23g(92%)中間體29(E構型)。
      B.化合物的制備 實施例B1 化合物1的制備
      于5℃下將三氟乙酸(1.4ml)加入中間體6(0.0005mol)的CH3OH(28ml)溶液中。室溫攪拌混合物48小時,蒸干。從乙腈/乙醚中結晶殘留物。過濾出沉淀,干燥,得到0.27g(92%)化合物1(熔點166℃;E構型)的三氟乙酸鹽(.0.83CF3COOH.0.62H2O)。
      實施例B2 化合物2的制備
      將中間體10(0.0007mol)在三氟乙酸(1.6ml)與CH3OH(32ml)中的混合物在室溫下攪拌72小時,然后蒸干。在乙醚中結晶殘留物。過濾沉淀,干燥,得到0.375g(87%)化合物2(熔點124℃;E構型)的三氟乙酸鹽(.2.11CF3COOH)。
      實施例B3 化合物3的制備
      于5℃向中間體14(0.0003mol)的CH3OH(17ml)溶液中滴加三氟乙酸(0.85ml)。室溫攪拌混合物48小時,然后蒸干。在乙醚/乙腈中結晶殘留物。過濾沉淀,干燥,得到0.15g(82%)化合物3(熔點148℃;E構型)的三氟乙酸鹽(.0.8CF3COOH.0.84H2O)。
      實施例B4 化合物4的制備
      于5℃向中間體17(0.0003mol)的CH3OH溶液(17ml)中滴加三氟乙酸(0.85ml)。室溫攪拌混合物48小時,然后蒸干。在乙醚中結晶殘留物。過濾沉淀,干燥,得到0.145g(79%)化合物4(熔點115℃;E構型)的三氟乙酸鹽(0.87CF3COOH.0.79H2O)。
      實施例B5 化合物5的制備
      于5℃向中間體21(0.0001mol)的CH2Cl2(3ml)溶液中滴加三氟乙酸(0.5ml)。于5℃攪拌混合物2小時。加入冰和水。加入K2CO3。用CH2Cl2提取混合物兩次。分離有機相,干燥(MgSO4),過濾,蒸發(fā)溶劑。用硅膠柱層析純化所得殘留物(0.15g)(洗脫劑CH2Cl2/CH3OH98/2;15-40μm)。收集純流分,蒸發(fā)溶劑。在DIPE/異丙醇中結晶將該流分(0.082g)。過濾沉淀,干燥,得到0.072g(59%)(熔點120℃;E構型)化合物5。
      實施例B6 化合物6的制備
      于5℃向中間體27(0.0001mol)的CH3OH(7ml)溶液中滴加三氟乙酸(0.33ml)。室溫攪拌混合物24小時,然后蒸干。在乙醚中結晶殘留物。過濾沉淀,干燥,得到0.062g(88%)(熔點131℃;E構型)化合物6的三氟乙酸鹽(.98CF3COOH)。
      實施例B7 化合物7的制備
      于5℃向中間體29(0.0003mol)的CH3OH(21ml)溶液中滴加三氟乙酸(1ml)。室溫攪拌混合物48小時,然后蒸干。在乙醚/乙腈中結晶殘留物。過濾沉淀,干燥,得到0.19g(86%)(熔點140℃;E構型)化合物7的三氟乙酸鹽(0.9CF3COOH.84H2O)。
      表F-1列出了依據(jù)上述實施例之一制備的化合物。
      表F-1
      C藥理學實施例 組蛋白去乙?;敢种频捏w外測定(見實施例C.1)檢測式(I)化合物的對HDAC酶活的抑制。
      在A2780腫瘤細胞中用細胞毒性或存活率檢測衡量式(I)化合物的細胞活性(Mosmann Tim,Journal of Immunological Methods 6555-63,1983)(見實施例C.2)。
      一種化合物的溶解度可衡量其停留于溶液中的能力。在第一種方法中,測定化合物被稀釋時停留在含水溶液中的能力(見實施例C.3a)。將DMSO儲備液以單一的含水緩沖液在不同的連續(xù)步驟中稀釋。在這一方法中(C.3.a),用BD Gentest溶解度掃描儀掃描混合物以檢測沉淀的產(chǎn)生。在第二種方法中用化學發(fā)光氮檢測器測定不同pH下化合物的溶解度(見實施例C.3.b)。
