抗o型口蹄疫多肽-核酸雙效類(lèi)病毒顆粒疫苗及制備方法
【專(zhuān)利摘要】抗O型口蹄疫多肽-核酸雙效類(lèi)病毒顆粒疫苗及制備方法，涉及口蹄疫疫苗。提供一種抗O型口蹄疫的多肽-核酸類(lèi)病毒顆粒雙效疫苗、疫苗的氨基酸序列和DNA序列、疫苗的制備方法和應(yīng)用。所述疫苗具有SEQ?ID?NO.1所示的氨基酸序列。制備方法：將MS2的成熟酶蛋白和插入O型口蹄疫病毒的抗原決定簇第141～160位氨基酸基因片段的外殼蛋白基因一起連接到pET28a表達(dá)載體中構(gòu)成如SEQ?ID?NO.2所示的DNA序列；設(shè)計(jì)引物將口蹄疫病毒3D基因如SEQ?ID?NO.3所示的序列的反義鏈擴(kuò)增出來(lái)，連接到pCDF-Duet-1表達(dá)載體的MCS1處；然后將兩個(gè)共表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)中。
【專(zhuān)利說(shuō)明】抗O型口蹄疫多肽-核酸雙效類(lèi)病毒顆粒疫苗及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及口蹄疫疫苗，特別是涉及一種抗O型口蹄疫多肽-核酸雙效類(lèi)病毒顆粒疫苗及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的危害70多種偶蹄目動(dòng)物的一種急性、高度接觸性、熱性傳染病，以傳播迅速、感染性高而著稱(chēng)。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)和許多國(guó)家都將其列為必須報(bào)告的傳染病。我國(guó)規(guī)定口蹄疫為一類(lèi)動(dòng)物傳染病。一旦一個(gè)地區(qū)爆發(fā)口蹄疫，如果應(yīng)急不當(dāng)，就會(huì)大規(guī)模地流行至許多地區(qū)或國(guó)家，這給地區(qū)或國(guó)家的畜牧業(yè)造成嚴(yán)重的危害，帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003]口蹄疫病毒的基因型和表型具有高變異性，主要有O型、A型、C型、Asia I型、SATI型(南非I型)、SAT II型(南非II型)、SAT III型(南非III型)等7個(gè)血清型，此外還有80多種亞型。血清型間交叉免疫現(xiàn)象，即使同一血清型的不同亞型的免疫情況也不相同，這給口蹄疫的防治帶來(lái)了極大的困難。
[0004]在許多國(guó)家和地區(qū)，疫苗接種是預(yù)防和控制此病的主要措施。目前廣泛使用的依然是傳統(tǒng)的滅活苗，它在一定程度上對(duì)口蹄疫的控制和預(yù)防起到了積極作用，極大地降低了該病帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)損失。滅活疫苗雖具有較好的免疫原性，但是也存在著不少缺點(diǎn)，存在很大的安全隱患，譬如生產(chǎn)各個(gè)環(huán)節(jié)操作要求嚴(yán)格，防止被致病物質(zhì)污染并杜絕病毒泄漏；滅活苗免疫的動(dòng)物與感染FMD的動(dòng)物區(qū)分不開(kāi)；同時(shí)生產(chǎn)需要FMDV的存在。綜上所述，口蹄疫的防治需要更加安全有效的新型疫苗的出現(xiàn)。
[0005]類(lèi)病毒顆粒(VLPs)疫苗是利用病毒載體構(gòu)建的一類(lèi)可以在體內(nèi)和(或)體外表達(dá)成一種可以自我組裝成類(lèi)病毒外殼蛋白結(jié)構(gòu)的一類(lèi)新型疫苗。因?yàn)檫@種顆粒具有大小合適，可能被免疫系統(tǒng)識(shí)別，進(jìn)而產(chǎn)生免疫反應(yīng)；機(jī)體內(nèi)半衰期較長(zhǎng)；沒(méi)有病毒核酸的存在，安全性高等優(yōu)點(diǎn)，使得該疫苗的研發(fā)受到廣大疫苗開(kāi)發(fā)人員的青睞。多種在開(kāi)發(fā)的類(lèi)病毒顆粒疫苗經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)具有很不錯(cuò)的免疫效果。
