專(zhuān)利名稱(chēng)：一種腺相關(guān)病毒衣殼蛋白基因、相應(yīng)的蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域和生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種腺相關(guān)病毒衣殼蛋白基 因、相應(yīng)的蛋白及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腺相關(guān)病毒(Adeno-associated virus，AAV，也譯作腺病毒伴隨病毒或腺伴隨病 毒)屬細(xì)小病毒科依賴病毒屬。AAV的病毒顆粒由兩部分組成首先是二十面體樣的蛋白 質(zhì)衣殼，衣殼內(nèi)包裹著單鏈的病毒基因組DNA?；蚪MDNA的兩端為反向重復(fù)序列anvert Terminal Repeat，ITR)。ITR之間包含兩個(gè)基因Rep基因和Cap基因，前者與病毒復(fù)制相 關(guān)，共編碼4種R印蛋白，后者編碼三種衣殼蛋白VP1，VP2和VP3。VP1、VP2、VP3位于同一 讀碼框，由核糖體從不同的起始密碼子翻譯而成。從氨基酸序列來(lái)講，VPl包含VP2，VP2包 含VP3。VP1，VP2，VP3共同構(gòu)成病毒衣殼，其比例約為1 1 10。目前的研究顯示，AAV 的組織親嗜性及細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率主要由其衣殼決定。不同種類(lèi)的衣殼，決定了不同的AAV具 有不同的組織親嗜性及轉(zhuǎn)化效率。特別是衣殼上三倍軸區(qū)域的氨基酸，與AAV和細(xì)胞表面 受體的結(jié)合密切相關(guān)。該區(qū)域氨基酸的微小變化，也可能導(dǎo)致親嗜性或轉(zhuǎn)化效率的顯著改 變(Wu，Asokan，et al. ,2006 ；Excoffon，Koerber，et al，2009)。AAV 衣殼上其他區(qū)域的一 些氨基酸的微小變化，會(huì)顯著影響病毒的包裝能力(BlekenPawlita，et al.，2006)。AAV載體與AAV病毒顆粒非常相似，具有同樣的蛋白質(zhì)衣殼。區(qū)別只在于AAV載 體的基因組DNA，剔除了野生型AAV的全部基因Otep及Cap)，而代之以攜帶目的基因的轉(zhuǎn) 基因表達(dá)盒。這樣就大大降低了由于病毒基因在細(xì)胞內(nèi)活動(dòng)而可能出現(xiàn)的風(fēng)險(xiǎn)。同時(shí)，目 前尚未發(fā)現(xiàn)AAV與人類(lèi)的任何疾病相關(guān)，這使得AAV載體成為迄今安全性最好的基因治療 及基因疫苗用的載體之一。迄今已進(jìn)行的所有以AAV載體為基因?qū)牍ぞ叩呐R床試驗(yàn)中， 均未發(fā)現(xiàn)有與AAV載體相關(guān)的、顯著的副作用。最近，以AAV為載體的基因治療取得重要進(jìn) 展(Maguire，Simonelli，et al，2008)，使得這一方向上的研究不斷升溫。同AAV病毒顆粒一樣，AAV載體的組織親嗜性和基因?qū)胄室彩怯善湟職Q定 的。目前已發(fā)現(xiàn)多種AAV，其衣殼性質(zhì)各有特點(diǎn)。比如，采用AAV8衣殼的AAV載體，肝臟轉(zhuǎn) 化效率很高；AAV9的衣殼，能很好地把目的基因?qū)胄募〖?xì)胞；采用AAV6衣殼的載體，轉(zhuǎn)化 呼吸道上皮細(xì)胞的能力優(yōu)于其他AAV。研究顯示，在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中，AAV的基因組DNA會(huì)整合到宿主細(xì)胞的基因組 上；而在體內(nèi)，AAV的基因組DNA多呈染色體外游離DNA的形式存在(feio，Vandenberghe, et al，2005)。AAV基因組DNA的這種特性，為從組織樣本中分離新型AAV、特別是其衣殼蛋 白基因，提供了基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種腺相關(guān)病毒衣殼蛋白基因，該 基因編碼的蛋白所包裝的載體可以有效地將外源基因?qū)塍w外培養(yǎng)的細(xì)胞中或?qū)塍w內(nèi)。
本發(fā)明另一目的在于提供上述腺相關(guān)病毒衣殼蛋白基因所編碼的蛋白質(zhì)。本發(fā)明另一目的在于提供一種含有上述腺相關(guān)病毒衣殼蛋白基因的載體。本發(fā)明另一目的在于提供一種含有上述腺相關(guān)病毒衣殼蛋白基因的質(zhì)粒。本發(fā)明另一目的在于提供一種含有上述腺相關(guān)病毒衣殼蛋白基因的質(zhì)粒的重組 工程菌株。本發(fā)明還有一個(gè)目的在于提供上述含有腺相關(guān)病毒衣殼蛋白基因的載體的應(yīng)用。本發(fā)明上述目的通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)一種腺相關(guān)病毒衣殼蛋白基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。