      藥物的滲透性表現(xiàn)了其從一種介質(zhì)移動至或穿過另一種介質(zhì)的能力。尤其是其穿過腸道膜進入血液和/或從血液進入靶位的能力。可由濾器固定化的人工膜磷脂雙分子層測定滲透性(見實施例C.4)。在濾器固定化的人工膜磷脂雙分子層檢測中,在96-孔微孔板和96-孔濾板之間形成“夾層”,這樣各復合孔被分成兩室,底部為供體溶液,頂部為受體溶液,由125μm微濾盤隔離(0.45μm孔),用二油酰磷脂酰-膽堿的十二烷溶液2%(wt/v)包被,條件為當體系與含水緩沖液接觸時在濾器通道內(nèi)部形成多層雙分子層?;衔锿高^這一人工膜的滲透性以cm/s為單位測定。其目的在于尋找藥物在兩個不同pH(4.0和7.4)時透過平行人工膜的滲透性。用UV-光譜測定法在250-500nm之間的最佳波長處測定化合物。
      藥物代謝意指脂溶性外生或內(nèi)生化合物被酶轉化成極性的、水溶性的和可分泌的代謝產(chǎn)物。藥物代謝的主要器官是肝臟。代謝產(chǎn)物常常比母體藥物活性更低或是非活性的。但是,一些代謝產(chǎn)物可能活性增加或具有毒性作用。因此藥物代謝可包括“去毒”和“中毒”過程。決定機體處理藥物和化學物質(zhì)能力的主要酶系統(tǒng)代表為P450單加氧酶,其為DADPH依賴型酶。可使用亞細胞人組織(見實施例C.5.)測定化合物的代謝穩(wěn)定性。這里的化合物代謝穩(wěn)定性表示為這些化合物與微粒體溫育15分鐘后被代謝藥物的百分比。
      研究已顯示多種抗腫瘤藥物可激活p21蛋白,包括DNA損傷劑和組蛋白去乙?;敢种苿NA損傷劑可通過腫瘤抑制因子p53激活p21基因,而組蛋白去乙?;敢种苿┛赏ㄟ^轉錄因子Sp1轉錄性激活p21基因。因此DNA損傷劑通過p53效應元件激活p21啟動子而組蛋白去乙酰化酶抑制劑通過sp1位點(位于與TATA盒相關的-60bp至+40bp區(qū))激活p21啟動子。當細胞中的p21啟動子由p211300bp啟動子片段(不包含p53效應元件)組成時,其相應地對DNA損傷劑為非效應性的。
      可通過檢測化合物誘導p21導致HDAC細胞水平抑制的能力來評價化合物誘導p21的能力??捎煤衟21 1300bp啟動子片段(不含有p53效應元件)的表達載體穩(wěn)定轉染細胞,并且與對照水平相比其中報告基因表達增加,確定化合物具有p21誘導能力。該報告基因為熒光蛋白質(zhì)且報告基因的表達以放射熒光的量的形式加以檢測(見實施例C.6.a)。
      第二種方法為體內(nèi)方法,其中使用小鼠篩選化合物的藥學活性??蓪⒂行Я康纳鲜龇€(wěn)定轉染的腫瘤細胞給予小鼠以產(chǎn)生腫瘤。在腫瘤細胞經(jīng)過足夠時間形成腫瘤之后,可給予動物具有潛在活性的化合物,通過測定報告基因的表達評價所述化合物對動物的作用。與藥學活性化合物溫育可導致與對照水平相比報告基因的表達增加(見實施例C.6.b)。
      特異性HDAC抑制劑不應抑制其它酶,例如豐富的CYP P450蛋白質(zhì)。CYP P450(E.coli表達)蛋白質(zhì)3A4、2D6 en 2C9將其特異性底物轉化成熒光分子。CYP3A4蛋白轉化7-芐氧基-三氟甲基香豆素(BFC)生成7-羥基-三氟甲基香豆素。CYP2D6蛋白質(zhì)可轉化3-[2-(N,N-二乙基-N-甲氨基)乙基]-7-甲氧基-4-甲基香豆素(AMMC)生成3-[2-(N,N-二乙基氨基)乙基]-7-羥基-4-鹽酸甲基香豆素。CYP2C9蛋白質(zhì)可轉化7-甲氧基-4-三氟甲基香豆素(MFC)生成7-羥基-三氟甲基香豆素。抑制該酶反應的化合物可降低熒光信號(見實施例C.7)。
      實施例C.1用熒光標記底物體內(nèi)檢測組蛋白去乙?;傅囊种? 使用Biomol HDAC熒光活性檢測/藥物研發(fā)試劑盒(試劑盒編碼AK-500-0001)。HDAC熒光活性檢測試劑盒基于Fluor de Lys(熒光產(chǎn)生組蛋白去乙酰化酶賴氨酰)底物和顯影劑組合物。Fluor de Lys底物包括乙?;嚢彼醾孺?。底物的去乙酰化將底物致敏,從而在第二步中用Fluor de Lys顯影劑處理可產(chǎn)生熒光基團。
      將60μg/ml HeLa核提取物與75μM底物溫育。將Fluor de Lys底物加入到含有25mM Tris、137mM NaCl、2.7mM KCl和1mMMgCl2.6H2O的pH7.4的緩沖液中。30分鐘后加入1體積的顯影劑。用355nm光激發(fā)熒光基團,在熒光酶標儀上于450n檢測發(fā)射光。
