專利名稱：：Wnt拮抗劑及其在wnt介導(dǎo)的病癥的診斷和治療中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明一般性涉及細(xì)胞生長的調(diào)節(jié)。更具體地，本發(fā)明涉及Wnt途徑的抑制劑以及其在特征在于Wnt途徑信號傳導(dǎo)激活的病癥的診斷和治療中的用途，以及由Wnt途徑信號傳導(dǎo)介導(dǎo)的細(xì)胞事件的調(diào)控。
背景技術(shù)：
：由于在某些鼠乳房胂瘤中的早期觀察和實驗結(jié)果，Wnt信號傳導(dǎo)途徑與致癌作用開始聯(lián)系起來。Wnt-l原癌基因(Int-l)最初從小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)誘導(dǎo)的乳房腫瘤(由于病毒DNA序列的插入)中鑒定。Nusse等，Cell1982;31:99-109。這種病毒整合的結(jié)果是導(dǎo)致肺瘤形成的不受調(diào)節(jié)的Int-l表達(dá)。Vanooyen,A.等，Cell1984;39:233-240;Nusse,R.等，Nature1984;307:131-136;Tsukamoto等，Cell1988;55:619-625。隨后的序列分析表明Int-l是牽涉發(fā)育的果蠅無翅(Wingless,Wg)基因的哺乳動物同系物，然后這些術(shù)語被組合起來以產(chǎn)生"Wnt",用以鑒定該蛋白質(zhì)家族。分泌型配體的人Wnt基因家族現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展至至少19個成員(例如Wnt-1(RefSeq.:NM一005430)、Wnt-2(RefSeq.:鹿—003391)、Wnt-2B(Wnt-13)(RefSeq.:NM—004185)、Wnt-3(ReSeq.:NM—030753)、Wnt3a(RefSeq.:NM—033131)、Wnt-4(RefSeq.:NM一030761)、Wnt-5A(RefSeq.:NM_003392)、Wnt-5B(RefSeq.:NM—032642)、Wnt-6(RefSeq.:雨—006522)、Wnt-7A(RefSeq.:NM—004625)、Wnt-7B(RefSeq.:NM一058238)、Wnt-8A(RefSeq.:兩一058244)、Wnt-8B(RefSeq.:固—003393)、Wnt-9A(Wnt-14)(RefSeq.:NM—003395)、Wnt-9B(Wnt-15)(RefS叫.NM—003396)、Wnt-10A(RefSeq.:NM—025216)、Wnt-10B(RefSeq.:畫—003394)、Wnt畫ll(RefSeq.:NM—004626)、Wnt-16(RefSeq.:NM—016087))。各個成員具有不同程度的序列同一性，但全都含有顯示高度保守間隔的23-24個保守半胱氨酸殘基。McMahon,AP等，TrendsGenet,1992;8:236-242;Miller,JR.GenomeBiol.2002;3(1):3001.1-3001.15。Wnt蛋白是小的(即39-46kD)?；置谛吞堑鞍祝湓谂咛グl(fā)生和成熟組織兩者中發(fā)揮關(guān)鍵的作用。在胚胎學(xué)發(fā)育過程中，Wnt蛋白的表達(dá)在圖式形成(patterning)中是重要的，其通過控制細(xì)胞增殖和決定干細(xì)胞命運來實現(xiàn)。Wnt分子還是棕櫚?；模绱似涫杷愿哂趦H通過氨基酸序列分析所預(yù)測的不進行棕櫚?；闆r中會具有的疏水性。Willert,K.等，Nature2003;423:448-52。還認(rèn)為棕櫚?；囊粋€或多個位點對于功能是至關(guān)重要的。Wnt蛋白起配體的作用，活化跨膜7次的受體巻曲蛋白(Frizzled,Frz)家族。Ingham,P.W.TrendsGenet.1996;12:382-384;YangSnyder,J.等，Curr.Biol.1996;6:1302-1306;Bhanot,R等，Nature1996;382:225-230。存在有10個已知的Frz家族成員(例如Frzl、Frz2、Frz3...Frzl0),每個的特征在于富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域(CRD)的存在。Huang等，GenomeBiol.2004;5:234.1-234.8。各種Wnt-巻曲蛋白相互作用之間的混雜程度巨大，但Wnt-Frz結(jié)合還必須摻入LDL受體相關(guān)蛋白(LRP5或LRP6)及細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)蛋白質(zhì)散亂蛋白(Dishevelled,Dsh)以形成活性信號傳導(dǎo)復(fù)合物。Wnt對巻曲蛋白的結(jié)合可以激活信號傳導(dǎo)，或是經(jīng)由規(guī)范的Wnt信號傳導(dǎo)途徑，由此導(dǎo)致(3-聯(lián)蛋白的穩(wěn)定化和轉(zhuǎn)錄活性升高[Peifer,M.等,Development1994;120:369-380;Papkoff，J.等，Mol.CellBiol.1996;16:2128-2134]，或是經(jīng)由非規(guī)范的信號傳導(dǎo)，諸如通過Wnt/平面細(xì)胞極性(Wnt/PCP)或Wnt-4丐(Wnt/Ca2+)途徑。Veeman,M.T.等，Dev.Cell2003;5:367-377。規(guī)范的Wnt信號傳導(dǎo)途徑是與癌癥形成最相關(guān)的Wnt信號傳導(dǎo)途徑。Ilyas,M.,J.Pathol.2005;205:130-144。該途徑的正常激活啟動一系列的下游事件，其在蛋白質(zhì)(3-聯(lián)蛋白的穩(wěn)定化和水平升高時達(dá)到頂點。該蛋白質(zhì)正常情況下是一種沒有活性的胞質(zhì)蛋白質(zhì)，并且見于與蛋白質(zhì)(包括上皮鈣粘著蛋白)結(jié)合的細(xì)胞膜。在沒有Wnt配體時，磷酸化的胞質(zhì)(3-聯(lián)蛋白被正常地快速降解。在規(guī)范途徑被激活后，未磷酸化的P-聯(lián)蛋白被運輸至細(xì)胞核，在那里其進一步導(dǎo)致各種靶基因的轉(zhuǎn)錄激活。隨后這些耙基因轉(zhuǎn)錄的上調(diào)導(dǎo)致細(xì)胞變化，而且此類靶基因持續(xù)的、不受調(diào)節(jié)的表達(dá)導(dǎo)致腫瘤形成。因為異常Wnt信號傳導(dǎo)在致癌作用中表現(xiàn)為必需的先驅(qū)，所以有效的Wnt信號傳導(dǎo)抑制劑作為癌癥治療劑是令人有極大興趣的?？扇苄允荏w作為配體-受體相互作用拮抗劑的用途在本領(lǐng)域中是已知的。此類分子可以是有效的治療性拮抗劑，如果它們結(jié)合游離配體且其結(jié)合方式使得阻止信號傳導(dǎo)途徑的初始受體活化步驟。根據(jù)晶體學(xué)數(shù)據(jù)，鑒定出巻曲蛋白受體的富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域(CRD)的可溶性最低限度胞外結(jié)構(gòu)域(ECD)片段，其展現(xiàn)對Wnt的結(jié)合。Dann等，Nature412:86-90(2001)。然而，雖然此類巻曲蛋白片段確實展現(xiàn)對Wnt配體的結(jié)合，但此類片段不適合作為治療劑，因為它們在體內(nèi)快速降解。提出了將偶聯(lián)有免疫球蛋白Fc的可溶性巻曲結(jié)構(gòu)域用作潛在的Wnt拮抗劑。TherapeuticOpportunitiesoftheWntSignalingPathwayinCancer,NewYorkAcademyofSciences,2005年10月25日；Hsieh,J-C.等，PNAS,96:3546-3551(1999)。然而，本發(fā)明之前，創(chuàng)建可溶性巻曲蛋白受體-Fc融合物治療劑的嘗試一直未獲成功。例如，一種基于Frz8CRD的殘基1-173的此類嵌合體(Frz(173)-Fc，SEQIDNO:113)具有亞最適功效(圖12),而且在體內(nèi)是不穩(wěn)定的(圖ll)。此外，F(xiàn)rz(173)-Fc嵌合體僅降低了腫瘤體積增加的速率(與縮小起始腫瘤體積形成對比)。另外，雖然Fc融合物的創(chuàng)建作為改善所得構(gòu)建體的體內(nèi)穩(wěn)定性的一種技術(shù)是普遍知道的，但由于許多問題(包括新蛋白構(gòu)建體的不正確蛋白質(zhì)折疊和融合構(gòu)建體與靶物的空間位阻)，有效的治療性Fc構(gòu)建體的創(chuàng)建可以是困難的。如此，需要體內(nèi)穩(wěn)定性增強的Wnt拮抗劑治療劑，其在抑制Wnt配體誘導(dǎo)的細(xì)胞信號傳導(dǎo)中起作用。發(fā)明概述本發(fā)明提供了組合物及其在診斷和治療Wnt介導(dǎo)的病癥(諸如癌癥)的方法和抑制細(xì)胞Wnt信號傳導(dǎo)中的用途。具體地，本發(fā)明提供了Wnt拮抗劑及其在診斷和治療Wnt介導(dǎo)的病癥的方法和抑制細(xì)胞Wnt信號傳導(dǎo)中的用途，所述Wnt拮抗劑是包含巻曲結(jié)構(gòu)域構(gòu)件(諸如自巻曲(Frz)蛋白、巻曲相關(guān)蛋白(sFRP)或另一種蛋白質(zhì)(例如Ror-l,-2等)衍生的多肽)及免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域的嵌合分子。本發(fā)明的一方面提供了包含巻曲結(jié)構(gòu)域構(gòu)件和Fc結(jié)構(gòu)域的Wnt拮抗劑。該Wnt拮抗劑的巻曲結(jié)構(gòu)域構(gòu)件包含自Frz蛋白、FRP蛋白或Ror蛋白衍生的多肽。在一個實施方案中，該Wnt拮抗劑的活性在體內(nèi)持續(xù)至少l小時。在另一個實施方案中，該Wnt拮抗劑的活性在體內(nèi)持續(xù)至少5小時。在另一個實施方案中，該Wnt拮抗劑的體內(nèi)半衰期為至少l天。在又一個實施方案中，該Wnt拮抗劑的體內(nèi)半衰期為至少2天。在進一步的實施方案中，巻曲結(jié)構(gòu)域構(gòu)件包含來自選自下組的Frz多肽的最低限度CRD(ECD)結(jié)構(gòu)域及其活性變體hFrzl(SEQIDNO:18)、hFrz2(SEQIDNO:19)、hFrz3(SEQIDNO:20)、hFrz4(SEQIDNO:21)、hFrz5(SEQIDNO:22)、hFrz6(SEQIDNO:23)、hFrz7(SEQIDNO:24)、hFrz8(SEQIDNO:25)、hFrz9(SEQIDNO:26)、及hFrz10(SEQIDNO:27)。在更進一步的實施方案中，巻曲結(jié)構(gòu)域構(gòu)件包含來自選自下組的sFRP多肽的最低限度CRD(ECD)結(jié)構(gòu)域及其活性變體sFRPl(SEQIDNO:28)、sFRP2(SEQIDNO:29)、sFRP3(SEQIDNO:30)、sFRP4(SEQIDNO:31)、及sFRP5(SEQIDNO:32)。在更進一步的實施方案中，巻曲結(jié)構(gòu)域構(gòu)件包含來自選自下組的Ror多肽的最低限度CRD(ECD)結(jié)構(gòu)域及其活性變體hRorl(SEQIDNO:33)及hRor2(SEQIDNO:34)。