[0006]不同亞型的口蹄疫病毒同源性很低，口蹄疫病毒的高變異型不僅讓研發(fā)者感到頭疼，還給例行的免疫接種帶來(lái)了很多困難?？谔阋卟《镜?D基因編碼的是口蹄疫病毒RNA復(fù)制所依賴的RNA聚合酶(RdRp)，該酶不僅對(duì)口蹄疫病毒的復(fù)制起到關(guān)鍵作用(Pengyan, W.，Yanj R.，Zhiruj G.&Chuangfu，C.1nhibition of foot-and-mouth diseasevirus replication in vitro and in vivo by small interfering RNA.VirologyJoumal5，86(2008))，此外，它還沒(méi)有亞型的差異。不少的實(shí)驗(yàn)證實(shí)以3D基因?yàn)榘悬c(diǎn)，可以很好地抑制口蹄疫病毒的復(fù)制(Chen，W.et al.Adenovirus-mediated RNA interferenceagainst foot-and-mouth disease virus infection both in vitro and in viv0.Journal of virology2006，80，3559-3566)。 申請(qǐng)人:針對(duì)3D基因的不同位點(diǎn)設(shè)計(jì)的幾個(gè)miRNA經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)也能很好的降低3D基因的表達(dá)抑制口蹄疫病毒的增殖。
[0007] 申請(qǐng)人:前期的研究發(fā)現(xiàn):如果將O型口蹄疫病毒VPl蛋白的第141-160位氨基酸的編碼基因插入到MS2外殼蛋白基因的特定位點(diǎn)，所表達(dá)出的O型口蹄疫的關(guān)鍵的抗原決定簇展示在MS2類(lèi)病毒顆粒表面的VLPs具有很好的免疫原性，在此基礎(chǔ)上 申請(qǐng)人:又引入了一個(gè)共表達(dá)系統(tǒng)，一個(gè)表達(dá)載體上連接有可以自我組裝成口蹄疫類(lèi)病毒顆粒疫苗的基因，另一個(gè)共表達(dá)載體上連接有針對(duì)口蹄疫病毒的增殖具有很好感染效果的3D基因的反義核酸。此共表達(dá)系統(tǒng)可以表達(dá)出這類(lèi)類(lèi)病毒顆粒蛋白:表面既展示有抗原決定簇，內(nèi)部還包裹著能有效干擾病毒復(fù)制的反義RNA。經(jīng)過(guò)體內(nèi)體外的研究發(fā)現(xiàn)，該類(lèi)病毒顆粒多肽-核酸雙效疫苗不僅可以引起機(jī)體產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答，還能很快地抑制病毒在體內(nèi)的增殖，有效地保護(hù)機(jī)體免受病毒侵害。
[0008]這類(lèi)疫苗的首次提出不僅為口蹄疫的防治提供了一個(gè)新的希望，再經(jīng)過(guò)一些改進(jìn)和大型動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)將其真正開(kāi)發(fā)成有效的疫苗。此外該疫苗的研究還為其他病毒疾病疫苗的研發(fā)提供了可借鑒的思路。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種能夠?qū)谔阋哌M(jìn)行預(yù)防治療的一類(lèi)安全有效的抗O型口蹄疫的多肽-核酸類(lèi)病毒顆粒雙效疫苗。
[0010]本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供抗O型口蹄疫的類(lèi)病毒顆粒多肽-核酸雙效疫苗的氨基酸序列和DNA序列。
[0011]本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供一種用于制備抗O型口蹄疫的多肽-核酸類(lèi)病毒顆粒雙效疫苗的安全穩(wěn)定的共表達(dá)系統(tǒng)，里面有可以將口蹄疫抗原決定簇展示到MS2類(lèi)病毒顆粒表面的原核表達(dá)載體28a-CP-VPl，和連接有可以跟MS2的外殼蛋白發(fā)生相互作用而被類(lèi)病毒顆粒包裹其中的3D基因的反義核酸。
[0012]本發(fā)明的第四個(gè)目的在于提供抗O型口蹄疫的多肽-核酸類(lèi)病毒顆粒雙效疫苗的應(yīng)用。