      對于每一項試驗,平行進行對照(含有HeLa核提取物和緩沖液)、空白溫育(含有緩沖液但是不含有HeLa核提取物)和樣品(含有溶于DMSO并進一步用緩沖液稀釋的化合物和HeLa核提取物)。在第一種情況下,在10-5M濃度下檢測化合物。當化合物在10-5M表現(xiàn)出活力時,繪制濃度-效應曲線,其中在10-5M和10-9M檢測化合物。所有樣品均檢測4次。在每一次檢測中,從對照和樣品值中減去空白。對照樣品表示底物100%去乙酰化。對于每一個樣品,熒光表示為對照平均值的百分比。當對分級數(shù)據(jù)進行幾率分析計算得到適當?shù)腎C50時(將代謝產(chǎn)物量減少至對照的50%所需要的藥物濃度)。本文中待測化合物的作用表示為pIC50(IC50-值的負log值)(見表F-2)。
      實施例C.2測定對A2780細胞的抗增殖活性 將所有待測化合物溶于DMSO并用培養(yǎng)基進一步稀釋。細胞增殖檢測中的DMSO終濃度不超過0.1%(v/v)。對照含有A2780細胞和DMSO,不含有化合物,空白含有DMSO,不含有細胞。將MTT溶解于PBS中,濃度為5mg/ml。制備含有0.1M甘氨酸和0.1M NaCl,并用NaOH(1N)調(diào)節(jié)至pH 10.5的甘氨酸緩沖液(所有試劑均購自Merck)。
      將人A2780卵巢癌細胞(美國賓夕法尼亞州Fox Chase CancerCentre T.C.Hamilton惠贈)在補充有2mM L-谷氨酰胺、50μg/ml慶大霉素和10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。按照常規(guī)將細胞保持為單層培養(yǎng)物,條件為37℃、濕度5%的CO2環(huán)境中。使用胰蛋白酶/EDTA以1:40的分流比將細胞每周傳代一次。所有培養(yǎng)基和添加劑購自Life Technologies。使用基因-探針支原體組織培養(yǎng)試劑盒(供應商BioMérieux)確定細胞不存在支原體污染。
      將細胞接種至NUNCTM 96孔板中(供應商Life Technologies)并允許其與塑料黏附過夜。平板培養(yǎng)使用的濃度為每孔1500個細胞,培養(yǎng)基總體積為200μl。當細胞黏附至板上后,更換培養(yǎng)基,加入藥物和/或溶劑至終體積為200μl。溫育四天之后,用200μl新鮮培養(yǎng)基替換原有培養(yǎng)基,使用MTT檢測法測定細胞濃度和成活力。向每一孔中加入25μl MTT溶液并將細胞于37℃繼續(xù)溫育2小時。小心吸出培養(yǎng)基,依次加入25μl甘氨酸緩沖液和100μl DMSO使藍色MTT-甲月替產(chǎn)品增溶。在微板振蕩器上將微測定板振蕩10分鐘,用Emax96孔-分光光度計(供應商Sopachem)于540nm處測定吸光度。
      在每一項試驗中,每一試驗條件的結果為3個重復孔的平均值。為了達到起初的篩選目的,使用單一的固定濃度10-6M檢測化合物。對于活性化合物,重復試驗以建立完整的濃度-效應曲線。對于每一項試驗,平行進行對照(不含藥物)和空白溫育(不含細胞或藥物)。從所有的對照和樣品值中減去空白值。對于每一個樣品,細胞生長的平均值(吸收單位)表示為對照細胞生長的平均值的百分比。適當時對分級數(shù)據(jù)進行機率分析計算得到IC50-值(將細胞生長減低至對照50%所需要的藥物量)(Finney,D.J.,Probit Analyses,2nd Ed.Chapter10,GradedResponses,Cambridge University Press,Cambridge 1962)。本文中待測化合物的作用表示為pIC50(IC50-值的負log值)(見表F-2)。
      實施例C.3溶解度/穩(wěn)定性 C.3a.含水培養(yǎng)基中的動力學溶解度 在96孔儲備液板(每孔200μl)中將DMSO-儲備液從5000μM稀釋至9.8μM(1/2稀釋)。每稀釋一次將樣品混合。將這些DMSO溶液(2μl)的等份試樣轉移至另外兩個96孔緩沖液板中,每孔含有(2μl)含水緩沖液。每一緩沖液板或含有pH 7.4的含水緩沖液或含有pH4.0的水性緩沖液。最后一次稀釋后將緩沖液板混合,將樣品于室溫下穩(wěn)定化1/2小時。每一化合物雙份稀釋以排除偶然誤差。然后用BD基因檢測溶解度掃描儀掃描混合物以檢測是否有沉淀生成?;诨旌衔镏写嬖诨虿淮嬖诔恋硗ㄟ^差值計算動力學溶解度。等級分為三類。具有高溶解度的化合物分值為3,其溶解度大于或等于50μM。具有中等溶解度的化合物分值為2,其溶解度大于10μM小于50μM。具有低溶解度的化合物分值為1,其溶解度低于或等于10μM。
