專利名稱：一種抗豬瘟病毒的肽核酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種抗豬瘟病毒的肽核酸。
背景技術(shù)：
豬痕(HogCholera, HC),又稱之為經(jīng)典豬痕(Classical Swine Fever, CSF),不同于非洲豬瘟，系由豬瘟病毒(CSFV)引起的一種高度接觸性傳染病。豬瘟最早于19世紀(jì)30年代在美國(guó)的俄亥俄州發(fā)現(xiàn)，是一種接觸性傳染，流行廣、死亡率高的豬的傳染病。豬瘟造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大，歷來(lái)是各國(guó)研究的熱點(diǎn)，國(guó)際獸醫(yī)局(OIE)國(guó)際委員會(huì)將豬瘟列入A類16種法定傳染病之一。 我國(guó)是世界上養(yǎng)豬最多的國(guó)家，也是豬瘟流行嚴(yán)重的國(guó)家之一，我國(guó)近幾年因各種疾病死亡的豬占飼養(yǎng)總數(shù)的8% 10%，其中1/3以上由豬瘟致死，每年的直接經(jīng)濟(jì)損失數(shù)十億元，造成了巨大的人力和資源浪費(fèi)。間接影響如豬群中存在豬瘟?xí)r主要國(guó)際市場(chǎng)都禁止進(jìn)口其活豬和豬肉。根據(jù)發(fā)病的程度，將其分為急性、亞急性、慢性、非典型性和不明顯型。急性CSF由強(qiáng)毒株引發(fā)，一般導(dǎo)致高發(fā)病率和死亡率，而弱毒病毒感染則無(wú)明顯臨床癥狀。介于疫苗的廣泛應(yīng)用，有效地控制了豬瘟的大流行，減少了急性死亡。但自上世紀(jì)70年代末以來(lái)，全世界豬瘟流行的特點(diǎn)均發(fā)生了重大變化，如臨床癥狀不典型，病程變長(zhǎng)，呈周期性、波浪形的地區(qū)散發(fā)性流行，持續(xù)感染普遍存在，疫苗的預(yù)防效果明顯下降。同時(shí)疫點(diǎn)明顯減少，多局限于所謂的“豬瘟的不穩(wěn)定地區(qū)”的散發(fā)性流行。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)又出現(xiàn)豬瘟的反彈現(xiàn)象，而且疫情變得異常復(fù)雜，如既有區(qū)域性大流行又有零散式發(fā)生，既有高死亡率的急性癥狀，又有頑固的持續(xù)發(fā)生的溫和性癥狀。目前世界各國(guó)針對(duì)CSF疫情的處理主要有兩種手段:1，撲殺，建立完善且嚴(yán)格的疫情監(jiān)測(cè)與報(bào)告體系，及時(shí)發(fā)現(xiàn)、劃定及封鎖疫區(qū)、采取徹底撲殺所有感染豬群與感染動(dòng)物并進(jìn)行無(wú)害化處理和徹底消毒環(huán)境，消滅傳染源；2，免疫，強(qiáng)化以豬瘟病毒(CSFV)疫苗接種為主要手段。中國(guó)豬瘟兔化弱毒(C2株)疫苗自從問(wèn)世以來(lái)，一直享譽(yù)海內(nèi)外，被許多國(guó)家竟相引用。自從二十世紀(jì)60年代以來(lái)，C2株疫苗及其換代產(chǎn)品(細(xì)胞苗)在我國(guó)以防為主的豬瘟防治策略的實(shí)施中起到了決定性的作用，有效地控制了豬瘟在我國(guó)的急性發(fā)生和大流行。但自20世紀(jì)80年代以來(lái)，非典型性豬瘟成為該病的主要發(fā)生形式，持續(xù)感染普遍存在，疫苗的預(yù)防效果明顯下降，使豬瘟防制遇到了新的困難。經(jīng)流行病學(xué)調(diào)研發(fā)現(xiàn)近年來(lái)豬瘟流行毒已呈遠(yuǎn)向疫苗毒的方向演變，近期豬瘟流行毒與古典豬瘟毒之間有較大差異(核酸和氨基酸同源性分別為82.2% 84.3%和87.9% 90.4%)。豬痕病毒屬于黃病毒科(Flaviviridae)痕病毒屬。