一種基于腺病毒AdC68的表達(dá)載體及其構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于腺病毒AdC68的表達(dá)載體及其構(gòu)建方法。本發(fā)明人通過改進(jìn)構(gòu)建方法，構(gòu)建了一種基于黑猩猩型腺病毒AdC68基因組的疫苗載體。所述的疫苗載體可應(yīng)用于制備可高效表達(dá)且具有良好免疫原性的疫苗。
【專利說明】一種基于腺病毒AdC68的表達(dá)載體及其構(gòu)建方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)和病毒學(xué)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及一種基于腺病毒AdC68的表達(dá)載體及其構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]腺病毒(Adenovirus)是一種無包膜、線性化的雙鏈DNA病毒，能夠高效感染各種哺乳動物細(xì)胞且易于擴(kuò)增及純化，被作為基因載體工具廣泛用于分子和細(xì)胞生物學(xué)研究。腺病毒能在體內(nèi)有效地誘導(dǎo)強烈的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)，被認(rèn)為是目前最有應(yīng)用前景的疫苗載體之一，包括用于研發(fā)HPV、HIV，乙肝、丙肝、流感、瘧疾、狂犬病等疾病的疫苗。傳統(tǒng)的腺病毒載體主要是基于人血清型AdHu2和AdHu5，其中AdHu5曾一度被應(yīng)用于臨床基因治療。然而據(jù)血清型調(diào)查表明人群中約40-60%的個體中含有抗人血清型腺病毒的中和抗體，導(dǎo)致基于人血清型腺病毒載體的免疫效果受到體內(nèi)預(yù)存的中和抗體很大程度的影口向(Singh, N.等，Molecular therapy: the journal of the American Society of GeneTherapyl6,965-971, do1: 10.1038/mt.2008.12(2008) ；Sprangers, M.C.等，Journal ofclinical microbiology41,5046-5052(2003))。
[0003]目前腺病毒載體的構(gòu)建策略一般采用同源重組的方法，包括:(1)細(xì)胞內(nèi)同源重組，此方法缺點是易受到親代腺病毒的污染，必須經(jīng)過2-3次的病毒空斑純化，并通過多次的噬斑形成方法鑒定重組病毒；另外重組效率低下，產(chǎn)生重組的時間至少需要兩周以上。
(2)位點特異性重組，缺點是同樣易受親代病毒的污染，需要經(jīng)過多次病毒空斑純化，由于引入了 Cre/loxp重組系統(tǒng)，會增加腺病毒發(fā)生遺傳改變的幾率，獲得不穩(wěn)定的腺病毒子代。(3)細(xì)菌內(nèi)同源重組(如AdEasy? System)，其缺點是篩選陽性克隆比較繁瑣，同時由于引入同源重組方法，腺病毒基因組在大腸桿菌中易發(fā)生突變。
[0004]因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員還需要開發(fā)新的構(gòu)建腺病毒載體的方法，以及開發(fā)免疫效果理想的腺病毒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種基于腺病毒AdC68的表達(dá)載體及其構(gòu)建方法。
[0006]在本發(fā)明的第一方面，提供一種制備腺病毒表達(dá)載體的方法，所述方法包括:將黑猩猩型腺病毒AdC68基因組分成4個片段，依次裝入到骨架載體中，并且，用連接序列替換AdC68基因組中El的大部份編碼序列；所述的連接序列中，設(shè)置酶切位點1-Ceu I和P1-Sce
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[0007]在一個優(yōu)選例中，所述的4個片段分別是:
[0008]黑猩猩型腺病毒AdC68基因組第1-6025位；
[0009]黑猩猩型腺病毒AdC68基因組第6026-17279位；
[0010]黑猩猩型腺病毒AdC68基因組第17280-34196位；和
[0011]黑猩猩型腺病毒AdC68基因組第34197-36519位。[0012]在另一優(yōu)選例中，各片段的氨基酸位點計算基于GenBank登錄號AC_000011的核苷酸序列。
[0013]在另一優(yōu)選例中，利用Nde I和SnaB I兩個酶切位點切除腺病毒El的大部份編碼序列，大小約為3.5kb，將其替換為含有內(nèi)切酶1-Ceu I和P1-Sce I的Linker片段。
[0014]在另一優(yōu)選例中，所述的骨架載體是pNEB193載體。
[0015]在另一優(yōu)選例中，所述的連接序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0016]在本發(fā)明的另一方面，提供一種腺病毒表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包括:改造的黑猩猩型腺病毒AdC68基因組序列；其中，El的大部份編碼序列由連接序列(Linker)替換；所述的連接序列中設(shè)置酶切位點1-Ceu I和P1-Sce I。