      檢測了四種化合物兩種化合物在兩個pH下的分值為1,兩種化合物在pH4.0時的分值為2。
      C.3b.pH2.3時的溶解度/穩(wěn)定性 也可使用化學發(fā)光氮氣檢測器測定化合物在pH2.3時的溶解度(見表F-2)。
      實施例C.4平行人工膜滲透性分析 將儲備液(100% DMSO中5mM儲備液的10μl等份試樣)稀釋于含有2ml pH4或pH 7.4的含水緩沖液體系的深孔板或預混合板中(PSR4 System Solution Concentrate(pION))。
      在將樣品加入?yún)⒈劝逯埃瑢?50μl緩沖液加入孔中并進行空白UV-測定。之后傾去緩沖液,將該板用作參比板。所有測定均在抗-UV板(供應商Costar或Greiner)中進行。
      當對參比板進行空白測定之后,將150μl稀釋樣品加入?yún)⒈劝逯胁?00μl稀釋樣品加入供體板1。用4μl人工膜形成溶液(含有0.1%2,6-二-叔-丁基-4-甲酚的1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿的十二烷溶液)包被受體過濾板(供應商Millipore,型號MAIP N45)并放置于供體板1之上以形成“夾心層”。將緩沖液(200μl)加入受體孔上部。將夾心層覆蓋并于室溫黑暗處儲存18小時。
      通過向孔中加入150μl緩沖液然后進行UV-測定進行受體板2的空白測定。在對受體板2進行空白測定之后傾去緩沖液,將150μl受體緩沖液從受體濾板1移轉至受體板2。然后從夾心層移除受體濾板1。在對供體板2進行空白測定之后(如上所述),將150μl供體緩沖液從供體板1移轉至供體板2。掃描(用SpectraMAX 190)供體板2、受體板2和參比板孔的UV光譜。對所有光譜進行處理,使用PSR4pCommand軟件計算滲透性。所有的化合物均測定三次。每一項試驗中使用卡馬西平、灰黃霉素、無環(huán)鳥苷、阿替洛爾、呋塞米和氯噻嗪作為標準。將化合物分為三個等級低滲透性(平均作用<0.5 x 10-6cm/s,分值為1)、中等滲透性(1 x 10-6cm/s>平均作用≥0.5 x 10-6cm/s;分值為2)或高滲透性(≥1 x 10-6cm/s;分值為3)。
      實施例C.5代謝穩(wěn)定性 根據(jù)Gorrod等(Xenobiotica 5453-462,1975)通過將組織勻漿后離心分離進行亞細胞組織制備。將肝組織在冰冷的0.1M Tris-HCl(pH7.4)緩沖液中潤洗以吸取多余的血液。將組織的水分吸干、稱重并用手術剪剪碎。用安裝有Teflon研棒的Potter-S(Braun,意大利)或SorvallOmni-Mix勻漿器將組織碎片在3個體積的冰冷0.1M磷酸緩沖液(pH7.4)中勻漿7 x 10sec。在兩種情況下,勻漿過程中將儀器放置于冰中/上。
      用Sorvall離心機或Beckman超速離心機將組織勻漿9000xg離心20分鐘(4℃)。將得到的上清保存于-80℃并標記為“S9”。
      可用Beckman超速離心機將S9流分進一步100.000xg離心60分鐘(4℃)。將所得上清小心吸出、等分并標記為“胞質(zhì)溶膠”。將沉淀重懸于0.1M磷酸緩沖液中(pH 7.4),每0.5g原始組織重量的終體積為1ml,標記為“微粒體”。
      將所有亞細胞流分等分。立即冷凍于液氮中,使用之前-80℃保存。
      對于待測樣品,溫育混合物包括PBS(0.1M)、化合物(5μM)、微粒體(1mg/ml)和NADPH-生成體系(0.8mM葡萄糖-6-磷酸,0.8mM氯化鎂和0.8單位的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)。對照樣品中含有相同的物質(zhì),但是微粒體被加熱失活(95攝氏度10分鐘)的微粒體取代。對照樣品中化合物的回收率通常為100%。
