專利名稱：截短胰高血糖素樣肽1(sGLP－1)、制法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及促胰島素分泌的胰高血糖素樣肽1(glucagon-likepeptide-1，GLP-1)的類似物，另外還涉及其制法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年來對促胰島素分泌肽GLP-1和Exendin 4的研究進展很快，兩者具有很高的同源性，應(yīng)用于治療II型糖尿病取得較好的效果。GLP-1是人腸道中分離純化得到的多肽，Exendin 4是從墨西哥巨蜥蜴的毒液中分離得到的一種短肽。兩者在很低濃度下即可促進胰臟合成和分泌胰島素，從而能幫助糖尿病人控制血糖。
GLP-1是人體分泌的一種腸道激素，由胰高血糖素原(Proglucagon)分子經(jīng)腸道蛋白水解酶作用而產(chǎn)生，因而稱為胰高血糖素類多肽。當血糖濃度高于6mmol/L時，GLP-1能顯著促進胰島素分泌；而一旦血糖濃度恢復至正常值則不再繼續(xù)作用，這一點對II型糖尿病的治療十分有用。人體內(nèi)的GLP-1有兩種形式，一種為GLP-1(7-36)NH2，是由30個氨基酸殘基組成的多肽，即由胰高血糖素原中第7位至第36位氨基酸組成，其C端是酰胺化了的；另一種為GLP-1(7-37)，是由31個氨基酸殘基組成的多肽，即胰高血糖素原中第7位至第37位氨基酸，GLP-1(7-36)NH2和GLP-1(7-37)有相同的促胰島素分泌作用，實驗證明，在1×10-10-1×10-111mol/L濃度下，GLP-1與離體胰島細胞作用時，可促進其分泌胰島素，故又稱它們?yōu)榇僖葝u素分泌肽。美國專利USP 05424286公開了Exendin4和GLP-1促胰島素分泌的對比實驗。與GLP-1相比，產(chǎn)生胰島素分泌作用所需的Exendin 4濃度更低，而且Exendin 4在人體內(nèi)的半衰期更長。這些研究表明，GLP-1或Exendin 4可能成為一種較為理想的II型糖尿病治療藥物。
一個治療II型糖尿病的理想藥物應(yīng)該是既能降低空腹血糖，也能降低餐后血糖，又不會導致低血糖，還能減少心血管系統(tǒng)的并發(fā)癥，并且沒有其它的副反應(yīng)。GLP-1是由30個氨基酸組成的肽，其序列His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg。雖然該序列用于治療糖尿病優(yōu)點是該序列為人體產(chǎn)生的天然序列，具有上述的多種特性，副反應(yīng)少，比如它能象糖原那樣抑制糖原的分泌，減慢胃腸排空，抑制食欲等；此外，GLP-1受體的刺激還可以促進細胞增殖及更新，從而使胰島素分泌增多，對糖的耐受性提高。但缺點是，頭兩個氨基酸His-Ala很快就被體內(nèi)的二肽基肽酶降解而喪失活性，在體內(nèi)的半衰期太短，只有90至120秒，幾乎沒有太大的臨床實用價值。目前國內(nèi)外進行GLP-1序列改構(gòu)的研究和專利均有很多，但沒有在GLP-1序列改構(gòu)同時進行序列長度縮減的。
Exendin 4在人體內(nèi)的半衰期長，降血糖作用明顯，但化學合成的Exendin 4是39個氨基酸組成的肽，成本高，而且作為異源多肽，長期使用有誘發(fā)人體產(chǎn)生對應(yīng)抗體而失效的可能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服上述不足問題，提供一種截短胰高血糖素樣肽1(sGLP-1)，與胰島細胞受體結(jié)合力更強，刺激胰島素分泌作用更強；半衰期延長，另外還提供其制法，合成成本低，最后還提供其應(yīng)用。