在進一步的實施方案中，巻曲結(jié)構(gòu)域構(gòu)件包含選自下組的成熟Frz多肽及其活性變體hFrzl(SEQIDNO:50)、hFrz2(SEQIDNO:51)、hFrz3(SEQIDNO:52)、hFrz4(SEQIDNO:53)、hFrz5(SEQIDNO:54)、hFrz6(SEQIDNO:55)、hFrz7(SEQIDNO:56)、hFrz8(SEQIDNO:57)、hFrz9(SEQIDNO:58)、及hFrzlO(SEQIDNO:59);或選自下組的成熟sFRP多肽及其活性變體sFRPl(SEQIDNO:60)、sFRP2(SEQIDNO:61)、sFRP3(SEQIDNO:62)、sFRP4(SEQIDNO:63)、及sFRP5(SEQIDNO:64);或選自下組的成熟Ror多肽及其活性變體hRorl(SEQIDNO:65)及hRor2(SEQIDNO:66)。在更進一步的實施方案中，巻曲結(jié)構(gòu)域構(gòu)件包含選自下組的Frz多肽原(pro-Frzpolypeptide)及其活性變體hFrzl(SEQIDNO:35)、hFrz2(SEQIDNO:36)、hFrz3(SEQIDNO:37)、hFrz4(SEQIDNO:38)、hFrz5(SEQIDNO:39)、hFrz6(SEQIDNO:40)、hFrz7(SEQIDNO:41)、hFrz8(SEQIDNO:42)、hFrz9(SEQIDNO:43)、及hFrz10(SEQIDNO:44);或選自下組的sFRP多肽原(pro-sFRPpolypeptide)及其活性變體sFRPl(SEQIDNO:45)、sFRP2(SEQIDNO:46)、sFRP3(SEQIDNO:47)、sFRP4(SEQIDNO:48)、及sFRP5(SEQIDNO:49)。在一個實施方案中，Wnt拮抗劑包含自選自IgGl、IgG2、IgG3及IgG4的免疫球蛋白衍生的Fc構(gòu)件。在另一個實施方案中，F(xiàn)c衍生自IgGl免疫球蛋白。在又一個實施方案中，F(xiàn)c包含SEQIDNO:67或SEQIDNO:68所示的Fc序列。在一個實施方案中，Wnt拮抗劑進一步包含連接巻曲結(jié)構(gòu)域構(gòu)件與Fc結(jié)構(gòu)域的接頭。在一個這種實施方案，所述接頭是肽接頭，諸如ESGGGGVT(SEQIDNO:69)、LESGGGGVT(SEQIDNO:70)、GRAQVT(SEQIDNO:71)、WRAQVT(SEQIDNO:72)、及ARGRAQVT(SEQIDNO:73)。在具體的實施方案中，Wnt拮抗劑包含選自下組的多肽Frz8-Fc(SEQIDNO:74)、Frz5-Fc(SEQIDNO:75)、Frzl-Fc(SEQIDNO:76)、Frz2-Fc(SEQIDNO:77)、Frz3-Fc(SEQIDNO:78)、Frz4-Fc(SEQIDNO:79)、Frz6-Fc(SEQIDNO:80)、Frz7-Fc(SEQIDNO:81)、Frz9畫Fc(SEQIDNO:82)、FrzlO-Fc(SEQIDNO:83)、sFRPl-Fc(SEQIDNO:84)、sFRP2(SEQIDNO:85)、sFRP3-Fc(SEQIDNO:86)、sFRP4-Fc(SEQIDNO:87)、及sFRP5-Fc(SEQIDNO:88)。本發(fā)明的另一方面提供了一種組合物，其包含至少一種藥學(xué)可接受載體或賦形劑和如上所述的Wnt拮抗劑。本發(fā)明的又一方面提供了編碼任何上文所述Wnt拮抗劑的核酸序列。在一個實施方案中，編碼Wnt拮抗劑的核酸進一步包含含有與所述核酸可操作連接的控制序列的載體。在另一個實施方案中，所述載體包含在宿主細(xì)胞中，諸如哺乳動物、昆蟲、大腸桿菌或酵母細(xì)胞。本發(fā)明的另一方面提供了一種制品，其包含含有至少一種藥學(xué)可接受載體或賦形劑和如上所述的Wnt拮抗劑的組合物和容器；其中所述Wnt拮抗劑裝在所述容器內(nèi)，且所述容器進一步包含(a)附于所述容器的標(biāo)簽，或(b)所述容器里的包裝插頁，其提及所述Wnt拮抗劑的用途，指出所述組合物用于Wnt介導(dǎo)的病癥的治療性處理或診斷性;險測的用途。本發(fā)明的又一方面提供了一種抑制細(xì)胞中Wnt信號傳導(dǎo)的方法，其包括使所述細(xì)胞與有效量的包含巻曲結(jié)構(gòu)域構(gòu)件和Fc結(jié)構(gòu)域的Wnt拮抗劑接觸。Wnt拮抗劑的巻曲結(jié)構(gòu)域構(gòu)件包含自Frz蛋白、FRP蛋白或Ror蛋白衍生的多肽。在一個實施方案中，所述Wnt拮抗劑的活性在體內(nèi)持續(xù)至少l小時。在另一個實施方案中，所述Wnt拮抗劑的活性在體內(nèi)持續(xù)至少5小時。在另一個實施方案中，所述Wnt拮抗劑的體內(nèi)半衰期為至少l天。在又一個實施方案中，所述Wnt拮抗劑的體內(nèi)半衰期為至少2天。在這方面的進一步實施方案中，巻曲結(jié)構(gòu)域構(gòu)件包含來自選自下組的Frz多肽的最低限度CRD(ECD)結(jié)構(gòu)域及其活性變體hFrzl(SEQIDNO:18)、hFrz2(SEQIDNO:19)、hFrz3(SEQIDNO:20)、hFrz4(SEQIDNO:21)、hFrz5(SEQIDNO:22)、hFrz6(SEQIDNO:23)、hFrz7(SEQIDNO:24)、hFrz8(SEQIDNO:25)、hFrz9(SEQIDNO:26)、及hFrzlO(SEQIDNO:27)。在進一步的實施方案中，巻曲結(jié)構(gòu)域構(gòu)件包含來自選自下組的sFRP多肽的最低限度CRD(ECD)結(jié)構(gòu)域及其活性變體sFRPl(SEQIDNO:28)、sFRP2(SEQIDNO:29)、sFRP3(SEQIDNO:30)、sFRP4(SEQIDNO:31)、及sFRP5(SEQIDNO:32)。在進一步的實施方案中，巻曲結(jié)構(gòu)域構(gòu)件包含來自選自下組的Ror多肽的最低限度CRD(ECD)結(jié)構(gòu)域及其活性變體hRorl(SEQIDNO:33)及hRor2(SEQIDNO:34)。在進一步的實施方案中，巻曲結(jié)構(gòu)域構(gòu)件包含選自下組的成熟Frz多肽及其活性變體hFrzl(SEQIDNO:50)、hFrz2(SEQIDNO:51)、hFrz3(SEQIDNO:52)、hFrz4(SEQIDNO:53)、hFrz5(SEQIDNO:54)、hFrz6(SEQIDNO:55)、hFrz7(SEQIDNO:56)、hFrz8(SEQIDNO:57)、hFrz9(SEQIDNO:58)、及hFrzlO(SEQIDNO:59);或選自下組的成熟sFRP多肽及其活性變體sFRPl(SEQIDNO:60)、sFRP2(SEQIDNO:61)、sFRP3(SEQIDNO:62)、sFRP4(SEQIDNO:63)、及sFRP5(SEQIDNO:64);或選自下組的成熟Ror多肽及其活性變體hRorl(SEQIDNO:65)及hRor2(SEQIDNO:66)。在更進一步的實施方案中，巻曲結(jié)構(gòu)域構(gòu)件包含選自下組的Frz多肽原及其活性變體hFrzl(SEQIDNO:35)、hFrz2(SEQIDNO:36)、hFrz3(SEQIDNO:37)、hFrz4(SEQIDNO:38)、hFrz5(SEQIDNO:39)、hFrz6(SEQIDNO:40)、hFrz7(SEQIDNO:41)、hFrz8(SEQIDNO:42)、hFrz9(SEQIDNO:43)、及hFrzlO(SEQIDNO:44);或選自下組的sFRP多肽原及其活性變體sFRPl(SEQIDNO:45)、sFRP2(SEQIDNO:46)、sFRP3(SEQIDNO:47)、sFRP4(SEQIDNO:48)、及sFRP5(SEQIDNO:49)。12在一個實施方案中，Wnt拮抗劑包含自選自IgGl、IgG2、IgG3及IgG4的免疫球蛋白衍生的Fc構(gòu)件。在另一個實施方案中，F(xiàn)c衍生自IgGl免疫球蛋白。在又一個實施方案中，F(xiàn)c包含SEQIDNO:67或SEQIDNO:68所示的Fc序列。在一個實施方案中，Wnt拮抗劑進一步包含連接巻曲結(jié)構(gòu)域構(gòu)件與Fc結(jié)構(gòu)域的接頭。在一個實施方案，所述接頭是肽接頭，諸如ESGGGGVT(SEQIDNO:69)、LESGGGGVT(SEQIDNO:70)、GRAQVT(SEQIDNO:71)、WRAQVT(SEQIDNO:72)、及ARGRAQVT(SEQIDNO:73)。在具體的實施方案中，Wnt拮抗劑包含選自下組的多肽Frz8-Fc(SEQIDNO:74)、Frz5-Fc(SEQIDNO:75)、Frzl-Fc(SEQIDNO:76)、Frz2-Fc(SEQIDNO:77)、Frz3-Fc(SEQIDNO:78)、Frz4-Fc(SEQIDNO:79)、Frz6-Fc(SEQIDNO:80)、Frz7-Fc(SEQIDNO:81)、Frz9-Fc(SEQIDNO:82)、FrzlO-Fc(SEQIDNO:83)、sFRPl-Fc(SEQIDNO:84)、sFRP2(SEQIDNO:85)、sFRP3扁Fc(SEQIDNO:86)、sFRP4-Fc(SEQIDNO:87)、及sFRP5-Fc(SEQIDNO:88)。在這種方法的一個實施方案中，所述細(xì)胞包含在哺乳動物內(nèi)，且施用的量是治療有效量。在另一個實施方案中，所述Wnt信號傳導(dǎo)源自Wnt信號傳導(dǎo)成分經(jīng)由體細(xì)胞突變的激活。在另一個實施方案中，所述對Wnt信號傳導(dǎo)的抑制導(dǎo)致對細(xì)胞生長的抑制。在又一個實施方案中，所述細(xì)胞是癌細(xì)胞。本發(fā)明的另一方面提供了一種在患有Wnt介導(dǎo)的病癥的哺乳動物中治療所述病癥的方法，其包括給所述哺乳動物施用治療有效量的包含巻曲結(jié)構(gòu)域構(gòu)件和Fc結(jié)構(gòu)域的Wnt拮抗劑。所述Wnt拮抗劑的巻曲結(jié)構(gòu)域構(gòu)件包含自Frz蛋白、FRP蛋白、或Ror蛋白衍生的多肽。在一個實施方案中，所述Wnt拮抗劑的活性在體內(nèi)持續(xù)至少l小時。在另一個實施方案中，所述Wnt拮抗劑的活性在體內(nèi)持續(xù)至少5小時。在另一個實施方案中，所述Wnt拮抗劑的體內(nèi)半衰期為至少1天。在又一個實施方案中，所述Wnt拮抗劑的體內(nèi)半衰期為至少2天。在這方面的進一步實施方案中，巻曲結(jié)構(gòu)域構(gòu)件包含來自選自下組的Frz多肽的最低限度CRD(ECD)結(jié)構(gòu)域及其活性變體hFrzl(SEQIDNO:18)、hFrz2(SEQIDNO:19)、hFrz3(SEQIDNO:20)、hFrz4(SEQIDNO:21)、hFrz5(SEQIDNO:22)、hFrz6(SEQIDNO:23)、hFrz7(SEQIDNO:24)、hFrz8(SEQIDNO:25)、hFrz9(SEQIDNO:26)、及hFrzlO(SEQIDNO:27)。在進一步的實施方案中，巻曲結(jié)構(gòu)域構(gòu)件包含來自選自下組的sFRP多肽的最低限度CRD(ECD)結(jié)構(gòu)域及其活性變體sFRPl(SEQIDNO:28)、sFRP2(SEQIDNO:29)、sFRP3(SEQIDNO:30)、sFRP4(SEQIDNO:31)、及sFRP5(SEQIDNO:32)。