      將混合物于37攝氏度預溫育5分鐘。在時間點0(t=0)加入0.8mM NADP起始反應并將樣品溫育15分鐘(t=15)。加入2體積的DMSO終止反應。將樣品900xg離心10分鐘,分析之前將所得上清室溫下保存,不得超過24小時。所有溫育均平行做兩份。用LC-MS分析上清。在Xterra MS C18(50 x 4.6mm,5μm,Waters,US)上洗脫樣品。使用Alliance 2790(供應商Waters,US)HPLC系統(tǒng)。用緩沖液A(25mM乙酸銨(pH5.2)的H2O/乙腈溶液(95/5))洗脫,溶劑B為乙腈,溶劑C為甲醇,流速為2.4ml/min。所應用的梯度以線性方式在5分鐘內(nèi)將有機相濃度內(nèi)從0%上升至50%B和50%C,直至1分鐘內(nèi)上升至100%B,將有機相濃度繼續(xù)保持穩(wěn)定1.5分鐘。樣品的總進樣量為25μl。
      將安裝有ESI源的Quattro(供應商Micromass,Manchester,UK)三聯(lián)四極質(zhì)譜儀作為檢測器。電噴霧源和去溶劑化溫度分別設定為120和350℃并將氮氣作為噴霧劑和干燥氣體。在正極掃描模式(單離子反應)下獲取數(shù)據(jù)。錐電壓設為10V,停留時間為1秒。
      代謝穩(wěn)定性表示為活性微粒體(E(act))存在下溫育15分鐘后化合物的代謝百分比


      代謝百分比小于20%的化合物被定義為高度代謝穩(wěn)定的。代謝在20-70%之間的化合物被定義為中等穩(wěn)定。代謝百分比高于70%的化合物定義為低代謝穩(wěn)定性。在進行任何一次代謝穩(wěn)定性掃描時均包括三種參比化合物。維拉帕米作為低代謝穩(wěn)定性化合物(%代謝=73%)。西沙比利作為中等代謝穩(wěn)定性化合物(%代謝=45%)。丙醇作為高代謝穩(wěn)定性化合物(25%代謝)。這些參比化合物用于驗證代謝穩(wěn)定性檢測。
      實施例C.6p21誘導能力 實施例C.6a細胞方法 在5% CO2加濕培養(yǎng)箱中將A2870細胞(ATCC)37℃培養(yǎng)于含有10% FCS、2mM L-谷氨酰胺和慶大霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中。所有的細胞培養(yǎng)溶液由Gibco-BRL(Gaithersburg,MD)提供。其它材料由Nunc提供。
      從增殖A2780細胞中提取基因組DNA并用作巢式PCR分離p21啟動子的模板。第一次擴增進行20個循環(huán),退火溫度為55℃,使用以基因組DNA作為模板的寡核苷酸對GAGGGCGCGGTGCTTGG和TGCCGCCGCTCTCTCACC。所得含有與TATA盒相關的—4551至+88片段的4.5kb片段用寡核苷酸TCGGGTACCGAGGGCGCGGTGCTTGG   和ATACTCGAGTGCCGCCGCTCTCTCACC再次擴增20個循環(huán),退火溫度為88℃,得到4.5kb片段,然后用寡核苷酸對TCGGGTACCGGTAGATGGGAGCGGATAGACACATC和ATACTCGAGTGCCGCCGCTCTCTCACC擴增20個循環(huán),退火溫度為88℃,得到含有與TATA盒相關的-1300至+88片段的1.3kb片段。寡核苷酸中的限制位點(下劃線序列)XhoI和KpnI用于亞克隆。
      將pGL3-基本型的熒光素酶報告子移除并用KpnI和XbaI限制位點的ZsGreen報告子取代(來自于pZsGreen1-N1質(zhì)粒)。通過將上述人p21啟動子區(qū)域的1.3kb片段在XhoI和KpnI位點插入pGL3-basic-ZsGreen中構建pGL3-basic-ZsGreen-1300。所有的限制性酶由Boehringer Manheim(德國)提供。將A2780細胞以2x105細胞的濃度加入6孔板中,溫育24小時,用Lipofectamine 2000(Invitrogen,Brussels,Belgium)根據(jù)使用說明用2μg pGL3-basic-ZsGreen-1300和0.2μg pSV2neo載體轉化。與G418(Gibco-BRL,Gaithersburg,MD)溫育10天篩選轉化細胞,單細胞懸液生長。三周后得到單個克隆。
