用于治療退變性病癥的ledgf肽及其制劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供具有抗蛋白質(zhì)聚集活性的LEDGF肽和使用方法。本文公開的LEDGF肽顯示治療退變性疾病和具有包括氧化應激和蛋白質(zhì)聚集應激的各種細胞應激的疾病的能力。此外，本發(fā)明提供延長釋放制劑，包括適于眼部施用的制劑。
【專利說明】用于治療退變性病癥的LEDGF肽及其制劑
[0001] 相關申請
[0002] 本申請要求2012年5月21日提交的美國臨時專利申請?zhí)?1/649, 847和2012年 11月16日提交的國際專利申請?zhí)朠CT/US2012/065620的優(yōu)先權(quán)。以上確認的優(yōu)先權(quán)申請 的內(nèi)容據(jù)此以引用的方式完全并入本文。

【技術領域】
[0003] 本發(fā)明大體上涉及用于治療退變性疾病和具有包括氧化應激和蛋白質(zhì)聚集應激 的各種細胞應激的疾病的新型晶狀體上皮源性生長因子（LEDGF)肽及其組合物。更具體來 說，本發(fā)明涉及具有增強的穩(wěn)定性和持續(xù)的遞送分布的新型LEDGFh 26制劑和它們治療蛋白 質(zhì)聚集介導的疾病、老年性疾病和退變性疾病的用途。
[0004] 背景
[0005] 在美國，包括老年性黃斑變性（AMD)和視網(wǎng)膜色素變性（RP)的眼后段疾病是致 盲的主要病因。（Jager等，N Em J MED，2008. 358(24) :2606-17)。當前，在美國約800萬 個體正摧患AMD,并且截至2020年，預期這個數(shù)目會達到1200萬。（Jager等；Friedman等 Arch 0phthalmol，2004. 122(4):第564-72頁）。與慢性氧化應激和炎癥相關的干性形式 的 AMD (干性 AMD)占 AMD 病例的 90%。（Libby 等 Adv Exp Med Biol，2010. 664:第 403-9 頁；Stuen. Generations，2003. 27 :第8-14頁）。另一方面，RP是一種由超過50個不同基 因突變引起的遺傳疾病。（〇hguro，H.等，Nihon Ganka Gakkai Zasshi，2002. 106(8):第 461-73 頁；Dryja，，等，Nature，1990. 343 (6256):第 364-6 頁。）全世界約 150 萬人當前罹 患 RP。（Hartong 等，Lancet，2006. 368 (9549):第 1795-809 頁）。
[0006] 眼的獨特解剖結(jié)構(gòu)和生理機能是針對眼背面（包括視網(wǎng)膜退變性疾?。┑乃幬?治療劑進步的主要障礙。（Kompella等，Ther Deliv.l(3):第435-56頁）。由于存在各 種靜態(tài)屏障（角膜、結(jié)膜和鞏膜以及其它組織）和動態(tài)屏障（眨眼、淚膜、淚翻轉(zhuǎn)和誘發(fā)的 流淚），表面施用途徑在向眼背面遞送藥物方面是低效的。（Gaudana，R.等，Ocular drug delivery. Aaps J，2010. 12(3):第 348-60 頁；Thrimawithana 等 Drug Discov Today， 2011. 16 (5-6):第270-7頁）。另一方面，血液視網(wǎng)膜屏障（BRB)、全身性降解、全身性副作用 和在靶標部位處濃度較低是靜脈內(nèi)途徑的主要挑戰(zhàn)。如前眼房內(nèi)、眼周、視網(wǎng)膜下的其它途 徑具有它們自身的一小組問題，所述問題與表面和全身性施用途徑共有一些爭論點（Baid 等 Drug Development and the back ofthe eye. Kompella UB 編.2〇10,第 4〇9-448 頁： Springer)。如玻璃體內(nèi)注射的局部遞送將藥物放置在緊密鄰近視網(wǎng)膜（視網(wǎng)膜退變性疾 病的靶標組織）處且因此是向視網(wǎng)膜遞送藥物的最有效途徑。然而，頻繁玻璃體內(nèi)注射藥 物會導致各種并發(fā)癥，如視網(wǎng)膜脫離、視網(wǎng)膜出血、眼內(nèi)炎、眼內(nèi)壓增加，而更不必提及患者 順應性和感染。（Peyman 等 Retina，2009. 29(7):第 875-912 頁· ；Wu 等 Semin Ophthalmol， 2009.24(2):第100-5頁）。因此，對可延長藥物在眼中的保留的組合物和遞送系統(tǒng)存在需 要。
[0007] 新型藥物遞送系統(tǒng)已贏得較大關注，其可持續(xù)延長時期來持續(xù)或控制釋放藥物以 及增加如蛋白質(zhì)、基因和其它小分子的治療劑的穩(wěn)定性和生物可用度。生物可降解（PLGA、 PCL)和非生物可降解（例如維曲賽特（Vitraset)和萊替舍特（Retisert))植入物提供用 于歷經(jīng)數(shù)月至數(shù)年持續(xù)釋放藥物的平臺。然而，生物可降解植入物的不穩(wěn)定藥物釋放分布 以及要求高度侵襲性眼手術是少許缺點。微米顆粒和納米顆粒持續(xù)數(shù)周至數(shù)月提供囊封的 分子的持續(xù)釋放。然而，在制備期間使用如二氯甲烷的有機溶劑會使蛋白質(zhì)變性且降低蛋 白質(zhì)功效，從而導致治療無效。此外，囊封效率、控制的顆粒尺寸和制備期間的無菌性是其 它障礙。也已嘗試基于離子電滲、微針、超聲的眼部遞送，然而，主要進步是就小分子藥物而 言，且仍然處于探究階段并且需要驗證以確定它們的功效和安全性。因此，隨著涌現(xiàn)的用于 視網(wǎng)膜變性的療法獲得不斷提高的進步，向后段的非侵襲性或最小侵襲性控制和持續(xù)遞送 正變得極其重要。
[0008] 概述
[0009] 本發(fā)明涉及可以高數(shù)量、高純度或兩者產(chǎn)生的LEDGF生物活性肽。舉例來說，如 通過SDS-PAGE和SEC-HPLC所定量，本發(fā)明涉及可在每升培養(yǎng)物20mg或大于20mg下且在 90 %或大于90 %純度下產(chǎn)生的LEDGF肽。在一個示例性實施方案中，肽是約40kDa單體，其 可以SOkDa二聚體形式存在。在另一示例性實施方案中，肽主要具有無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)且包括 N末端應激相關的結(jié)合結(jié)構(gòu)域和任選TAT結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
[0010] 在另一示例性實施方案中，肽包含LEDGF的氨基酸I-SZe(LEDGF1I 26)。在另一示 例性實施方案中，肽包含SEQ ID NO :2。在另一示例性實施方案中，肽包含與SEQ ID NO: 2具有至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%序列同一性的氨 基酸序列。此外，本發(fā)明包括編碼SEQ ID NO :2的核酸序列或編碼與SEQ ID NO :2具有至 少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%序列同一性的氨基酸序列 的核酸序列。本發(fā)明還包括含有所述核酸序列的載體。在一個示例性實施方案中，載體是 pET-28a(+)載體。