在進一步的實施方案中，巻曲結(jié)構(gòu)域構(gòu)件包含來自選自下組的Ror多肽的最低限度CRD(ECD)結(jié)構(gòu)域及其活性變體hRorl(SEQIDNO:33)及hRor2(SEQIDNO:34)。在進一步的實施方案中，巻曲結(jié)構(gòu)域構(gòu)件包含選自下組的成熟Frz多肽及其活性變體hFrzl(SEQIDNO:50)、hFrz2(SEQIDNO:51)、hFrz3(SEQIDNO:52)、hFrz4(SEQIDNO:53)、hFrz5(SEQIDNO:54)、hFrz6(SEQIDNO:55)、hFrz7(SEQIDNO:56)、hFrz8(SEQIDNO:57)、hFrz9(SEQIDNO:58)、及hFrzlO(SEQIDNO:59);或選自下組的成熟sFRP多肽及其活性變體sFRPl(SEQIDNO:60)、sFRP2(SEQIDNO:61)、sFRP3(SEQIDNO:62)、sFRP4(SEQIDNO:63)、及sFRP5(SEQIDNO:64);或選自下組的成熟Ror多肽及其活性變體hRorl(SEQIDNO:65)及hRor2(SEQIDNO:66)。在更進一步的實施方案中，巻曲結(jié)構(gòu)域構(gòu)件包含選自下組的Frz多肽原及其活性變體hFrzl(SEQIDNO:35)、hFrz2(SEQIDNO:36)、hJFrz3(SEQIDNO:37)、hFrz4(SEQIDNO:38)、hFrz5(SEQIDNO:39)、hFrz6(SEQIDNO:40)、hFrz7(SEQIDNO:41)、hFrz8(SEQIDNO:42)、hFrz9(SEQIDNO:43)、及hFrzlO(SEQIDNO:4勺；或選自下組的sFRP多肽原及其活性變體sFRPl(SEQIDNO:45)、sFRP2(SEQIDNO:46)、sFRP3(SEQIDNO:47)、sFRP4(SEQIDNO:48)、及sFRP5(SEQIDNO:49)。在一個實施方案中，Wnt拮抗劑包含自選自IgGl、IgG2、IgG3及IgG4的免疫球蛋白衍生的Fc構(gòu)件。在另一個實施方案中，F(xiàn)c衍生自IgGl免疫球蛋白。在又一個實施方案中，F(xiàn)c包含SEQIDNO:67或SEQIDNO:68所示的Fc序列。在一個實施方案中，Wnt拮抗劑進一步包含連接巻曲結(jié)構(gòu)域構(gòu)件與Fc結(jié)構(gòu)域的接頭。在一個實施方案，所述接頭是肽接頭，諸如ESGGGGVT(SEQIDNO:69)、LESGGGGVT(SEQIDNO:70)、GRAQVT(SEQIDNO:71)、WRAQVT(SEQIDNO:72)、及ARGRAQVT(SEQIDNO:73)。在具體的實施方案中，Wnt拮抗劑包含選自下組的多肽FrzS-Fc(SEQIDNO:74)、Frz5-Fc(SEQIDNO:75)、Frzl-Fc(SEQIDNO:76)、Frz2-Fc(SEQIDNO:77)、Frz3-Fc(SEQIDNO:78)、Frz4-Fc(SEQIDNO:79)、Frz6-Fc(SEQIDNO:80)、Frz7-Fc(SEQIDNO:81)、Frz9-Fc(SEQIDNO:82)、FrzlO-Fc(SEQIDNO:83)、sFRPl-Fc(SEQIDNO:84)、sFRP2(SEQIDNO:85)、sFRP3-Fc(SEQIDNO:86)、sFRP4-Fc(SEQIDNO:87)、及sFRP5-Fc(SEQIDNO:88)。在這種方法的一個實施方案中，所述病癥是與異常Wnt信號傳導(dǎo)活性有關(guān)的細(xì)胞增殖性病癥。在另一個實施方案中，所述異常Wnt信號傳導(dǎo)活性源自Wnt蛋白表達(dá)升高。在又一個實施方案中，所述細(xì)胞增殖性病癥是癌癥，諸如結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、乳腺癌、白血病、神經(jīng)力交質(zhì)瘤、及髓母細(xì)胞瘤(medulloblastoma)。本發(fā)明的又一方面提供了一種用于檢測Wnt蛋白存在的方法，其包括使樣品與如上所述的Wnt拮抗劑接觸，其中復(fù)合物的存在，或所述Wnt拮抗劑和Wnt蛋白之間的結(jié)合水平指示W(wǎng)nt蛋白和/或信號傳導(dǎo)的存在。在一個實施方案中，所述方法進一步包括確定Wnt信號傳導(dǎo)水平是否異常，該方法進一步包括將所述樣品中的結(jié)合水平與已知具有生理學(xué)正常Wnt信號傳導(dǎo)的第二樣品中的水平進行比較。所述樣品中的結(jié)合水平高于或低于所述第二樣品中的結(jié)合水平指示異常的Wnt信號傳導(dǎo)。在又一個實施方案中，所述異常Wnt信號傳導(dǎo)進一步指示W(wǎng)nt介導(dǎo)的病癥(諸如癌癥)的存在。本發(fā)明的另一方面提供了一種在特征在于激活的或過量的Wnt信號傳導(dǎo)的細(xì)胞中調(diào)控Wnt靶基因表達(dá)的方法，其包括使所述細(xì)胞與有效量的上文所述Wnt拮抗劑4妻觸。本發(fā)明的又一方面提供了一種治療性處理Wnt介導(dǎo)的癌癥的方法，其包括施用治療有效量的包含巻曲結(jié)構(gòu)域構(gòu)件和Fc結(jié)構(gòu)域的Wnt拮抗劑。Wnt拮抗劑的巻曲結(jié)構(gòu)域構(gòu)件包含自Frz蛋白、FRP蛋白或Ror蛋白衍生的多肽。在一個實施方案中，所述Wnt拮抗劑的活性在體內(nèi)持續(xù)至少l小時。在另一個實施方案中，所述Wnt拮抗劑的活性在體內(nèi)持續(xù)至少5小時。在另一個實施方案中，所述Wnt拮抗劑的體內(nèi)半衰期為至少l天。在又一個實施方案中，所述Wnt拮抗劑的體內(nèi)半衰期為至少2天。在這方面的進一步實施方案中，巻曲結(jié)構(gòu)域構(gòu)件包含來自選自下組的Frz多肽的最低限度CRD(ECD)結(jié)構(gòu)域及其活性變體hFrzl(SEQIDNO:1518)、hFrz2(SEQIDNO:19)、hFrz3(SEQIDNO:20)、hFrz4(SEQIDNO:21)、hFrz5(SEQIDNO:22)、hFrz6(SEQIDNO:23)、hFrz7(SEQIDNO:24)、hFrz8(SEQIDNO:25)、hFrz9(SEQIDNO:26)、及hFrzlO(SEQIDNO:27)。在進一步的實施方案中，巻曲結(jié)構(gòu)域構(gòu)件包含來自選自下組的sFRP多肽的最低限度CRD(ECD)結(jié)構(gòu)域及其活性變體sFRPl(SEQIDNO:28)、sFRP2(SEQIDNO:29)、sFRP3(SEQIDNO:30)、sFRP4(SEQIDNO:31)、及sFRP5(SEQIDNO:32)。在進一步的實施方案中，巻曲結(jié)構(gòu)域構(gòu)件包含來自選自下組的Ror多肽的最低限度CRD(ECD)結(jié)構(gòu)域及其活性變體hRorl(SEQIDNO:33)及hRor2(SEQIDNO:34)。在進一步的實施方案中，巻曲結(jié)構(gòu)域構(gòu)件包含選自下組的成熟Frz多肽及其活性變體hFrzl(SEQIDNO:50)、hFrz2(SEQIDNO:51)、hFrz3(SEQIDNO:52)、hFrz4(SEQIDNO:53)、hFrz5(SEQIDNO:54)、hFrz6(SEQIDNO:55)、hFrz7(SEQIDNO:56)、hFrz8(SEQIDNO:57)、hFrz9(SEQIDNO:58)、及hFrzlO(SEQIDNO:59);或選自下組的成熟sFRP多肽及其活性變體sFRPl(SEQIDNO:60)、sFRP2(SEQIDNO:61)、sF鵬(SEQIDNO:62)、sFRP4(SEQIDNO:63)、及sFRP5(SEQIDNO:64);或選自下組的成熟Ror多肽及其活性變體hRorl(SEQIDNO:65)及hRor2(SEQIDNO:66)。在更進一步的實施方案中，巻曲結(jié)構(gòu)域構(gòu)件包含選自下組的Frz多肽原及其活性變體hFrzl(SEQIDNO:35)、hFrz2(SEQIDNO:36)、hFrz3(SEQIDNO:37)、hFrz4(SEQIDNO:38)、hFrz5(SEQIDNO:39)、hFrz6(SEQIDNO:40)、hFrz7(SEQIDNO:41)、hFrz8(SEQIDNO:42)、hFrz9(SEQIDNO:43)、及hFrzlO(SEQIDNO:44);或選自下組的sFRP多肽原及其活性變體sFRPl(SEQIDNO:45)、sFRP2(SEQIDNO:46)、sFRP3(SEQIDNO:47)、sFRP4(SEQIDNO:48)、及sFRP5(SEQIDNO:49)。在一個實施方案中，Wnt拮抗劑包含自選自IgGl、IgG2、IgG3及IgG4的免疫球蛋白衍生的Fc構(gòu)件。在另一個實施方案中，F(xiàn)c衍生自IgGl免疫球蛋白。在又一個實施方案中，F(xiàn)c包含SEQIDNO:67或SEQIDNO:68所示的Fc序列。在一個實施方案中，Wnt拮抗劑進一步包含連接巻曲結(jié)構(gòu)域構(gòu)件與Fc結(jié)構(gòu)域的接頭。在一個實施方案，所述接頭是肽接頭，諸如ESGGGGVT(SEQIDNO:69)、LESGGGGVT(SEQIDNO:70)、GRAQVT(SEQIDNO:71)、WRAQVT(SEQIDNO:72)、及ARGRAQVT(SEQIDNO:73)。在具體的實施方案中，Wnt拮抗劑包含選自下組的多肽Frz8-Fc(SEQIDNO:74)、Frz5-Fc(SEQIDNO:75)、Frzl-Fc(SEQIDNO:76)、Frz2-Fc(SEQIDNO:77)、Frz3-Fc(SEQIDNO:78)、Frz4-Fc(SEQIDNO:79)、Frz6-Fc(SEQIDNO:80)、Frz7-Fc(SEQIDNO:81)、Frz9隱Fc(SEQIDNO:82)、FrzlO-Fc(SEQIDNO:83)、sFRPl-Fc(SEQIDNO:84)、sFRP2(SEQIDNO:85)、sF鵬-Fc(SEQIDNO:86)、sFRP4-Fc(SEQIDNO:87)、及sFRP5陽Fc(SEQIDNO:88)。所述拮抗劑的施用阻滯所述癌癥任何隨后的大小增加或嚴(yán)重程度進展。在一個實施方案中，所述Wnt拮抗劑的施用導(dǎo)致癌癥大小或嚴(yán)重程度降低。在另一個實施方案中，所述Wnt拮抗劑的施用降低所述癌癥的腫瘤負(fù)荷。在又一個實施方案中，所述Wnt拮抗劑的施用殺死所述癌癥。本發(fā)明的另一方面提供了Wnt拮抗劑在制備用于治療細(xì)胞增殖性病癥的藥物中的用途。Wnt拮抗劑包含巻曲結(jié)構(gòu)域構(gòu)件和Fc結(jié)構(gòu)域。Wnt拮抗劑的巻曲結(jié)構(gòu)域構(gòu)件包含自Frz蛋白、FRP蛋白或Ror蛋白衍生的多肽。在一個實施方案中，所述Wnt拮抗劑的活性在體內(nèi)持續(xù)至少l小時。在另一個實施方案中，所述Wnt拮抗劑的活性在體內(nèi)持續(xù)至少5小時。在另一個實施方案中，所述Wnt拮抗劑的體內(nèi)半衰期為至少l天。在又一個實施方案中，所述Wnt拮抗劑的體內(nèi)半衰期為至少2天。