      將A2780的已篩選克隆擴增并以10000細胞/孔接種至96孔板。接種后24小時,用化合物(影響鄰近p21啟動子區(qū)域的sp1位點)繼續(xù)處理24小時。然后將細胞與4% PFA混合30秒并用Hoechst染料復染。p21啟動子的活化導致生成ZsGreen并因此產(chǎn)生熒光,用AscentFluoroskan(Thermo Labsystems,Brussels,Belgium)監(jiān)測。
      對于每一項試驗,對照(不含藥物)和空白溫育(不含細胞或藥物)平行進行。從所有對照和樣品值中減去空白值。對于每一個樣品,p21誘導值表示為對照中p21值的百分比。誘導百分比大于130%定義為顯著誘導。
      實施例C.6.b體內(nèi)方法 將篩選克隆皮下注射裸鼠側腹,12天后得到圓規(guī)可測的腫瘤。從12天起將溶劑和20-40mpk化合物(每4-10只動物)每天口服或靜脈給藥動物,持續(xù)6天。用內(nèi)部研發(fā)的自動全身成像系統(tǒng)(安裝有GFP濾器并與CCD相機(型號

      CV-M90,由基于National

      的IMAQ視覺軟件控制)偶聯(lián)的熒光立體顯微鏡,型號

      SZX12)檢測腫瘤熒光?;衔颮306465(WO03/76422)作為參比使用。將化合物分為非活性(沒有可檢測的熒光)、較R306465更弱、相同或更強。
      實施例C.7P450抑制能力 將所有化合物溶于DMSO(5mM)中并進一步用乙腈稀釋至510-4M。然后用檢測緩沖液進一步稀釋(0.1M NaK磷酸緩沖液pH7.4)并且終濃度不高于2%。
      CYP3A4蛋白檢測包括每孔15pmol P450/mg蛋白(0.01M NaK磷酸緩沖液+1.15% KCl)、NADPH生成體系(3.3mM葡萄糖-6-磷酸,0.4U/ml葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、1.3mM NADP和3.3mMMgCl2.6H2O的檢測緩沖液溶液)和化合物,總檢測體積為100μl。于37℃預溫育5分鐘后加入150μM熒光探針底物BFC的檢測緩沖液溶液起始反應。在室溫下溫育30分鐘后加入2體積的乙腈終止反應。在405nm激發(fā)光和535nm發(fā)射光下測定熒光。本試驗中酮康唑(IC50-值=3 X 10-8M)作為參比化合物加入。CYP2D6蛋白質(zhì)檢測包括每孔6pmol P450/mg蛋白(0.01M NaK磷酸緩沖液+1.15% KCl)、NADPH生成體系(0.41mM葡萄糖-6-磷酸,0.4U/ml葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、0.0082mM NADP和0.41mM MgCl2.6H2O的檢測緩沖液溶液)和化合物,總檢測體積為100μl。于37℃預溫育5分鐘后加入3μM熒光探針底物AMMC的檢測緩沖液溶液起始酶反應。在室溫下溫育45分鐘后加入2體積的乙腈終止反應。在405nm激發(fā)光和460nm發(fā)射光下測定熒光。本試驗中奎尼丁(IC50-值<5 X 10-8M)作為參比化合物加入。
      CYP2C9蛋白質(zhì)檢測包括每孔15pmol P450/mg蛋白(0.01M NaK磷酸緩沖液+1.15% KCl)、NADPH生成體系(3.3mM葡萄糖-6-磷酸,0.4U/ml葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、1.3mM NADP和3.3mMMgCl2.6H2O的檢測緩沖液溶液)和化合物,總檢測體積為100μl。于37℃預溫育5分鐘后加入200μM熒光探針底物MFC的檢測緩沖液溶液起始酶反應。在室溫下溫育30分鐘后加入2體積的乙腈終止反應。在405nm激發(fā)光和535nm發(fā)射光下測定熒光。本試驗磺胺苯吡唑(IC50-值=6.8 X 10-7M)作為參比化合物加入。
      對于起始掃描,在單一固定濃度1 X 10-5M下檢測化合物,重復該試驗以建立完整濃度-效應曲線。對于每一項試驗,對照(不含藥物)和空白溫育(不含酶或藥物)平行進行。所有化合物均檢測四次。從所有對照和樣品值中減去空白值。對于每一份樣品,樣品P450活性的平均值(相對熒光單位)表示為對照P450活性平均值的百分比。百分抑制表示為100%減去樣品P450活性的平均值。適當時計算IC50-值(將p450活性降低至對照50%所需的藥物濃度)。
