專利名稱：一種葉下珠多糖組份的提取分離方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一種涉及葉下珠多糖組份TOIP II的提取分離方法。
背景技術(shù)：
珠^Phyllanthus urinaria L ),又名珍珠草、夜合草、陰陽草,屬于大戟科(Euphorbi aceae)葉下珠屬植物葉下珠的干燥全草，在民間廣泛用于利水解毒、平肝清熱。1988年，印度學(xué)者Thyagarajan等人首次通過實(shí)驗(yàn)證明苦味葉下珠可以使59%患者的乙肝表面抗原(HBsAg)轉(zhuǎn)陰，這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果引起了國內(nèi)外學(xué)者對葉下珠的關(guān)注。大量研究表明]葉下珠具有抗乙肝病毒、保肝降酶、抗肝纖維化、防止肝損傷和抗癌變的效果，且毒副作用低，是一種值得深入開發(fā)的治療乙型肝炎的天然藥材。葉下珠中含有多種化學(xué)成分，文獻(xiàn)已經(jīng)報(bào)道過的有木脂素、萜類、黃酮、糅質(zhì)、生物堿等，包括正十八烷、去氫訶子次酸、阿魏酸、沒食子酸、短葉蘇木酚酸、丁二酸、甲氧基糅花酸、山茶素、老鶴草素、短葉蘇木酸甲脂、短葉蘇術(shù)酚酸乙脂、柯里拉京、去氫訶子次酸三甲月旨、多糖等等。

多糖類化合物具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗炎、抗消化性潰瘍、抗凝血、降血糖、降血脂、抗輻射、抗血栓、抗水腫、抗毒物損傷等多種生物活性。乙型病毒性肝炎(HBV)是全球性的公共衛(wèi)生問題，根據(jù)全球衛(wèi)生組織(WHO)數(shù)據(jù)，全世界有3. 5 4. O億乙肝病毒感染者，其中每年有近100萬患者死于HBV感染引起的肝功能衰竭、肝硬化和肝癌。目前應(yīng)用于乙型肝炎治療的藥物主要是干擾素和核苷類似物，然而這些藥物只能獲得某種程度上的治療效果。在尋找乙肝治療藥物的過程中，中藥多糖成分越來越受到人們的重視。葉下珠具有抗乙肝病毒，保肝，抗腫瘤等功效已得到普遍證實(shí)，并且相關(guān)學(xué)者也對其中的幾種化學(xué)成分，如沒食子酸、黃酮類及葉下珠素等做了結(jié)構(gòu)和生物活性的研究，但對其中的多糖研究卻很少。開展對葉下珠中多糖成分的提取分離，結(jié)構(gòu)鑒定及生物活性的檢測，有利于進(jìn)一步確定葉下珠用于治療乙型肝炎的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，更好地開發(fā)葉下珠這一藥用植物資源，為尋找乙肝治療新藥打下理論基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種葉下珠多糖組份I3UIP II的提取分離方法。本發(fā)明所述的葉下珠多糖組份TOIP II的提取分離方法，包括如下步驟
O葉下珠全草用蒸餾水洗凈，干燥后粉碎，用石油醚脫脂，乙醇脫小分子糖后，藥渣用水浸提，浸提液離心分離，取清液濃縮后加入乙醇醇沉，醇沉物即為粗總多糖；粗總多糖經(jīng)2)除蛋白，3)醇沉、洗滌和4)透析、干燥即得葉下珠精總多糖；5)多糖各組分分離純化葉下珠精總多糖過離子交換柱，用NaCl溶液梯度洗脫，苯酚一硫酸法跟蹤檢測，繪制洗脫曲線，洗脫曲線上依次出現(xiàn)四個(gè)峰，分別代表四個(gè)多糖組分，按照出峰的順序分別記為PULP1、PULP I1、PULP III和I3ULP IV，收集第2主峰組分，濃縮，重蒸水透析，冷凍干燥得葉下珠多糖PULP II純組分。步驟I)粉碎的葉下珠全草粉末，用石油醚在70 90°C下回流提取2 4次，每次I 3小時(shí)，棄去回流液，藥渣繼續(xù)用50 100%乙醇在80 95°C下回流提取2 4次，每次I 3小時(shí)，棄去回流液，得到的藥渣再用60 95 °C水浸提3次，每次I 3小時(shí)，合并3次浸提液進(jìn)行離心分離，離心速度2000 6000r/min，取清液濃縮至原體積1/4，加入4倍體積的90 100%乙醇，靜置24h，離心，取醇沉物即為粗多糖。步驟2)所述除蛋白采用Sevag法脫蛋白將步驟I)得到的醇沉物用蒸餾水復(fù)溶得粗多糖溶液，在粗多糖溶液中加入氯仿和正丁醇混合液，粗多糖溶液氯仿和正丁醇混合液體積為I 6 :1 3，所述氯仿和正丁醇混合液中氯仿正丁醇體積比=1 4:1 4，攪拌，充分靜置分層，棄去沉淀，重復(fù)I 10次后直至界面無白色沉淀。