[0011] 在另一方面，本發(fā)明包含含有LEDGF肽的組合物。在一個示例性實施方案中，組合 物包含LEDGF肽與藥物載體、稀釋劑、賦形劑或其組合的組合。在另一示例性實施方案中， 組合物包含與如鋅的膠態(tài)金屬顆粒締合或結(jié)合以形成納米裝配體的LEDGF肽。在另一示例 性實施方案中，組合物包含囊封或結(jié)合于裝載至多孔外部顆粒中的內(nèi)部顆粒的LEDGF肽。 在某些示例性實施方案中，用于以上組合物中的LEDGF肽是LEDGF 1I6。
[0012] 在另一方面，本發(fā)明涉及通過向有需要的患者施用以上LEDGF肽組合物來治療蛋 白質(zhì)聚集介導的疾病的方法。在某些示例性實施方案中，蛋白質(zhì)聚集介導的疾病是視網(wǎng) 膜變性疾病。示例性視網(wǎng)膜變性疾病包括但不限于老年性黃斑變性（AMD)、視網(wǎng)膜色素變 性（RP)和糖尿病性視網(wǎng)膜病變（DR)。在另一示例性實施方案中，蛋白質(zhì)聚集介導的疾病 是神經(jīng)退變性疾病，包括但不限于阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD)、帕金森氏病 (Parkinson's disease, F1D)、亨廷頓氏?。℉D)、肌萎縮性側(cè)索硬化或朊病毒疾病。
[0013] 附圖簡述
[0014] 圖1是純化全長LEDGF的免疫印跡，其指示試圖純化全長LEDGF會產(chǎn)生不穩(wěn)定和 片段化產(chǎn)物。
[0015] 圖2是比較全長LEDGF與LEDGFh26的圖。
[0016] 圖3是瓊脂糖凝膠的圖片，其顯示編碼LEDGF1I26的核酸序列被成功克隆至 pET-28a(+)中。PCR擴增Ledgf^326基因且接著連接至pET-28a(+)載體中。泳道1:PCR 擴增的Ledgf ^26基因，泳道2 :未切割環(huán)狀pET-28a (+)，泳道3 :線性化BamHI消化的 pET-28a (+)，泳道 4 :未切割環(huán)狀 pLEDGFn (連接有 LedgfV32f^ pET-28a (+))，泳道 5 :線 性化BamHl消化的PLEDGFh26，泳道6 :線性化HindIII消化的PLEDGFh26，泳道7 和 HindIII 雙重消化的 PLEDGFh26，泳道 8 :自 PleDGFh26PCR 擴增 Ledgf基因。
[0017] 圖4A至4C是一組顯示成功表達和純化LEDGF1I的圖：A) SDS-PAGE-泳道1蛋 白質(zhì)標記（Fermentas，Glen Burnie，MD),泳道2未誘導的細胞溶解產(chǎn)物，泳道3IPTG誘導 的細胞溶解產(chǎn)物，泳道4溶解產(chǎn)物的可溶性部分，泳道5由FPLC-陽離子交換管柱獲得的 LEDGFn，泳道6由FPLC-凝膠過濾管柱獲得的LEDGFn5B) FPLC-陽離子交換色譜圖；C) FPLC-凝膠過濾色譜圖。
[0018] 圖5A至是一組顯示LEDGF1I2J^某些物理特征的圖。A) SEC-HPLC :使用含有ImM CaClj^]25mM Tris-HCL緩沖液（pH 7.0)在Agilent Bio-SEC管柱上按尺寸分離LEDGF^6。 LEDGF1I6主要洗脫為在11. 5分鐘時的單峰，伴有約5%較高分子量物質(zhì)。B)MALDI-T0F : LEDGF1I6具有分子量40kDa，并且可以二聚體形式存在。C)DLS :使用Nano ZS在25mM磷酸 鹽緩沖液（pH 7.0)中分析LEDGF1I6尺寸。LEDGF 具有直徑約IOnm的單分散群體，不存 在聚集體。D) SDS-PAGE :在4-15% SDS-PAGE膠凝上在還原性（β -巰基乙醇且煮沸）和非 還原性（無 β-巰基乙醇且不煮沸）條件下按尺寸分離LEDGFm26。非還原性膠凝指示存在 LEDGF1J6 的二聚體。
[0019] 圖6Α至6Β是一組代表關于LEDGF1I的預測結(jié)構(gòu)特征的其它數(shù)據(jù)的圖。Α)圓 二色性：使用Chirascan分析25mM磷酸鹽緩沖液（ρΗ7· 0)中的500 μ g/ml LEDGF1^26的二 級結(jié)構(gòu)。未獲得α-螺旋或β-折疊的特征峰。此外，在200nm下存在強烈陰性信號指示 LEDGF1I6主要是無規(guī)卷曲蛋白質(zhì)。B)LEDGF 模型：通過I-Tasser蛋白質(zhì)建模服務器 基于LEDGF1I6的氨基酸序列和與結(jié)構(gòu)可在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中獲得的蛋白質(zhì)的同源性來預測 LEDGF^J-D結(jié)構(gòu)。根據(jù)3-D模型，LEDGF1I6是無規(guī)卷曲蛋白質(zhì)。
[0020] 圖7A至7F提供代表關于LEDGF^j^預測結(jié)構(gòu)特征的其它數(shù)據(jù)的其它圖。熒光光 譜術-化學變性：A)在激發(fā)波長280nm下自300至400nm記錄與含0-6M脲的25mM磷酸鹽 緩沖液（pH 7.0) -起孵育的300μ/πι1 LEDGF1I26的熒光光譜。B)將340/356nm下的熒光 強度比率相對于脲濃度繪圖以確定構(gòu)象穩(wěn)定性參數(shù)。C)自220至260nm記錄與含0-6M脲的 25禮磷酸鹽緩沖液（?!17.0)-起孵育的30(^8/11111^6? 1_326的〇)光譜。0)將23011111下 的CD信號相對于脲濃度繪圖以確定構(gòu)象穩(wěn)定性參數(shù)。E)使用熱使LEDGF^/變性且自215 至250nm記錄相應⑶信號變化。F)將222nm下的⑶信號相對于溫度繪圖以確定LEDGF 1J6 的熔解溫度。
[0021] 圖8A至8B是一組顯示LEDGFp32fJg夠從聚集介導的應激中挽救ARPE-19細胞的 圖。ARPE-19細胞在A)不存在或B)存在聚集應激下用LEDGFh 26處理48小時。
[0022] 圖9A至9B是一組說明LEDGF1I延遲RCS大鼠中的光受體功能性損失的圖。A) 使用〇.41og cd-s/m2閃光記錄暗視ERG，并且將暗視B波幅值相對于大鼠年齡繪圖。對于 明視ERG，使用30cd/m 2背景光使大鼠適應光照3分鐘，隨后記錄ERG。B)將明視B波幅值 相對于大鼠年齡繪圖。將個別大鼠的三個ERG平均化且接著將各組內(nèi)的b波幅值平均化以 得到平均值。數(shù)據(jù)代表N = 3的平均值土 S. D.。*，相較于相應未處理組，p < 0. 05。
[0023] 圖10是一組顯示LEDGFn6/鋅納米裝配體在稀釋之后穩(wěn)定的圖。
[0024] 圖IlA至IlC是一組顯示在不存在或存在添加劑下的LEDGF1-326三級結(jié)構(gòu)、二級 結(jié)構(gòu)和尺寸變化的圖。
[0025] 圖12是在還原性條件下裝載的LEDGFn6W SDS-PAGE膠凝圖片。
[0026] 圖13A至13B是一組顯示在存在和不存在各種添加劑下LEDGF1I26的可溶性蛋白 質(zhì)和不溶性聚集體的量的圖。
[0027] 圖13C是顯示在存在各種添加劑下不存在LEDGFn6的不溶性聚集體的微量離心 管圖片。
[0028] 圖14是描繪在存在和不存在各種添加劑下LEDGF1I6的免疫反應性的圖。
[0029] 圖15A至15C是一組顯示在添加劑存在下LEDGF1I2J^結(jié)構(gòu)完整性和構(gòu)象穩(wěn)定性的 生物物理學表征的圖。A)在各種添加劑存在下，在280nm激發(fā)下，1^06匕_ 326在34211111下的 隨時間而變的熒光強度。抝1^06匕_326在208nm下的隨時間和添加劑而變的圓二色性（CD)。 C) LEDGFm26的隨時間和添加劑而變的流體動力學尺寸。