在這方面的進一步實施方案中，巻曲結(jié)構(gòu)域構(gòu)件包含來自選自下組的Frz多肽的最低限度CRD(ECD)結(jié)構(gòu)域及其活性變體hFrzl(SEQIDNO:18)、hFrz2(SEQIDNO:19)、hFrz3(SEQIDNO:20)、hFrz4(SEQIDNO:21)、hFrz5(SEQIDNO:22)、hFrz6(SEQIDNO:23)、hFrz7(SEQIDNO:24)、hFrz8(SEQIDNO:25)、hFrz9(SEQIDNO:26)、及hFrzlO(SEQIDNO:27)。在進一步的實施方案中，巻曲結(jié)構(gòu)域構(gòu)件包含來自選自下組的sFRP多肽的最低卩艮度CRD(ECD)結(jié)構(gòu)域及其活性變體sFRPl(SEQIDNO:28)、sFRP2(SEQIDNO:29)、sFRP3(SEQIDNO:30)、sFRP4(SEQIDNO:31)、及sFRP5(SEQIDNO:32)。在進一步的實施方案中，巻曲結(jié)構(gòu)域構(gòu)件包含來自選自下組的Ror多肽的最低限度CRD(ECD)結(jié)構(gòu)域及其活性變體hRorl(SEQIDNO:33)及hRor2(SEQIDNO:34)。在進一步的實施方案中，巻曲結(jié)構(gòu)域構(gòu)件包含選自下組的成熟Frz多肽及其活性變體hFrzl(SEQIDNO:50)、hFrz2(SEQIDNO:51)、hFrz3(SEQIDNO:52)、hFrz4(SEQIDNO:53)、hFrz5(SEQIDNO:54)、hFrz6(SEQIDNO:55)、hFrz7(SEQIDNO:56)、hFrz8(SEQIDNO:57)、hFrz9(SEQIDNO:58)、及hFrzlO(SEQIDNO:59);或選自下組的成熟sFRP多肽及其活性變體sFRPl(SEQIDNO:60)、sFRP2(SEQIDNO:61)、sFRP3(SEQIDNO:62)、sFRP4(SEQIDNO:63)、及sFRP5(SEQIDNO:64);或選自下組的成熟Ror多肽及其活性變體hRorl(SEQIDNO:65)及hRor2(SEQIDNO:66)。在更進一步的實施方案中，巻曲結(jié)構(gòu)域構(gòu)件包含選自下組的Frz多肽原及其活性變體hFrzl(SEQIDNO:35)、hFrz2(SEQIDNO:36)、hFrz3(SEQIDNO:37)、hFrz4(SEQIDNO:38)、hFrz5(SEQIDNO:39)、hFrz6(SEQIDNO:40)、hFrz7(SEQIDNO:41)、hFrz8(SEQIDNO:42)、hFrz9(SEQIDNO:43)、及hFrzlO(SEQIDNO:44);或選自下組的sFRP多肽原及其活性變體sFRPl(SEQIDNO:45)、sFRP2(SEQIDNO:46)、sFRP3(SEQIDNO:47)、sFRP4(SEQIDNO:48)、及sFRP5(SEQIDNO:49)。在一個實施方案中，Wnt拮抗劑包含自選自IgGl、IgG2、IgG3及IgG4的免疫球蛋白衍生的Fc構(gòu)件。在另一個實施方案中，F(xiàn)c衍生自IgGl免疫球蛋白。在又一個實施方案中，F(xiàn)c包含SEQIDNO:67或SEQIDNO:68所示的Fc序列。在一個實施方案中，Wnt拮抗劑進一步包含連接巻曲結(jié)構(gòu)域構(gòu)件與Fc結(jié)構(gòu)域的接頭。在一個實施方案，所述接頭是肽接頭，諸如ESGGGGVT(SEQIDNO:69)、LESGGGGVT(SEQIDNO:70)、GRAQVT(SEQIDNO:71)、WRAQVT(SEQIDNO:72)、及ARGRAQVT(SEQIDNO:73)。在具體的實施方案中，Wnt拮抗劑包含選自下組的多肽Frz8-Fc(SEQIDNO:74)、Frz5-Fc(SEQIDNO:75)、Frzl-Fc(SEQIDNO:76)、Frz2-Fc(SEQIDNO:77)、Frz3-Fc(SEQIDNO:78)、Frz4陽Fc(SEQIDNO:79)、Frz6-Fc(SEQIDNO:80)、Frz7-Fc(SEQIDNO:81)、Frz9-Fc(SEQIDNO:82)、FrzlO-Fc(SEQIDNO:83)、sFRPl-Fc(SEQIDNO:84)、sFRP2(SEQIDNO:85)、sFRP3-Fc(SEQIDNO:86)、sFRP4-Fc(SEQIDNO:87)、及sFRP5-Fc(SEQIDNO:88)。在一個實施方案中，所述細(xì)胞增殖性病癥是癌癥，諸如結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、乳腺癌、白血病、神經(jīng)力交質(zhì)瘤、及髓母細(xì)胞瘤。18附圖簡述圖l是處于"關(guān)閉"或者無活性狀態(tài)以及"開啟"或活性狀態(tài)的規(guī)范Wnt信號傳導(dǎo)途徑的簡略概要。圖2的示意圖描繪了與人免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的Fc區(qū)域連接的巻曲胞外結(jié)構(gòu)域。圖3是17種已知的巻曲蛋白胞外結(jié)構(gòu)域的比對。圖3A顯示了10種巻曲蛋白原(SEQIDNO:35-44)和5種sFRP蛋白原(SEQIDNO:45-49)的胞外結(jié)構(gòu)域的比對，而圖3B顯示了IO種成熟巻曲蛋白(SEQIDNO:50-59)和5種成熟sFRP蛋白(SEQIDNO:60-64)的胞外結(jié)構(gòu)域以及2種成熟Ror蛋白(SEQIDNO:65-66)的胞外結(jié)構(gòu)域的比對。相似殘基以灰色框示，相同殘基以星號指示。相似殘基以酸性的、^喊性的、極性的和非極性的來分組。在圖3B中，在兩個劃上方框的帶箭頭線條之間指示最小限度CRD(ECD)結(jié)構(gòu)域(SEQIDNO:18-34)。圖4顯示了Frz(156)-Fc和Frz(173)-Fc嵌合構(gòu)建體的序列。圖4A顯示了較長的Frz(173)-Fc序列(SEQIDNO:113)。以粗體顯示的(即前24個N端氨基酸殘基)是前導(dǎo)信號序列。殘基25-27是丙氨酸殘基，其可能存在于成熟蛋白中或可能不存在于成熟蛋白中。以劃上方框的文本顯示的(即殘基157-173)是區(qū)分較長(Frzl73)嵌合構(gòu)建體與較短(Frzl56)嵌合構(gòu)建體的Frz8受體額外序列。接頭序列(即殘基174-182)是加下劃線的，而Fc結(jié)構(gòu)域序列以斜體顯示(即殘基l83-409)。圖4B顯示了較短的Frz(156)-Fc(SEQIDNO:74)。以粗體顯示的(即前24個N端氨基酸殘基)是前導(dǎo)信號序列。殘基25-27是丙氨酸殘基，其可能存在于成熟蛋白中或可能不存在于成熟蛋白中。接頭序列(即殘基157-164)是加下劃線的，而Fc結(jié)構(gòu)域序列以斜體顯示(即殘基165-391)。圖5A-5H顯示了編碼數(shù)種Wnt拮抗劑嵌合構(gòu)建體的核酸序列(Frzl-Fc(SEQIDNO:115)、Frz2-Fc(SEQIDNO:116)、Frz3-Fc(SEQIDNO:117)、Frz4-Fc(SEQIDNO:118)、Frz5-Fc(SEQIDNO:119)、Frz6-Fc(SEQIDNO:120)、Frz7-Fc(SEQIDNO:121)、Frz8-Fc(SEQIDNO:122)、Frz9扁Fc(SEQIDNO:123)、FrzlO-Fc(SEQIDNO:124)、sFRPl-Fc(SEQIDNO:125)、sFRP2-Fc(SEQIDNO:126)、sFRP3-Fc(SEQIDNO:127)、sFRP4-Fc(SEQIDNO:128)、及sFRP5-Fc(SEQIDNO:129》。圖6A-6E顯示了人Frz、sFRP、及Ror蛋白的全長氨基斷列。圖7(A、B、及C)顯示了數(shù)種Wnt拮抗劑嵌合構(gòu)建體的氨基酸序列(Frzl-Fc(SEQIDNO:76)、Frz2-Fc(SEQIDNO:77)、Frz3-Fc(SEQIDNO:78)、Frz4-Fc(SEQIDNO:79)、Frz5-Fc(SEQIDNO:75)、Frz6-Fc(SEQIDNO:80)、Frz7-Fc(SEQIDNO:81)、Frz8-Fc(SEQIDNO:74)、Frz9畫Fc(SEQIDNO:82)、FrzlO-Fc(SEQIDNO:83)、sFRPl-Fc(SEQIDNO:84)、sFRP2隱Fc(SEQIDNO:85)、sFRP3-Fc(SEQIDNO:86)、sFRP4-Fc(SEQIDNO:87)、及sFRP5-Fc(SEQIDNO:88))。Frzl-Fc(前28個N端氨基酸殘基)、Frz2-Fc(前31個N端氨基酸殘基)、Frz3-Fc(前31個N端氨基酸殘基)、Frz4-Fc(前31個N端氨基酸殘基)、Frz5-Fc(前31個N端氨基酸殘基)及sFRP3-Fc(前31個N端氨基酸殘基)的粗體文本指示非天然前導(dǎo)序列。接頭是加下劃線的，而接頭之后的Fc結(jié)構(gòu)域以斜體顯示。圖8顯示了巻曲胞外結(jié)構(gòu)域的比對，其中黑色顯示了在所有受體間(acrossallreceptors)的保守殘基，而灰色表示在同源組內(nèi)(acrossthehomologousgroupsyf呆守的殘基。圖9顯示了基于全長和胞外結(jié)構(gòu)域序列同一性兩者而分入各家族的巻曲蛋白。圖10描繪了從CHO細(xì)胞表達(dá)和純化的純化的巻曲蛋白-Fc融合蛋白的樣品。將樣品在非還原性SDS-PAGE凝膠上分離，并通過考馬斯染色成像。圖ll顯示了兩種不同的Frz8-Fc嵌合體Frz8(173)-Fc和Frz(156)-Fc的血清穩(wěn)定性比較。圖llA是人Fc的免疫印跡，其用于在經(jīng)嵌合物注射的無胸腺棵鼠的血清中檢測漸增時間點上存在的嵌合蛋白。圖11B顯示了嵌合蛋白的Wnt抑制活性，其通過以相對螢光素酶活性測量Y軸上所示的TOPglow活性而獲得。圖12是腫瘤體積隨時間的曲線圖，其源自使用Frz8(173)-Fc嵌合物的處理。圖13顯示了施用單劑Frz8-Fc后測得的所述蛋白質(zhì)的藥動學(xué)(PK)數(shù)據(jù)。圖13A是來自用Frz8-Fc處理的小鼠的純凈血清(neatsemm)的免疫印跡，其顯示了自20或5mg/kg1.V.或20mg/kg1.P兩者中在7天及之后的血清中的檢測。圖13B和13C是從藥動學(xué)研究中測定的Frz8-Fc血清水平的圖解匯總。圖13D是Frz8-Fc藥動學(xué)兩階段模型(biphasicmodel)的參數(shù)匯總表。圖14表明Frz8-ECD在連接至二聚Fc結(jié)構(gòu)域后阻斷Wnt3a信號傳導(dǎo)的能圖。圖14B的凝膠證實了分離的Frz8(156)CRD(ECD)的純度。顯示的是(a)未減小的(non-reduced)Frz8ECD(第l道);(b)分子量標(biāo)志物(第2道);及減小的(reduced)Frz8ECD(第3道)。圖15表明Wnt3a^JTrz8-Fc嵌合物的直接結(jié)合。圖15A的BIAcore傳感圖表明純化的可溶性Wnt3a對固定化Frz8-Fc的結(jié)合。圖15B是固定化Frz8-Fc對純化的可溶性Wnt3a的免疫沉淀。圖16表明數(shù)種Frz-Fc嵌合物對Wnt配體的直接結(jié)合，如使用OCTE丁tm系統(tǒng)所測量的。圖16A顯示了來自Wnt3a^j"Frzl-Frz10-Fc嵌合物的結(jié)合的數(shù)據(jù)，圖16B顯示了來自Wnt3a對sFRP-Fc嵌合物的結(jié)合的數(shù)據(jù)。