步驟3)所述醇沉、洗滌在除蛋白后的多糖溶液中加入3 6倍體積的75 100%乙醇，靜置12 36h，離心，沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚清洗，重復(fù)2 5次。步驟4)所述透析、干燥取醇沉、洗滌后的多糖加入蒸餾水，充分復(fù)溶后用蒸餾水透析，透析在磁力攪拌下進(jìn)行，樣品液與蒸餾水體積比為1:10 30，4 8h換一次水，透析12 120h，透析完畢后將糖溶液放入冷凍干燥機(jī)中干燥得葉下珠精總多糖，多糖含量在95%以上。步驟5)的離子交換柱采用DEAE-52陰離子交換樹脂。步驟5)所述NaCl溶液的濃度梯度范圍為O 3mol/L。優(yōu)選地，所述NaCl溶液的濃度梯度分別為 0、0· 1,0. 25,0. 5,0. 75mol/L。
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步驟5)依次用不同濃度NaCl梯度洗脫，每種濃度NaCl溶液洗脫8小時(shí)，流速4mL/min，用管收集洗脫液，每IOmin收集一管，繪制洗脫曲線。所述洗脫曲線以收集的管序?yàn)闄M坐標(biāo)，溶液的光吸收度為縱坐標(biāo)繪制而成。本發(fā)明所述的葉下珠多糖TOIP II，為土黃色粉末，易吸潮，是一類不含有N、S元素酸性多糖，相對平均分子量為579962. 6 ；PULP II單糖組成及其比例為鼠李糖(Rha):阿拉伯糖(Ara):甘露糖(Man):葡萄糖(Glc)為 O. 11:0. 36:0. 08:0. 45 ;主鏈由 Rha>Ara 和 Glc組成。各單糖通過呋喃糖苷鍵連接，糖苷鍵以I — 6連接為主，同時(shí)還存在I — 4和I — 3連接方式。本發(fā)明所述的葉下珠多糖TOIP II，具有一定的抗氧化、抗乙肝病毒活性。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是通過對葉下珠粗多糖的分離純化，得到了純凈單一的葉下珠多糖成分。通過對多糖的純組分PULP II的結(jié)構(gòu)分析及體外抗氧化、抗病毒活性實(shí)驗(yàn)的研究，確證了葉下珠多糖是葉下珠治療乙肝的有效成分，這為研究葉下珠多糖的抗乙肝病毒作用機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)；今后可在此基礎(chǔ)上，結(jié)合多糖的構(gòu)效關(guān)系，進(jìn)一步為開發(fā)以葉下珠多糖為原材料的抗乙肝病毒藥物奠定基礎(chǔ)。


圖1為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖2為多糖梯度洗脫曲線。圖3為H印G2. 2. 2. 15細(xì)胞分泌HBsAg、HBeAg的規(guī)律。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明
實(shí)施例1葉下珠多糖的提取
I材料與方法1.1材料(略)
1.2實(shí)驗(yàn)方法
1.2.1葉下珠預(yù)處理
葉下珠全草蒸餾水洗滌去土，50°C低溫干燥后，粉碎，密封備用。其粉末為黃綠色。1. 2. 2葉下珠多糖的提取方法
石油醚80 1回流脫脂一95%乙醇80 1回流脫小分子糖一90 °C水回流提取3次，合并3次濾液4000r/min離心，濃縮至1/4體積一加入4倍體積的95%乙醇，靜置24h，離心，蒸懼水復(fù)溶一sevag法除蛋白(氯仿正丁醇=4:1,多糖溶液混合液=3:1),磁力攪拌30min,充分靜置分層，重復(fù)7 8次操作即可除去游離蛋白質(zhì)一除蛋白后的多糖溶液加入4倍體積的95%乙醇沉淀24h —依次用無水乙醇、丙酮、乙醚清洗、重復(fù)三次一透析72h —冷凍干燥得葉下珠總多糖(PULP )。1. 2. 3葉下珠總多糖含量的測定1.2. 3.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液和樣品供試液的制備
精密稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品(在105°C下干燥到重量不再發(fā)生變化)10mg，用蒸餾水溶解后，置于IOOmL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，制成O. lmg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，備用。

精密稱取干燥至恒重的葉下珠多糖10mg，用蒸餾水溶解后，置于IOOmL容量瓶中加蒸懼水定容至刻度，搖勻，制成O. lmg/mL的樣品供試液備用。1. 2. 3. 2吸收波長的確定