      表F-2依據(jù)實施例C.1、C.2和C.3.b檢測的化合物的結果(空白表示沒有相關化合物的數(shù)值) 表F-2 D.組合物實施例薄膜包衣片 片芯制備 將100g式(I)化合物、570g乳糖和200g淀粉的混合物混合均勻并用5g十二烷基硫酸鈉和10g聚乙烯吡咯烷酮的水(約200ml)溶液潤濕。將濕粉末混合物過篩、干燥并重新過篩。然后加入100g微晶纖維素和15g氫化植物油。將整體混合均勻并壓制成片,得到10000片,每一片包括10mg式(I)化合物。
      包衣 向10g甲基纖維素的變性乙醇(75ml)溶液中加入5g乙基纖維素的二氯甲烷(150ml)溶液。然后加入75ml二氯甲烷和2.5ml1,2,3-丙三醇。將10g聚乙二醇溶化并溶解于75ml的二氯甲烷中。將后一溶液加入前一溶液中,然后加入2.5g硬脂酸鎂、5g聚乙烯吡咯烷酮和30ml濃縮顏料混懸液并將整體混勻。在包衣裝置中用所得混合物將片芯包衣。
      權利要求
      1.式(I)化合物,
      其N-氧化物形式、藥學可接受的加成鹽和立體化學異構體形式,
      其中
      X為N或CH;
      R1為羥基或式(a-1)的基團
      其中
      R4為羥基或氨基;
      R5為氫、噻吩基、呋喃基或苯基并且各噻吩基、呋喃基或苯基任選被一個或兩個以下基團取代鹵素、氨基、硝基、氰基、羥基、苯基、C1-6烷基、(二C1-6烷基)氨基、C1-6烷氧基、苯基C1-6烷氧基、羥基C1-6烷基、C1-6烷氧基羰基、羥基羰基、C1-6烷基羰基、多鹵代C1-6烷氧基、多鹵代C1-6烷基、C1-6烷基磺酰基、羥基羰基C1-6烷基、C1-6烷基羰基氨基、氨基磺?;?、氨基磺酰基C1-6烷基、異噁唑基、氨基羰基、苯基C2-6烯基、苯基C3-6炔基或吡啶基C3-6炔基;
      R6、R7和R8各自獨立為氫、氨基、硝基、呋喃基、鹵素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、三氟甲基、噻吩基、苯基、C1-6烷基羰基氨基、氨基羰基C1-6烷基或-C≡C-CH2-R9;
      其中R9為氫、C1-6烷基、羥基、氨基或C1-6烷氧基;
      R2為氨基、C1-6烷基氨基、芳基C1-6烷基氨基、C1-6烷基羰基氨基、C1-6烷基磺?;被3-7環(huán)烷基氨基、C3-7環(huán)烷基C1-6烷基氨基、戊二酰亞胺基、馬來酰亞胺基、酞酰亞胺基、琥珀酰亞胺基、羥基、C1-6烷氧基、苯氧基,其中所述苯氧基的苯基部分任選被一個或兩個取代基取代,取代基各自獨立選自鹵素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、氰基、C1-6烷氧基羰基和三氟甲基;
      R3為苯基、萘基或雜環(huán)基;其中
      各所述苯基或萘基可任選被一個或兩個取代基取代,取代基各自獨立選自鹵素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、多鹵代C1-6烷基、芳基、羥基、氰基、氨基、C1-6烷基羰基氨基、C1-6烷基磺?;被?、羥基羰基、C1-6烷氧基羰基、羥基C1-6烷基、C1-6烷氧基甲基、氨基甲基、C1-6烷基氨基甲基、C1-6烷基羰基氨基甲基、C1-6烷基磺?;被谆被酋;?、C1-6烷基氨基磺?;碗s環(huán)基;
      芳基為苯基或萘基;其中各所述苯基或萘基任選被一個或兩個取代基取代,取代基各自獨立選自鹵素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、三氟甲基、氰基和羥基羰基;及
