專利名稱：改良脂質體復合物的穩(wěn)定性和保存期的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種制備穩(wěn)定復合物的方法，所述復合物包含一種配體和一種包囊封裝(encapsulating)有一種治療劑或診斷劑的陽離子脂質體。
背景技術：
本文所引用的所有參考文獻均以其全文并入參考。陽離子脂質體由正電荷的脂質雙層組成，并且可以通過簡單地混和脂質與DNA而與負電荷的裸DNA進行復合，由此所得復合物具有凈正電荷。所述復合物可以結合培養(yǎng)細胞并被其以中等良好程度的轉染效率攝取。陽離子脂質體已經被證實對于體內基因輸送是安全而有效的。脂質體可通過對其加以修飾由此其將有效載荷(payload)選擇性輸送至腫瘤細胞而用于靶向腫瘤細胞。表面分子可用于將脂質體靶向于腫瘤細胞，因為腫瘤細胞外面的分子的類型和/或數目與正常細胞上的那些不同。例如，如果脂質體在其表面上具有葉酸或運鐵蛋白(Tf)分子，則其將導 向葉酸或運鐵蛋白受體的水平高于正常細胞水平的癌細胞。除了使用由腫瘤細胞上受體識別的配體之外，也可以將特異性抗體附于脂質體表面，使其靶向于特異性腫瘤表面抗原(包括但不限于受體)。這些“免疫脂質體”可將治療藥物輸送至特異的細胞群。例如已經發(fā)現(xiàn)與脂質體綴合的抗-HER-2單克隆抗體(Mab)Fab片段可以特異性結合過表達HER-2的乳腺癌細胞系S-BR-3(Park，J.ff.，et al.PNAS92:1327-1331 (1995))。發(fā)現(xiàn)免疫脂質體是被有效內在化的，并且抗_HER_2Fab片段的錨定增強其抑制作用。組合陽離子脂質體基因轉移和免疫脂質體技術似乎是一種有前途的靶向基因治療系統(tǒng)。本領域描述了針對DNA基因治療的配體靶向脂質體輸送系統(tǒng)，其具有選擇性腫瘤革巴向和高轉染效率。見 Xu, L.，et al.Human Gene Therapy8:467-475(1997) ；Xu, L.，et al., Human Gene TherapylO:2941-2952(1999)及 Xu, L., et al., Tumor Targeting4:92-104(1999)所述。這個系統(tǒng)通過使用抗運鐵蛋白受體單鏈(TfRscFv)抗體片段作為復合物中的靶向配體而得以改良(Xu，L.，et al.Molecule Medicine7:723-734(2001) ；Xu, L.,et al.Molecular Cancer Therapeuticsl:337-346 (2002))。TfRscFv 是由分別來自輕鏈和重鏈的VH和VL可變結構域與適當設計的接頭肽連接而形成。所述接頭連接第一個可變區(qū)的C末端和第二個可變區(qū)的N末端，順序為VH-接頭-VL或者VL-接頭-VH。scFv的結合位點可以復制其親代抗體結合位點的親和性和特異性。癌癥的常規(guī)治療包括化療和/或放療。在這些常規(guī)癌癥療法中加入一種新的使腫瘤對化療或放療敏化的成分將具有很大的臨床實用性，降低這兩種類型抗癌療法的有效劑量并相應地減輕通常與這些治療相關的副作用。