取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液和樣品溶液各I mL,分別加入ImL 5%苯酹溶液(取5g重蒸苯酹于IOOmL棕色容量瓶中加蒸餾水定容)，搖勻后，懸空垂直加入5mL濃硫酸，置沸水浴中加熱15min，然后置冷水浴中冷卻，在400 600 nm范圍內(nèi)全波長掃描，確定吸收波長。L 2. 3. 3葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作
精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液O. 2,0. 4,0. 6,0. 8、ImL于IOmL具塞刻度試管中，依次添加水使終體積為ImL,空白對照為ImL水,然后加入ImL 5%苯酹溶液搖勻,迅速加入5mL濃硫酸(懸空垂直加入)，置沸水浴中加熱15min,然后置冷水浴中冷卻，于490nm處測定吸光度。以吸光度為Y軸，葡萄糖質(zhì)量為X軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程。1. 2. 3. 4糖含量的計(jì)算
精密吸取供試液lmL，按“1. 2. 3. 3”同法操作，于490nm處測定吸光度。按照公式計(jì)算糖含量
糖含量=C / (C0X V) X 100%
C :由標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的葡萄糖微克數(shù) C0 :樣品溶液的濃度(O.1 mg/mL)
V :測定時(shí)用的樣品溶液體積(1. OmL)1.2. 3. 5多糖的提取率
多糖的提取率=多糖的質(zhì)量/原材料的質(zhì)量X 100 %2.結(jié)果與分析
2..1測定波長的確定
樣品溶液和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液的最大吸收峰波長都在490 nm左右處，所以選取490 nm作為多糖含量的測定波長。2. 2葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線
以吸光度為Y軸，葡萄糖微克數(shù)()為X軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1，可以看出在20 100 g范圍內(nèi)，葡萄糖量與吸光度有良好的線性關(guān)系。2. 3糖含量
測得樣品液的吸光度A為O. 388，根據(jù)回歸方程計(jì)算其相應(yīng)葡萄糖的微克數(shù)為28. 27 g。根據(jù)公式得糖含量
糖含量=C / (C0X V) X 100%=28. 27/(0. 1X1) X 100%=28. 27%
2.4多糖的提取率
多糖的提取率==1. 5/100X 100 %=1. 5%
3結(jié)論
本實(shí)驗(yàn)通過石油醚脫脂，再以95%的乙醇脫去低聚糖等小分子物質(zhì)，然后以水提醇沉法從葉下珠中分離出多糖，并采用sevag法脫蛋白，苯酚一硫酸法測定其含量，其最大吸收波長為490nm，多糖提取率為1. 5%，糖含量為28. 27%。實(shí)施例2葉下珠多糖的分離純化 I材料與方法1.1材料(略)
1.2.實(shí)驗(yàn)方法1. 2.1 DEAE-52 柱分離1.2.1.1 DEAE-52填料預(yù)處理
DEAE-52纖維素填料用蒸餾水浸泡48h，期間4 5h換一次水，并用傾瀉法除去懸浮雜質(zhì)，然后進(jìn)行堿-酸-堿處理。先用O. 5 mol/L的NaOH溶液浸泡30 min后蒸懼水洗至中性，再用O. 5 mol/L的HCl溶液浸泡30 min后蒸餾水洗至中性，最后用O. 5 mol/L的NaOH溶液浸泡30 min后蒸餾水洗至中性，得到0H_型纖維素。濕法裝柱(柱尺寸為500 X 50mm)，蒸餾水平衡48h，裝柱過程中避免氣泡及斷層現(xiàn)象。1. 2.1. 2過DEAE-52層析柱分離純化
稱取640mg葉下珠總多糖溶于80mL重蒸水中(8 mg/mL),過O. 45 μ m濾膜后上樣。依次用 0、0· 1,0. 25,0. 5,0. 75mol/L NaCl 梯度洗脫，每 IOmin 收集一管，流速 4mL/min ;苯酚-硫酸法跟蹤檢測，收集各主峰組分，濃縮，重蒸水透析48h，冷凍干燥得葉下珠多糖各組分。1. 2. 2.純度鑒定1.2. 2.1 SephadexG-200葡聚糖凝膠過濾法