[0030] 圖16是提供LEDGF1I隨時間而變的分子量分析的SDS-PAGE膠凝圖片。
[0031] 圖17A至17D是一組顯示在鋅存在下的LEDGF^gA米裝配體形成的圖。A)動態(tài) 光散射。1^06? 1_326在鋅存在下形成納米裝配體。B)圓二色性。在鋅存在下，LEDGF^dA 二級結(jié)構(gòu)被改變。C)熒光光譜術。在鋅存在下，LEDGFh26-光光譜被淬滅，從而指示疏水 性殘基暴露于極性更大環(huán)境。D)紫外光譜術：在0. ImM和ImM鋅存在下而非在IOmM鋅下， LEDGFh26紫外吸收被淬滅。
[0032] 圖18是LEDGF1I6鋅納米裝配體的一組TEM圖像。
[0033] 圖19A至19D是一組說明LEDGF1I^米裝配體的可逆形成的圖。
[0034] 圖20A至20D是說明LEDGF^jA米裝配體的穩(wěn)定性隨時間增加的一組圖和 SDS-PAGE膠凝圖像。
[0035] 圖21是說明ARPE-19細胞對LEDGF1I^米裝配體的攝取增加的圖。
[0036] 圖22是描繪MTT測定的結(jié)果的圖，其說明LEDGF1I納米裝配體能夠從血清饑餓 中挽救ARPE-19細胞。
[0037] 圖23A至23D是一組說明如使用視網(wǎng)膜電描記術所考查，LEDGF1I 26納米裝配體能 夠降低視網(wǎng)膜變性的圖。
[0038] 圖24A至24H是一組說明如通過檢測正常SD大鼠中的Alexa-LEDGF1I 2f^熒光信 號所測量，LEDGF1I6納米裝配體在玻璃體中持續(xù)至少14天的圖。A)說明在玻璃體內(nèi)注射 SD大鼠眼之前，空白掃描的結(jié)果。B)和C)分別說明對照和LEDGF1I6裝配體的標準曲線。 D) 和E)說明如由Flurotron掃描獲得的在包括玻璃體、脈絡膜-RPE和水狀液的各種組織 中的熒光信號；F)、G)和H)分別使以上測量的玻璃體、脈絡膜-RPF和水狀液的熒光信號轉(zhuǎn) 換成實際LEDGF^ 26納米裝配體。
[0039] 圖25是說明納米裝配體能夠保持LEDGF1I的免疫反應性的圖。
[0040] 圖26A至26B是A)用LEDGF1I26轉(zhuǎn)染的ARPE-19細胞的細胞計數(shù)測定的一組圖像 以及B)說明細胞計數(shù)測定的結(jié)果隨時間和LEDGF 1I^度而變的圖。
[0041] 圖27是說明測定結(jié)果的圖，其指示用LEDGF1I轉(zhuǎn)染的ARPE-19細胞中的吞噬活 性增加。
[0042] 圖28A至28D是一組說明對用LEDGF1I6注射的SD大鼠眼的組織學分析的結(jié)果的 圖像和圖。A)是對眼垂直截面和玻璃體內(nèi)注射部位的圖示描繪。B)是正常SD、未處理RCS 和LEDGF1I6處理的RCS視網(wǎng)膜的橫截面的一組圖像。C)和D)是分別描繪對照和LEDGF 處理的視網(wǎng)膜中的眼外核層和內(nèi)核層的測量厚度的圖。
[0043] 圖29是對照和LEDGFu處理的大鼠 SD視網(wǎng)膜的免疫熒光圖像的圖面。
[0044] 圖30是顯示His-LEDGFp326自示例性PinP組合物累積釋放的圖
[0045] 圖31是顯示在大鼠眼中用Alexa-His-LEDGFn6進行玻璃體內(nèi)注射之后的非侵襲 性眼熒光光度法的結(jié)果的圖。
[0046] 詳述
[0047] 定義
[0048] 如本文所用，"視網(wǎng)膜和視網(wǎng)膜性"是指視網(wǎng)膜以及鄰近于視網(wǎng)膜的一般性眼后段 兩者。
[0049] 如本文所用，"治療"是指完全逆轉(zhuǎn)或消除潛伏疾病、臨時或持續(xù)防止疾病進展、臨 時或持續(xù)消退疾病、以及改善一種或多種與疾病相關的癥狀。
[0050] 術語"肽"、"多肽"和"蛋白質(zhì)"在本文中可互換使用。除非另外指示，否則所述術 語是指具有至少兩個通過肽鍵連接的氨基酸的聚合物。因此，所述術語包括寡肽、蛋白質(zhì)片 段、類似物、衍生物、糖基化衍生物、聚乙二醇化衍生物、融合蛋白等。
[0051] 如本文所用，"序列同一性/類似性"是指兩個或更多個氨基酸序列的同一性、類 似性。序列同一性可以同一性百分比來量度，百分比越高，序列越相同。比對方法和供比較 的序列在本領域中是熟知的。各種程序和比對算法描述于Smith和Waterman, Adv. Appl. Math. 2 :482,1981 ;Needleman 和 Wunsch, J. Mol. Biol. 48 :443 ;Pearson 和 Lipman, Proc. Natl.Acad. Sci. USA 85 :2444,1988 ;Higgins 和 Sharp，Gene，73 :237-44,1988 ;Higgins 和 Sharp，CABI0S 5 :151-3,1989 ;Corpet 等 Nuc. Acids. Res. 16 :10881-10,1990 中，所述文獻 呈現(xiàn)對序列比對方法和同源性計算的詳述考慮。
[0052] NCBI 基本局部比對研究工具（BLAST) (Altschule 等 J. Mol. Biol. 215 :403-10， 1990)可自若干來源，包括國家生物信息中心（NCBI，National Library of Medicine， Building 38A，Room 8N805, Bethesda，MD 20894)和在因特網(wǎng)上獲得以與序列分析程序 blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx關聯(lián)使用。Blastp用于比較氨基酸序列。其 它信息可見于NCBI網(wǎng)站。
[0053] -般來說，一旦對準，即通過對相同氨基酸殘基存在于兩個序列中所處的位置的 數(shù)目計數(shù)來確定匹配的數(shù)目。同一性百分比是通過用匹配的數(shù)目除以鑒定的序列中闡述的 序列長度或連貫長度（如來自鑒定的序列中闡述的序列的100個連續(xù)核苷酸或氨基酸殘 基），隨后用100乘以所得值來確定。
[0054] 引言
[0055] 全長LEDGF能夠從P23H突變視紫紅質(zhì)（rhodopsin)聚集誘導的應激中挽救視網(wǎng) 膜色素上皮細胞（Baid等，PLoS One. 6(9):第e24616頁）。然而，由于要求蛋白質(zhì)維持特 定三維結(jié)構(gòu)以保持生物活性，所以在蛋白質(zhì)可用作治療劑的水平上使基因翻譯成蛋白質(zhì)已 始終具有挑戰(zhàn)性。此外，由于在整個生物合成和純化過程期間缺乏蛋白質(zhì)穩(wěn)定性，所以生產(chǎn) 和生物合成常常失敗。此外，為有效使用蛋白質(zhì)治療劑，常常必須達成數(shù)毫克產(chǎn)量以有效表 征蛋白質(zhì)性質(zhì)。舉例來說，每500ml僅產(chǎn)生0. 9mg全長LEDGF，遠低于為適當表征蛋白質(zhì)所 需的數(shù)十毫克，并且會產(chǎn)生片段化產(chǎn)物。
[0056] 本發(fā)明提供維持全長蛋白質(zhì)的細胞存活活性，同時允許以高數(shù)量和純度產(chǎn)生和純 化LEDGF肽的LEDGF肽。此外，本發(fā)明的LEDGF肽具有抗蛋白質(zhì)聚集活性。本發(fā)明的LEDGF 肽顯示治療退變性疾病和與包括氧化應激和蛋白質(zhì)聚集應激的各種細胞應激相關聯(lián)的疾 病的能力。因此，如本發(fā)明的LEDGF肽的分子可代表一種用于治療多種蛋白質(zhì)聚集介導的 疾病，包括其它視網(wǎng)膜退變性和神經(jīng)退變性疾病的通用治療性蛋白質(zhì)。本發(fā)明還包含適用 于治療以上疾病的延長釋放LEDGF肽制劑。