圖16C顯示了來自Wnt5a對Frz1-Frz10-Fc嵌合物和sFRP-Fc嵌合物的結(jié)合的數(shù)據(jù)。圖17顯示了Wnt拮抗劑對經(jīng)TOPglow螢光素酶TCF報道質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染的Wnt刺激細(xì)胞的效應(yīng)。圖17A顯示了用Wnt3a刺激的細(xì)胞，而圖17B顯示了用Wnt-5a刺激的細(xì)胞。在才艮道分子外還用Frz4和Lrp5轉(zhuǎn)染有待用Wnt5a處理的細(xì)月包。用100ng/mlWnt3a或lug/mlWnt5a活化293(人腎)細(xì)胞。然后對細(xì)月包不進行處理，用對照Fc處理，或用PBS中的純化的Frz-Fc蛋白處理，并測定螢光素酶應(yīng)答。圖18顯示了在經(jīng)縈光素酶TCF報道質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的U20S(人骨肉瘤)細(xì)胞中Wnt拮抗劑對Wnt信號傳導(dǎo)的抑制。通過Wnt3a活化獲得細(xì)胞中的初始Wnt信號傳導(dǎo)。圖19顯示了Frz8-Fc對培養(yǎng)的畸胎瘤細(xì)胞和腫瘤異種移植物中Wnt-靶基因表達(dá)的效應(yīng)。圖19A顯示了Wnt-靶基因在經(jīng)Wnt3a和Frz8-Fc處理的PA-l細(xì)胞系中的表達(dá)。將從經(jīng)Wnt3a、Frz8-Fc、或?qū)φ誇c蛋白處理的PA-1細(xì)胞中分離的RNA進行微列陣分析，并將所示基因表達(dá)水平響應(yīng)外源添加的Wnt3a、Frz8-Fc、及對照Fc蛋白的變化繪圖。柱，來自三個孔的表達(dá)水平均值；工形線，標(biāo)準(zhǔn)誤差(S)。圖19B顯示了在來自給予PBS、CD4-Fc、或Frz8-Fc的小鼠的NTera-2胂瘤中的Wnt靶基因APCDDl、Gad-l、及Fzd5相對于PBS對照的相對表達(dá)。數(shù)據(jù)表示來自所示數(shù)目腫瘤的表達(dá)水平均值，并代表至少兩個一式兩份進行的獨立qRT-PCR實驗。還呈現(xiàn)了通過添加純化的Wnt3a至相應(yīng)的培養(yǎng)細(xì)胞對每種基因表達(dá)的調(diào)節(jié)。圖20顯示了圖19(實施例9)所示基因表達(dá)的實時定量PCR分析所使用的引物和探針的編號和序列。圖21的線性示意圖描繪了用于轉(zhuǎn)染以創(chuàng)建Wnt動物模型的載體構(gòu)建體。圖22顯示了Frz8-Fc通過腹膜內(nèi)(IP)劑量給藥對無胸腺棵鼠中MMTV-Wnt腫瘤移植物的功效。圖22A的曲線圖顯示了來自包含MMTV-Wnt-l腫瘤移植物的棵鼠的數(shù)據(jù)，所述棵鼠通過每周二次腹膜內(nèi)注射而施用PBS、CD4-Fc(10mg/kg/天)或Frz8-Fc(10mg/kg/天)。將腫瘤體積均值對時間繪圖，并通過X軸上的箭頭指示了處理日。圖22B是四個處理組中隨時間的腫瘤體積均值和腫瘤體積均值％變化的列表匯總。圖23顯示了Frz8-Fc通過靜脈內(nèi)(IV)劑量給藥對無胸腺棵鼠中MMTV-Wnt肺瘤移植物的功效。圖23A的曲線圖顯示了來自包含MMTV-Wnt-l腫瘤移植物的棵鼠的數(shù)據(jù)，所述凈果鼠通過每周三次靜脈內(nèi)注射而施用PBS、CD4-Fc(10mg/kg/天)或Frz8-Fc(10mg/kg/天)。將腫瘤體積均值對時間繪圖，并通過X軸上的箭頭指示了處理日。圖23B是四個處理組中隨時間的肺瘤體積均值和腫瘤體積均值％變化的列表匯總。圖24的條形圖顯示了自MMTVWnt腫瘤研究分離的血清中各種Wnt拮抗劑的TOPglow測定法中的Wnt信號傳導(dǎo)拮抗劑活性。依照處理、小鼠研究數(shù)目和稀釋度，X軸樣品出現(xiàn)在組A-E(圖24A)或A-F(圖24B)中。TOPGLOW基因報道測定法中的相對安光素酶活性顯示在Y軸上。用約40ng/ml純化的Wnt3a處理除NA(對照)外的所有樣品。所有其它蛋白質(zhì)對照以5嗎/ml存在于培養(yǎng)基中。圖24A顯示了從經(jīng)IP處理的小鼠中分離的血清的測試結(jié)果，而經(jīng)IV處理的'J、鼠的測試結(jié)果顯現(xiàn)在圖24B中。圖25顯示了所示畸胎癌細(xì)胞系中各種Wnt拮抗劑的TOPglow測定法中的Wnt信號傳導(dǎo)拮抗劑活性，其在沒有(圖25A)外源添加的Wnt3a時或存在(圖25B)外源添加的Wnt3a時測定。對于每種細(xì)月包系，活性表述成相對于沒有任何處理(NA)時觀察到的活性；其代表至少兩個獨立的實驗。從TOPglow測定法中測量各種癌細(xì)胞系的相對螢光素酶活性(Y軸)，其在存在Wnt抑制劑時或沒有Wnt抑制劑時測量。圖26顯示了Frz8(156)-Fc處理對無胸腺棵鼠中NTera2腫瘤異種移植物生長的抗胂瘤功效。圖26A是規(guī)程流程圖，而圖26B的曲線圖描繪了隨時間的腫瘤體積均值，其中處理日通過X軸上的箭頭指示。圖26C的條形圖描繪了研究的第20天處死該組中所有動物時的腫瘤重量均值。圖26D和26E分別是肺瘤體積均值和腫瘤體積均值。/。變化的列表匯總。圖27的條形圖顯示了自NTera2腫瘤研究中的各個動物分離的血清的Wnt信號傳導(dǎo)拮抗劑活性，正如TOPglow測定法所測定的。Y軸顯示了來自對照和Frz8-FcWnt拮抗劑的TOPglow測定法的相對螢光素酶活性(Y軸)。沒有向細(xì)胞添加額外的純化的Wnt或Wnt條件化培養(yǎng)基。圖28顯示了Frz8(156)-Fc處理對無胸腺棵鼠中PA-l腫瘤異種移植物生長的抗肺瘤功效。圖28A是規(guī)程流程圖，而圖28B的曲線圖描繪了隨時間的腫瘤體積均值。圖28C是處死時胂瘤重量均值的曲線圖。將腫瘤重量均值±SEM作為分組的函數(shù)繪圖。圖28D和28E分別是腫瘤體積均值和腫瘤體積均值。/。變化的列表匯總。圖29顯示了在用Frz8-Fc或Frz5-Fz處理的小鼠中的Wnt信號傳導(dǎo)抑制，正如TOPglow測定法所測定的。Y軸顯示了來自對照和Frz8-Fc和Frz5-FcWnt拮抗劑的TOPglow測定法的相對螢光素酶活性(Y軸)。圖30顯示了用Frz8-Fc和Frz5-Fz處理的肺瘤中降低的軸蛋白2表達(dá)，其中圖30A顯示了相對于GAPDH表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化的表達(dá)，而圖30B顯示了相對于rpl19表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化的表達(dá)。圖31顯示了(3-聯(lián)蛋白的免疫組織化學(xué)(IHC)染色的IHC顯微照片，并表明對再生組織(諸如腸和皮膚)的Frz8-Fc處理表現(xiàn)正常。圖31A顯示了經(jīng)PBS(A-1)、對照蛋白質(zhì)(A-2)、及Frz8-Fc(A-3)處理的小鼠的小腸中P-聯(lián)蛋白的IHC。圖31B顯示了經(jīng)PBS(B-l)、對照蛋白質(zhì)(B-2)、及Frz8-Fc(B-3)處理的小鼠的皮膚中(3-聯(lián)蛋白的IHC。圖32顯示了人乳腺癌中的活性Wnt信號傳導(dǎo)。圖32A顯示了在正常的(A-l)、低等級的(A-"和高等級的(A-:3)人乳腺腫瘤中的Wnt-l表達(dá)(如通過體外雜交所示的),其最初報道于Wong等，J.Pathol.196:145(2002)。圖32B顯示了乳腺癌患者中(3-聯(lián)蛋白的核(B-l)定位和胞質(zhì)(B-2)定位(如通過IHC所示的)。還顯示的是Kaplan-Meier存活曲線(B-3)，其顯示了與所示(3-聯(lián)蛋白表達(dá)樣式相關(guān)的患者存活概率。該數(shù)據(jù)最初報道于Lin等，P.N.A.S.(USA)97(8):4262-66(2000)。圖32C是Wnt-l表達(dá)的微列陣分析，其比較了來自沒有癌癥的患者的正常乳房與從患有her-2陰性浸潤性(導(dǎo))管癌的患者中分離的組織。發(fā)明詳述I.定義"Wnt蛋白，，是結(jié)合巻曲受體以激活Wnt信號傳導(dǎo)的Wnt信號傳導(dǎo)途徑成分配體。Wnt蛋白的具體例子包括至少19個成員，包括Wnt-l(RefSeq.:薩—005430)、Wnt畫2(RefSeq.:畫—003391)、Wnt隱2B(Wnt陽13)(RefS叫:畫—004185)、Wnt-3(ReS叫.NM—030753)、Wnt3a(RefSeq.:薩—033131)、Wnt-4(RefSeq.:畫—030761)、Wnt-5A(RefS叫.薩—003392)、Wnt畫5B(RefSeq.:NM—032642)、Wnt-6(RefSeq.:NM_006522)、Wnt隱7A(RefS叫.:麗—004625)、Wnt-7B(RefSeq.:NM—058238)、Wnt-8A(RefS叫.:畫—058244)、Wnt-8B(RefS叫濯—003393)、Wnt-9A(Wnt匿14)(RefSeq.:NM一003395)、Wnt-9B(Wnt-15)(RefSeq.:NM一003396)、Wnt-10A(RefSeq.:NM—025216)、Wnt-10B(RefSeq.:NM—003394)、Wnt-ll(RefSeq.:NM_004626)、Wnt-16(RefS叫.NM_016087))。雖然每個成員具有不同程度的序列同一性，但是每個都含有顯示高度保守間隔的23-24個保守半胱氨酸殘基。McMahon，AP等，TrendsGenet.8:236-242(1992);MillerJR.,GenomeBiol.3(1):3001.1-3001.15(2002)。為了本發(fā)明的目的，Wnt蛋白及其活性變體指結(jié)合巻曲ECD或此類FrzECD的CRD構(gòu)件的蛋白質(zhì)。"巻曲"(Frz)蛋白是一種Wnt信號傳導(dǎo)途徑成分且是7次跨膜受體，其能結(jié)合Wnt蛋白，并進一步與其它膜結(jié)合的Wnt信號傳導(dǎo)成分復(fù)合以將Wnt信號傳導(dǎo)傳遞至下游月包內(nèi)成分。Frz蛋白包4舌Frzl、Frz2、Frz3、Frz4、Frz5、Frz6、Frz7、Frz8、Frz9、及FrzlO。人全長Frz蛋白的例子是hFrzl(NP—003496)(SEQIDNO:1)、hFrz2(NP一001457)(SEQIDNO:2)、hFrz3(NP—059108)(SEQIDNO:3)、hFrz4(NP036325)(SEQIDNO:4)、hFrz5(NP—003459)(SEQIDNO:5)、hFrz6(NP—003497)(SEQIDNO:6)、hFrz7(NP—003498)(SEQIDNO:7)、hFrz8(NP—114072)(SEQIDNO:8)、hFrz9(NP—003499)(SEQIDNO:9)、及hFrzlO(NP009128)(SEQIDNO:10)(圖6A-6C)。"分泌型巻曲相關(guān)蛋白"(sFRP)是一種Wnt信號傳導(dǎo)途徑成分且是能結(jié)合Wnt蛋白的分泌型胞外多肽。sFRP蛋白包括sFRPl、sFRP2、sFRP3、sFRP4、及sFRP5。