本發(fā)明為實現(xiàn)上述目的所采用的技術(shù)方案是截短胰高血糖素樣肽1(sGLP-1)，其由26個氨基酸組成，其序列如下His-X1-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu式中英文縮寫表示His(縮寫為H，以下相同。)組氨酸、Gly(G)甘氨酸、Glu(E)谷氨酸、Thr(T)蘇氨酸、Phe(F)苯丙氨酸、Ser(S)絲氨酸、Asp(D)天冬氨酸、Val(V)纈氨酸、Tyr(Y)酪氨酸、Leu(L)亮氨酸、Gln(Q)谷氨酰胺、Lys(K)賴氨酸、Ile(I)異亮氨酸、Trp(W)色氨酸。
其中所述的X1為Gly或Ser。
本發(fā)明所述截短胰高血糖素樣肽1(sGLP-1)的制法第一步sGLP-1肽樹脂的合成稱取0.5克的多肽合成樹脂倒入合成反應(yīng)柱中，加入二甲基甲酰胺溶劑溶脹，按照sGLP-1氨基酸序列依次稱取0.1克的9芘甲氧羰基進行氨基酸N端(FMOC)保護的氨基酸于反應(yīng)器的容器中，采用Merrifield發(fā)明的固相化學合成方法合成，sGLP-1的氨基酸序列從C端開始依次進行，在合成反應(yīng)柱中，加入用二甲基甲酰胺溶解的N，N二異丙級碳二亞胺(DIC)，4-二甲氨基吡啶(DMAP)，C端第一個氨基酸(FMOC-Leu)，反應(yīng)2-3小時中止，減壓抽干反應(yīng)液，洗樹脂，分別用異丙醇洗3次，二氯甲烷洗3次，二甲基甲酰胺洗3次，加入含20％(V/V)6-氫吡啶的二甲基甲酰胺脫保護溶液，反應(yīng)30分鐘，抽干反應(yīng)液，分別用異丙醇洗3次，二氯甲烷洗3次，二甲基甲酰胺3次，隨后加入的第二個FMOC保護的氨基酸，和無水羥基苯丙三氮唑(HOBT)，2-苯駢三氮唑-1，1，3，3，-四甲基脲四氟硼酸酯(HBTU)，N，N-二異丙基乙胺(DIPEA)，溶解活化5分鐘，立即加入反應(yīng)器中反應(yīng)2小時，按上法洗樹脂，脫保護，隨后依照序列結(jié)構(gòu)偶連反應(yīng)直到序列完全，偶連完成后，用二甲基甲酰胺充分洗去殘余的未偶連試劑，用惰性氣體N2吹干肽樹脂，備用。
第二步sGLP-1樹脂的裂解取上述肽樹脂于容器中，加入裂解液9.5ml三氟乙酸，0.4ml硫代苯甲醚，0.4ml苯甲醚，0.2ml-1，2-乙二硫醇，于室溫避光反應(yīng)2小時，過濾，濾液于室溫濃縮后加入預(yù)先冷凍的無水乙醚中，冰凍過夜，離心，棄上清液，沉淀用水或冰醋酸溶解后，冷凍后置冷凍干燥機中干燥，得粗肽。第三步sGLP-1肽純化取上述粗肽，加入無熱源水溶解，得到樣品溶液，過濾并收集樣品濾液；將乙腈及無熱源水用0.45u濾膜過濾，分別加入0.1％三氟乙酸，混勻，用C18反向柱分離純化，分離條件采用流動相A0.1％三氟乙酸+100％H2O；流動相B0.1％三氟乙酸+100％乙腈；0→90分鐘梯度洗脫純化制備，收集純化的sGLP-1洗脫液，冷凍后置冷凍干燥機中干燥，得到sGLP-1多肽純品。
本發(fā)明所述截短胰高血糖素樣肽1(sGLP-1)在治療II型糖尿病藥物中的應(yīng)用。如在治療II型糖尿病注射針劑、口服片劑或膠囊、噴霧劑中的應(yīng)用。
所述中成分除sGLP-1外，注射針劑包含sGLP-1及人體可接受的稀釋液體，如注射用水、生理鹽水和磷酸鹽緩沖液等；口服片劑或膠囊包括sGLP-1及醫(yī)藥可接受的穩(wěn)定劑、固型劑等。