上述腺相關(guān)病毒衣殼蛋白基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。一種載體，該載體含有所述腺相關(guān)病毒衣殼蛋白基因。一種質(zhì)粒，該質(zhì)粒含有所述腺相關(guān)病毒衣殼蛋白基因。一種重組工程菌株，該菌株含有上述含有所述腺相關(guān)病毒衣殼蛋白基因的質(zhì)粒。本發(fā)明腺相關(guān)病毒衣殼蛋白所包裝的腺相關(guān)病毒載體可以用于制備基因治療的 藥物，或者用于制備基因疫苗。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果本發(fā)明腺相關(guān)病毒衣殼蛋白所包裝的腺相關(guān)病毒載體可以有效地將外源基因?qū)?入體外培養(yǎng)的細(xì)胞中或?qū)塍w內(nèi)，用于制備基因治療或基因疫苗相關(guān)的藥物。


圖1為使用PCR從人組織DNA中擴(kuò)增AAV衣殼蛋白基因片段。其中，泳道M 分子量標(biāo)準(zhǔn)；泳道1-4 陽(yáng)性對(duì)照，其所含模板拷貝數(shù)分別為1、10、100、 1000個(gè)拷貝/PCR反應(yīng)；泳道5-16 以組織DNA為模板的PCR產(chǎn)物；泳道17 =PCR陰性對(duì)照 (以水作為模板)。分子量標(biāo)準(zhǔn)2500BP箭頭所指示的泳道12、15為PCR產(chǎn)物預(yù)期大小。圖2為用本發(fā)明腺相關(guān)病毒衣殼蛋白基因所包裝的、可表達(dá)綠色熒光蛋白的AAV 載體感染體外培養(yǎng)的293細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)。左圖為陰性對(duì)照，添加lOOuLPBS ；右圖為添加用本 發(fā)明所公布的衣殼蛋白基因所包裝的、可表達(dá)綠色熒光蛋白的AAV載體(劑量lxl09gc)。 感染后M小時(shí)，使用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察并拍照。放大倍數(shù)200X。圖3為用本發(fā)明腺相關(guān)病毒衣殼蛋白基因所包裝的、可表達(dá)人AlAT基因的AAV載 體的小鼠實(shí)驗(yàn)。取AAV載體，用PBS稀釋至IOOuL,載體終濃度為3x101 lgc/mL，對(duì)小鼠進(jìn)行 滴鼻灌注。在灌注后第1、2、4、6星期，采血，測(cè)定血清中人AlAT的含量。以AAV2衣殼蛋白 包裝的、可表達(dá)人AlAT基因的AAV載體作為對(duì)照。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限 定。本說(shuō)明書(shū)所涉及術(shù)語(yǔ)，除非特別說(shuō)明者，均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所通常理解的含義。實(shí)施例1新的AAV衣殼蛋白基因的克隆取人組織標(biāo)本，用基因組DNA提取試劑盒Oliagen，USA，貨號(hào)69504)提取基因組 DNA，然后進(jìn)行PCR反應(yīng)。所用PCR引物為正向引物如SEQ ID NO :3所示，反向引物如SEQ ID N0:4所示。PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為PCR酶0. 25uL(寶生物工程(大連)有限公司，中國(guó)，貨號(hào):DR001A)，10XPCR緩沖液5uL， dNTP混合物4uL (每種的終濃度為0. 2mM)，正向引物(終濃度0. 2uM)，反向引物(終濃度 0. 2uM)，基因組DNA (IOOng)，補(bǔ)水至50uL。PCR程序?yàn)?4度30秒，65度30秒，72度3分 鐘，30個(gè)循環(huán)。取5uL PCR產(chǎn)物電泳，預(yù)期條帶大小為3. Okb左右。結(jié)果如圖1所示，泳道 16所對(duì)應(yīng)的樣品為顯著的PCR陽(yáng)性。將該泳道的與預(yù)大小相對(duì)應(yīng)的DNA條帶切下，使用凝 膠純化試劑盒Oliagen，USA，貨號(hào)J8704)純化，裝入pMD18_T載體(寶生物工程(大連) 有限公司，中國(guó)，貨號(hào)D101A)。送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。在GenBank中進(jìn)行blast分析顯示， 與之最相似的序列為AAV. hu. LG15的衣殼蛋白基因(訪問(wèn)號(hào)AY695377)，本發(fā)明所公布的 基因與之存在8個(gè)堿基的差別，相似度為2200/2208(99% )；其所對(duì)應(yīng)的氨基酸序列存在3 個(gè)氨基酸的差別。這3個(gè)氨基酸差異中，1個(gè)位于5倍軸孔區(qū)域，另一個(gè)位于2倍軸區(qū)域的 上方。因此本基因?yàn)樾禄颉?shí)施例2使用本發(fā)明新AAV衣殼蛋白包裝制備AAV載體AAV載體的制備使用三重質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染法進(jìn)行。