人全長sFRP蛋白的例子是sFRPl(NP—003003)(SEQIDNO:11)、sFRP2(NP—003004)(SEQIDNO:12)、sFRP3(NP001454)(SEQIDNO:13)、sFRP4(NP—003005)(SEQIDNO:14)、及sFRP5(NP—003006)(SEQIDNO:15)(圖6C-6D)。"Ror"蛋白包括哺乳動物同系物，即Rorl和Ror2,其特征在于胞外巻曲蛋白樣富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域(CRD)以及近膜三環(huán)域。Ror蛋白在發(fā)育形態(tài)發(fā)生中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，并與細(xì)胞骨架的不同成分有關(guān)。Rorl與F-肌動蛋白沿著應(yīng)力纖維共定位(co-localize)，而Ror2與微管部分共定位。Rorl和Ror2共享約5S。/。的總體序列同一性。Roi^與黑素瘤相關(guān)抗原(MAGE)家族蛋白質(zhì)Dlxin-l結(jié)合(associate),并調(diào)節(jié)其胞內(nèi)分布。Rorl蛋白包括Rorl和Ror2。人全長Ror蛋白的例子是hRorl(NP—005003)(SEQIDNO:16)及hRor2(NP一004551)(SEQIDNO:17)(圖6D陽6E)。"Frz結(jié)構(gòu)域構(gòu)件"指能夠與Wnt蛋白結(jié)合的自Frz蛋白、sFRP蛋白、Ror蛋白、或其它蛋白質(zhì)衍生的多肽。"衍生自"某蛋白質(zhì)或"自"某蛋白質(zhì)"衍生，，的多肽指具有可以在參照蛋白質(zhì)序列內(nèi)或在蛋白質(zhì)活性變體的序列內(nèi)找到的氨基酸序列的多肽。Frz結(jié)構(gòu)域構(gòu)件的例子包括Frz蛋白、sFRP蛋白、Ror蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域"CRD(ECD)"(諸如Frzl、Frz2、Frz3、Frz4、Frz5、Frz6、Frz7、Frz8、Frz9、Frz10、sFRPl、sFRP2、sFRP3、sFRP4、sFRP5、Rorl、或Roi^的CRD(ECD))的最低限度富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域(CRD)及其活性變體。CRD(ECD)是100至250個氨基酸的保守結(jié)構(gòu)基序，并通過10個高度保守的半胱氨酸定義。人CRD(ECD)的具體例子以劃上方框的文本顯示在圖3B中，并表示為SEQIDNO:hFrzl(SEQIDNO:18)、hFrz2(SEQIDNO:19)、hFrz3(SEQIDNO:20)、hFrz4(SEQIDNO:21)、hFrz5(SEQIDNO:22)、hFrz6(SEQIDNO:23)、hFrz7(SEQIDNO:24)、hFrz8(SEQIDNO:25)、hFrz9(SEQIDNO:26)、hFrzl0(SEQIDNO:27)、sFRPl(SEQIDNO:28)、sFRP2(SEQIDNO:29)、sFRP3(SEQIDNO:30)、sFRP4(SEQIDNO:31)、sFRP5(SEQIDNO:32)、hRorl(SEQIDNO:33)、及hRor2(SEQIDNO:34)。Frz結(jié)構(gòu)域構(gòu)件的別的例子包括自Frz或sFRP蛋白原(諸如Frzl、Frz2、Frz3、Frz4、Frz5、Frz6、Frz7、Frz8、Frz9、Frz10、sFRPl、sFRP2、sFRP3、sFRP4、或sFRP5)衍生的Frz結(jié)構(gòu)域原(pro-Frzdomain)及其活性變體。人Frz結(jié)構(gòu)域原的具體例子顯示于圖3A中，并表示為SEQIDNO:hFrzl(SEQIDNO:35)、hFrz2(SEQIDNO:36)、hFrz3(SEQIDNO:37)、hFrz4(SEQIDNO:38)、hFrz5(SEQIDNO:39)、hFrz6(SEQIDNO:40)、hFrz7(SEQIDNO:41)、hFrz8(SEQIDNO:42)、hFrz9(SEQIDNO:43)、hFrz10(SEQIDNO:44)、sFRPl(SEQIDNO:45)、sFRP2(SEQIDNO:46)、sFRP3(SEQIDNO:47)、sFRP4(SEQIDNO:48)、及sFRP5(SEQIDNO:49)。Frz結(jié)構(gòu)域構(gòu)件的別的例子包括自成熟Frz、sFRP、或Ror蛋白(諸如Frzl、Frz2、Frz3、Frz4、Frz5、Frz6、Frz7、Frz8、Frz9、Frz10、sFRPl、sFRP2、sFRP3、sFRP4、sFRP5、Rorl、或Ror2)書f生的成熟Frz結(jié)構(gòu)域及其活性變體。人成熟Frz結(jié)構(gòu)域的具體例子顯示在圖3B中，并表示為SEQIDNO:hFrzl(SEQIDNO:50)、hFrz2(SEQIDNO:51)、hFrz3(SEQIDNO:52)、hFrz4(SEQIDNO:53)、hFrz5(SEQIDNO:54)、hFrz6(SEQIDNO:55)、hFrz7(SEQIDNO:56)、hFrz8(SEQIDNO:57)、hFrz9(SEQIDNO:58)、hFrz10(SEQIDNO:59)、sFRPl(SEQIDNO:60)、sFRP2(SEQIDNO:61)、sFRP3(SEQIDNO:62)、sFRP4(SEQIDNO:63)、sFRP5(SEQIDNO:64)、hRorl(SEQIDNO:65)、及hRor2(SEQIDNO:66)。"Wnt拮抗劑"是包含F(xiàn)rz結(jié)構(gòu)域構(gòu)件和免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域的嵌合多肽，其能結(jié)合Wnt蛋白，且有減弱細(xì)胞Wnt信號傳導(dǎo)或由此引起的生理學(xué)癥狀的活性。在某些實施方案中，F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域是人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4Fc結(jié)構(gòu)域。在一個實施方案中，F(xiàn)c結(jié)構(gòu)域是人IgGlFc結(jié)構(gòu)域。Fc結(jié)構(gòu)域的具體例子顯示在圖4、5和圖7及SEQIDNO:67和SEQIDNO:68中。在有些實施方案中，F(xiàn)rz結(jié)構(gòu)域構(gòu)件和Fc結(jié)構(gòu)域是通過接頭融合的。術(shù)語"接頭"指將Frz結(jié)構(gòu)域構(gòu)件與Fc結(jié)構(gòu)域拴在一起的構(gòu)件。適于在本發(fā)明中使用的接頭對Wnt拮抗劑分子的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的表達(dá)、分泌和折疊展現(xiàn)最低限度干擾或沒有干擾，并給Fc結(jié)構(gòu)域的效應(yīng)器功能或Frz結(jié)構(gòu)域的Wnt蛋白相互作用功能(例如結(jié)合至Wnt蛋白)提供最低限度干擾或沒有干擾，所述干擾是不通過立體的或其它的手段實現(xiàn)的。在具體的實施方案中，接頭是短肽序列。接頭序列還可以包括活性所需的最低限度殘基外的來自Frz結(jié)構(gòu)域構(gòu)件或Fc結(jié)構(gòu)域的別的氨基酸殘基。優(yōu)選的接頭還會提供優(yōu)秀的血清穩(wěn)定性，并對蛋白酶切割有抗性。有用的接頭的具體例子顯示在圖4、圖5、及圖7中，包括序列ESGGGGVT(SEQIDNO:69)、LESGGGGVT(SEQIDNO:70)、GRAQVT(SEQIDNO:71)、WRAQVT(SEQIDNO:72)、及ARGRAQVT(SEQIDNO:73)。如上文所述，這些接頭可以包括活性所需的最低限度殘基外的來自Frz結(jié)構(gòu)域構(gòu)件或Fc結(jié)構(gòu)域的別的氨基酸殘基。這些接頭還可以包含除來自Frz結(jié)構(gòu)域構(gòu)件或Fc結(jié)構(gòu)域構(gòu)件的那些之外的別的氨基酸殘基。"Wnt信號傳導(dǎo)途徑成分"指轉(zhuǎn)導(dǎo)源自Wnt蛋白和Frz受體之間相互作用的信號的成分。因為Wnt信號傳導(dǎo)途徑是復(fù)雜的，并牽涉廣泛的反饋調(diào)節(jié)，因此Wnt信號傳導(dǎo)途徑有很多的且可能尚未發(fā)現(xiàn)的成員。Wnt信號傳導(dǎo)途徑成分的例子包括膜結(jié)合蛋白LRP5和LRP6、軸蛋白、和散亂蛋白(Dishevelled)、胞外Wnt相互作用性蛋白sFRP、WIF-1、LRP滅活蛋白Dkk和Krn、胞質(zhì)蛋白(3-聯(lián)蛋白、(3-聯(lián)蛋白"降解復(fù)合物"APC的成員、GSK3卩、CKIa和PP2A、核運輸?shù)鞍譇PC、pygopus和bcl9/無腿(legless)、及轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF、Groucho和各種組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶諸如CBP/p300和Brg-1。"Wnt介導(dǎo)的病癥"指特征在于異常Wnt信號傳導(dǎo)的病癥、疾患、或疾病狀態(tài)。在具體的方面，異常Wnt信號傳導(dǎo)指懷疑患病的細(xì)胞或組織中的Wnt信號傳導(dǎo)水平超過類似的未患病的細(xì)胞或組織中的Wnt信號傳導(dǎo)水平。在具體的方面，Wnt介導(dǎo)的病癥包括癌癥。術(shù)語"癌癥"指哺乳動物中特征通常在于不受調(diào)節(jié)的細(xì)胞生長/增殖的生理疾患。癌癥的例子包括但不限于癌瘤(carcinoma)、淋巴瘤、母細(xì)胞瘤、和白血病。癌癥的更具體例子包括但不限于慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)、肺癌(包括非小細(xì)胞肺癌(NSCLC))、乳腺癌、印巢癌、宮頸癌、子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌、結(jié)腸直腸癌、腸的類癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、肝癌(肝細(xì)胞癌)、肝母細(xì)胞瘤、食管癌、肺的腺癌、間皮瘤、滑膜肉瘤、骨肉瘤、頭頸鱗狀細(xì)胞癌、青少年鼻咽血管纖維瘤、脂肪肉瘤、曱狀腺癌、黑素瘤、基細(xì)胞癌(BCC)、髓母細(xì)胞瘤及硬纖維瘤(desmoid)。術(shù)語"控制序列"指在特定宿主生物體中表達(dá)可操作連接的編碼序列所必需的DNA序列。適用于例如原核生物的控制序列包括啟動子、任選的操縱基因序列、及核糖體結(jié)合位點。已知真核細(xì)胞利用啟動子、多腺苷酸化信號、及增強子。若一段核酸與另一段核酸序列處于功能性相互關(guān)系中，則它是"可操作連4妄的"。