本發(fā)明所述的截短胰高血糖素樣肽1(sGLP-1)與目前GLP-1及其類似物相比，具有突出的特點1.截短肽鏈改構(gòu)后與胰島細胞受體結(jié)合力更強，刺激更強的胰島素分泌作用；2.通過第二位氨基酸序列的改變，由Ala改為Gly或Ser使改構(gòu)的模擬序列可抵抗二肽基肽酶降解作用，從而使半衰期延長，藥效增強；3.通過截短肽鏈，降低合成成本。多肽的制備一般可采用化學合成和基因工程技術(shù)兩種方法生產(chǎn)。但生產(chǎn)的成本很高，這成為其進入藥品市場的障礙。本發(fā)明提供的合成方法，通過改變肽鏈中的少數(shù)若干個氨基酸可得到多肽的類似物，同時又可以大規(guī)模、低成本地進行生產(chǎn)。通過用II型糖尿病大鼠模型試驗，進行II型糖尿病降血糖治療試驗，結(jié)果表明本發(fā)明sGLP-1降血糖作用優(yōu)于GLP-1及其改構(gòu)序列，動物試驗表明降糖效果明顯提高。用改構(gòu)的縮短序列與胰島細胞受體結(jié)合，具有更佳的刺激胰島素分泌作用，具有較好的用于II型糖尿病病人的治療藥物的應(yīng)用前景。


圖1為本發(fā)明sGLP-1液相色譜純度鑒定圖。
圖2為本發(fā)明sGLP-1分子量質(zhì)譜鑒定圖。
具體實施例方式實施例1按下述方法合成sGLP-1，其序列如下His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu第一步sGLP-1肽樹脂的合成稱取0.5克的Wang樹脂(或其他多肽合成樹脂)倒入合成反應(yīng)柱中，加入二甲基甲酰胺溶劑溶脹，按照本發(fā)明的降血糖肽的氨基酸序列依次稱取0.1克的FMOC(9芘甲氧羰基進行氨基酸N端保護的)氨基酸于反應(yīng)器的容器中，按照Merrifield發(fā)明的固相化學合成方法(具體方法如下)依照本發(fā)明的sGLP-1的氨基酸序列從C端開始依次進行，在合成反應(yīng)柱中，加入用10ml的二甲基甲酰胺溶解的4ml N，N二異丙級碳二亞胺(DIC)，0.012克4-二甲氨基吡啶的C端第一個氨基酸(FMOC-氨基酸)，反應(yīng)2-3小時中止，減壓抽干反應(yīng)液，洗樹脂，分別用異丙醇洗3次，二氯甲烷洗3次，二甲基甲酰胺3次，加入含20％(V/V)6-氫吡啶的二甲基甲酰胺脫保護溶液，反應(yīng)30分鐘，抽干反應(yīng)液，分別用異丙醇洗3次，二氯甲烷洗3次，二甲基甲酰胺3次，隨后加入的第二個FMOC保護的氨基酸，和0.22克無水羥基苯丙三氮唑，0.6克2-苯駢三氮唑-1，1，3，3，-四甲基脲四氟硼酸酯(HBTU)，0.35mlN，N-二異丙基乙胺，溶解活化5分鐘，立即加入反應(yīng)器中反應(yīng)2小時，按上法洗樹脂，脫保護，隨后依照序列結(jié)構(gòu)偶連反應(yīng)直到序列完全，偶連完成后，用二甲基甲酰胺充分洗去殘余的未偶連試劑，用惰性氣體N2吹干肽樹脂，備用。
第二步sGLP-1樹脂的裂解取上述肽樹脂于容器中，加入裂解液9.5ml三氟乙酸，0.4ml硫代苯甲醚，0.4ml苯甲醚，0.2ml-1，2-乙二硫醇，于室溫避光反應(yīng)2小時，過濾，濾液與室溫濃縮后加入預(yù)先冷凍的無水乙醚中，冰凍過夜，離心，棄上清液，沉淀用200ml水或冰醋酸溶解后，冷凍后置冷凍干燥機中干燥，得粗肽。