[0013]所述抗O型口蹄疫的多肽-核酸類(lèi)病毒顆粒雙效疫苗具有SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列，該序列包含有MS2外殼蛋白及O型口蹄疫病毒的VPl上優(yōu)勢(shì)抗原決定簇序列。所述抗O型口蹄疫的多肽-核酸類(lèi)病毒顆粒雙效疫由SEQ ID N0.2所示的DNA序列編碼，此DNA序列包含MS2的成熟酶蛋白基因、外殼蛋白基因和O型口蹄疫病毒的VPl上的優(yōu)勢(shì)抗原決定族基因序列。
[0014]所述抗O型口蹄疫的多肽-核酸類(lèi)病毒顆粒雙效疫苗利用大腸桿菌表達(dá)，且在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)自主包裝為類(lèi)病毒顆粒結(jié)構(gòu)，以類(lèi)病毒顆粒形成存在。
[0015]所述抗O型口蹄 疫的多肽-核酸類(lèi)病毒顆粒雙效疫苗除了表面所展示的O型口蹄疫重要的抗原決定簇外，內(nèi)部還包裹著口蹄疫病毒的3D基因的反義RNA。該類(lèi)病毒顆粒內(nèi)包裹著各種亞型口蹄疫病毒共有的RNA依賴的RNA聚合酶(RdRpWDpt51的3D基因的反義RNA。該疫苗中包裹的反義RNA序列是具有SEQ ID N0.3所示DNA序列的反義RNA序列或與之同源性較高的序列。
[0016]所述抗O型口蹄疫的多肽-核酸類(lèi)病毒顆粒雙效疫苗的DNA序列SEQ ID N0.2的第1254~1316位核苷酸為O型口蹄疫病毒的VPl的第141~160位抗原決定簇氨基酸對(duì)應(yīng)的核苷酸；該氨基酸序列SEQ ID N0.1是將O型口蹄疫病毒VPl的第141~160位優(yōu)勢(shì)抗原決定簇氨基酸插入到噬菌體MS2外殼蛋白的第15位氨基酸后面。[0017]用于制備抗O型口蹄疫的多肽-核酸類(lèi)病毒顆粒雙效疫苗的兩種共表達(dá)載體，一種表達(dá)載體含有SEQ ID N0.2所示的DNA序列，或含有與SEQ ID N0.2所示的的DNA序列不完全同源，但能夠翻譯出SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列的DNA序列，另一種表達(dá)載體含有SEQ ID N0.3所示的3D的DNA序列的反義RNA序列，或與之同源性較高的序列。
[0018]所述抗O型口蹄疫多肽-核酸雙效類(lèi)病毒顆粒疫苗的制備方法，包括:將MS2的成熟酶蛋白和插入了 O型口蹄疫病毒的抗原決定簇第141~160位氨基酸基因片段的外殼蛋白基因一起連接到pET28a表達(dá)載體中構(gòu)成如SEQ ID N0.2所示的DNA序列；設(shè)計(jì)引物將口蹄疫病毒3D基因如SEQ ID N0.3所示的序列的反義鏈擴(kuò)增出來(lái)，連接到P⑶F-Duet-1表達(dá)載體的MCSl處；然后將兩個(gè)共表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到BL21 (DE3)中；
[0019]I)在適宜的培養(yǎng)基、適宜的溫度、適宜的振蕩條件下培養(yǎng)重組工程菌，通過(guò)添加合適的誘導(dǎo)物誘導(dǎo)重組細(xì)胞表達(dá)并自主包裝成類(lèi)病毒顆粒結(jié)構(gòu)；
[0020]2)通過(guò)離心，收集經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)的重組工程菌，反復(fù)凍融菌體3次，超聲波徹底破碎菌體，15000r/min離心15min，上清即為含類(lèi)病毒顆粒疫苗的產(chǎn)物；
[0021]3)所得表達(dá)產(chǎn)物的上清中加入NaCl至終濃度lmol/L，冰浴lh，離心所得的上清中再加入終濃度為10%的PEG8000，冰浴，離心得到類(lèi)病毒顆粒沉淀，沉淀經(jīng)氯仿洗滌后再經(jīng)過(guò)蔗糖梯度超速離心得到類(lèi)病毒顆粒的純化產(chǎn)物；
[0022]4)經(jīng)蔗糖梯度純化后的類(lèi)病毒顆粒即為抗O型口蹄疫多肽-核酸雙效類(lèi)病毒顆粒疫苗。
[0023]所述抗O型口 蹄疫多肽-核酸雙效類(lèi)病毒顆粒疫苗的應(yīng)用:該疫苗與相應(yīng)佐劑混合后通過(guò)肌肉注射途徑對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫。
[0024]本發(fā)明具有以下突出優(yōu)點(diǎn):
[0025]I)本發(fā)明提供的抗O型口蹄的類(lèi)病毒顆粒多肽-核酸雙效疫苗，免疫后可誘導(dǎo)動(dòng)物同時(shí)產(chǎn)生抗O型口蹄疫的抗體，并且可以抑制體內(nèi)口蹄疫病毒的增殖。