例長口，若前序歹'J(presequence)或分;必前導(dǎo)(secretoryleader)的DNA表達(dá)成參與多肽分泌的前蛋白質(zhì)(preprotein),則它與該多肽的DNA可操作連接；若啟動子或增強子影響編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則它與該序列可操作連接；或者，若核糖體結(jié)合位點的定位促進翻譯，則它與編碼序列可操作連接。一般而言，"可操作連接的，，意味著相連的DNA序列是相鄰的，而且在分泌前導(dǎo)的情況中意味著相鄰且處于閱讀狀態(tài)。然而，增強子不必相鄰。連接可以通過在方便的限制性位點處的連接來實現(xiàn)。若沒有此類位點，則依照常規(guī)實踐使用合成的寡核苷酸銜接頭或接頭。"活性"多肽、變體多肽、或其片段保留活性多肽的天然或自然存在成分的生物學(xué)活性。生物學(xué)活性指由活性多肽的天然或自然存在對應(yīng)物介導(dǎo)的功能。例如，結(jié)合或蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用構(gòu)成生物學(xué)活性。在一種具體的意義中，活性Wnt信號傳導(dǎo)途徑成分可以是通過與其它Wnt信號傳導(dǎo)途徑成分相互作用而有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)信號的成分。在另一種具體的意義中，活性Wnt拮抗劑是相對于施用Wnt拮抗劑之前的水平，可檢測地減弱Wnt信號傳導(dǎo)或由此引起的生理學(xué)疾患的成分。雜交反應(yīng)的"嚴(yán)格性，，可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員容易的確定，而且通常根據(jù)探針長度、洗滌溫度和鹽濃度憑經(jīng)驗計算。一般而言，較長的探針要求較高的溫度以正確退火，而較短的探針需要較低的溫度。雜交通常依賴于當(dāng)互補鏈存在于低于其解鏈溫度的環(huán)境中時變性DNA重新退火的能力。探針和可雜交序列之間的期望同源性程度越高，可使用的相對溫度也越高。結(jié)果是，推斷出較高相對溫度將趨向于使反應(yīng)條件更為嚴(yán)格，而較低溫度也就較不嚴(yán)格。關(guān)于雜交反應(yīng)嚴(yán)格性的其它細(xì)節(jié)和解釋，參見Ausubd等，CurrentProtocolsinMolecularBiology，WileyIntersciencePublishers，1995。"高嚴(yán)格性條件"，如本文中所定義的，可以如下鑒定(l)采用低離子強度和高溫進行清洗，例如0.015M氯化鈉/0.0015M檸檬酸鈉/0.1%十二烷基硫酸鈉，于50。C;(2)在雜交過程中采用變性劑，諸如曱酰胺，例如50。/。(v/v)曱酰胺及0.1%牛血清清蛋白/0.1%Ficoll/0.1%聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸鈉緩沖液pH6.5及750mM氯化鈉，75mM檸檬酸鈉，于42。C;或(3)在如下溶液中于42。C過夜雜交，所述溶液采用50%曱酰胺，5xSSC(0,75MNaCl，0.075M檸4蒙酸鈉)，50mM磷酸鈉(pH6.8),0.1%焦石粦酸鈉，5xDenhardt氏溶液，超聲處理的鮭魚精DNA(50嗎/ml),0.1%SDS,和10%硫酸右旋糖苷，及于42。C在0.2xSSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)中清洗10分鐘，接著于55。C在含EDTA的0.1xSSC中高嚴(yán)格性清洗10分鐘。"中等嚴(yán)格條件"可以如Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual,NewYork,ColdSpringHarborPress,1989中所述鑒定，包括使用比上文所述較不嚴(yán)格的清洗溶液和雜交條件(例如溫度、離子強度和％SDS)。中等嚴(yán)格條件的一個例子是于37。C在含20。/。曱酰胺，5xSSC(150mMNaCl,15mM檸檬酸三鈉)，50mM磷酸鈉(pH7.6),5xDenhardt氏溶液，10%硫酸右旋糖苷，和20mg/ml變性剪切的鮭魚精DNA的溶液中溫育過夜，接著于約37-50。C在lxSSC中清洗濾膜。技術(shù)人員將認(rèn)識到如何在必要時調(diào)整溫度、離子強度等以適應(yīng)諸如探針長度等因素。術(shù)語"加表位標(biāo)簽的，，指與"標(biāo)簽多肽，，融合的多肽。標(biāo)簽多肽具有足夠殘基以提供表位而可制備針對其的抗體，但又足夠短使得其不干擾與其融合的多肽的活性。標(biāo)簽多肽優(yōu)選還是相當(dāng)獨特的，使得其抗體基本上不與其它表位發(fā)生交叉反應(yīng)。合適的標(biāo)簽多肽通常具有至少6個氨基酸殘基，通常在約8個和約50個氨基酸殘基之間(優(yōu)選在約10個和約20個氨基酸殘基之間)。范例表位標(biāo)簽序列包括HA、GD、c-myc、多His及FLAG。"治療"或"處理"或"緩和"指治療性處理及預(yù)防性或防范性措施二者，其中目標(biāo)是預(yù)防或減緩(減輕)所靶向的生理學(xué)疾病或病患或病癥。需要治療的受試者包括早就患有病癥的受試者以及傾向于患上病癥的受試者或要預(yù)防(prevent或prophylaxis)病癥的受試者。在Wnt介導(dǎo)的病癥是癌癥時，若在依照本發(fā)明的方法接受治療量的Wnt拮抗劑后，患者在如下一項或多項中顯示出可觀察和/或可測量的降低或消失，則受試者或哺乳動物被成功"治療"或顯示降低的腫瘤負(fù)荷癌細(xì)胞數(shù)減少或癌細(xì)胞消失；肺瘤大小的降低；癌細(xì)胞浸潤到周圍器官中，包括癌傳播到軟組織和骨中受到抑制(即一定程度的減緩，優(yōu)選停止)；腫瘤轉(zhuǎn)移受到抑制(即一定程度的減緩，優(yōu)選停止)；肺瘤生長受到一定程度的抑制；和/或與特定癌癥有關(guān)的一種或多種癥狀得到一定程度的減輕；發(fā)病率和死亡率降低，及生命質(zhì)量提高。就Wnt拮抗劑可預(yù)防癌細(xì)胞生長和/或殺死現(xiàn)有癌細(xì)胞的程度而言，它可以是抑制細(xì)胞的和/或毒害細(xì)胞的。這些征候或癥狀的減輕還可以由患者感受到。用于在病癥中評估成功治療和改善的上述參數(shù)是通過內(nèi)科醫(yī)師所熟悉的常規(guī)規(guī)程可容易測量的。對于癌癥療法，功效可以通過例如評估病情進展前時間(TDP)和/或測定應(yīng)答率(RR)來測量?？梢匀缦聹y定轉(zhuǎn)移，即通過分期(staging)測試和通過骨掃描和針對鍋水平及其它酶的測試以測定對骨的擴散。還可以進行CT掃描以在該區(qū)域中找尋對骨盆和淋巴結(jié)的擴散。使用胸部X射線和通過已知方法進行的肝臟酶水平測量來分別找尋對肺和肝的轉(zhuǎn)移。用于監(jiān)測疾病的其它路徑包括經(jīng)直腸超聲檢查法(TRUS)和經(jīng)直腸針吸活組織檢查(TRNB)。"長期"施用指以與短期(acute)模式相反的連續(xù)模式施用藥劑，從而將初始治療效果(活性)維持較長的一段時間。"間歇"施用指循環(huán)性的或受到周期性中斷的處理，與連續(xù)的(continuous或consecutive)形成對比。"哺乳動物"指歸入哺乳類的任何哺乳動物，包括人，家畜和牲畜，及動物園、運動或?qū)櫸飫游铮T如犬、貓、牛、馬、綿羊、豬、山羊、家兔等。優(yōu)選的是，哺乳動物指人。"聯(lián)合，，一種或多種其它治療劑的施用包括同時(共同)施用和任意次序的序貫施用。"載體，，在用于本文時包括藥學(xué)可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑，它們在所采用的劑量和濃度對暴露于其的細(xì)胞或哺乳動物是無毒的。通常，生理學(xué)可接受的載體是pH緩沖水溶液。生理學(xué)可接受載體的例子包括緩沖劑，諸如磷酸鹽、杵檬酸鹽和其它有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量(少于約10個殘基)多肽；蛋白質(zhì)，諸如血清清蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA;糖醇，諸如甘露醇或山梨醇；成鹽反荷離子，諸如鈉；和/或非離子表面活性劑，諸如TWEEN⑧、聚乙二醇(PEG)和PLURONICS。Wnt拮抗劑的"有效量"指足以實現(xiàn)明確規(guī)定的目的的量。"有效量"可憑經(jīng)驗且以常規(guī)方式，聯(lián)系規(guī)定的目的來確定。術(shù)語"治療有效量"指Wnt拮抗劑有效"治療"受試者或哺乳動物中Wnt介導(dǎo)的病癥的量。在癌癥的情況中，藥物的治療有效量可減少癌細(xì)胞數(shù)目；縮小腫瘤體積；抑制(即一定程度的減緩，優(yōu)選停止)癌細(xì)胞浸潤到周圍器官中；抑制(即一定程度的減緩，優(yōu)選停止)腫瘤轉(zhuǎn)移；一定程度地抑制腫瘤生長；和/或一定程度地減輕與癌癥有關(guān)的一種或多種癥狀。參見本文中"治療"的定義。就藥物可預(yù)防癌細(xì)胞生長和/或殺死現(xiàn)有癌細(xì)胞的程度而言，它可以是抑制細(xì)胞的和/或毒害細(xì)胞的。Wnt拮抗劑的"生長抑制量"指能夠在體外或在體內(nèi)抑制細(xì)胞，尤其是肺瘤，例如癌細(xì)胞生長的量。Wnt拮抗劑為了抑制贅生性(neoplastic)細(xì)胞生長的"生長抑制量，，可憑經(jīng)驗且以常規(guī)方式來確定。Wnt拮抗劑的"細(xì)胞毒性量，，指能夠在體外或在體內(nèi)引起細(xì)胞，尤其是肺瘤，例如癌細(xì)胞破壞的量。Wnt拮抗劑為了抑制贅生性細(xì)胞生長的"細(xì)胞毒性量，，可憑經(jīng)驗且以常規(guī)方式來確定。術(shù)語"抗體"和"免疫球蛋白"可互換且以最廣義使用，包括單克隆抗體(例如全長的或完整的單克隆抗體)、多克隆抗體、多^N元體、多特異性抗體(例如展現(xiàn)出想要的生物學(xué)活性的雙特異性抗體)，而且還可以包括某些抗體片段，正如本文更詳細(xì)描述的?？贵w可以是嵌合的、人的、人源化的或親和力成熟的。根據(jù)其恒定域氨基酸序列，來自任何脊推動物物種的輕鏈可歸入兩種截然不同類型中的一種，稱作卡巾自(K)和拉姆達(dá)(人)。根據(jù)其重鏈恒定域(CH)氨基酸序列，免疫球蛋白可歸入不同的類或同種型。免疫球蛋白有五類IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，它們分別具有稱為a、S、e、Y和P的重鏈。Y和a類根據(jù)CH序列和功能中相對微小的差異而進一步分為亞類，例如人表達(dá)如下亞類IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。不同類的免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)造是眾所周知的，并一般性地記載于例如Abbas等，CellularandMolecularBiology,第4版(2000)?？贵w可以是通過抗體與一個或多個其它蛋白質(zhì)或多肽的共價或非共價結(jié)合而形成的較大融合分子的一部分。"抗體片段"包含完整抗體的一部分，優(yōu)選完整抗體的抗原結(jié)合或可變區(qū)。