SephadexG-200的預(yù)處理S印hadexG-200填料加適量蒸餾水浸泡24h，期間4 5h換一次水，并用傾瀉法除去懸浮雜質(zhì)，然后超聲脫氣直到凝膠液中沒有氣泡出現(xiàn)為止。濕法裝柱(柱尺寸為500 X 25mm)，用0.05 mol/L的NaCl溶液平衡48 h后備用。SephadexG-200柱層析將上面收集的各組分配制成25mg/mL的樣品液,上樣2mL,用O. 05 mol/L的NaCl洗脫。自動(dòng)部分收集器收集,每管5 mL,每30 min收集一管,苯酹-硫酸法跟蹤檢測。1. 2. 2 2 HPLC高效液相色譜法
將純化后的各組分多糖配制成lmg/mL的樣品液,過O. 45 μ m的濾膜后進(jìn)樣。色譜條件色譜柱PolyS印-SEC4000 Part No:00H-3144-K0 ColumnSize:300X7. 8mm ;
檢測器示差檢測器；柱溫30°C;流動(dòng)相雙蒸水；流速0. 8 mL/min ;進(jìn)樣量20 μ L。2結(jié)果與分析·
2.1 DEAE-52柱層析分離結(jié)果
經(jīng)過脫蛋白，透析處理后的葉下珠精多糖(PULP)，過DEAE - 52離子交換柱，依次用O、O. U0. 25,0. 5,0. 75mol/L NaCl溶液梯度洗脫，苯酚一硫酸法跟蹤檢測，得如圖2所示中洗脫曲線。由圖2可以看出，TOLP經(jīng)DEAE-52柱層析分離后，能夠明顯分離出四個(gè)峰形對稱的洗脫峰，分別代表四個(gè)組分，記為I3ULP1、PULP I1、PULP III和I3ULP IV。收集含量較大的組分PULP II做進(jìn)一步分析。2. 2 SephadexG-200 柱和 HPLC 純度鑒定 2. 2.1 SephadexG-200 柱結(jié)果
取葉下珠多糖組分I3ULP II過S印hadexG-200凝膠柱，NaCl洗脫，苯酚一硫酸法跟蹤檢測，用吸光度值與洗脫管數(shù)作洗脫曲線，PULP II在Sephadex G-200柱上的洗脫曲線是對稱的單一峰，說明TOLP II組分是分子量相對均一的多糖組分。2. 2. 2 HPLC法純度鑒定
利用HPLC法檢測葉下珠多糖組分TOLP II的純度時(shí)，結(jié)果顯示，經(jīng)DEAE-52纖維素柱分離純化后的多糖組分PULP II，在高效液相圖譜上峰型比較對稱，且經(jīng)過面積歸一法計(jì)算其純度達(dá)到95%以上，與S印hadex G-200凝膠色譜圖結(jié)果相吻合，說明純度比較高，可以用來做結(jié)構(gòu)鑒定。3 結(jié)論
水提醇沉脫蛋白后的葉下珠多糖經(jīng)過DEAE-52纖維素柱分離純化后得到四個(gè)組分，分別記為 I3ULP I ,PULP I1、TOLPIII和 I3ULPIV。收集含量較大的組分I3ULP II，用 S印hadexG-200凝膠柱層析法和高效液相色譜法(HPLC)兩種方法進(jìn)行純度鑒定，證明其組分相對均一，可以進(jìn)一步做結(jié)構(gòu)分析。實(shí)施例3 PULP II的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)分析1、理化性質(zhì)
PULP II為土黃色粉末，易吸濕。易溶于水，不溶于乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑。Molish反應(yīng)、苯酚-硫酸反應(yīng)、硫酸-咔唑反應(yīng)陽性，茚三酮反應(yīng)、碘-碘化鉀反應(yīng)、斐林反應(yīng)、三氯化鐵反應(yīng)和硫酸基反應(yīng)為陰性。由理化性質(zhì)，糖醛酸含量測定，元素分析、紅外和紫外，HPLC綜合分析表明PULP II中是一類不含有N、S元素酸性多糖，相對平均分子量為579962. 6。2、PULP II的紅外吸收圖譜
紅外圖譜表明，PULP II 在 3100 3500 cm_1,2800 2900 cnT1，1400 1530 cnT1，1000 1100 cnT1處有明顯的多糖的特征吸收峰。且PULP II在1010 1100 cnT1有兩個(gè)強(qiáng)吸收峰，說明有呋喃型糖苷鍵存在。
由單糖組成和部分酸水解結(jié)果分析，PULP II單糖組成及其比例為Rha:Ara: ManiGlc 為 0. 11:0. 36:0. 08:0. 45 ;主鏈主要由 Rha, Ara 和 Glc 組成。綜合高碘酸氧化和Smith降解結(jié)果分析，PULP II糖苷鍵以I — 6連接為主，同時(shí)還存在I — 4和I — 3連接方式。實(shí)施例4葉下珠多糖I3UIP II的體外抗氧化活性初歩研究 I材料與方法1.1材料與試劑(略)