如上述對脂質體復合物的最初研究示出所述復合物在將診斷或治療劑輸送至感興趣的靶細胞中是有效的。在該復合物形成時立即將其給予患者是不切實際的。希望提供靶向脂質體復合物，其是凍干的并在2-8°C、-20°C或-80°c貯存仍保持穩(wěn)定至少6個月并可以復原(reconstituted)而不顯著喪失活性。先前的報道表明兩種成分的復合物(脂質和DNA但無靶向配體或蛋白質)可以在存在單糖或雙糖的情況下凍干并仍保留其生物學活性及適于基因治療的顆粒大小(Li，B.，et al., Journal of Pharmaceutical Sciences89:355-364(2000)和 Molina, M.D.C.etal.Journal of Pharmaceutical Sciences90:1445-1455(2001) ；Allison, S.D., etal.Biochemical et Biophysical Actal468:127-138 (2000))。另夕卜，通過 PEG 與 PE1-DNA聚合復合物(polyplex)連接的Tf在冷凍和解凍后仍保留一些生物學活性(Kursa, M.etal.,Bioconjugate Chemistryl4:222-231 (2003))。重要的是注意這種復合物不是凍干的，未給定可能的貯存長度和條件，如果包括糖(蔗糖)則在解凍后加入。這種聚合物復合物需要Tf通過PEG分子與所述聚合物連接。發(fā)明概述本發(fā)明提供了一種制備穩(wěn)定復合物的方法，所述復合物包含一種配體和一種包囊封裝有一種治療劑或診斷劑或報道基因的陽離子脂質體，所述方法包括:組合一種復合物和一種溶液，所述復合物包含一種配體和包囊封裝有一種診斷劑或治療劑或報道基因的陽離子脂質體，所述溶液包含穩(wěn)定量的蔗糖；及凍干所得的復合物和蔗糖的溶液以獲得凍干的制品；其中在復原(reconstitution)時所述制品保留其至少約80%的凍干前活性。

在一個優(yōu)選的實施方案中，所述制品保留其凍干前至少約85%的活性，更優(yōu)選至少約90%的凍干前活性。附圖簡述

圖1示出新鮮制備的和凍干的含有5%葡萄糖或5%蔗糖的復合物(Tf-LipA-Luc和 TfRscFv-LipA-Luc)的大小(nm)。圖2A和2B示出新鮮制備的和凍干的含有5%葡萄糖或5%蔗糖的復合物(Tf-LipA-Luc和TfRscFv-LipA-Luc)在DU145人前列腺細胞中的體外轉染效率，以相對發(fā)光單位(relative light units, RLU) / μ g 蛋白質表示。圖3示出新鮮制備的和凍干的含有5%或10%蔗糖的TfRscFv-LipA-Luc復合物在DU145人前列腺癌細胞中的體外轉染效率(RLU/μ g蛋白質)。圖4A和4B分別示出凍干的配體-脂質體質粒DNA復合物對DU145前列腺和PANCI胰異種移植腫瘤的靶向。圖5示出在人前列腺癌(DU145)異種移植小鼠模型中，實驗室制備的具有10%蔗糖的TfRscFV-LipA-p53復合物在凍干并在2_8°C貯存直至6個月后仍保持腫瘤靶向能力。圖6示出在DU145異種移植小鼠模型中凍干的、具有10 %蔗糖的TfRscFv-LipA-p53復合物的腫瘤靶向和轉染效率在批次與批次之間的一致性。圖7示出在DU145異種移植小鼠模型中5個不同批次的商業(yè)制備并凍干的具有10%蔗糖的TfRSCFv-LipA-p53的腫瘤靶向和轉染效率。圖8示出通過非變性凝膠電泳評估的在多個新鮮的和凍干的TfRscFv-LipA_p53復合物中未復合的TfRscFv的百分比。圖9示出在MDA-MB-435乳腺癌細胞中凍干的與新鮮制備的TfRscFv-LipA-AS-HER-2復合物之間細胞生長抑制作用的體外對比。圖10示出新鮮制備的或凍干的TfRscFv-LipA-AS HER-2復合物的PANC-1化學敏感性的體外對比。圖11示出在MDA-MB-435人乳腺癌細胞中具有10%蔗糖的TtRscFv-LipA-ASHER-2在凍干并在2-8°C貯存直至6個月后體外下調HER-2的表達。發(fā)明詳述根據本發(fā)明，凍干的配體與包囊封裝有診斷劑或治療劑的脂質體的復合物的穩(wěn)定性可以通過在凍干之前將該組合物與穩(wěn)定量的蔗糖水溶液組合而增加。