病毒顆粒呈圓形,直徑為40 -50 nm,有囊膜,病毒表面有6 nm 8 nm類似穗樣的突起，內(nèi)部為二十面體的對(duì)稱核衣殼，內(nèi)部核心直徑大約30 nm，豬瘟病毒不耐熱，pH5 10時(shí)穩(wěn)定，不耐酸(如<pH3.0)，對(duì)乙醚、氯仿和去氧膽酸鹽等脂溶劑敏感，可很快使病毒失活。參考豬瘟流行毒株的序列，該病毒可分為三個(gè)群=CSFV-1,稱為古典豬瘟，以Brescia株為代表。CSFV-2，以Alfort株為代表。CSFV-3，與上述二個(gè)群均有較大差異，包括了一些日本、泰國(guó)和臺(tái)灣地區(qū)近年來(lái)流行毒株。中國(guó)流行的優(yōu)勢(shì)毒株多屬CSFV-2。CSFV基因組為單股線性正鏈RNA分子，基因組大約12.5 kb,由5’非編碼區(qū)(5’ -UTR)、一個(gè)開放閱讀框(ORF)和3’-非編碼區(qū)(3’-UTR)構(gòu)成。其5'端無(wú)甲基化帽子結(jié)構(gòu)，3'端也無(wú)poly (A)尾巴結(jié)構(gòu)。5'端UTR長(zhǎng)度為373 nt或374 nt，有莖環(huán)，發(fā)夾等復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)，其5'端沒(méi)有帽子結(jié)構(gòu)，因而翻譯起始機(jī)制與一般真核生物的mRNA分子不同，是由5'端UTR內(nèi)有一個(gè)稱為核糖體內(nèi)部進(jìn)入位點(diǎn)(Internal Ribosome Entry Site, IRES)的結(jié)構(gòu)元件與核糖體40S亞基結(jié)合，啟動(dòng)蛋白質(zhì)的翻譯。5'端UTR不僅與翻譯有關(guān)，與病毒基因組的復(fù)制也有關(guān)。3’端長(zhǎng)度215 nt 239 nt，隨毒株不同而有差異。在所有瘟病毒中3'端是高度保守的，特別是最后大約100 nt的區(qū)域。3'端在病毒的復(fù)制繁殖過(guò)程中有重要作用，它參與病毒基因組的復(fù)制、多聚蛋白的翻譯和病毒粒子的裝配。中間的ORF編碼一個(gè)3898個(gè)氨基酸的多聚蛋白，分子量約438 kDa的多聚蛋白(NpM、C、Ems (E0),EUE2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)，并進(jìn)一步在病毒和宿主細(xì)胞蛋白酶的作用下加工為成熟蛋白，CSFV的所有結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白均由該ORF所編碼。蛋白及其功能
C蛋白為豬瘟病毒的核衣殼蛋白，為結(jié)構(gòu)蛋白，由86 89個(gè)氨基酸殘基組成，分子質(zhì)量14 kDa，又被稱之為pl4，該蛋白的N端為Serl9。C蛋白富含堿性氨基酸(賴氨酸和精氨酸)，帶正電荷。C蛋白除構(gòu)成病毒的核衣殼外，同時(shí)在病毒增殖過(guò)程中對(duì)基因表達(dá)調(diào)控發(fā)揮著重要的作用。研究表明，該蛋白179 180、194 198、208 212氨基酸的突變將顯著降低病毒的增殖能力。C蛋白主要分布在細(xì)胞核和細(xì)胞漿中，這可能與C蛋白參與病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)，但其具體作用機(jī)制還需深入研究。另有研究表明，重組表達(dá)的C蛋白可激活人HSP70基因的啟動(dòng)子，但對(duì)SV40啟動(dòng)子具有抑制作用，這也證明了 C蛋白對(duì)基因表達(dá)有調(diào)節(jié)作用，而且對(duì)不同的啟動(dòng)子有截然相反的調(diào)控作用。