1.2實(shí)驗(yàn)方法1. 2.1多糖還原カ的測定
實(shí)驗(yàn)參考Oyaizu方法，略做稍微改動(dòng)。取I mL不同濃度(l、2、3、4、5mg/mL)的多糖溶液于具塞試管中，然后分別加入2. 5 mL 0.2 mol/L pH 6.6磷酸緩沖溶液及1%鐵氰化鉀溶液，50で水浴反應(yīng)20 min后冰浴迅速冷卻，加入2. 5 mL 10%的三氯こ酸溶液，搖勻，離心(3000 r/min, 10 min)。取上清液 2. 5 mL，_2.5 mL 雙蒸水和 0. 5 mL 0.1% FeCl3,搖勻，反應(yīng)10 min后，測定700 nm處的吸光度。1.2..2多糖體外羥基自由基( 0H)清除率的測定
在Fenton反應(yīng)體系中，H2O2與Fe2 +混合產(chǎn)生 0H。由于 OH反應(yīng)活性強(qiáng)，存活時(shí)間很短，加入水楊酸，就能有效地捕捉到.0H，并生成在510 nm處有強(qiáng)吸收的有色物質(zhì)。同時(shí)，若在此體系中加入與水楊酸有競爭作用的能夠清除.OH的物質(zhì)，則有色物質(zhì)的生成量變少，吸光度變低，吸光度越低，證明該物質(zhì)清除.OH的能力越強(qiáng)。在具塞試管中 分別加入2 mL 9 mmol/L的FeSO4溶液、2 mL 9 mmol/L的水楊酸こ醇溶液，不同濃度(l、2、3、4、5mg/mL)的多糖溶液，最后加入2 mL 8. 8mmol/L的H2O2溶液啟動(dòng)反應(yīng)，室溫下反應(yīng)30 min，測定510 nm處的吸光度，以蒸餾水代替多糖溶液做空白對照。自由基清除率計(jì)算公式P= (A0-Ai) /A0X 100%
A0 :空白吸光度，A1:樣品吸光度
1.2. 3抗脂質(zhì)過氧化能力
吸取 0.4 mL 卵黃懸液[V (卵黃):V (PBS) =1:25], I mL 不同濃度(l、2、3、4、5mg/mL)的多糖溶液，0.4 mL 25 mmol/L的FeSO4，于具塞試管中，加入0.1 mol/LpH7. 45的PBS溶液至總體積為4. 0 mL，37°C水浴恒溫振蕩15 min。取出后加入1. 0 mL 20%的TCA，靜置10min后，離心(3500 r/min, 10 min)。吸取4. 0 mL上清液,加入2.0 mL 0.8%的硫代巴比妥酸，加塞，沸水浴15 min，冷卻后，以PBS做參比，測定532 nm處的吸光值。樣品對卵黃脂蛋白脂質(zhì)過氧化的抑制率表示樣品的抗氧化活性的能力，即
抑制率 I= (A0-A)/A0X 100%
Atl-對照管的吸光度；A-樣品的吸光度 2結(jié)果與分析
2.1 PULP II的還原カ
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明各濃度下的PULP II多糖溶液都具有一定的還原能力，并且在I 5mg/mL的濃度范圍內(nèi)，其還原カ隨濃度的增高而增強(qiáng)。2. 2 PULP II體外羥基自由基清除率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明各濃度下的PULP II多糖溶液對體外羥基自由基都有一定的清除能力，并且在I 5mg/mL的濃度范圍內(nèi)，其清除率隨濃度的增高而增強(qiáng)。5mg/mL吋，PULP II的清除率為35. 5%。2.3 PULP II抗脂質(zhì)過氧化能力
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明各濃度下的PULP II多糖溶液對LPO均具有一定的抑制作用，并且在I 5mg/mL的濃度范圍內(nèi)存在量效關(guān)系，其抑制率隨濃度的增高而增強(qiáng)。5mg/mL吋，PULP II的抑制率為10. 7%。3 結(jié)論
葉下珠多糖PULP II具有一定的還原力、清除體外羥基自由基能力和抗脂質(zhì)過氧化能力，并且隨著多 糖濃度的增大而增強(qiáng)。在5mg/mL時(shí)，PULP II的還原カ為0. 538，對體外羥基自由的清除率達(dá)到35. 5%，對LPO的抑制率分別為10. 7%。這說明葉下珠多糖具有一定的抗氧化活性并且其抗氧化活性主要表現(xiàn)在清除體外羥基自由基上。