第三步sGLP-1肽純化取粗肽，加入200ml無熱源水溶解，得到樣品溶液，過濾并收集樣品濾液；將乙腈及無熱源水用0.45u濾膜過濾，分別加入0.1％三氟乙酸，混勻，用C18反向柱分離純化，分離條件采用流動相A0.1％三氟乙酸+100％H2O；流動相B0.1％三氟乙酸+100％乙腈；0→90分鐘梯度洗脫純化制備，收集純化的sGLP-1洗脫液，冷凍后置冷凍干燥機中干燥，得到sGLP-1多肽純品。
實施例2按照實施例1所述方法合成sGLP-1，其序列如下His-Ser-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu。
動物實驗1、降血糖效果實驗材料和方法GK糖尿病大鼠(中國科學院上海動物中心提供)sGLP-1序列如下No1HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRNo2HGEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLNo3HSEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLNo4HSEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFINo5HGEGTFTSDVSSYLEGQAVRLFINo6HGEGTFTSDVSSYMEEEAVRNo7HGE GTFTSDVSSYMNo8HGEGTFTSDVSS上述8種序列多肽用0.9％NaCl溶液配置成1mg/ml溶液，備用。
大鼠隨機分組，禁食過夜后，用刻度毛細管(注射前以肝素處理)從眼竇取血20微升，置入300微升生理鹽水中混勻，3000轉(zhuǎn)/分離心除去紅血球，血清用于空腹血糖濃度測定。然后各組分別注射不同多肽，用生理鹽水作陰性對照，每只大鼠每天注射兩次，每次0.1mg，連續(xù)注射兩周，禁食過夜后，再次按上法取血，測定空腹血糖。
結(jié)果見附表1，No1～No5均有降血糖作用，其中No1序列是第2位氨基酸由A改為G的全長GLP-1序列作為陽性對照；No2～No5為不同截短長度的改構(gòu)序列，而且No2和No3組降血糖作用明顯高于No1組，為最終確定的本發(fā)明sGLP-1序列。
2、對NOD小鼠的降血糖作用實驗材料與方法
NOD小鼠禁食過夜(中國科學院上海動物中心提供)40％葡萄糖、0.9％NaCl溶液、sGLP-1純品(實施例1所得產(chǎn)品)、GLP-1純品、血糖測定試劑盒(中國衛(wèi)生部上海生物制品所出品)NOD小鼠禁食過夜，分為三組。第一組腹腔注射200微升40％葡萄糖和10微克sGLP-1，第二組腹腔注射200微升40％葡萄糖和10微克GLP-1，第三組為對照組，只注射葡萄糖。立刻用刻度毛細管(注射前以肝素處理)從眼竇取血20微升，置入300微升生理鹽水中混勻，3000轉(zhuǎn)/分離心除去紅血球，血清用于血糖濃度測定。分別于30，60，120分鐘按同樣操作取血，分離血清。三組血清均按照試劑盒所述方法測定血糖濃度，以檢驗各組的降血糖作用。
結(jié)果如表1所示。
對照組血糖濃度大幅度升高后，逐漸回落到正常水平；而給藥組血糖濃度未出現(xiàn)顯著升高，一直保持在正常水平附近。這是由于給藥后促進了胰島素分泌，從而避免了血糖濃度的大幅波動。由此可證明sGLP-1和GLP-1的降血糖作用。
表1.sGLP-1對NOD小鼠的降血糖作用