pro蛋白及其功能 Npro蛋白，也稱p23，為豬瘟病毒編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白，分子量為23kDa，處于ORF編碼的多聚蛋白N端的第一位，由168個(gè)氨基酸殘基組成，是一種具有蛋白水解酶活性的半胱氨酸蛋白酶，其具有在自身C端剪切產(chǎn)生病毒核衣殼蛋白的N端的功能，是病毒在細(xì)胞內(nèi)增殖所必需的構(gòu)件，當(dāng)它缺失后，從培養(yǎng)物中分離不到存活的病毒。研究表明Npix)有助于CSFV逃避機(jī)體的自然免疫，建立持續(xù)性感染。Xu等通過(guò)基因沉默技術(shù)，干擾Npix)表達(dá)可有效抑制CSFV在PK-15細(xì)胞中的繁殖。Wen等以家兔為模型，發(fā)現(xiàn)家兔感染CSFV后，干擾Npro表達(dá)同樣可以能有效抑制豬瘟病毒的增殖。Ruggli等研究表明，Npix)能抑制機(jī)體的天然免疫系統(tǒng)，使病毒逃避宿主的免疫清除，因此，Npro實(shí)可能與豬瘟病毒的毒力及致病性有關(guān)。反義核酸(antisense nucleic acid)是一段與革E基因(mRNA或DNA)的某段序列互補(bǔ)的天然存在或人工合成的核苷酸序列，反義核酸通過(guò)堿基配對(duì)方式特異性的與病毒靶基因結(jié)合形成雜交分子，從而在復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，或誘導(dǎo)RNase H識(shí)別并切割mRNA，進(jìn)而使其功能喪失。反義核酸包括反義RNA (antisense RNA)和反義DNA (antisense DNA),具有合成方便、序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、容易修飾、選擇性高、親和力強(qiáng)等特點(diǎn)。反義核酸作為一種新的抗病毒、抗腫瘤藥物，掀起了一場(chǎng)藥理學(xué)領(lǐng)域的革命，即新的藥物受體mRNA通過(guò)新受體結(jié)合方式(Watson-Crick雜交)、引發(fā)新的藥物受體結(jié)合后反應(yīng):(I) RNase H介導(dǎo)的祀RNA的降解；(2)抑制DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后的加工和翻譯等。可以說(shuō)反義寡核苷酸(ODNs)療法比傳統(tǒng)的藥物治療手段有更高的特異性。從二十世紀(jì)70年代末到現(xiàn)在，在這三十年的時(shí)間中，反義核酸藥物已走出實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)入了實(shí)際臨床應(yīng)用。特別是第一個(gè)反義核酸藥物Fomivirsen通過(guò)FDA批準(zhǔn)上市后,人們對(duì)反義療法尤為關(guān)注。反義核酸作用原理基于堿基配對(duì)原則，可通過(guò)與靶RNA進(jìn)行堿基配對(duì)結(jié)合的方式參與對(duì)相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控。其作用方式可能有:①反義RNA與病毒mRNA結(jié)合形成互補(bǔ)雙鏈阻斷核糖體與病毒mRNA的結(jié)合，從而抑制了病毒mRNA翻譯成蛋白質(zhì)的過(guò)程。②反義DNA能與祀基因形成一種三鏈核酸(triple helix nucleic acid),它通過(guò)作用于控制基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄子、增強(qiáng)子和啟動(dòng)子區(qū)，對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控。③反義核酸與病毒mRNA的結(jié)合可阻擋mRNA向細(xì)胞質(zhì)的運(yùn)輸。