所述蔗糖溶液可以是簡單的蔗糖與水的溶液，或者可以是與緩沖液如PBS、HEPES, TRIS或TRIS/EDTA的溶液。典型地，將所述蔗糖溶液與所述復合物組合至終濃度為約I % -約80%蔗糖，典型地為約I % -約50 %蔗糖，如I % -約10 %、20 %、30 %或40 %蔗糖，優(yōu)選約5 % -10 %蔗糖，最優(yōu)選約10%蔗糖。該凍干制品在約2-8°C至約_80°C的范圍內可以保持穩(wěn)定性至少6個月而不明顯喪失活性。優(yōu)選地，所述制品可以穩(wěn)定至少約6-12個月。在復原時，所述復合物保持其至少80%的凍干前活性，優(yōu)選保持其至少約85%的凍干前活性，最優(yōu)選保持其至少約90-95%的凍干前活性。先前的報道已經表明了脂質與DNA的復合物可以在存在單糖或二糖的情況下凍干并保持生物學活性(Li，B., et al., Journal of Pharmaceutical Sciences89:355-364 (2000)及 Molina, M.D.C.et al.Journal of Pharmaceutical Sciences90:1445-1455 (2001) ；Allison, S.D., et al.Biochemical et Biophysical Actal468:127-138(2000))。然而未曾料到由如下成分組成的一種三成分復合物也可以凍干并在復原后保持其大小和生物學活性:1)蛋白質(例如運鐵蛋白)，甚至包括是抗體或抗體片段(例如抗運鐵蛋白受體單鏈抗體片段，TfRscFv)的蛋白；2)脂質體及3)治療性核酸分子(例如質粒DNA、反義寡核苷酸分子或者甚至siRNA分子)。所述脂質體復合物典型地通過靜脈內給予。對于靜脈內注射,將50%葡萄糖溶液常規(guī)加入所述配體-脂質體復合物中，至終濃度為5%?，F(xiàn)在令人驚奇地發(fā)現(xiàn)通過將新鮮制備的(即制備后不超過約1-約24小時的復合物)配體-脂質體復合物與蔗糖溶液而不是葡萄糖溶液組合，該三成分復合物(包括具有抗原靶向實體(entity)的那些復合物)的活性和保存期在凍干及復原后可以顯著增加。所述三成分復合物在凍干之前可以簡單地與蔗糖溶液混和。所述溶液典型地包含約50-約100%重量的蔗糖，優(yōu)選包含約50%重量的蔗糖。凍干可以根據任何常規(guī)的方法將復合物的水分含量降低至約1.3%以下而進行。一個優(yōu)選的方法包含將含有復合物的溶液在_50°C至_60°C、在20-50微米汞柱優(yōu)選25微米汞柱的條件下、凍干12-60小時，優(yōu)選20-48小時，然后在約2-8°C與約_80°C之間貯存該凍干制品。在另一個優(yōu)選的方法中，將含有復合物溶液的小瓶在環(huán)境溫度置于商購的冷凍干燥器中，然后將溫度在I個小時內降低至-45°C ±3°C并在此溫度保持3小時。然后將冷凝器設定在_80°C或更低溫度，真空設定為50微米Hg。保存溫度然后在I小時內升至_35±3°C，并在此溫度保持約36-72小時，優(yōu)選約48小時。然后在4小時內將保存溫度升至20±3°C，并在此溫度保持約6-約48小時，優(yōu)選約12小時。在這個方法結束時，將室壓用氮氣恢復至大氣壓水平(通過適當的無菌微生物滯留濾膜)并將瓶子用塞子塞住。凍干的復合物可以通過加入與凍干前的溶液等體積的無菌、無內毒素的水而復原。輕輕搖動以迅速溶解所述干燥的復合物。沒有由于凍干或貯存而發(fā)生可測量的復合物的大小或zeta電勢改變。可與蔗糖溶液混和、凍干并復原的合適的復合物是能靶向細胞的、全身性輸送用于治療或診斷疾病的多種類型治療或診斷分子的細胞靶向配體/脂質體/治療性分子、報道分子或診斷分子復合物。