注表中血糖濃度值為mmol/L3、sGLP-1的促胰島素分泌作用實驗材料與方法NOD小鼠(中國科學院上海動物中心提供)0.9％NaCl溶液、sGLP-1純品(實施例1所得產(chǎn)品)、GLP-1純品放射免疫胰島素測定試劑盒(中國衛(wèi)生部上海生物制品所出品)NOD小鼠分成三組。首先用刻度毛細管(先以1mg/mL肝素潤洗毛細管內(nèi)壁并晾干)從眼竇取血50微升，然后三組小鼠分別腹腔注射10微克sGLP-1、10微克GLP-1和200微升生理鹽水，并記此時為零時刻。然后分別于5，10，20，30分鐘按同樣操作取血。取血后各血樣立刻加入盛有50微升生理鹽水的離心管中，混勻，3000轉(zhuǎn)/分離心除去紅血球，按放射免疫試劑盒使用方法測定血清中胰島素濃度，以檢驗sGLP-1的促胰島素分泌作用。
實驗結(jié)果如表2所示。該結(jié)果表明，腹腔注射sGLP-1能顯著促進胰島素的分泌，短時間刺激產(chǎn)生胰島素能力與GLP-1相當，中長時間刺激產(chǎn)生胰島素能力超過GLP-1。
表2.sGLP-1的促胰島素分泌作用

注表中胰島素值為10-6國際單位4.sGLP-1的促C肽分泌作用實驗材料與方法健康C57/BL小鼠(中國科學院上海動物中心提供)0.9％NaCl溶液、sGLP-1純品(實施例1所得產(chǎn)品)、GLP-1純品。放射免疫C-肽測定試劑盒(中國衛(wèi)生部上海生物制品所出品)健康C57/BL小鼠分成三組。首先用刻度毛細管(先以1mg/mL肝素潤洗毛細管內(nèi)壁并晾干)從眼竇取血50微升，然后兩組小鼠分別腹腔注射10微克sGLP-1、10微克GLP-1和200微升生理鹽水，并記此時為零時刻。然后分別于5，10，20，30分鐘按同樣操作取血。取血后各血樣立刻加入盛有50微升生理鹽水的離心管中，混勻，3000轉(zhuǎn)/分離心除去紅血球，按放射免疫試劑盒使用方法測定血清中C肽濃度，以檢驗sGLP-1的促C肽分泌作用。
實驗結(jié)果如表3所示。該結(jié)果表明，腹腔注射sGLP-1能顯著促進c肽的分泌，而且促進c肽的分泌能力高于GLP-1。
表3.sGLP-1的促胰島素分泌作用

注表中c肽濃度為pmol/mL
附表1 降血糖效果實驗

權(quán)利要求
1.截短胰高血糖素樣肽1(sGLP-1)，其特征在于其由26個氨基酸組成，其序列如下His-Xl-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的截短胰高血糖素樣肽1(sGLP-1)，其特征在于其中Xl為Gly或Ser。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的截短胰高血糖素樣肽1(sGLP-1)的制法，其特征在于第一步sGLP-1肽樹脂的合成稱取0.5克的多肽合成樹脂倒入合成反應(yīng)柱中，加入二甲基甲酰胺溶劑溶脹，按照sGLP-1氨基酸序列依次稱取0.1克的9芘甲氧羰基進行氨基酸N端(FMOC)保護的氨基酸于反應(yīng)器的容器中，采用Merrifield發(fā)明的固相化學合成方法合成，sGLP-1的氨基酸序列從C端開始依次進行，在合成反應(yīng)柱中，加入用二甲基甲酰胺溶解的N，N二異丙級碳二亞胺(DIC)，4-二甲氨基吡啶(DMAP)，C端第一個氨基酸(FMOC-Leu)，反應(yīng)2-3小時中止，減壓抽干反應(yīng)液，洗樹脂，分別用異丙醇洗3次，二氯甲烷洗3次，二甲基甲酰胺洗3次，加入含20％(V/V)6-氫吡啶的二甲基甲酰胺脫保護溶液，反應(yīng)30分鐘，抽干反應(yīng)液，分別用異丙醇洗3次，二氯甲烷洗3次，二甲基甲酰胺3次，隨后加入的第二個FMOC保護的氨基酸，和無水羥基苯丙三氮唑(HOBT)，2-苯駢三氮唑-1，1，3，3，-四甲基脲四氟硼酸酯(HBTU)，N，N-二異丙基乙胺(DIPEA)，溶解活