④反義核酸與病毒mRNA結(jié)合后使得mRNA更加易被核酸酶識(shí)別降解，從而大大縮短mRNA的半衰期。上述四種作用途徑都可表現(xiàn)為對(duì)病毒基因表達(dá)的抑制或調(diào)控，且這種調(diào)控是高度特異性的。反義核酸是通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)的原理來(lái)識(shí)別所打靶的基因，從理論來(lái)分析，研究人員以動(dòng)物細(xì)胞為例，其染色體大約有幾十億對(duì)堿基，如果4個(gè)堿基(A、G、C和T)的數(shù)目大致相同，并在整個(gè)基因中隨機(jī)分布，那么按照統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，大于17個(gè)堿基的反義核酸與非靶基因雜交的可能性不大，所以長(zhǎng)度超過(guò)17個(gè)堿基的反義核酸分子與靶基因的結(jié)合可以說(shuō)是唯一的，從而使反義核酸具有高度的特異性。研究表明，在細(xì)胞內(nèi)部一個(gè)拷貝的基因會(huì)產(chǎn)生200-300條mRNA，翻譯出10萬(wàn)個(gè)具有生物活性的蛋白質(zhì)分子。傳統(tǒng)藥物主要作用于有生物功能的蛋白分子的某結(jié)構(gòu)域上的幾個(gè)作用位點(diǎn)，事實(shí)上蛋白的結(jié)構(gòu)是非常復(fù)雜的，且在生物體內(nèi)，活性蛋白的空間結(jié)構(gòu)又是千變?nèi)f化的，以傳統(tǒng)藥物有限的幾種作用位點(diǎn)來(lái)控制靶分子的動(dòng)態(tài)的和整體的功能很難達(dá)到理想的效果，因而不難看出傳統(tǒng)藥物的局限性。由mRNA可翻譯出幾十到幾百個(gè)蛋白，反義核酸在mRNA水平對(duì)靶基因直接進(jìn)行調(diào)控 ，這個(gè)步驟相當(dāng)于將傳統(tǒng)藥物作用放大了數(shù)十到數(shù)百倍，可見(jiàn)反義核酸的調(diào)控是極其經(jīng)濟(jì)合理的。毒理學(xué)研究表明，反義核酸在體內(nèi)具有很低的毒性，盡管其在生物體內(nèi)的存留時(shí)間有長(zhǎng)有短，但最終都將被降解消除，這避免了如轉(zhuǎn)基因療法中外源基因整合到宿主染色體上的危險(xiǎn)性。與傳統(tǒng)藥物相比，反義核酸藥物具有特異性強(qiáng)，效率高和毒副作用低等優(yōu)點(diǎn)，在抑制腫瘤生長(zhǎng)和抗病毒復(fù)制等方面顯現(xiàn)出了良好的應(yīng)用價(jià)值。目前已有多個(gè)藥物進(jìn)入美國(guó)和歐洲市場(chǎng)，另還有30多種反義核酸藥物正在進(jìn)行臨床前期的研究或開發(fā)后進(jìn)入了 1、II和III期實(shí)驗(yàn)。由于動(dòng)物體內(nèi)存在大量的核酸外切酶，反義核酸若不經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾，很快就被降解，失去活性。目前對(duì)反義核酸的化學(xué)修飾有很多方法，常見(jiàn)的有硫代修飾反義核酸及2’-甲氧基修飾反義核酸等。且目前硫代修飾藥物的研究最為全面，它可有效抵抗核酸酶的降解，同時(shí)可促進(jìn)核酸酶Rase H的活性，目前這種修飾方法已成功用于臨床的反義核酸藥物。但這些還只是第一代反義核酸的修飾方法，隨著技術(shù)的發(fā)展與進(jìn)步，新的修飾途徑與方法被開發(fā)出來(lái)，使得反義核酸的研究進(jìn)入了第二、三代，其中肽核酸的修飾最為引人關(guān)注。肽核酸(peptidenucleic acids, PNAs),是一種以中性酰胺鍵為骨架的全新的DNA類似物，其骨架的結(jié)構(gòu)單元為N (2-氨基乙基)-甘氨酸，堿基部分通過(guò)亞甲基羰基連接于主骨架的氨基N上。