      雜環(huán)基為呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡咯啉基、吡咯烷基、二氧雜環(huán)戊烯基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、咪唑啉基、咪唑烷基、吡唑基、吡唑啉基、吡唑烷基、異噁唑基、異噻唑基、噁二唑基、三唑基、噻二唑基、吡喃基、吡啶基、哌啶基、二噁烷基、嗎啉基、二噻烷基、硫代嗎啉基、噠嗪基、嘧啶基、吡嗪基、哌嗪基、三嗪基、三噻烷基、吲嗪基、吲哚基、吲哚滿基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、嘌呤基、喹嗪基、喹啉基、噌啉基、酞嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基或萘啶基;其中
      各所述雜環(huán)基任選被一個或兩個取代基取代,取代基各自獨立選自鹵素、C1-6烷基、C1-6烷氧基、氰基、氨基和單或雙(C1-4烷基)氨基。
      2.根據(jù)權利要求1的化合物,其中
      a)X為N;
      b)R1為羥基
      c)R2為氨基、C1-6烷基羰基氨基、C1-6烷基磺?;被?、酞酰亞胺基、琥珀酰亞胺基或苯氧基,其中所述苯氧基的苯基部分任選被鹵素取代基取代;及
      d)R3為被一個或兩個取代基任選取代的苯基,取代基各自獨立選自鹵素、C1-6烷基、C1-6烷氧基和多鹵代C1-6烷基。
      3.根據(jù)權利要求1的化合物,其中
      a)X為N;
      b)R1為羥基;
      c)R2為氨基;及
      d)R3為被選自鹵素和C1-6烷氧基的取代基任選取代的苯基。
      4.根據(jù)權利要求1的化合物,其中化合物2為以下所指
      5.一種藥物組合物,含有藥學可接受的載體和作為活性成份的治療有效量的權利要求1-4中任一項所要求保護的化合物。
      6.制備如權利要求5要求保護的藥物組合物的方法,其中將藥學可接受載體與權利要求1-4中任一項所要求保護的化合物充分混合。
      7.權利要求1-4中任一項要求保護的化合物,作為藥物使用。
      8.權利要求1-4中任一項要求保護的化合物在生產(chǎn)治療增殖性疾病的藥物中的用途。
      9.一種抗癌藥物和權利要求1-4中任一項要求保護的HDAC抑制劑的組合。
      10.制備權利要求1要求保護的化合物的方法,其特征為
      a)將式(II)化合物與適當?shù)乃岱磻纬墒?I-a)化合物
      b)將式(III)中間體(其中M代表氫或堿金屬)與式(IV)化合物反應形成式(I-b)化合物
      11.式(B)化合物,其中Q為C1-2烷氧基羰基、MO2C(其中M為氫或堿金屬)或四氫吡喃氧基氨基羰基、R2a如對R2所定義或為羥甲基,X和R3如對式(I)所定義,及其N-氧化物、藥學可接受的加成鹽和立體化學異構體
      12.制備權利要求11所要求的化合物的方法,其特征為
      a)將式(III)中間體與式(V)中間體反應生成式(B)中間體,其中Q為四氫吡喃氧基氨基羰基,由下式(II)表示
      b)將式(VI)中間體與適當?shù)乃崛芤夯蜻m當?shù)膲A金屬堿反應生成式(B)中間體,其中Q為MO2C,由下式(III)表示
      c)將式(X)中間體與偶氮二甲酸二異丙基酯(DIAD)、三-正-丁基膦(PBu3)和適當?shù)挠H核劑R2H(XI)反應生成式(B)中間體,其中Q為C1-2烷氧基羰基,由下式(VI)表示
      d)將式(XII)的中間體與1,4-二噁烷-2,5-二醇和式(XV)適當?shù)呐鹚岱磻?其中R3如上定義)生成式(B)中間體,其中Q為C1-2烷氧基羰基,R2a為下式(X)表示的羥甲基
      全文摘要
      本發(fā)明包括新型式(I)化合物,其中R1、R2、R3和X具有確定意義,具有組蛋白去乙?;敢种泼富钚?;它們的制備、包含它們的組合物以及將它們作為藥物的用途。
      文檔編號C07D409/14GK101370790SQ200780002738
      公開日2009年2月18日 申請日期2007年1月16日 優(yōu)先權日2006年1月19日
      發(fā)明者L·F·B·馬康內(nèi)特-德克拉恩, S·F·D·高蘭德, P·R·安基鮑德 申請人:詹森藥業(yè)有限公司
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