靶細胞優(yōu)選是癌細胞，但也可以是非癌細胞。優(yōu)選的癌靶細胞包括前列腺、胰腺、乳腺、頭頸、卵巢、肝和腦癌及黑素瘤。本領域技術人員熟知大多數類型的癌細胞，包括但不限于上述那些細胞，均過表達運鐵蛋白和葉酸的受體，這些受體在癌細胞中也迅速 再循環(huán)(Li, H., and Qian,.Ζ.Μ., Medicinal research Reviews2 (3):225-250(2000) ；Qian, Z.M.，et al.，Pharmacological Reviews54(4):561-587(2002)；gosselin, M.A., and Lee, P.J., Biotechnology annual Reviews8:103-131(2002))。希望的是，所述治療分子是基因、多核苷酸，如質粒DNA、DNA片段、寡核苷酸、寡脫氧核苷酸、反義寡核苷酸、嵌合的RNA/DNA寡核苷酸、RNA、siRNA、核酶、病毒顆粒、生長因子、細胞因子、免疫調節(jié)劑或其它蛋白質，包括其表達時呈遞刺激或抑制免疫系統(tǒng)的抗原的蛋白質。優(yōu)選的治療劑是核酸分子，優(yōu)選DNA或siRNA分子。優(yōu)選的DNA分子是編碼基因如野生型p53分子、Rb94分子、Apoptin分子、EGFG分子或反義分子的DNA分子。優(yōu)選的HER-2反義寡核苷酸是針對HER-2基因并具有序列5' -TCC ATG GTG CTC ACT-3'。優(yōu)選的siRNA分子是針對HER-2mRNA起作用的分子。其它優(yōu)選的治療性分子可以由本領域技術人員不用過多的實驗而確定。如上所述，靶細胞或者可以是非癌細胞。優(yōu)選的非癌靶細胞包括樹突細胞、血管內皮細胞、肺細胞、乳腺細胞、骨髓細胞和肝細胞。可以靶向非希望的但良性的細胞，如良性的前列腺增生細胞、過度活性的甲狀腺細胞、脂瘤細胞，及與自身免疫疾病相關的細胞，如產生參與關節(jié)炎、狼瘡、重癥肌無力、鱗狀上皮化生(squamous metaplasia)、發(fā)育異常等的抗體的B細胞。或者，所述制劑可以是在給予后能在體內檢測的診斷劑。診斷劑例如包括電子致密材料(electron dense material)、磁共振顯象劑和放射性制劑。用于顯象的放射性核素包括銅、鎵、銦、錸、和锝的放射性同位素，包括64CU、67CU、mIn、99mTc、67Ga*68Ga。由在此并入參考的Low等的美國專利5，688，488所揭示的成象劑用于本發(fā)明所述的脂質體復合物中。配體可以是其受體在靶細胞上差異表達的任何配體。例如包括運鐵蛋白、葉酸、其它維生素、EGF、胰島素、Heregulin, RGD肽或與整聯(lián)蛋白受體反應的其它多肽、抗體或其片段。優(yōu)選的抗體片段是抗體的單鏈Fv片段。所述抗體或抗體片段是結合靶細胞表面上受體的抗體或抗體片段，優(yōu)選結合在靶細胞上差異表達的受體。一種優(yōu)選的抗體是抗TfR單克隆抗體，優(yōu)選的抗體片段是基于抗TfR單克隆抗體的scFv。另一優(yōu)選的抗體抗HER-2單克隆抗體，另一優(yōu)選的抗體片段是基于抗HER-2單克隆抗體的scFv。配體與脂質體在室溫混和，配體與脂質體的比率在約1: 0.001至I: 500(μ g: nmole)的范圍，優(yōu)選約1: 10至約1: 50 ( μ g: nmole)。將治療劑與陽離子脂質體在室溫混和，制劑:脂質比率在約1: 0.1至1: 50(yg: nmole)的范圍，優(yōu)選約1: 10至約1: 24(yg: nmole)。