[0026]2)該疫苗制備安全，無(wú)滅活疫苗制備過(guò)程中存在的安全隱患。
[0027]3)該疫苗為類(lèi)病毒顆粒結(jié)構(gòu)，O型口蹄疫病毒的抗原表位被有效呈遞在類(lèi)病毒顆粒的表面。因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)表面規(guī)則且有序，可以很好地刺激B、T細(xì)胞，引起免疫應(yīng)答。
[0028]4)類(lèi)病毒顆粒多肽-核酸雙效疫苗的結(jié)構(gòu)在體內(nèi)血清中的半衰期長(zhǎng)，穩(wěn)定性好，有效期長(zhǎng)，疫苗運(yùn)輸儲(chǔ)存方便、有利于推廣使用。
[0029]5)展示口蹄疫抗原決定簇的類(lèi)病毒顆粒大小合適，會(huì)很好地被淋巴系統(tǒng)識(shí)別，產(chǎn)生免疫抗體。
[0030]6)類(lèi)病毒顆粒多肽-核酸雙效疫苗內(nèi)包裹的3D基因的反義核酸可以增強(qiáng)抗原決定簇的免疫應(yīng)答，此外還能快速降低口蹄疫病毒的復(fù)制和增殖。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0031]圖1為CP-VPl基因構(gòu)建示意圖。其中PMS27模板中包括MS2的成熟酶蛋白基因、外殼蛋白基因。引物F-1-R98與F-2-F98中都含有部分O型MYA98FMDV的抗原決定簇，且相互間還有19個(gè)互補(bǔ)堿基。以U-CP與F-1-R98為引物可以擴(kuò)增出目的CP-VPl的上游片段，以F-2-F98及D-CP為引物可以擴(kuò)增出目的CP-VPl的下游片段。以擴(kuò)增得到的上下游片段等量混合物為模板，以U-CP及D-CP為引物就可以搭橋獲得目的CP-VPl基因片段。[0032]圖2為28a-CP-VPl和CDF-3D (M)表達(dá)載體共轉(zhuǎn)化到BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，在抗性固體培養(yǎng)基中進(jìn)行單克隆的挑選。
[0033]圖3為單克隆的PCR鑒定。單克隆既能擴(kuò)增出CP-VPl (約1850bp)，也能擴(kuò)增出3D的反義基因(約1400bp)。
[0034]圖4為目的基因的蛋白表達(dá)SDS-PAGE圖?？梢钥吹紺P-VPl-RNA大約16ku。
[0035]圖5為CP-VPl-RNA類(lèi)病毒顆粒中RNA的穩(wěn)定性分析?？梢钥吹桨赩LPs內(nèi)部的3D基因的反義RNA在DNase和RNase都存在的情況下依然可以穩(wěn)定存在。
[0036]圖6為電鏡下CP-VPl-RNA的類(lèi)病毒顆粒圖片。用JEM2100透射電子顯微鏡觀察，可以發(fā)現(xiàn)視野中是均勻分布的白色的直徑大約為65nm類(lèi)病毒顆粒顆粒。
[0037]圖7 為 28a-CP_VPl 及 CP-VP1-RNA Western blot 結(jié)果。結(jié)果顯示 CP-VP1 和CP-VPl-RNA都能與豚鼠抗O型FMD陽(yáng)性血清有特異反應(yīng)。
【具體實(shí)施方式】
[0038]以下實(shí)施例將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0039]表1為實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所用的的引物及其序列。
[0040]表1
【權(quán)利要求】
1.一種抗O型口蹄疫多肽-核酸雙效類(lèi)病毒顆粒疫苗，其特征在于具有SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列，該序列包含有MS2外殼蛋白及O型口蹄疫病毒的VPl上優(yōu)勢(shì)抗原決定簇序列。
2.如權(quán)利要求1所述一種抗O型口蹄疫多肽-核酸雙效類(lèi)病毒顆粒疫苗，其特征在于所述疫苗由SEQ ID N0.2所示的DNA序列編碼，此DNA序列包含MS2的成熟酶蛋白基因、外殼蛋白基因和O型口蹄疫病毒的VPl上的優(yōu)勢(shì)抗原決定簇基因序列。