實(shí)施例5葉下珠多糖I3UIP II體外抗こ肝病毒研究本試驗(yàn)采用目前應(yīng)用最廣泛的體外抗こ肝病毒藥物篩選模型H印G2. 2. 2. 15細(xì)胞模型，從、葉下珠提取分離得到PUIP II與H印G2. 2. 2. 15細(xì)胞作用，取其細(xì)胞上清液，分別測定其こ肝表面抗原(HBsAg)、e抗原(HBeAg)的滴度變化，來判斷該藥物是否有效，并采用MTT法測定各部分的細(xì)胞毒性。綜合這ニ個(gè)指標(biāo)，對葉下珠多糖PUIP II進(jìn)行體外抗こ肝藥效學(xué)試驗(yàn)，并選用臨床上已證實(shí)的具有抗こ肝病毒作用的阿昔洛韋(ACV)作為陽性對照藥物，以評價(jià)各部位抗こ肝病毒的效果，以此篩選有效部位或有效成分。I材料與方法1.1材料與試劑(略)1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1細(xì)胞的復(fù)蘇
基本步驟調(diào)配37°C -40°C的溫水；從液氮罐中取出H印G2. 2. 2. 15細(xì)胞凍存管，立即投入37°C -40°C的溫水中快速晃動(dòng)，直至凍存液完全融解，融解過程在l_2min內(nèi)完成；將細(xì)胞凍存懸液移入離心管，加入約5mL培養(yǎng)液，輕輕吹勻；將細(xì)胞懸液800r-1000r/min離心5min,棄上清液；給細(xì)胞沉淀加入完全培養(yǎng)液，輕輕吹吸打勻，將細(xì)胞懸液移入培養(yǎng)瓶，加足培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，置于37°C，5%C02細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。1. 2. 2細(xì)胞的傳代培養(yǎng)
H印G2. 2. 2. 15細(xì)胞置于5%C02，37°C培養(yǎng)。培養(yǎng)基為DMEM，添加10%的胎牛血清，3%L-谷氨酰胺1%，G418 200ug/mL，青霉素100u/mL，鏈霉素100u/mL。2. 2. 15細(xì)胞長滿培養(yǎng)瓶后，先用EDTA消化10-30秒，再用0. 25%胰酶37°C消化3_10min，加培養(yǎng)液吹打，I 3或1:4傳代，8天長滿，采用細(xì)胞記數(shù)板記數(shù)，配制成IO5個(gè)/mL接種細(xì)胞培養(yǎng)板，96孔板每孔
0.1mL ；24孔板每孔lmL，5%C02，37°C培養(yǎng)24小時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。1. 2. 3細(xì)胞計(jì)數(shù)方法
一般用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，按白細(xì)胞計(jì)數(shù)法進(jìn)行計(jì)數(shù)。取待稀釋的細(xì)胞懸液ImL加生理鹽水做5倍稀釋，用IOX 10的倍數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，中央為紅細(xì)胞計(jì)數(shù)用，四角大格為白細(xì)胞計(jì)數(shù)用，計(jì)數(shù)時(shí)僅統(tǒng)計(jì)完整的細(xì)胞，若聚成ー團(tuán)的細(xì)胞按ー個(gè)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，在一個(gè)方格中，如果有細(xì)胞位于線上，一般計(jì)上線不計(jì)下線，計(jì)左線不計(jì)右線，計(jì)數(shù)誤差不超過±5%，計(jì)數(shù)后需計(jì)算每mL懸液中的細(xì)胞數(shù)，由于計(jì)數(shù)板中的姆一方格的面積為0.1cm2,高為0. Olcm,體積為0. 0001cm3。姆mL細(xì)胞數(shù)按式I計(jì)算
每 mL 細(xì)胞數(shù)=(n/4) X10000X5(I)
式中n為四大格細(xì)胞總數(shù)1.2. 4 MTT比色法測細(xì)胞存活率
H印G2. 2. 2. 15細(xì)胞培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板，每孔80 U I培養(yǎng)液；加入20 u IMTT,繼續(xù)培養(yǎng)
3-4h ;吸去100 ill培養(yǎng)液，加入等量0.04-0. lmol/L鹽酸異丙醇溶液，室溫下約IOmin (或?qū)⑵桨逯糜谖⑿驼鹗幤髡鹗?，使結(jié)晶物溶解；在酶標(biāo)儀上測定光吸收，測定波長為570nm。1.2.5 MTT法測藥物毒性