例如在其中配體是運鐵蛋白和治療劑是質粒DNA的復合物中，治療劑與脂質體與配體的有用比率典型地在約1μ g: 0.l-50nmole: 0.1-100 μ g的范圍內，優(yōu)選 lug: 5-24nmole: 6-36 μ g,最優(yōu)選約 I μ g:1Onmole: 12.5yg。如果配體是TfRscFv，則配體與脂質體的有用比率典型地在約1: 5-1: 40(μ g: μ g)的范圍內，優(yōu)選1: 30(yg: μ g)的范圍內，質粒DNA與脂質體的比率典型地在約1:6-1: 20(yg: yg)的范圍內，優(yōu)選1: 14(yg: μ g)的范圍內。如果治療劑是寡核苷酸(ODN)而不是質粒DNA，配體、脂質體和ODN的典型比率為0.lnmole-36nmole (0DN:脂質體)及0.1 μ g-100 μ g(配體:脂質體),優(yōu)選0.5nmole-20nmole(0DN:脂質體)及
0.5 μ g-50 μ g (配體:脂質體)，最優(yōu)選 lnmole-15nmole (0DN:脂質體)及 I μ g_30 μ g (配體:脂質體)。如果治療劑是siRNA，則成分的有用比率可以是0.1yg: 30nmole (siRNA:脂質體)及 0.1yg: 100 μ g (TfRscFv:脂質體)，優(yōu)選 Iyg: 7nmole (siRNA:脂質體)及 Iyg: 30 μ g (TfRscFv:脂質體)。有許多陽離子脂質體用于制備所述復合物。在此并入參考的公布的PCT申請W099/25320描述了一些陽離子脂質體的制備。希望的脂質體例如包括包含二油?；谆姿徜@(DOTAP)和二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)和/或膽固醇(chol)的混合物或者包含二甲基雙十八烷基溴化銨(DDAB)和DOPE和/或膽固醇的混合物的那些脂質體。脂質的比率可以加以變化以優(yōu)化特異性靶細胞類型對治療性分子的攝取。所述脂質體可以包含一或多種陽離子脂質及一或多種中性或輔助脂質的混合物。陽離子脂質與中性或輔助脂質的希望比率是約1: (0.5-3)，優(yōu)選1: (1-2)(摩爾比率)。在一個實施方案中，用于形成復合物的脂質體是一種空間穩(wěn)定的脂質體?？臻g穩(wěn)定的脂質體是其中已經整合進親水性聚合物如PEG、聚(2-乙基丙烯酸)或者聚(η-異丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)的脂質體。這種修飾的脂質體當與治療劑或診斷劑復合時可以是特別有用的，因為它們典型地不被網狀內皮系統(tǒng)以如同清除未如此修飾的相應脂質體那樣快地從血流中清除。在第二個實施方案中，用于形成所述復合物的脂質體也與由組氨酸和賴氨酸(分支的或線性的)組成 的肽結合，其中所述肽的長度為至少約10個氨基酸，典型地為約10-1000個氨基酸之間，并且是由5-100%的組氨酸和0-95%的非組氨酸氨基酸組成，優(yōu)選至少10%的非組氨酸氨基酸是賴氨酸。最優(yōu)選地，所述肽的長度為約31個氨基酸，約20%的氨基酸是組氨酸，約80%的氨基酸是非組氨酸，至少75%是賴氨酸及至少一個是末端半胱氨酸。優(yōu)選的肽具有結構5' -K[K (H) -Κ-Κ-Κ]5-K (H) -K-K-C-3/，并且可以通過末端半胱氨酸和脂質體中的一個馬來酰亞胺基團而與所述脂質體共價綴合。在這種復合物中，成分的比率典型地可以如下:配體與HK-脂質體(μ g: yg)比率為1: 5-1: 40，優(yōu)選I: 30，及 DNA 與 HK-脂質體(μ g: nmole)比率為 1: 1-1: 20，優(yōu)選 1: 14。所述復合物可以通過將配體-脂質體與治療劑或診斷劑混和在一起、將所得溶液緩慢上下顛倒一定時間或者以在溶液中恰好形成渦流的速度攪動該溶液約10秒至約10分鐘，優(yōu)選15秒至約2分鐘而制備。