3.如權(quán)利要求1所述一種抗O型口蹄疫多肽-核酸雙效類(lèi)病毒顆粒疫苗，其特征在于所述疫苗利用大腸桿菌表達(dá)，且在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)自主包裝為類(lèi)病毒顆粒結(jié)構(gòu)，以類(lèi)病毒顆粒形成存在。
4.如權(quán)利要求3所述一種抗O型口蹄疫多肽-核酸雙效類(lèi)病毒顆粒疫苗，其特征在于類(lèi)病毒顆粒除了表面所展示的O型口蹄疫重要的抗原決定簇外，內(nèi)部還包裹著口蹄疫病毒的3D基因的反義RNA。
5.如權(quán)利要求4所述一種抗O型口蹄疫多肽-核酸雙效類(lèi)病毒顆粒疫苗，其特征在于該類(lèi)病毒顆粒內(nèi)包裹著各種亞型口蹄疫病毒共有的RNA依賴的RNA聚合酶(RdRp) 3Dpo1的3D基因的反義RNA。
6.如權(quán)利要求4所述一種抗O型口蹄疫多肽-核酸雙效類(lèi)病毒顆粒疫苗，其特征在于該疫苗中包裹的反義RNA序列是具有SEQ ID N0.3所示DNA序列的反義RNA序列或與之同源性較高的序列。
7.如權(quán)利要求2所述一種抗O型口蹄疫多肽-核酸雙效類(lèi)病毒顆粒疫苗，其特征在于該DNA序列的第1254~1316位核苷酸為O型口蹄疫病毒的VPl的第141~160位抗原決定簇氨基酸對(duì)應(yīng)的核苷酸；該氨基酸序列是將O型口蹄疫病毒VPl的第141~160位優(yōu)勢(shì)抗原決定簇氨基酸插入到噬菌體MS2外殼蛋白的第15位氨基酸后面。
8.用于制備抗O型口蹄疫多肽-核酸雙效類(lèi)病毒顆粒疫苗的兩種共表達(dá)載體，其特征在于，一種表達(dá)載體含有SEQ ID N0.2所示的DNA序列，或含有與SEQ ID N0.2所示的的DNA序列不完全同源，但能夠翻譯出SEQ ID N0.1所示的氨基酸序列的DNA序列，另一種表達(dá)載體含有SEQ ID N0.3所示的3D的DNA序列的反義RNA序列，或與之同源性較高的序列。
9.如權(quán)利要求1~7中任一所述一種抗O型口蹄疫多肽-核酸雙效類(lèi)病毒顆粒疫苗的制備方法，其特征在于，該方法包括:將MS2的成熟酶蛋白和插入了 O型口蹄疫病毒的抗原決定簇第141~160位氨基酸基因片段的外殼蛋白基因一起連接到pET28a表達(dá)載體中構(gòu)成如SEQ ID N0.2所示的DNA序列；設(shè)計(jì)引物將口蹄疫病毒3D基因如SEQ ID N0.3所示的序列的反義鏈擴(kuò)增出來(lái)，連接到P⑶F-Duet-1表達(dá)載體的MCSl處，然后將兩個(gè)共表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)中； a)在適宜的培養(yǎng)基、適宜的溫度、適宜的振蕩條件下培養(yǎng)重組工程菌，通過(guò)添加合適的誘導(dǎo)物誘導(dǎo)重組細(xì)胞表達(dá)并自主包裝成類(lèi)病毒顆粒結(jié)構(gòu)； b)通過(guò)離心，收集經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)的重組工程菌，反復(fù)凍融菌體3次，超聲波徹底破碎菌體，15000r/min離心15min，上清即為含類(lèi)病毒顆粒疫苗的產(chǎn)物； c)所得表達(dá)產(chǎn)物的上清中加入NaCl至終濃度lmol/L，冰浴lh，離心所得的上清中再加入終濃度為10%的PEG8000，冰浴，離心得到類(lèi)病毒顆粒沉淀，沉淀經(jīng)氯仿洗滌后再經(jīng)過(guò)蔗糖梯度超速離心得到類(lèi)病毒顆粒的純化產(chǎn)物；d)經(jīng)蔗糖梯度純化后的類(lèi)病毒顆粒即為所述抗O型口蹄疫的類(lèi)病毒顆粒多肽-核酸雙效疫苗。
10.如權(quán)利要求1~7中任一所述一種抗O型口蹄疫多肽-核酸雙效類(lèi)病毒顆粒疫苗的應(yīng)用，其特征在于該疫苗 與相應(yīng)佐劑混合后通過(guò)肌肉注射途徑對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫。
【文檔編號(hào)】A61K48/00GK103656682SQ201310673567
【公開(kāi)日】2014年3月26日 申請(qǐng)日期:2013年12月11日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月11日
【發(fā)明者】陳亮, 董艷美, 郭小玲, 黃小君, 張國(guó)廣, 郭遲鳴 申請(qǐng)人:廈門(mén)大學(xué)