將H印G2. 2. 2. 15細(xì)胞按IO5個(gè)/mL接種于96孔培養(yǎng)板中，0.1 mL/孔，次日用培養(yǎng)液將待測藥物分別配成幾種不同的濃度，加入細(xì)胞孔，每孔濃度加3孔，0.1mL/孔，并設(shè)無藥細(xì)胞對照及陽性對照藥。加藥后培養(yǎng)4天，棄上清用MTT染色，每孔加lmg/mL的MTT無血清培養(yǎng)液0. lmL，孵育4小時(shí)，棄上清，加入0. 04mol/L鹽酸異丙醇0.1mL溶解后，用570nm波長比色測定OD值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。1. 2. 6 測 HBsAg、HBeAg 分泌規(guī)律
將H印G2. 2. 2. 15細(xì)胞105/mL接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1. OmL,共10孔，第3、5、8、11、13天收集上清250 yl，培養(yǎng)液補(bǔ)足原量至第13天，培養(yǎng)上清于-20°C凍存，最后集中按試劑盒說明書，用ELISA法測定HBsAg、HBeAgo1. 2. 7藥物對HBV抑制試驗(yàn) 將H印G2. 2. 2. 15細(xì)胞按105/mL接種于24孔板，每孔1. OmL,次日棄培養(yǎng)液，以待測藥物的H印G2. 2. 2. 15細(xì)胞的半數(shù)毒性濃度為起始濃度用培養(yǎng)液進(jìn)行倍比稀釋，另設(shè)無藥對照及陽性對照藥，培養(yǎng)于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中。每4天收取上清，并換加原濃度藥液繼續(xù)培養(yǎng)，將收集的上清_20°C凍存，于第12天收集完，集中用ELISA法測定HBsAg、HBeAg，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。1. 2. 8 ELISA 法測 HBsAg、HBeAg
(I)將試劑盒各組分從盒中取出，平衡至室溫(18-25°C )。(2)濃縮洗滌液配制前充分搖勻如有晶體應(yīng)充分融解，濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水按1: 19稀釋后使用。(3)將微孔板條固定于支架，按序編號。(4)每孔加入待測標(biāo)本50 iU，設(shè)陰、陽對照各2孔，每孔加入陰、陽對照各50 iU，
并設(shè)空白對照一孔；
(5)每孔加入酶標(biāo)記抗體50Ul (除空白對照外)、充分混勻后封板，置于37°C環(huán)境中孵育 30min ；
(6)手工洗板；棄去孔內(nèi)液體，洗滌液貯滿各孔，靜置5秒后甩干，重復(fù)5次后拍干；
(7)每孔加顯色劑A液、B液各50iU，充分混勻，封板，置37°C環(huán)境中孵育15min；
(8)每孔加入終止液50u 1，混勻；
(9)用酶標(biāo)儀讀數(shù)，取波長450nm，先用空白空校零。然后讀取各孔OD值。(陰性對照OD值低于0. 05作為0. 05計(jì)算，高于0. 05按實(shí)際OD值計(jì)算。)1.3數(shù)據(jù)分析1.3.1 MTT法測藥物毒性后可得
權(quán)利要求
1.一種葉下珠多糖組份PUIP II的提取分離方法，包括如下步驟 1)葉下珠全草用蒸餾水洗凈，干燥后粉碎，用石油醚脫脂，乙醇脫小分子糖后，藥渣用水浸提，浸提液離心分離，取清液濃縮后加入乙醇醇沉，醇沉物即為粗總多糖；粗總多糖經(jīng)2)除蛋白，3)醇沉、洗滌和4)透析、干燥即得葉下珠精總多糖；5)多糖各組分分離純化葉下珠精總多糖過離子交換柱，用NaCl溶液梯度洗脫，苯酚一硫酸法跟蹤檢測，繪制洗脫曲線，洗脫曲線上依次出現(xiàn)四個(gè)峰，分別代表四個(gè)多糖組分，按照出峰的順序分別記為PULP1、PULP I1、PULP III和I3ULP IV，收集第2主峰組分，濃縮，重蒸水透析，冷凍干燥得葉下珠多糖PULP II純組分，即葉下珠多糖組份I3UIP II。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的葉下珠多糖組份PUIPII的提取分離方法，其特征在于步驟1)粉碎的葉下珠全草粉末，用石油醚在70 90°C下回流提取2 4次，每次I 3小時(shí)，棄去回流液，藥渣繼續(xù)用50 100%乙醇在80 95°C下回流提取2 4次，每次I 3小時(shí)，棄去回流液，得到的藥渣再用60 95 °C水浸提3次，每次I 3小時(shí)，合并3次浸提液進(jìn)行離心分離，離心速度2000 6000r/min，取清液濃縮至原體積1/4，加入4倍體積的90 100%乙醇，靜置24h，離心，取醇沉物即為粗多糖。