所述復合物可以與另外的治療劑組合給予，如與放射物或化療劑組合。所述治療劑或治療劑的組合可以在給予所述復合物之前或隨后給予，例如在約12小時至約7天內給予?；焺┌ǖ幌抻诶绨⒚顾亍?-氟尿嘧啶(5FU)、順鉬(cisplatin，CDDP)、紫杉特爾(docetaxel)、吉西他濱(gemcitabine)、紫杉醇(paclitaxel)、長春花堿、表鬼曰毒素P比喃葡糖苷(VP-16)、喜樹堿(camptothecia)、放線菌素-D、米托蒽醌(mitoxantrone)和絲裂霉素C。放射療法包括Y射線、X-線、UV放射、微波、電子發(fā)射等。本發(fā)明通過如下實施例得以進一步例證，所述實施例只是例證本發(fā)明而無限制之
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實施例實施例1:新鮮的和凍干的具有碳水化合物的復合物的制備及活性和大小的體外評估進行最初的實驗以測試用碳水化合物制備的配體-脂質體核酸復合物在凍干前后的大小及體外轉染效率。測試兩個單獨的配體，Tf和TfRscFv。所述復合物使用美國專利申請09/601，444和公布的美國專利申請09/914，046和10/113，927所述的方法制備[也見于 Xu, L., et al.Human Gene TherapylO:2941-2952 (1999) ；Xu, L., et al., HumanGene Therapy13:469-481(2002);和 Xu, L., et al., Molecular Cancer Therapeuticsl:337-346(2002)所述]。在每個復合物中，脂質體是1:1比率的DOTAP: D0PE，在此稱為脂質體A(LipA)。使用的DNA是攜帶編碼的螢火蟲螢光素酶基因的質粒。在所有情況中，碳水化合物溶液均在復合物制備的最后步驟中加入。制備一系列8個復合物。4個含有Tf作為配體(DNA: LipA: Tf比率為lyg: IOnmole: 12.5μ g) ;4 個含有 TfRscFv 作為配體(DNA: LipA: TfrscFv 比率為Iyg: Hnmole: 0.34 μ g)。將含有配體-脂質體的溶液與DNA混和在一起，緩慢倒轉10次，將所得溶液在室溫保持15分鐘，之后加入葡萄糖或蔗糖于水中的水溶液至終濃度為5%。將每個所得混合物倒轉10次，然后在室溫保持15分鐘，之后凍干或轉染。
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準備凍干的溶液使用Virtis Benchtop3L冷凍干燥器在25微米萊柱在_55°C凍干24小時，然后在_80°C貯存過夜之后復原。在用與凍干前溶液體積相等的水復原之后，將裝有每種溶液的容器緩慢倒轉10次并在室溫保持60分鐘。之后復原的復合物可以在2-8°C保持直至24小時。凍干前后復合物的大小使用Malvern ZetasizerfOOOH通過動態(tài)激光光散身寸(dynamic laser light scattering)而測定。測定大小的結果(平均數)示于圖1。當Tf是配體時，在存在5%葡萄糖的情況中凍干后大小增加近10倍。而具有5%蔗糖的新鮮復合物的大小略大于具有5%葡萄糖的復合物，在存在蔗糖的情況中凍干前后基本無變化。當TfRscFv用作配體時觀測到相似的模式。在這里使用5%蔗糖提供更好的凍干后結果。對新鮮的和凍干的復合物還評估了其在人前列腺腫瘤細胞系DU145中的轉染效率。對比在復原時的凍干復合物(具有Tf和TtRscFv)與相應的新鮮制備的相同復合物的溶液的轉染效率。