[0017]在另一優(yōu)選例中，所述的連接序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0018]在另一優(yōu)選例中，所述的腺病毒表達(dá)載體的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
[0019]在另一優(yōu)選例中，所述表達(dá)載體的酶切位點1-Ceu I和P1-Sce I之間，還包括外源的抗原編碼基因。
[0020]在另一優(yōu)選例中，所述的外源的抗原是(但不限于)腸道病毒EV71的VPl抗原。
[0021]在另一優(yōu)選例中，所述的VPl抗原的編碼基因的序列如SEQ ID N0:4所示。
[0022]在本發(fā)明的另一方面，提供一種制備疫苗的方法，所述方法包括:
[0023](I)提供所述的腺病毒表達(dá)載體；
[0024](2)將外源的抗原編碼基因插入到(I)表達(dá)載體的酶切位點1-Ceu I和P1-SceI之間；
[0025](3)將(2)的重組表達(dá)載體感染病毒生產(chǎn)細(xì)胞，病毒在細(xì)胞內(nèi)包裝，從而獲得具有免疫原性的疫苗。
[0026]在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于制備疫苗的試劑盒，所述試劑盒包括:前面任一所述的腺病毒表達(dá)載體。
[0027]在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒還包括:病毒生產(chǎn)細(xì)胞；和/或抗原編碼基因。
[0028]在另一優(yōu)選例中，所述的病毒生產(chǎn)細(xì)胞是HEK293細(xì)胞。
[0029]本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0030]圖1、野生型腺病毒AdC68基因組的酶切鑒定結(jié)果。
[0031]M =DNA分子量標(biāo)準(zhǔn);1、2:Bgl II和Mfe I酶切鑒定。
[0032]圖2、復(fù)制缺陷型腺病毒載體AdC68的構(gòu)建及鑒定。
[0033]A、基于腺病毒AdC68基因組酶切位點分析的結(jié)果，將其分成KE，AK, XA和PX四個片段，在其末端分別添加Pac I酶切位點便于線性化。
[0034]B、構(gòu)建復(fù)制缺陷型腺病毒AdC68的策略示意圖:先將KE，AK，XA組裝入pNEB193載體；將另一部分的PX組裝入另一個PNEB193載體，其中在PX部位刪除腺病毒El部分區(qū)域并連入含有1-Ceu I和P1-Sce I歸位內(nèi)切酶的Linker ;最后組裝成完整的El部分刪除的復(fù)制缺陷型腺病毒AdC68。
[0035]C、復(fù)制缺陷型腺病毒AdC68的酶切鑒定結(jié)果。M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；l_4:Xho I，Bgl II，Mfe I和Xma I分別酶切鑒定結(jié)果。
[0036]圖3、含有報告基因的重組載體pAdC68-El-deleted+EGFP(即pNEB193+El-deleted AdC68_EGFP)構(gòu)建及鑒定結(jié)果。
[0037]A、報告基因CMV-EGFP克隆入pAdC68-El_deleted載體示意圖。
[0038]B、質(zhì)粒 pAdC68-El-deleted+EGFP 的酶切鑒定結(jié)果。M =DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)；1_4 =XhoI，Bgl II，Mfe I和Xma I分別酶切鑒定結(jié)果。
[0039]圖4、轉(zhuǎn)染含有報告基因的重組載體pAdC68-El-deleted+EGFP的熒光表達(dá)情況(100X)。
[0040]圖5、第 12 代重組腺病毒 AdC68-El-deleted 和 AdC68-El-deleted+EGFP 基因組的鑒定。
[0041]A、重組腺病毒AdC68-El_deleted基因組的酶切鑒定結(jié)果；M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-3 =Xho I，Bgl II和Mfe I分別酶切鑒定結(jié)果。
[0042]B、重組腺病毒AdC68-El_deleted+EGFP基因組的酶切鑒定結(jié)果；M:DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1-3 =Xho I，Bgl II和Mfe I分別酶切鑒定結(jié)果。
[0043]圖6、重組腺病毒AdC68-El_deleted+VPl的酶切鑒定。