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的葉下珠多糖組份PUIPII的提取分離方法，其特征在于步驟2)所述除蛋白采用Sevag法脫蛋白將步驟I)得到的醇沉物用蒸餾水復(fù)溶得粗多糖溶液，在粗多糖溶液中加入氯仿和正丁醇混合液，粗多糖溶液氯仿和正丁醇混合液體積為I 6 :1 3，所述氯仿和正丁醇混合液中氯仿正丁醇體積比=1 4:1 4，攪拌，充分靜置分層，棄去沉淀，重復(fù)I 10次后直至界面無白色沉淀。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的葉下珠多糖組份PUIPII的提取分離方法，其特征在于步驟3)所述醇沉、洗滌在除蛋白后的多糖溶液中加入3 6倍體積的75 100%乙醇，靜置12 36h，離心，沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚清洗，重復(fù)2 5次。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的葉下珠多糖組份PUIPII的提取分離方法，其特征在于步驟4)所述透析、干燥取醇沉、洗滌后的多糖加入蒸餾水，充分復(fù)溶后用蒸餾水透析，透析在磁力攪拌下進(jìn)行，樣品液與蒸餾水體積比為1:10 30，4 8h換一次水，透析12 120h，透析完畢后將糖溶液放入冷凍干燥機(jī)中干燥得葉下珠精總多糖。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的葉下珠多糖組份PUIPII的提取分離方法，其特征在于步驟5)的離子交換柱采用DEAE-52陰離子交換樹脂。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的葉下珠多糖組份PUIPII的提取分離方法，其特征在于步驟5)所述NaCl溶液的濃度梯度范圍為0 3mol/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的葉下珠多糖組份PUIPII的提取分離方法，其特征在于所述NaCl溶液的濃度梯度分別為0,0. 1,0. 25,0. 5,0. 75mol/L。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的葉下珠多糖組份PUIPII的提取分離方法，其特征在于步驟5)依次用不同濃度NaCl梯度洗脫，每種濃度NaCl溶液洗脫8小時(shí)，流速4mL/min，用管收集洗脫液，每10min收集一管，繪制洗脫曲線。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的葉下珠多糖組份PUIPII的提取分離方法，其特征在于所述洗脫曲線以收集的管序?yàn)闄M坐標(biāo)，溶液的光吸收度為縱坐標(biāo)繪制而成。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種葉下珠多糖組份PUIPⅡ的提取分離方法。包括如下步驟1)葉下珠全草用蒸餾水洗凈，干燥后粉碎，用石油醚脫脂，乙醇脫小分子糖后，藥渣用水浸提，浸提液離心分離，取清液濃縮后加入乙醇醇沉，醇沉物即為粗總多糖；粗總多糖經(jīng)2)除蛋白，3)醇沉、洗滌和4)透析、干燥即得葉下珠精總多糖；5)多糖各組份分離純化，收集第2主峰組份，得葉下珠多糖PULPⅡ純組份。本發(fā)明通過對葉下珠粗多糖的分離純化，得到了純凈單一的葉下珠多糖成分。通過對多糖的純組份PULPⅡ的結(jié)構(gòu)分析及體外抗氧化、抗病毒活性實(shí)驗(yàn)的研究，確證了葉下珠多糖是葉下珠治療乙肝的有效成分，這為研究葉下珠多糖的抗乙肝病毒作用機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。
文檔編號A61P31/20GK103059157SQ20131000570
公開日2013年4月24日 申請日期2013年1月8日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月8日
發(fā)明者李清祿, 李宇翔, 李凌峰, 張麗麗, 謝勇平, 曹高娟, 黃志堅(jiān) 申請人:福建農(nóng)林大學(xué)