凍干前后的轉染效率結果示于圖2A和2B。當配體是Tf時，含有5%葡萄糖的制品在凍干后效率下降至新鮮制備的復合物的約60%，而含有5%蔗糖的凍干制品保持其初始活性的約80%。模式與TfRscFv作為配體時相似。含有5%葡萄糖的凍干復合物的活性下降至新鮮制品活性的約50%，而當使用5%蔗糖時保留約90%活性(圖2B)。因此，蔗糖是比葡萄糖更有效的穩(wěn)定劑。糖/復合物比率被進一步優(yōu)化以改良穩(wěn)定性并保持顆粒大小。對比具有5%和10%蔗糖的復合物。并將質粒DNA的量也增加至20 μ g，在體內研究中通常用于單次注射的量在下文論述。在如上述凍干后，含有10%蔗糖的復合物的轉染效率是用5%葡萄糖溶液常規(guī)制備的新鮮復合物的 95%。圖3示出了用5%和10%蔗糖制備的復合物之間的轉染效率的對比。使用含有10%蔗糖的凍干復合物的體外轉染效率最佳。發(fā)現(xiàn)這不依賴于是否是蛋白質還是抗體片段用作靶向配體。對含有10%蔗糖的復合物在使用上述條件凍干前后的大小也進行了評估。與用5%葡萄糖制備的常規(guī)新鮮復合物相對比，用10%蔗糖制備的復合物的大小在凍干前后無顯著差異。本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)這種情況也不依賴于靶向配體。因此，與含有5%葡萄糖或5%蔗糖的相應復原制品相比，復原的脂質體復合物制品中存在10%的蔗糖更好的維持了生物學活性和大小。實施例2:凍干的復合物在2-8 °C貯存一周后在體內對人前列腺腫瘤的靶向在復合物中使用增強的綠色熒光蛋白(EGFP)作為報道基因，測試具有10%蔗糖的脂質體復合物(新鮮制備的或凍干的并在2-8°C貯存I周)的體內腫瘤靶向。所述復合物是TfRscFv-脂質體A-pEGFP，其中脂質體A是DOTAP: DOPE (I: I)。三種成分的比率是0.3yg: 14nmole: I μ g(TfRscFv:脂質體:DNA)。所述復合物如實施例1所述制備并凍干。在凍干后，將復合物在2-8°C冷卻貯存I周。樣品通過加入無內毒素水而復原為凍干前的體積，如實施例1所述進行。給攜帶至少50mm3的DU145異種移植腫瘤的小鼠在24小時內靜脈內注射3次不同復合物(具有5%葡萄糖的新鮮制品、具有10%蔗糖的新鮮制品及復原的具有10%蔗糖的凍干制品，其在復原前在2-8°C已經冷卻貯存I周，所有制品均用TfRscFv作為靶向配體)。48小時后，將動物處死，切下腫瘤和肝臟，分離蛋白質并使用抗EGFPAb (C0VANCE)進行Western分析。如圖4A所示，具有10%蔗糖的凍干和復原的復合物與任一新鮮制備的復合物相對比均具有相似的基因表達水平。更顯著地，在腫瘤中顯然存在高水平的外源基因表達，在小鼠的肝臟中幾乎沒有EGFP表達，這表明了復合物的腫瘤特異性性質，并且這種腫瘤靶向特異性在凍干后、在2-8°C貯存至少I周及復原后仍保留。實施例3:凍干的復合物在_80°C貯存I個月之后的體內人胰腺腫瘤靶向對在-80°C貯存I個月后的凍干復合物的穩(wěn)定性通過其靶向胰腺癌異種移植腫瘤也加以測試。所述復合物如實施例1所述用10%蔗糖制備并凍干(與實施例2所述相同的復合物及比率)。凍干后，將樣品在-80°C貯存I個月，然后如實施例1所述用無內毒素水復原。如圖4B所示，來自在24小時內經靜脈內注射3次小鼠(如實施例2所述)的腫瘤示出甚至比用新鮮制備的復合物注射后發(fā)現(xiàn)的EGFP基因表達水平更高的水平。同樣，在肝中僅觀測到非常弱的表達或無表達。實施例4:通過大小和體外轉染效率評估在2_8°C貯存的凍干復合物的長期穩(wěn)定性為增加Tf RscFv-脂質體-DNA復合物作為可行的臨床治療劑的潛力，揭示了一種增加其穩(wěn)定性的手段，由此保持其腫瘤靶向能力和貯存期。