[0044]A、重組腺病毒AdC68-El_deleted+VPl質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果；M:DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1-3 =Xho I，Bgl II和Mfe I分別酶切鑒定結(jié)果。
[0045]B、重組腺病毒AdC68-El_deleted+VPl基因組的酶切鑒定結(jié)果；M:DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1_3 =Xho I，Bgl II和Mfe I分別酶切鑒定結(jié)果。
[0046]圖7、重組腺病毒AdC68-El_deleted+VPl的VPl蛋白表達(dá)及抗體反應(yīng)。
[0047]A、ffestern-blot 檢測 VPl 基因的表達(dá)。1:陰性對照(AdC68_empty,即AdC68-El-deleted) ;2_5:分別為 108vp、109vp、IOicVp 和 10nvpAdC68-El-deleted+VPl ；6:陽性對照，EV71滅活病毒。
[0048]B、ELISA檢測AdC68-El_deleted+VPl誘導(dǎo)的特異性抗體。圖示各樣本血清稀釋度為1:80的OD值。
【具體實施方式】
[0049]本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究，通過改進(jìn)構(gòu)建方法，構(gòu)建了一種基于黑猩猩型腺病毒AdC68基因組的疫苗載體。所述的疫苗載體可應(yīng)用于制備可高效表達(dá)且具有良好免疫原性的病毒疫苗。
[0050]為解決現(xiàn)有技術(shù)的問題，本發(fā)明人選擇稀有血清型或其他種屬來源的腺病毒作為疫苗載體，由于人群中一般不會含有抗黑猩猩型腺病毒的中和抗體，因此基于黑猩猩型腺病毒的疫苗載體，其免疫效果將顯著優(yōu)于以人血清型腺病毒構(gòu)建的疫苗載體。
[0051] 因此，本發(fā)明提供了一種腺病毒表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包括:改造的黑猩猩型腺病毒AdC68基因組序列；其中，El編碼序列由連接序列替換；所述的連接序列中設(shè)置酶切位點 1-Ceu I 和 P1-Sce I。
[0052]針對腺病毒AdC68基因組，本發(fā)明人經(jīng)過細(xì)致的序列比對，最終確定了應(yīng)用酶切位點1-Ceu I和P1-Sce I作為外源基因的插入位點，從而不會導(dǎo)致在腺病毒表達(dá)載體的其它位置造成剪切。[0053]由于腺病毒的基因組比較大，大約有36kb，使直接克隆重組腺病毒載體成為技術(shù)瓶頸。因此，本發(fā)明人開發(fā)了能通過酶切連接的快速方法直接構(gòu)建基于黑猩猩型腺病毒AdC68作為疫苗載體，即充分利用腺病毒基因組中存在的某些酶切位點。根據(jù)對腺病毒AdC68整個基因組序列的分析，將其分成KE，AK，XA和PX四個片段，然后通過酶切連接的方法再逐步克隆到PNEB193的載體中，最終獲得一個復(fù)制缺陷型的腺病毒克隆。其中在腺病毒AdC68的PX部分，利用Nde I和SnaB I兩個酶切位點刪除了與腺病毒復(fù)制相關(guān)的El部分，大小約為3.5kb，將其替換為含有歸位內(nèi)切酶1-Ceu I和P1-Sce I的Linker片段。此方法構(gòu)建的復(fù)制缺陷型腺病毒AdC68經(jīng)過線性化能夠在HEK293細(xì)胞中成功包裝并擴(kuò)增出遺傳穩(wěn)定的重組腺病毒。
[0054]KE, AK, XA和PX四個片段之間可包括限制性的酶切位點，這樣有利于各元件的有機連接。
[0055]所述的表達(dá)載體通常還含有復(fù)制起點和/或標(biāo)記基因等。本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建本發(fā)明所需的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。所述的DNA序列可有效連接到表達(dá)載體中的適當(dāng)啟動子(如CMV)上，以指導(dǎo)mRNA合成。表達(dá)載體還包括翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點和轉(zhuǎn)錄終止子。此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀。
[0056]本發(fā)明還提供了一種制備腺病毒表達(dá)載體的方法，所述方法包括:將黑猩猩型腺病毒AdC68基因組分成4個片段，依次裝入到骨架載體中，并且，用連接序列替換AdC68基因組中El編碼序列；所述的 連接序列中，設(shè)置酶切位點1-Ceu I和P1-Sce I。
[0057]獲得所述腺病毒表達(dá)載體后，將之轉(zhuǎn)染病毒生產(chǎn)細(xì)胞，進(jìn)行病毒的繁殖。轉(zhuǎn)染后的一段時間后，可以收獲病毒。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，收獲的病毒可反復(fù)感染病毒生產(chǎn)細(xì)胞，持續(xù)傳代。病毒滴度(TCID5tl)的測定可以根據(jù)本領(lǐng)域常規(guī)方法進(jìn)行。