[0057] LEDGF 肽
[0058] 本發(fā)明的LEDGF肽含有全長LEDGF的N末端肽。在一個示例性實施方案中，LEDGF 肽包含LEDGF N末端應激相關的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。盡管不受以下理論限制，但LEDGF充當轉(zhuǎn)錄 因子且啟始其它應激反應基因的轉(zhuǎn)錄的能力可有助于LEDGF肽保護免遭蛋白質(zhì)聚集介導 的疾病的能力?；蛘?，LEDGF肽可直接或通過其它中間蛋白質(zhì)結(jié)合錯誤折疊的蛋白質(zhì)，并且 有助于正常折疊或錯誤折疊的蛋白質(zhì)的泛素化以確保蛋白水解降解。在某些示例性實施方 案中，LEDGF肽可還包含TAT結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
[0059] 在一個示例性實施方案中，LEDGF肽是LEDGF1J6 (SEQ ID NO: 2)。LEDGFh26被純 化至接近均質(zhì)。LEDGF^6S要具有無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，在室溫下穩(wěn)定，并且以40kDa單體和/或 80kDa二聚體形式存在。如以下實施例章節(jié)中進一步詳細所述，LEDGFp 32fJg夠防止ARPE-19 細胞中P23H突變視紫紅質(zhì)介導的聚集應激。單次玻璃體內(nèi)注射1^06?1_ 326使視網(wǎng)膜退變性 大鼠模型中的光受體功能性損失降低超過八周。
[0060] 本發(fā)明的LEDGF肽也包括與LEDGFh26具有至少約70 %、至少約75 %、至少約 80%、至少約85%、至少約90%或至少約95%序列同一性的LEDGF肽。在一個示例性實施 方案中，LEDGF肽包括涵蓋全長LEDGF的N末端應激相關的結(jié)合結(jié)構(gòu)域且與LEDGFm 26具有 至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%或至少約95%序列同一 性的肽。在另一示例性實施方案中，LEDGF肽包括具有N末端應激相關的結(jié)合結(jié)構(gòu)域和TAT 結(jié)合結(jié)構(gòu)域且與LEDGF1I6具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少 約90%或至少約95%序列同一性的肽。此外，本發(fā)明包括涵蓋大于或小于SEQ ID NO :2的 326個氨基酸的肽，其中較大或較小肽不導致在生物合成和純化期間LEDGF生物活性或穩(wěn) 定性顯著降低。LEDGF肽供與本發(fā)明一起使用的適合性可由本領域普通技術人員通過使用 以下實施例章節(jié)中所述的測定評估推定肽與生物物理學和生物化學性質(zhì)和生物活性的類 似性來確定。普通技術人員可預測地認識到與LEDGF 1I6具有類似生物物理學性質(zhì)、生物化 學性質(zhì)和生物活性的LEDGF肽將具有類似效用且因此屬于本發(fā)明的范圍。
[0061] 在某些示例性實施方案中，上述LEDGF肽是以合成方式制備。在某些其它示例性 實施方案中，上述LEDGF肽是以重組方式制備。適于表達LEDGF肽的宿主包括但不限于大腸 桿菌（E.coli)、酵母屬（Saccharomces)、畢赤酵母屬（Picchia)、桿菌屬（Bacillus)、CH0、 BHK、COS 和 NSO 細胞。
[0062] 標準藥物制劑
[0063] 本文所述的LEDGF肽可使用已知技術提供為生理可接受的制劑。由E. W. Martin 所著的 Remington, s Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co. , Easton, PA,第 19 版（1995))描述適于藥物遞送本文公開的LEDGF肽的組合物和制劑。
[0064] 本發(fā)明的制劑可以片劑、膠囊、糖錠、扁囊劑、溶液、混懸液、乳液、粉劑、氣霧劑、栓 齊?、噴霧劑、軟錠劑、軟膏劑、霜劑、糊劑、泡沫劑、凝膠劑、棉塞、子宮托、顆粒劑、大丸劑、嗽 口劑、植入物、裝置、滴眼劑或經(jīng)皮貼片形式施用。
[0065] 制劑包括適于口服、經(jīng)直腸、經(jīng)鼻、吸入、表面（包括經(jīng)皮膚、經(jīng)皮、經(jīng)頰和滴眼 劑）、經(jīng)陰道、胃腸外（包括皮下、肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、眼內(nèi)、氣管內(nèi)和硬膜外）、眼部（眼 周、眼內(nèi)，包括脈絡膜上、視網(wǎng)膜下和玻璃體內(nèi)）或吸入施用的制劑。在一個示例性實施方 案中，本發(fā)明的肽被配制來供經(jīng)鞏膜、脈絡膜上、視網(wǎng)膜下或玻璃體內(nèi)遞送。經(jīng)鞏膜遞送包 括結(jié)膜下、眼球筋膜下和眼球后經(jīng)鞏膜遞送。制劑可宜以單位劑型呈現(xiàn)且可通過常規(guī)醫(yī)藥 技術來制備。所述技術包括使活性成分和藥物載體或賦形劑締合的步驟。一般來說，制劑 是通過使活性成分與液體載體或微細固體載體或兩者均一且精細締合，并且接著必要時使 產(chǎn)物成形來制備。
[0066] 適于口服施用的本發(fā)明的制劑可呈現(xiàn)為個別單元，如膠囊、扁囊劑或片劑，各自含 有預定量的活性成分；粉劑或顆粒劑；于水性液體或非水性液體中的溶液或混懸液；或水 包油液體乳液或油包水乳液等。
[0067] 片劑可通過任選與一種或多種輔助成分一起壓制或模制來制備。壓制片劑可通過 在適合機器中壓制任選與粘合劑、潤滑劑、惰性稀釋劑、防腐劑、表面活性劑或分散劑混合 的呈自由流動形式（如粉劑或顆粒）的活性成分來制備。模制片劑可通過在適合機器中模 制濕潤粉劑狀化合物與惰性液體稀釋劑的混合物來制備。片劑可任選被包覆或劃線且可被 配制以便提供其中活性成分的緩慢或控制釋放。
[0068] 適于在口中進行表面施用的制劑包括糖錠，其包含活性劑于通常是蔗糖和阿拉伯 膠或黃蓍膠的調(diào)味基質(zhì)中；軟錠劑，其包含活性成分于如明膠和甘油或蔗糖和阿拉伯膠的 惰性基質(zhì)中；以及嗽口劑，其包含待施用的成分于適合液體載體中。
[0069] 適于向皮膚進行表面施用的制劑可呈現(xiàn)為包含待施用的成分于藥學上可接受的 載體中的軟膏劑、霜劑、凝膠劑、糊劑和滴眼劑。
[0070] 用于經(jīng)直腸施用的制劑可呈現(xiàn)為具有包括例如可可脂或水楊酸鹽的適合基質(zhì)的 栓劑。
[0071] 適于經(jīng)鼻施用的其中載體是固體的制劑包括顆粒尺寸例如在20至500微米的范 圍內(nèi)的粗粉，其是以進行鼻吸的方式施用；即通過鼻部通道自貼近鼻部固持的具有粉劑的 容器快速吸入。適于施用的其中載體是液體的制劑（如例如鼻噴霧劑或如滴鼻劑）包括活 性成分的水性或油性溶液。
[0072] 適于經(jīng)陰道施用的制劑可呈現(xiàn)為除活性成分之外也含有如本領域中已知為適當 的成分（如載體）的子宮托、棉塞、霜劑、凝膠劑、糊劑、泡沫劑或噴霧制劑。
[0073] 適于吸入的制劑可呈現(xiàn)為除活性成分之外也含有如本領域中已知為適當?shù)某煞?(如載體）的噴霧、粉塵、粉劑或噴霧制劑。