我們的一些研究表明具有10%蔗糖作為賦形劑的凍 干的復合物可以在_20°C、-80°C或2-8°C成功貯存。為便于臨床應用，優(yōu)選的貯存方法是在2-8°C。為確定凍干的復合物可以在2-8°C貯存而不喪失生物學活性的時間長度，對凍干的并在2-8°C貯存1、4和6個月的復合物的體外轉染效率進行評估。所述復合物為TfRscFv-脂質體A-p53，其中脂質體A是DOTAP: DOPE (I: I)。三種成分的比率是0.3 μ g: 14nmole: lug (TfRscFv:脂質體A: DNA),這等于
0.34yg: IOyg: Iygo 10%蔗糖用作賦形劑。復合物中的DNA是含有編碼人野生型P53的 1.7Kb cDNA序列的質粒載體。如實施例1所述制備、凍干，并在2_8°C貯存后適當的時間復原所述復合物。大小(數字參數)和Zeta電勢使用Malvern 3000H Zetasizer確定。功能活性使用螢光素酶共轉染分析評定。將人前列腺癌DU145細胞用BP100質粒DNA和所述復合物共轉染。BP100質粒攜帶在wtp53誘導型啟動子控制下的螢光素酶基因。由此，功能性P53在轉染細胞中的水平通過螢光素酶活性水平反映。在轉染24小時后，將細胞裂解并使用Promega螢光素酶試劑根據廠商指導分析螢光素酶活性。如表I所示，螢光素酶活性、所述復合物的大小和zeta電勢在新鮮制備的復合物及凍干的并在2_8°C貯存直至6個月的復合物之間是一致的。表1:凍干復合物和新鮮制備復合物的比較
權利要求
1.凍干復合物在制備用于靶向細胞的藥物中的用途，所述凍干復合物基本由復合物以及增加所述復合物穩(wěn)定性的量的鹿糖組成，所述復合物包含配體與包囊封裝有治療劑或報道基因或診斷劑的陽離子脂質體，所述配體是運鐵蛋白、葉酸、抗體或抗體片段，所述陽離子脂質體是至少一種陽離子脂質和至少一種中性或輔助脂質的混合物，其中所述制品在-80°c至8°C的溫度范圍內保持穩(wěn)定至少6個月，同時保留至少80%活性，且 其中所述制劑是從基本上由所述復合物與穩(wěn)定量的蔗糖和水、穩(wěn)定量的蔗糖和PBS緩沖液、穩(wěn)定量的蔗糖和HEPES緩沖液、穩(wěn)定量的蔗糖和TRIS緩沖液、或穩(wěn)定量的蔗糖和TRIS/EDTA緩沖液組成的溶液凍干的。
2.權利要求I的用途，其中所述蔗糖以1%-50%的量存在。
3.權利要求I的用途，其中所述蔗糖以1%-20%的量存在。
4.權利要求I的用途，其中所述蔗糖以10%蔗糖的量存在。
5.權利要求I的用途，其中所述抗體片段是抗體的單鏈Fv片段。
6.權利要求I的用途，其中所述治療劑選自化學治療劑、基因、質粒DNA、蛋白質、小分子、寡核苷酸、寡脫氧核苷酸、反義寡核苷酸、miRNA、siRNA或任何小RNA分子。
7.權利要求I的用途，其中所述脂質體是至少一種陽離子脂質和至少一種中性脂質的混合物。
8.權利要求I的方法，其中所述診斷劑選自電子致密材料，磁共振顯象劑或放射性制劑。
9.權利要求I的用途，其中所述靶細胞是癌細胞。
10.權利要求I的用途，其中所述靶細胞是非癌細胞。
全文摘要
一種制備穩(wěn)定的細胞靶向復合物的方法，所述復合物包含一種配體及一種包囊封裝有一種治療劑或診斷劑的陽離子脂質體，所述方法包括(a)將所述復合物與一種包含穩(wěn)定量的蔗糖的溶液組合及(b)凍干所得溶液以獲得凍干的制品；其中在復原時所述制品保留其至少約80％的凍干前活性。
文檔編號A61K9/19GK103251562SQ20131018576
公開日2013年8月21日 申請日期2004年6月4日 優(yōu)先權日2003年6月4日
發(fā)明者埃斯特·H.·章, 凱瑟琳·F.·皮羅洛 申請人:喬治敦大學