具體是取攜帶腺病毒片段的輔助 質(zhì)粒AF6 lOOOug，順式質(zhì)粒pAAV. CMV.EGFP 500ug，含有新衣殼蛋白基因的質(zhì)粒500ug，加 入CaCl2溶液至終濃度為0. 25M，與等倍體積的HBS緩沖液(5g HEPES，8g NaCl，0· 37g KCl, 0. 14g Na2HPO4. 2H20溶于1升重蒸水)混合后，轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞系_293細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后3天 收獲細(xì)胞，反復(fù)凍融3次后，按照文獻(xiàn)方法進(jìn)行純化(Fisher，(}ao，et al. ,1996)使用氯化 銫等密度梯度離心純化，純化后加入無(wú)菌甘油(終濃度5%，ν/ν)，保存于-80度備用。取 1小份使用熒光定量PCR進(jìn)行定量。測(cè)得用本發(fā)明所公開(kāi)的新衣殼蛋白包裝的、攜載EGFP 表達(dá)盒的載體的滴度為3. 23x1012基因組拷貝數(shù)(genome copies, gc)/mL。實(shí)施例3本發(fā)明新AAV衣殼蛋白包裝的AAV載體的體外感染實(shí)驗(yàn)感染前1天，取293細(xì)胞，用胰蛋白酶/EDTA溶液消化，按1 2. 5的比例鋪M孔 細(xì)胞板。感染當(dāng)天，更換細(xì)胞板內(nèi)的培養(yǎng)基，每孔細(xì)胞加入按上述方法(實(shí)施例幻制備的 AAV載體顆粒(每孔加lxl09gc的載體顆粒)，以PBS為陰性對(duì)照。放入細(xì)胞培養(yǎng)箱。培養(yǎng) M小時(shí)后，使用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白(EGFP)的表達(dá)情況，并進(jìn)行拍照(圖2)。結(jié) 果顯示用本發(fā)明所公布的新的AAV衣殼蛋白包裝的AAV載體能夠有效地把基因?qū)氲襟w 外培養(yǎng)的細(xì)胞內(nèi)。實(shí)施例4新的AAV衣殼蛋白包裝的AAV載體的小鼠呼吸道基因?qū)雽?shí)驗(yàn)按上述方法制備、用本發(fā)明所公布的新的AAV衣殼蛋白包裝、攜載人阿爾法1-抗 胰蛋白酶(Alpha 1-antitrypsin, hAlAT)基因的AAV載體，對(duì)小鼠進(jìn)行滴鼻灌注，劑量為 lxlOllGC/小鼠。同時(shí)，以目前使用最廣泛的AAV2衣殼蛋白包裝的、攜載hAlAT基因的 AAV載體同樣劑量滴鼻灌注小鼠，作為對(duì)照。載體注射后的第1、2、4、6周小鼠眼眶采血，用 ELISA檢測(cè)其血清中hAlAT的含量。結(jié)果(圖3)顯示隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，注射新的AAV衣 殼蛋白包裝的AAV載體的小鼠體內(nèi)的hAlAT水平逐漸升高，從第1周開(kāi)始到第6周，均明顯 高于AAV2衣殼蛋白包裝的載體，顯示出在把基因?qū)牒粑婪矫?，本發(fā)明所公布的新衣殼 蛋白包裝的載體，能夠有效地進(jìn)行基因?qū)搿?br> 權(quán)利要求
1.一種腺相關(guān)病毒衣殼蛋白基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
2.權(quán)利要求1所述腺相關(guān)病毒衣殼蛋白基因編碼的蛋白質(zhì)，其氨基酸序列如SEQID NO 2所示。
3.一種載體，其特征在于所述載體含有權(quán)利要求1所述腺相關(guān)病毒衣殼蛋白基因。
4.一種質(zhì)粒，其特征在于所述質(zhì)粒含有權(quán)利要求1所述腺相關(guān)病毒衣殼蛋白基因。
5.一種重組工程菌株，其特征在于所述菌株含有權(quán)利要求4所述質(zhì)粒。
6.權(quán)利要求3所述載體在制備基因治療的藥物中的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求3所述載體在制備基因疫苗中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種腺相關(guān)病毒衣殼蛋白基因、相應(yīng)的蛋白及其應(yīng)用。本發(fā)明腺相關(guān)病毒衣殼蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。本發(fā)明腺相關(guān)病毒衣殼蛋白所包裝的腺相關(guān)病毒載體可以有效地將外源基因?qū)塍w外培養(yǎng)的細(xì)胞中或?qū)塍w內(nèi)，用于制備基因治療或基因疫苗相關(guān)的藥物。
文檔編號(hào)A61K39/00GK102071206SQ201010518449
公開(kāi)日2011年5月25日 申請(qǐng)日期2010年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月22日
發(fā)明者盧建溪, 李剛, 王強(qiáng) 申請(qǐng)人:中山大學(xué)