[0074] 適于腸胃外施用的制劑包括水性和非水性無菌注射溶液，其可含有抗氧化劑、緩 沖劑、制菌劑和致使制劑與預定接受者的血液等張的溶質(zhì)；以及水性和非水性無菌混懸液， 其可包括混懸劑和增稠劑；凝膠劑；和手術放置將植入物。
[0075] 納米裝配制劑
[0076] 在某些示例性實施方案中，本發(fā)明的LEDGF肽可通過使LEDGF肽與膠態(tài)金屬顆粒 結(jié)合或另外締合來以納米顆粒裝配體形式遞送。任何膠態(tài)金屬都可用于本發(fā)明中。膠態(tài)金 屬包括任何水不溶性金屬顆粒、分散在液體水中的金屬化合物、水溶膠或金屬溶膠。膠態(tài)金 屬顆?？蛇x自周期表的IA、IB、IIB和IIIB族中的金屬以及過渡金屬，尤其是VIII族的那 些。示例性金屬包括鋅、金、銀、鋁、釕、鐵、鎳和鈣。其它適合金屬包括呈它們的所有各種氧 化狀態(tài)的以下金屬：裡、納、緩、鐘、銳、欽、鑰;、絡、猛、鉆、銅、嫁、銀、銀、鑰、鈕!、鋼、錫、鶴、鍊、 鉬和釓。金屬優(yōu)選以離子形式自適當金屬化合物獲得，例如Al 3+、RU3+、Zn2+、Fe3+、NilPCa 2+。
[0077] 在一個示例性實施方案中，納米顆粒是通過直接向含有LEDGF肽的溶液中添加膠 態(tài)金屬來形成。如本文所用，"納米顆粒"是指一種或多種結(jié)合或吸附于單一膠態(tài)金屬顆粒 的表面的肽或結(jié)合或吸附于多個膠態(tài)金屬顆粒的肽。舉例來說，LEDGF/Zn納米顆粒是通過 在室溫下以控制方式添加 IOmM Zn(II)來形成。此后，在37°C下歷經(jīng)24小時時期使納米裝 配體形成。使用其它膠態(tài)金屬來形成其它納米裝配體的條件可易于由本領域普通技術人員 確定。
[0078] 顆粒包顆粒制劑
[0079] 在另一示例性實施方案中，LEDGF肽被配制成顆粒包顆粒延長釋放制劑。本發(fā)明 的延長釋放組合物包含含有在較大多孔外部顆粒內(nèi)的內(nèi)部顆粒，包括各種構(gòu)造，如納米顆 粒在多孔微粒中（PMP包NP)、小納米顆粒在多孔大納米顆粒中（PLNP包SNP)、以及小微粒 在多孔大微粒中（PLMP包SMP)。相較于較大顆粒，內(nèi)部顆粒較小且相對不可膨脹。外部顆 粒是可膨脹的且在加工期間形成允許在外部顆粒的多孔結(jié)構(gòu)內(nèi)嵌入內(nèi)部顆粒的顯著多孔 結(jié)構(gòu)。
[0080] 如本發(fā)明的上下文中所用，如果顆粒的初始表面積在約1. 25倍至約100倍的范圍 內(nèi)增加，那么顆粒被視為在超臨界流體存在下膨脹。在某些示例性實施方案中，如果顆粒的 初始表面積在約1. 25至約5倍、約5至約25倍、約25至約50倍、約50至約75倍、或約75 至100倍的范圍內(nèi)膨脹，那么顆粒被視為會膨脹。或者，如果顆粒的初始尺寸增加至少5%、 10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或 50%，那么顆粒被視為會膨脹。
[0081] 本發(fā)明的內(nèi)部顆粒是使用在超臨界流體存在下不膨脹的聚合或非聚合物材料制 備。在某些示例性實施方案中，納米顆粒材料是在超臨界流體存在下將不膨脹的聚合物材 料。在某些示例性實施方案中，聚合物材料是在超臨界二氧化碳存在下將不膨脹的材料。 可用于本發(fā)明中的適合聚合和非聚合物材料的實例包括聚交酯（PLA)、聚（乙醇酸）、乳酸 和乙醇酸的共聚物（PLGA)、纖維素衍生物、殼聚糖、聚乙烯（PE)、聚丙烯、聚（四氟乙烯）、 聚（對苯二甲酸乙二酯）、氧化鐵、氧化鈰、氧化鋅、金、銀、其它生物相容性金屬和晶體、以 及二氧化硅。結(jié)晶材料或結(jié)晶區(qū)域較大的材料在超臨界流體加工期間膨脹的可能性較小。 聚合內(nèi)部顆粒可使用常規(guī)乳化-溶劑蒸發(fā)方法或其它類似適合合成方法來制備。LEDGF肽 可在形成期間囊封在內(nèi)部顆粒中，或在內(nèi)部顆粒形成之后裝載在表面上。
[0082] 本發(fā)明的外部顆粒是使用在超臨界流體存在下膨脹的材料制備。在某些示例性 實施方案中，微粒材料是在超臨界流體存在下膨脹的聚合物材料。在某些示例性實施方案 中，材料在超臨界二氧化碳存在下膨脹。可用于本發(fā)明中的適合聚合物材料的實例包括丙 交酯-共聚-乙交酯、聚酰胺、聚碳酸酯、聚亞烷基二醇、聚亞烷基氧化物、聚乙烯醇、聚乙烯 醚、聚乙烯酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙交酯及其共聚物。此外，適合聚合物材料也包括烷基 纖維素、羥烷基纖維素、纖維素醚、纖維素酯、硝基纖維素、丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯的聚合 物、甲基纖維素、乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羥丁基甲基纖維素、乙酸 纖維素、乙酸丁酸纖維素、乙酸鄰苯二甲酸纖維素、羧乙基纖維素、纖維素聚（甲基丙烯酸 甲酯）、聚（甲基丙烯酸乙酯）、聚（甲基丙烯酸丁酯）、聚（乙烯醇）、聚（乙酸乙烯酯）和 聚乙烯吡酪烷酮。一般來說，非晶材料或非晶區(qū)域較大的材料適于在超臨界流體加工期間 膨脹。聚合外部顆?？墒褂贸Ｒ?guī)乳化-溶劑蒸發(fā)或其它類似適合合成方法來制備。在某些 示例性實施方案中，LEDGF肽可在形成期間囊封在外部顆粒中或在外部顆粒形成之后裝載 在表面上。
[0083] 產(chǎn)生各種顆粒構(gòu)造的方法是使用超臨界流體流動技術來達成。所得無有機溶劑裝 載尤其非常適合于易經(jīng)受聚集或降解的藥物，如基于肽和核苷酸的藥物。舉例來說，LEDGF 肽可被裝載在內(nèi)部顆粒、外部顆?；騼烧叩谋砻嫔?；內(nèi)部顆粒、外部顆?；騼烧叩幕|(zhì)中； 存在于外部顆粒的孔中；或其組合。在某些示例性實施方案中，LEDGF肽可存在于內(nèi)部顆 粒的表面上。在另一示例性實施方案中，LEDGF肽可存在于內(nèi)部和外部顆粒的表面上。在 另一示例性實施方案中，LEDGF肽可存在于內(nèi)部顆粒的基質(zhì)中。在另一示例性實施方案中， LEDGF膚可存在于內(nèi)部顆粒與外部顆粒兩者的基質(zhì)中。在另一不例性實施方案中，此外，治 療劑可存在于外部顆粒的多孔結(jié)構(gòu)中。
[0084] 使內(nèi)部顆粒和外部顆粒混合在一起且在高壓下暴露于超臨界流體。在某些示例性 實施方案中，超臨界流體是二氧化碳。在暴露于超臨界流體后，外部顆粒膨脹以在外部表面 上產(chǎn)生多孔結(jié)構(gòu)。超臨界流體接著使內(nèi)部顆粒注入外部顆粒中以形成顆粒包顆粒延長釋放 制劑。在一個示例性實施方案中，顆粒包顆粒延長釋放制劑包含在直徑約1 μ m至約100 μ m 的外部微粒中并入直徑約Inm至約900nm的內(nèi)部納米顆粒。在另一示例性實施方案中，顆粒 包顆粒延長釋放制劑包含在直徑約IOnm至約999nm的外部納米顆粒中并入直徑約Inm至 約300nm的內(nèi)部納米顆粒。在另一示例性實施方案中，顆粒包顆粒延長釋放制劑包括在直 徑約2 μ m至約500 μ m的外部微粒中并入直徑約1 μ m至約100 μ m的內(nèi)部微粒。對適當尺 寸的內(nèi)部和外部顆粒的選擇將取決于構(gòu)成顆粒的材料的類型、外部顆粒在所用超臨界流體 中的膨脹能力、以及待并入在外部顆粒內(nèi)的內(nèi)部顆粒的尺寸。這些是可易于由本領域普通 技術人員選擇的所有因素。一般來說，內(nèi)部顆粒與外部顆粒之間的尺寸比率可自約1 : 5至 約1 : 100變化。在一個示例性實施方案中，尺寸比率可為1 : 5、1 : 10、1 : 15、1 : 20、 1 : 25、1 : 30、1 : 35、1 : 40、1 : 45、1 : 50、1 : 55、1 : 60、1 : 65、1 : 70、1 : 75、 1 : 80、1 : 85、1 : 90、1 : 95 或 1 : 100。