盡管PNA在結(jié)構(gòu)上相對(duì)寡核苷酸有了顯著的改變，但PNA與互補(bǔ)核酸之間的結(jié)合仍遵循堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，甚至比天然核苷酸具有更高的親和性。PNA可序列特異性地靶向作用于DNA或RNA，為反義核酸的第二、三代產(chǎn)品。PNA與對(duì)應(yīng)的DNA或RNA形成穩(wěn)定的PNA-DNA或PNA-RNA結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)非常穩(wěn)定，幾乎不受環(huán)境因素變化的影響，如離子，PH值等。近年來(lái)，科研人員對(duì)最初開發(fā)出的PNA進(jìn)一步優(yōu)化，在結(jié)構(gòu)方面作了很大改進(jìn)(如骨架結(jié)構(gòu)、在N-(2-氨基乙基)甘氨酸上連接手性和非手性的基團(tuán)、堿基的類型等)，提高其生物學(xué)穩(wěn)定性和利用度、靶結(jié)合特性以及藥代動(dòng)力學(xué)特性，并將PNA應(yīng)用于診斷和治療等方面。殼聚糖是天然多糖中唯一的堿性多糖，具有來(lái)源豐富、無(wú)毒、易化學(xué)修飾性、生物相容性和可再生性等優(yōu)越的功能性質(zhì)和獨(dú)特分子結(jié)構(gòu)。殼聚糖作為可生物降解材料用于新型給藥系統(tǒng)，通過(guò)改變給藥途徑可大大提高藥物療效，具有控制釋放、增加靶向性、減少刺激和降低毒副作用以及提高疏水性藥物通過(guò)細(xì)胞膜、增加藥物穩(wěn)定性等作用特點(diǎn)。
權(quán)利要求
1.一種抗豬瘟病毒的肽核酸，其特征在于，所說(shuō)的肽核酸為針對(duì)抗豬瘟病毒的C蛋白和/或Npn5蛋白的反義核酸序列，所述的針對(duì)C蛋白的反義核酸序列選自SEQ ID.1、SEQID.2和SEQ ID.3核苷酸序列中的一種或一種以上；所述的針對(duì)Npn5蛋白的反義核酸序列選自SEQ ID.4、SEQ ID.5和SEQ ID.6核苷酸序列中的一種或一種以上。
2.有如權(quán)利要求1述的抗豬瘟病毒的肽核酸的藥物組合物。
3.按權(quán)利要求1所述的抗豬瘟病毒在制備動(dòng)物藥物上的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種抗豬瘟病毒的肽核酸，所說(shuō)的肽核酸為針對(duì)抗豬瘟病毒的C蛋白和/或Npro蛋白的反義核酸序列。本發(fā)明還提供了含有所述的抗豬瘟病毒的肽核酸的藥物組合物。本發(fā)明還提供了所述的抗豬瘟病毒在制備動(dòng)物藥物上的用途。本發(fā)明的用于防控豬瘟病毒CSFV的特異性抗病毒肽核酸動(dòng)物藥物，是針對(duì)CSFVC和Npro的基因保守部分設(shè)計(jì)高效特異性的反義核酸序列，并采用特定工藝人工合成肽核酸片段，該序列與上述保守性靶基因互補(bǔ)，根據(jù)堿基互補(bǔ)原理，反義核酸序列特異性地與CSFVC和Npro的對(duì)應(yīng)的靶基因相結(jié)合，誘導(dǎo)核酶對(duì)靶基因進(jìn)行降解，從而阻斷靶基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，抑制CSFV在機(jī)體內(nèi)復(fù)制與裝配，以達(dá)到防控豬瘟的目的。
文檔編號(hào)A61K48/00GK103088025SQ201310014160
公開日2013年5月8日 申請(qǐng)日期2013年1月15日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月15日
發(fā)明者韓健寶, 曲向陽(yáng), 顧宏偉, 王遠(yuǎn)孝, 馬國(guó)輔 申請(qǐng)人:韓健寶