[0058]本發(fā)明的腺病毒表達(dá)載體作為一個表達(dá)載體平臺，適用于表達(dá)多種抗原，從而制備病毒疫苗。所述的抗原沒有特別的限制。
[0059]作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，本發(fā)明人通過利用腺病毒基因組直接克隆方法構(gòu)建成復(fù)制缺陷型腺病毒AdC68載體后，將腸道病毒EV71的VPl基因克隆至AdC68載體，免疫小鼠后該重組載體AdC68-VPl能誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)，證明本發(fā)明人成功獲得一種基于黑猩猩型腺病毒AdC68的新型疫苗載體，為新型疫苗研發(fā)提供一種新型的載體平臺。
[0060]本發(fā)明避開了傳統(tǒng)的通過同源重組方法構(gòu)建腺病毒載體，極大程度上降低了腺病毒發(fā)生突變的可能，遺傳穩(wěn)定性好，通過引入Stbl2大腸桿菌轉(zhuǎn)化體系，使得腺病毒發(fā)生突變的概率進(jìn)一步降低。因此，利用本發(fā)明獲得的腺病毒載體表達(dá)外源基因?qū)⒏€(wěn)定、高效。本發(fā)明利用體外直接酶切連接方法構(gòu)建腺病毒載體，在細(xì)菌水平篩選獲得陽性克隆更容易、更便捷，極大地縮短了腺病毒載體的構(gòu)建時間。此外，本發(fā)明適用于所有腺病毒載體的構(gòu)建，僅僅需要對腺病毒基因組酶切位點進(jìn)行分析并加以合理應(yīng)用即可，能被普遍推廣應(yīng)用于所有生物醫(yī)學(xué)實驗室，還能對腺病毒內(nèi)部序列進(jìn)行優(yōu)化改造，構(gòu)建各自特異性的腺病毒載體。綜上所述，本發(fā)明不僅提供了一種新型表達(dá)載體，而且對腺病毒載體的構(gòu)建提供了一種新的優(yōu)異方法，將更好地促進(jìn)腺病毒在生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究領(lǐng)域和臨床應(yīng)用開發(fā)方面發(fā)揮其優(yōu)異特征，為保障人類健康、提高生活質(zhì)量奠定基礎(chǔ)。[0061]基于本發(fā)明的新改進(jìn)，本發(fā)明還提供了一種用于制備疫苗的試劑盒，所述試劑盒包括所述的腺病毒表達(dá)載體。
[0062]所述的試劑盒還可包括病毒生產(chǎn)細(xì)胞，所欲表達(dá)的抗原的編碼基因。此外，所述的試劑盒中還可包括說明疫苗制備方法的使用說明書。
[0063]下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，第三版，科學(xué)出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0064]1.材料
[0065]1.1動物、病毒株和細(xì)胞 [0066]雌性BALB/C小鼠(6_8周)購于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司；野生型腺病毒 AdC68 (GenBank 登錄號 AC_000011)購于 ATCC(American Type Culture Collection,Manassas, VA) ;HEK293細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海生物化學(xué)和細(xì)胞生物研究所，培養(yǎng)液為有10%(v/v)胎牛血清DMEM。
[0067]1.2限制性內(nèi)切酶、菌種與質(zhì)粒
[0068]所有限制性內(nèi)切酶以及pNEB193質(zhì)粒購自New England Biolabs ；DH5 α和Stbl2菌種購自Invitrogen。
[0069]質(zhì)粒pShuttle-CMV 購自 Clontech Laboratories, Inc。
[0070]質(zhì)粒pShuttle-CMV-EGFP構(gòu)建:EGFP序列(SEQ ID NO: 3)獲自南京金斯瑞公司，并由該公司克隆至PUC57載體，獲pUC57-EGFP。本發(fā)明人將pUC57_EGFP中EGFP克隆至pShutt Ie-CMV 載體，獲 pShutt I e-CMV-EGFP。
[0071]pUC57-VPl (optimized):優(yōu)化的VPl序列(SEQ ID NO:4)由南京金斯瑞公司合成，并克隆至PUC57載體，獲pUC57-VPl。
[0072]2.方法
[0073]2.1擴(kuò)增病毒和分離病毒基因組