[0085] PMP包NP的形成可通過在約IOOOpsi至約HOOpsi下暴露納米顆粒和微粒來達 成。暴露時間可例如自約5分鐘至約2小時變化。溫度可在30°C至45°C的范圍內(nèi)。對適當 壓力和溫度范圍的選擇是主要由接近給定超臨界流體的超臨界點的溫度和壓力范圍決定。 因此，本領域普通技術人員將能夠選擇基于所用超臨界流體、所需外部顆粒膨脹的尺寸或 量、以及所需外部顆粒中的孔隙度確定范圍的適當時間、溫度和壓力。舉例來說，持續(xù)較長 時期和/或在較高壓力下暴露繼之以壓力淬滅將導致膨脹和孔隙性大于較短暴露時間和/ 或壓力。
[0086] 在一個示例性實施方案中，內(nèi)部顆粒和外部顆粒是在約1 : 3的比率下混合。在 一個示例性實施方案中，所用內(nèi)部顆粒與外部顆粒的比率是約1 : 9。這些比率將影響納米 顆粒并入和藥物緩慢釋放的程度。一般來說，內(nèi)部顆粒相對于外部顆粒的量越大，外部顆粒 中并入的內(nèi)部顆粒的量越高，從而增加藥物釋放速率和劑量。內(nèi)部顆粒相對于外部顆粒的 量越小，爆發(fā)性釋放越小。
[0087] 蛋白質(zhì)聚集介導的疾病和治療方法
[0088] 本發(fā)明的LEDGF制劑可用于治療蛋白質(zhì)聚集介導的疾病?？捎帽景l(fā)明的LEDGF組 合物治療的蛋白質(zhì)聚集介導的疾病包括視網(wǎng)膜退變性疾病和神經(jīng)退變性疾病。視網(wǎng)膜退變 性疾病包括老年性黃斑變性、視網(wǎng)膜色素變性和糖尿病性視網(wǎng)膜病變。神經(jīng)退變性疾病包 括阿爾茨海默?。ˋD)、帕金森氏?。≒D)、亨廷頓氏?。℉D)、肌萎縮性側(cè)索硬化和朊病毒疾 病。
[0089] 在一個示例性實施方案中，本發(fā)明包含治療視網(wǎng)膜退變性疾病的方法，其包括向 患有視網(wǎng)膜退變性疾病的患者施用包含本發(fā)明的LEDGF肽的組合物。在某些示例性實施方 案中，LEDGF肽是SEQ OD NO :2。在一個示例性實施方案中，LEDGF組合物是經(jīng)鞏膜遞送。 在另一示例性實施方案中，LEDGF組合物是以滴眼劑形式向眼進行表面施用。在另一示例性 實施方案中，LEDGF組合物是以延長釋放制劑形式植入或全身性施用。在一個示例性實施 方案中，延長釋放制劑是納米裝配延長釋放制劑，如LEDGF/鋅納米裝配制劑。在另一示例 性實施方案中，延長釋放制劑是顆粒包顆粒制劑，如納米顆粒于多孔微粒中（PMP包NP)制 劑。
[0090] 在一個示例性實施方案中，本發(fā)明包含降低視網(wǎng)膜退變性疾病中蛋白質(zhì)聚集的方 法，其包括向患有視網(wǎng)膜退變性疾病的患者施用包含本發(fā)明的LEDGF肽的組合物。在某些 示例性實施方案中，LEDGF肽是LEDGFm 26。在一個示例性實施方案中，LEDGF組合物是經(jīng)鞏 膜遞送。在另一示例性實施方案中，LEDGF組合物是以滴眼劑形式向眼進行表面施用。在 另一示例性實施方案中，LEDGF組合物是以延長釋放制劑形式植入或全身性施用。在一個 示例性實施方案中，延長釋放制劑是本發(fā)明的納米顆粒延長釋放制劑，如LEDGF/鋅納米顆 粒制劑。在另一示例性實施方案中，延長釋放制劑是顆粒包顆粒制劑，如納米顆粒于多孔微 粒中（PMP包NP)制劑。
[0091] 在另一示例性實施方案中，本發(fā)明包含治療神經(jīng)退變性疾病的方法，其包括向患 有神經(jīng)退變性疾病的患者施用包含本發(fā)明的LEDGF肽的組合物。在某些示例性實施方案 中，LEDGF肽是LEDGF 1I6。在一個示例性實施方案中，LEDGF組合物是腹膜內(nèi)遞送。在另一 示例性實施方案中，LEDGF組合物是口服施用。在另一示例性實施方案中，LEDGF組合物是 以延長釋放制劑形式全身性施用。在一個示例性實施方案中，延長釋放制劑是本發(fā)明的納 米顆粒延長釋放制劑，如LEDGF/鋅納米顆粒制劑。在另一示例性實施方案中，延長釋放制 劑是顆粒包顆粒制劑，如納米顆粒于多孔微粒中（PMP包NP)制劑。
[0092] 在另一示例性實施方案中，本發(fā)明包含降低神經(jīng)退變性疾病中蛋白質(zhì)聚集的方 法，其包括向患有神經(jīng)退變性疾病的患者施用包含本發(fā)明的LEDGF肽的組合物。在某些示 例性實施方案中，LEDGF肽是LEDGFm 26。在一個示例性實施方案中，LEDGF組合物是腹膜 內(nèi)遞送。在另一示例性實施方案中，LEDGF組合物是口服施用。在另一示例性實施方案中， LEDGF組合物是以延長釋放制劑形式施用。在一個示例性實施方案中，延長釋放制劑是本發(fā) 明的納米顆粒延長釋放制劑，如LEDGF/鋅納米顆粒制劑。在另一示例性實施方案中，延長 釋放制劑是顆粒包顆粒制劑，如納米顆粒于多孔微粒中（PMP包NP)制劑。
[0093] 組合物和方法由以下非限制性實施例進一步說明，所述實施例無論如何都不應解 釋為對其范圍施加限制。相反，應明確了解的是在不脫離本發(fā)明的精神下可采取其各種在 讀取本文描述之后可向本領域技術人員顯現(xiàn)它們自身的其它實施方案、修改和等效物。 實施例
[0094] 實施例1
[0095] 1.材料
[0096] 質(zhì)粒 pEGFP-LEDGF 由 Toshimichi Shinohara 博士 （University of Nebraska Medical Center，Omaha，NE)惠贈。正向和反向引物自 Integrated DNA Technologies(Coralville，IA)獲得。DNA聚合酶 I、T4DNA連接酶和限制酶自 New England Biolab Inc. (Ipswich, MA)獲得。QIAquick膠凝提取試劑盒、QIAprep旋轉(zhuǎn)小型制備試劑 盒和QIAGEN質(zhì)粒小型試劑盒自Qiagen (Valencia，CA)獲得。XK 16/20管柱、S-200凝膠過 濾管柱、SP 瓊脂糖珠粒自 GE Lifesciences Healthcare (Piscataway，NJ)獲得。ARPE-19 細胞自ATCC(Manassas，VA)獲得。DMEM/F12細胞培養(yǎng)基、胎牛血清、轉(zhuǎn)脂胺2000、LB培 養(yǎng)基和超純瓊脂糖自Invitrogen (Carsbad，CA)獲得。除非指定，否則所有其它材料都自 Sigma-Aldrich(St. Louis，MO)獲得。
[0097] 制備LEDGF^DNA構(gòu)建體