化5分鐘，立即加入反應(yīng)器中反應(yīng)2小時，按上法洗樹脂，脫保護，隨后依照序列結(jié)構(gòu)偶連反應(yīng)直到序列完全，偶連完成后，用二甲基甲酰胺充分洗去殘余的未偶連試劑，用惰性氣體N2吹干肽樹脂，備用；第二步sGLP-1樹脂的裂解取上述肽樹脂于容器中，加入裂解液9.5ml三氟乙酸，0.4ml硫代苯甲醚，0.4ml苯甲醚，0.2ml-1，2-乙二硫醇，于室溫避光反應(yīng)2小時，過濾，濾液于室溫濃縮后加入預(yù)先冷凍的無水乙醚中，冰凍過夜，離心，棄上清液，沉淀用水或冰醋酸溶解后，冷凍后置冷凍干燥機中干燥，得粗肽；第三步sGLP-1肽純化取上述粗肽，加入無熱源水溶解，得到樣品溶液，過濾并收集樣品濾液；將乙腈及無熱源水用0.45u濾膜過濾，分別加入0.1％三氟乙酸，混勻，用C18反向柱分離純化，分離條件采用流動相A0.1％三氟乙酸+100％H2O；流動相B0.1％三氟乙酸+100％乙腈；0→90分鐘梯度洗脫純化制備，收集純化的sGLP-1洗脫液，冷凍后置冷凍干燥機中干燥，得到sGLP-1多肽純品。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的截短胰高血糖素樣肽1(sGLP-1)在治療II型糖尿病藥物中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的截短胰高血糖素樣肽1(sGLP-1)在治療II型糖尿病注射針劑、口服片劑或膠囊、噴霧劑中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的截短胰高血糖素樣肽1(sGLP-1)在治療II型糖尿病藥物中的應(yīng)用，其特征在于注射針劑包含sGLP-1及人體可接受的稀釋液體，如注射用水、生理鹽水和磷酸鹽緩沖液。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的截短胰高血糖素樣肽1(sGLP-1)在治療II型糖尿病藥物中的應(yīng)用，其特征在于口服片劑或膠囊包括sGLP-1及醫(yī)藥可接受的穩(wěn)定劑、固型劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及促胰島素分泌的胰高血糖素樣肽1(glucagon－likepeptide－1，GLP－1)的類似物，截短胰高血糖素樣肽1(sGLP－1)，其由26個氨基酸組成，其序列如下His－X1－Glu－Gly－Thr－Phe－Thr－Ser－Asp－Val－Ser－Ser－Tyr－Leu－Glu－Gly－Gln－Ala－Ala－Lys－Glu－Phe－Ile－Ala－Trp－Leu。發(fā)明所述的截短胰高血糖素樣肽1(sGLP－1)與目前GLP－1及其類似物相比，具有突出的特點1.截短肽鏈改構(gòu)后與胰島細胞受體結(jié)合力更強，刺激更強的胰島素分泌作用；2.通過第二位氨基酸序列的改變，由Ala改為Gly或Ser使改構(gòu)的模擬序列可抵抗二肽基肽酶降解作用，從而使半衰期延長，藥效增強；3.通過截短肽鏈，降低合成成本。
文檔編號A61P3/10GK1817904SQ20051004780
公開日2006年8月16日 申請日期2005年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月21日
發(fā)明者李元, 黃慶生, 李別虎, 張虎明, 張明杰, 薛小平, 王延竹, 韓文君, 張衛(wèi)華, 張勝軍 申請人:大連帝恩生物工程有限公司