[0074]在一個T175cm培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)80-90%密度的HEK293細(xì)胞，應(yīng)用野生型腺病毒AdC68感染細(xì)胞，感染24h后收集細(xì)胞，在室溫與_80°C超低溫之間反復(fù)凍融3次，3500rpm/min低溫離心10min取上清，再次感染20個T175cm培養(yǎng)瓶中長至80-90%的HEK293細(xì)胞。待HEK293細(xì)胞被病毒完全裂解后收集細(xì)胞，同樣反復(fù)凍融3次，然后用標(biāo)準(zhǔn)的氯化銫梯度沉降的方法純化腺病毒AdC68。
[0075]根據(jù)DNeasy Tissue Kit (QIAGEN, Valencia, CA)試劑盒標(biāo)準(zhǔn)的說明步驟分離純化腺病毒AdC68的基因組，并酶切鑒定。
[0076]2.2復(fù)制缺陷型腺病毒AdC68載體的構(gòu)建
[0077]2.2.1 質(zhì)粒 pNEB193+KE 的構(gòu)建
[0078]根據(jù)pNEB193載體上的多克隆位點和腺病毒AdC68基因組的序列，設(shè)計擴(kuò)增KE片段的引物(表1)，PCR擴(kuò)增目的產(chǎn)物KE片段。PCR擴(kuò)增體系總體積為50uL，反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為:95°C預(yù)變性 5min ;94°C變性 Imin ;退火溫度 57°C 30s ;72°C延伸 2.2min。EcoR I 和 KpnI雙酶切PCR擴(kuò)增的KE片段，瓊脂糖凝膠純化KE片段，連接至經(jīng)相同酶切的PNEB193載體，轉(zhuǎn)化入DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽性克隆，經(jīng)酶切和測序鑒定得到ρΝΕΒ193+ΚΕ。[0079]表1、PCR引物序列
[0080]
【權(quán)利要求】
1.一種制備腺病毒表達(dá)載體的方法，其特征在于，所述方法包括:將黑猩猩型腺病毒AdC68基因組分成4個片段，依次裝入到骨架載體中，并且，用連接序列替換AdC68基因組中El的大部份編碼序列；所述的連接序列中，設(shè)置酶切位點1-Ceu I和P1-Sce I。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的4個片段分別是: 黑猩猩型腺病毒AdC68基因組第1-6025位； 黑猩猩型腺病毒AdC68基因組第6026-17279位； 黑猩猩型腺病毒AdC68基因組第17280-34196位；和 黑猩猩型腺病毒AdC68基因組第34197-36519位。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的連接序列的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。
4.一種腺病毒表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體包括:改造的黑猩猩型腺病毒AdC68基因組序列；其中，El的大部份編碼序列由連接序列替換； 所述的連接序列中設(shè)置酶切位點1-Ceu I和P1-Sce I。
5.如權(quán)利要求4所述 的腺病毒表達(dá)載體，其特征在于，所述的連接序列的核苷酸序列如 SEQ ID NO:1 所示。
6.如權(quán)利要求5所述的腺病毒表達(dá)載體,其特征在于，所述的腺病毒表達(dá)載體的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
7.如權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體的酶切位點1-CeuI和P1-Sce I之間，還包括外源的抗原編碼基因。
8.如權(quán)利要求7所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述的外源的抗原是腸道病毒EV71的VPl抗原。
9.一種制備疫苗的方法，其特征在于，所述方法包括: (1)提供權(quán)利要求4所述的腺病毒表達(dá)載體； (2)將外源的抗原編碼基因插入到(I)表達(dá)載體的酶切位點1-CeuI和P1-SceI之間； (3)將(2)的重組表達(dá)載體感染病毒生產(chǎn)細(xì)胞，病毒在細(xì)胞內(nèi)包裝，從而獲得具有免疫原性的疫苗。
10.一種用于制備疫苗的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括: 權(quán)利要求4-8任一所述的腺病毒表達(dá)載體。
11.如權(quán)利要求10所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括: 病毒生產(chǎn)細(xì)胞；和/或 抗原編碼基因。
【文檔編號】A61P31/14GK103937835SQ201310362225
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2013年8月19日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月19日
【發(fā)明者】周東明, 楊勇, 丁妙 申請人:中國科學(xué)院上海巴斯德研究所