[0098] 將編碼 LEDGFh26蛋白的基因克隆至 pET_28a(+)載體（Novagen，Madison，WI)中。 簡要來說，使用由HindIII限制核酸內(nèi)切酶位點組成的正向引物5'AGTAGTGGATCCATGACTCG CGATTTCAAAC3' (SEQ ID NO :3)和由BamHI限制核酸內(nèi)切酶位點組成的反向引物5'AATAATA AGCTTTCACTGCTCAGTTTCCATTTGTTC' 3 (SEQ ID NO :4)，自 pEGFP-LEDGF 質(zhì)粒 PCR (聚合酶鏈反 應）擴增Ledgf^26基因。使用DNA聚合酶I用以下方案進行PCR擴增：在94°C下變性5分 鐘；繼之以36個循環(huán)：在94°C下變性30秒，在50°C下退火45秒并在72°C下延伸2分鐘；以 及最終在72°C下進行延伸步驟5分鐘。根據(jù)制造商方案，使用QIAquick膠凝提取試劑盒純 化擴增的LedgfV 326基因。此后，分別使用HindIII和BamHI限制酶在5'和3'末端處連續(xù) 消化純化的LedgfH 6基因插入物和pET-28a(+)載體。接著根據(jù)制造商方案使用QIAprep 旋轉(zhuǎn)小型制備試劑盒來純化它們。在4°C下使用T4DNA連接酶將插入物和載體的粘末端連 接過夜。根據(jù)制造商方案使用熱激程序用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5ci細胞。挑選 十個菌落且使用QIAGEN質(zhì)粒小型試劑盒擴增、提取和純化質(zhì)粒。通過三種不同方式確認 LedgfH6插入pET-28a(+)載體中：首先通過PCR篩選，其次通過限制消化，并且最后通過 DNA測序。使用2%瓊脂糖凝膠分析重組DNA的純度和尺寸。使用NanoDrop 1000 (Thermo scientific, Wilmington, DE)進行DNA定量。進一步培養(yǎng)顯示陽性PCR信號和正確測序結(jié) 果的菌落，并且制備細菌甘油儲備物并儲存在-80°C下供所有未來使用。
[0099] 生物信息學分析
[0100] 將LEDGF1I氨基酸序列提交至ExPASy生物信息學資源門戶且計算LEDGF M26W 分子量、理論pi、氨基酸組成、原子組成、消光系數(shù)、估計半衰期。
[0101] 表達和純化LEDGFh326
[0102] 對于蛋白質(zhì)生物合成，根據(jù)制造商方案使用QIAGEN質(zhì)粒小型試劑盒自大腸桿 菌DH5a菌落擴增和純化PLEDGFh 26質(zhì)粒。接著根據(jù)制造商方案將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化于大腸桿菌 BL21(DE3)菌株中。此后，將含有質(zhì)粒的細菌的單菌落接種至含有SOyg/ml卡那霉素的 LB(魯里亞（Luria)肉湯）培養(yǎng)基中過夜。添加1 %過夜生長培養(yǎng)物接種物至一升含有 50^8/1111卡那霉素的1^培養(yǎng)基中。使培養(yǎng)物在371：下生長直至培養(yǎng)基的光密度（0.0.)達 到0.6-0. 8。通過添加 IPTG (異丙基-β-D-硫代-半乳糖苷）以達到最終濃度200 μ M來 誘導蛋白質(zhì)表達。此后，在37°C下再孵育細胞3小時且通過在4°C下在3000g下離心15分 鐘來收集。將收集的細胞再混懸于緩沖液A(25mM Tris-HCKpH 7.0)、I mM EDTA、ImM PMSF 和5%蔗糖）中。在70%輸出（36瓦）5秒繼之以冷卻15秒下對細胞進行脈沖超聲處理 (]^8〇11丨1，3〇11；^31:〇1 3000，？31'111；[1^(1316，附），持續(xù)總計30分鐘。在4°(1|下在 1300(^下離 心溶解的細胞20分鐘以分離溶解產(chǎn)物的可溶性和不溶性部分。在SDS-PAGE上分析可溶性 (上清液）和不溶性（離心塊）部分的蛋白質(zhì)含量且測定產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的可溶性/不溶性 性質(zhì)。
[0103] FPLC =LEDGFp32f^在可溶性部分中表達，如通過SDS-PAGE所確定。使用快速蛋白 質(zhì)液相色譜（FPLC)技術分兩步，首先基于電荷（陽離子交換）且接著基于尺寸（凝膠過 濾）來純化LEDGFh 26。簡要來說，將陽離子交換SP瓊脂糖珠粒裝填在XK 16/20管柱中且 使用緩沖液A在2ml/min流速下進行平衡。此后，在流速lml/min下將可溶性部分裝載在 管柱上。管柱接著用五管柱體積的緩沖液A在2ml/min流速下洗滌。使用尖銳梯度的氯化 鈉（0至28%電導）洗脫大多數(shù)非特異性以及松散結(jié)合的雜質(zhì)。在移除顯著比例的管柱結(jié) 合雜質(zhì)之后，使用在40分鐘內(nèi)電導自28 %至40 %的第二梯度的NaCl達成LEDGF^26的進 一步洗脫。通過使用嵌入紫外檢測器測量280nm下的吸光度來監(jiān)測蛋白質(zhì)洗脫曲線。在洗 脫過程期間收集2. 5ml洗脫份且在SDS-PAGE上分析以測定純度。將含有高蛋白質(zhì)量的洗 脫份匯合在一起。使用透析緩沖液（25mM Tris (pH 7.0)和0. 1 %鹿糖）透析匯合的洗脫份 且接著凍干48小時。將凍干蛋白質(zhì)溶解于2ml去離子水中。對于下一純化步驟，使用平衡 緩沖液 B (25mM Tris-HCl (pH 7. 0)和 IOOmM NaCl)在流速 lml/min 下使預裝填的 S-200 凝 膠過濾管柱平衡。接著將來自陽離子交換的LEDGF1I^*縮溶液裝載于S-200管柱上。使 用緩沖液B在流速lml/min下洗脫LEDGF^ 26。在約100分鐘時獲得尖銳峰，收集Iml洗脫 份。使用SDS-PAGE分析收集的洗脫份。將含有純LEDGFh 26的洗脫份匯合在一起。接著在 4°C下以三次緩沖交換在透析緩沖液（25mM Tris-HCKpH 7.0)和0. 1%蔗糖）中充分透析 純化LEDGF^dS小時以移除過量鹽和其它雜質(zhì)。在-80°C下冷凍并凍干透析的LEDGFp32f^S 小時。將凍干的LEDGFn6等分且儲存在-80°C下以達成所有未來目的。
[0104] 紫外光譜術：準確稱重12mg凍干的LEDGFm26且接著溶解于Iml去離子水中。使 用 Spectramax M5(Molecular Devices，Downingtown，PA)自 200nm至 400nm記錄紫外吸收 光譜。使用去離子水連續(xù)稀釋樣本直至獲得280nm下的吸光度小于1。這個吸光度用于基 于摩爾消光系數(shù)計算樣本中存在的純化蛋白質(zhì)的量。
[0105] 物理表征
[0106] 通過 SDS-PAGE、SEC-HPLC 和 MALDI-T0F 來測定 LEDGF1J2f^ 白的分子量和純度。
[0107] SDS-PAGE :簡要來說，將5 μ g LEDGFp32f^ SDS-PAGE樣本緩沖液（含有β -巰基乙 醇）中煮沸10分鐘。將蛋白質(zhì)樣本裝載于4-15% SDS-PAGE膠凝（Bi〇-Rad，Hercules，CA) 上且在30mA下進行電泳90分鐘。膠凝接著用考馬斯亮藍（coomassie brilliant blue) 染色且使用GelDoc? XR(Biorad，Hercules，CA)在白光下觀察。對于非還原性SDS-PAGE， 將LEDGFh26稀釋于非還原性樣本緩沖液（無 β-巰基乙醇）中且避免煮沸。
[0108] SEC-HPLC :將凍干蛋白質(zhì)溶解于去離子水中以達到最終濃度500μ g/ml且經(jīng) 0. 22um(PVDF)過濾器過濾。利用Agilent Bio SEC-3管柱，在25°C下使用25mM含有ImM CaCljA Tris緩沖液（pH 7.0)以流速lml/min評估蛋白質(zhì)。用分子量標準物（Invitrogen) 校正管柱。在214nm下測量紫外吸光度。
[0109] MALDI-T0F :通過用 4800Plus MALDI T0F/T0F?(AB Sciex，F(xiàn)ramingham，MA)測定分 子量來確認蛋白質(zhì)均質(zhì)性和身份。將蛋白質(zhì)樣本溶解入標準MALDI基質(zhì)芥子酸的溶液中， 點樣且干燥于金屬靶板上。自5900強度的1000次激光照射以總離子流（TIC)形式收集數(shù) 據(jù)。
[0110] DLS :使用 zetasizer Nano ZS (Malvern，Westborough，MA)分析 LEDGF卜326蛋白 的均質(zhì)性和尺寸。簡要來說，將凍干蛋白質(zhì)樣本溶解于去離子水中以得到最終蛋白質(zhì)濃度 2. 5mg/ml。使用動態(tài)光散射技術，在173°反向散射角下進行數(shù)據(jù)收集來以數(shù)目、強度和體 積平均值量度尺寸。測量結(jié)果是13次掃描的平均值。
[0111] 生物物理學表征
[0112] 對于生物物理學表征，在25mM磷酸鹽緩沖液（pH 7.0)中充分透析蛋白質(zhì)以移除 Tris-HCl和蔗糖，并且經(jīng)0. 22 μ m PVDF注射器過濾器過濾。使用Origin? 8. 5 (OriginLab Corp., Northampton, MA)或 SigmaPlot 11.0 (Systat Software, Inc, Chicago, IL)分 析獲得的光譜。使用如下由Scholtz等定義的等式I和2擬合數(shù)據(jù)以確定AG、m值和 [脲]1/2[62]。

【權(quán)利要求】
1. 一種包含晶狀體上皮源性生長因子（L邸G巧的氨基酸序列的膚，其中所述膚包含 LEDGF N末端應激相關的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
2. 如權(quán)利要求1所述的膚，其中所述膚還包含TAT結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
3. 如權(quán)利要求1所述的膚，其中所述膚具有約40kDa的分子量。
4. 如權(quán)利要求1所述的膚，其中所述膚具有氨基酸序列SEQ IDN0;2,或與SEQ ID NO: 2具有至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %或至少95 %序列同一性的氨基 酸序列。
5. -種核酸序列，其編碼如權(quán)利要求4所述的膚。
6. -種載體，其包含如權(quán)利要求5所述的核酸序列。
7. -種組合物，其包含如權(quán)利要求1至4中任一項所述的膚。
8. 如權(quán)利要求7所述的組合物，其還包含藥物載體、稀釋劑、賦形劑或其組合。
9. 如權(quán)利要求7所述的組合物，其中所述膚與膠態(tài)金屬納米顆粒結(jié)合或締合。
10. 如權(quán)利要求9所述的組合物，其中所述膠態(tài)金屬納米顆粒是金、銀、鉛、釘、鋒、鐵、 媒、巧、裡、軸、鎮(zhèn)、鐘、筑、鐵、饑、鉛、猛、鉆、銅、嫁、餓、魄、鋼、把、鋼、錫、鶴、練、笛或亂膠態(tài) 金屬納米顆粒。
11. 如權(quán)利要求10所述的組合物，其中所述納米顆粒是鋒納米顆粒。
12. 如權(quán)利要求9至11中任一項所述的組合物，其還包含藥物載體、稀釋劑、賦形劑或 其組合。
13. 如權(quán)利要求7所述的組合物，其中所述膚結(jié)合或囊封于內(nèi)部顆粒中，并且其中所述 內(nèi)部顆粒被裝載在多孔外部顆粒中。
14. 如權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述內(nèi)部顆粒是由在超臨界二氧化碳中不膨脹 的顆粒材料制得。
15. 如權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述內(nèi)部顆粒材料是聚合物材料。
16. 如權(quán)利要求15所述的組合物，其中所述內(nèi)部顆粒聚合物材料選自由W下組成的 組；聚交醋（PLA)、聚（己醇酸）（PGA)、乳酸和己醇酸的共聚物（PLGA)、纖維素衍生物和殼 聚糖。
17. 如權(quán)利要求16所述的組合物，其中所述內(nèi)部顆粒聚合物材料是聚交醋（PLA)。
18. 如權(quán)利要求13所述的組合物，其中所述外部顆粒是由在超臨界二氧化碳中膨脹的 顆粒材料制得。
19. 如權(quán)利要求18所述的組合物，其中所述外部顆粒是聚合物材料。
20. 如權(quán)利要求19所述的組合物，其中所述聚合物材料是選自W下的材料；聚醜胺、聚 碳酸醋、聚亞焼基二醇、聚亞焼基氧化物、聚己帰醇、聚己帰離、聚己帰醋、聚己帰化咯焼麗、 聚己交醋及其共聚物、焼基纖維素、輕焼基纖維素、纖維素離、纖維素醋、硝基纖維素、丙帰 酸醋和甲基丙帰酸醋的聚合物、甲基纖維素、己基纖維素、輕丙基纖維素、輕基-丙基甲基 纖維素、輕下基甲基纖維素、己酸纖維素己酸下酸纖維素、己酸鄰苯二甲酸纖維素、駿己基 纖維素、纖維素聚（甲基丙帰酸甲醋）、聚（甲基丙帰酸己醋）、聚（甲基丙帰酸下醋）、聚 (己帰醇）、聚（己酸己帰醋）和聚己帰化酪焼麗。
21. 如權(quán)利要求20所述的組合物，其中所述外部顆粒材料是丙交醋-共聚-己交醋。
22. -種治療蛋白質(zhì)聚集介導的疾病的方法，其包括向有需要的患者施用如權(quán)利要求 7至21中任一項所述的組合物。
23. 如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述聚集介導的疾病是眼病。
24. 如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述眼病是視網(wǎng)膜變性疾病。
25. 如權(quán)利要求24所述的方法，其中所述視網(wǎng)膜變性疾病是老年性黃斑變性（AMD)或 視網(wǎng)膜色素變性（RP)。
26. 如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述聚集介導的疾病是神經(jīng)退變性疾病。
27. 如權(quán)利要求26所述的方法，其中所述神經(jīng)退變性疾病是阿爾茨海默?。ˋD)、帕金 森氏?。≒D)、亨廷頓氏?。?、肌萎縮性側(cè)索硬化或化病毒疾病。
28. -種降低蛋白質(zhì)聚集介導的疾病中蛋白質(zhì)聚集的方法，其包括向有需要的患者施 用如權(quán)利要求7至21中任一項所述的組合物。
29. 如權(quán)利要求28所述的方法，其中蛋白質(zhì)聚集是由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、氧化應激或兩者引 起。
30. 如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述患者患有視網(wǎng)膜變性疾病。
31. 如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述視網(wǎng)膜變性疾病是AMD或RP。
32. 如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述患者患有神經(jīng)退變性疾病。
33. 如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述神經(jīng)退變性疾病是AD、PH、皿、肌萎縮性側(cè)索 硬化或化病毒疾病。
【文檔編號】A61K38/18GK104470534SQ201380038504
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2013年5月21日 優(yōu)先權(quán)日:2012年5月21日
【發(fā)明者】烏達伊·B·康佩拉, 林庫·拜德, 阿倫·K·烏帕德亞伊, 薩拉·揚德拉普 申請人:科羅拉多大學董事會