抗體片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段；雙抗體；線性抗體(美國專利5,641,870);Zapata等，ProteinEng.8(10):1057-1062(1995);單鏈抗體分子；及由抗體片段形成的多特異性抗體。木瓜蛋白酶消化抗體生成兩個相同的抗原結(jié)合片段(稱為"Fab"片段)，及剩余的"Fc"片段(其名稱反映易于結(jié)晶的能力)。Fab片段由一條完整輕鏈以及一條重鏈的重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域(VH)及第一恒定域(CHl)組成。每個Fab片段關(guān)于抗原結(jié)合是單價的，即其具有單個抗原結(jié)合位點?？贵w的胃蛋白酶處理產(chǎn)生了單個大的F(ab，)2片段，其大致對應(yīng)于經(jīng)二硫化物連接的、具有二價抗原結(jié)合活性的兩個Fab片段，并仍能夠交聯(lián)抗原。Fab，片段與Fab片段的不同之處在于其在CHl結(jié)構(gòu)域的羧基末端具有額外的幾個殘基，包括一個或多個來自抗體鉸鏈區(qū)的半胱氨酸。Fab'-SH是本文中對其中恒定域半胱氨酸殘基攜帶游離硫醇基的Fab'的稱謂。F(ab')2抗體片段最初是作為在Fab'片段之間有鉸鏈半胱氨酸的成對Fab'片段生成的。還知道抗體片段的其它化學(xué)偶聯(lián)。Fc片段包含通過二硫鍵保持在一起的兩條重鏈的羧基端部分?？贵w的效應(yīng)器功能是由Fc區(qū)中的序列決定的，該區(qū)還是受到在某些類型的細(xì)胞上找到的Fc受體(FcR)識別的部分。"Fv"是包含完整抗原識別和結(jié)合位點的最小抗體片段。此區(qū)由緊密、非共價結(jié)合的一個重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域和一個輕鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域的二聚體組成。術(shù)語"單克隆抗體"在用于本文時指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即構(gòu)成群體的各個抗體相同，除了可能以極小量存在的可能的天然存在突變外。單克隆抗體是高度特異性的，針對單個抗原。與典型的包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制備物不同，每種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。明確包括在單克隆抗體定義內(nèi)的術(shù)語"嵌合"抗體指這樣的抗體，其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，以及此類抗體的片段，只要它們展現(xiàn)期望生物學(xué)活性(美國專利4,816，567;Morrison等，P.N.A.S.USA81:6851-6855(1984))。非人(例如嚙齒類)抗體的"人源化，，形式是包含自非人抗體衍生的最低限度序列的嵌合抗體。在極大程度上，人源化抗體是這樣的人免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自受體高變區(qū)的殘基為具有期望抗體特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠、家兔或非人靈長類的高變區(qū)的殘基所替換。在有些情況中，人免疫球蛋白的框架區(qū)(FR)殘基為相應(yīng)的非人殘基所替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中都未找到的殘基。進行這些修飾以進一步改善抗體性能。一般而言，人源化抗體將包含至少一個，通常兩個基本上整個如下可變域，其中所有或基本上所有高變環(huán)對應(yīng)于非人免疫球蛋白的那些，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗體任選地還會包含免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的。更多細(xì)節(jié)參見Jones等，Nature321:522-525(1986);Riechmann等，Nature332:323-329(1988);及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。還可參見Vaswani和Hamilton,Ann.Allergy,Asthma&Immunol.1:105-115(1998);Harris,Biochem.Soc.Trans.23:1035-1038(1995);Hurle和Gross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994)。"多核香酸"或"核酸"在本文中可互換使用，指任何長度的核苷酸聚合物，包括但不限于DNA和RNA。核苷酸可以是脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經(jīng)修飾的核普酸或堿基、和/或其類似物，或者是可通過DNA或RNA聚合酶或者通過合成反應(yīng)摻入聚合物中的任何底物。多核香酸可包含經(jīng)修飾的核苷酸，諸如曱基化核苷酸及其類似物。如果有的話，對核苷酸結(jié)構(gòu)的修飾可以在裝配聚合物之前或之后引入。核芬酸序列可以由非核苦酸成分中斷。多核苷酸可以在合成后進一步修飾，諸如通過與標(biāo)記物偶聯(lián)。其它類型的修飾包括例如"帽"，將一個或多個天然存在的核苷酸用類似物替代，核苦酸間修飾諸如例如不帶電荷連接(例如膦酸曱酯、磷酸三酯、磷酰胺酯(phosphoamidate)、氨基曱酸酯等)；帶電荷連接(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)，懸垂模塊(pendantmoiety)，諸如例如蛋白質(zhì)(例如核酸酶、毒素、抗體、信號肽、多L-賴氨酸等)、嵌入劑(例如吖啶、補骨脂素等)、螯合劑(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等)、烷化劑、經(jīng)修飾的連接(例如a端基異構(gòu)核酸(anomericnucleicacid)等)。另外，通常存在于糖類中的任何羥基可以用例如膦酸(phosphonate)基團、磷酸(phosphate)基團替換，用標(biāo)準(zhǔn)保護基團保護，或活化以制備與另外的核苷酸的另外的連接，或者可偶聯(lián)至固相或半固相支持物。5'和3'末端OH可磷酸化或者用胺或l-20個碳原子的有機加帽基團模塊取代。其它羥基也可衍生成標(biāo)準(zhǔn)保護基團。多核苦酸還可含有本領(lǐng)域普遍知道的核糖或脫氧核糖糖類的類似物形式，包括例如2'-0-曱基、2'-O-烯丙基、2'-氟-或2'-疊氮-核糖，碳環(huán)糖類似物，a-端基異構(gòu)糖，差向異構(gòu)糖諸如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖，無環(huán)類似物及脫堿基核苷類似物諸如曱基核糖核苷?？捎脗溥x連接基團替換一個或多個磷酸二酯連接。這些備選連接基團包括但不限于如下實施方案，其中磷酸酯用p(o)-S-(硫代酸酯(thioate))、P(S)-S-(二硫代酸酯(d他ioate))、(0)NR2-(酰胺酉旨(amidate))、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2-(曱縮醛(formacetal))替換，其中R或R'各自獨立為H或者取代的或未取代的Cwo烴基，任選含有醚、芳基、烯基、環(huán)烯基或芳烴基連接。并非多核苷酸中的所有連接都必需是相同的。上述描述適用于本文中提及的所有多核苦酸，包括RNA和DNA。術(shù)語"肽"一般指通過肽鍵連接的氨基酸的連續(xù)且相對短的序列。典型地，但不是必須地，肽的長度為約2-50個氨基酸、4-40個氨基酸或10-30個氨基酸。雖然術(shù)語"蛋白質(zhì)"一般指"多肽"的較長形式，但是兩個術(shù)語在本文的有些背景中可以互換使用，指一般較長且可能較復(fù)雜的氨基酸序列(例如多重序列，二級和更高級結(jié)構(gòu))。多肽的"區(qū)域"指2個或更多個氨基酸殘基的連續(xù)序列。在備選的實施方案中，區(qū)域是至少約3個、5個、IO個、15個或更多個連續(xù)的氨基酸殘基。"C端區(qū)域"、"C端序列，，及其變化形式在用于本文時指位于C端(一般是3，)末端或與C端末端極接近的氨基酸序列。一般地，所述序列包括具有游離羧基的氨基酸。在一個實施方案中，C端區(qū)域或序列指包括約l-15個距離C末端最近的殘基的多肽區(qū)域。"N端區(qū)域"、"N端序列"及其變化形式在用于本文時指位于N端(一般是5，)末端或與N端末端極接近的氨基酸序列。一般地，所述序列包括具有游離氨基的氨基酸。在一個實施方案中，N端區(qū)域或序列指包括約l-15個距離多肽N末端最近的殘基的多肽區(qū)域。"內(nèi)部區(qū)域"或"內(nèi)部序列"及其變化形式指位于多肽內(nèi)且在其N端和C端側(cè)翼有一個或多個不是該序列一部分的氨基酸的氨基酸序列。一般地，該序列不包括具有游離羧基或氨基的氨基酸。"配體，，指能夠與蛋白質(zhì)或其它分子(諸如受體)上特定位點結(jié)合相互作用的天然存在的或合成的分子或模塊。Wnt配體指與巻曲受體特異性相互作用的分子。"受體，，通常但非必須位于細(xì)胞表面或膜上。"融合蛋白"指具有兩個共價連接在一起的部分的多肽，其中每個部分是從不同蛋白質(zhì)衍生的。所述兩個部分可通過單個肽鍵直接連接，或者經(jīng)由包含一個或多個氨基酸殘基的肽接頭。通常，所述兩個部分和接頭會彼此處于讀碼框中，并使用重組技術(shù)來生成。"抑制腫瘤細(xì)胞生長"的Wnt拮抗劑或"生長抑制性"Wnt拮抗劑指導(dǎo)致具有異常Wnt信號傳導(dǎo)活性的腫瘤細(xì)胞可測量的生長抑制的Wnt拮抗劑。與適當(dāng)?shù)膶φ障啾?，?yōu)選的生長抑制性Wnt拮抗劑將具有異常Wnt信號傳導(dǎo)活性的肺瘤細(xì)胞的生長抑制大于20%,優(yōu)選從約20%至約50%，甚至更優(yōu)選大于50%(例如從約50%至約100%)，所述對照典型地是沒有用正^f皮測試的Wnt拮抗劑分子處理的癌細(xì)胞。在一個實施方案中，可以在細(xì)胞培養(yǎng)物中在約0.1至30)ag/ml或約0.5nM至200nM的Wnt拮抗劑濃度測量到生長抑制，其中所述生長抑制是在腫瘤細(xì)胞暴露于Wnt拮抗劑后l-10天測定到的。體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的生長抑制可以以多種方式測定，諸如在下述實驗實施例部分中所述的。若施用約l(ig/kg至約100mg/kg體重的Wnt拮抗劑導(dǎo)致腫瘤大小或細(xì)胞增殖在離第一次施用抗體約5天至3月內(nèi)，優(yōu)選在約5至30天內(nèi)降低，則Wnt拮抗劑在體內(nèi)是生長抑制性的。在一個具體的方面中，腫瘤大小相對于其在療法開始時的大小是下降的。術(shù)語"細(xì)胞增殖性病癥"和"增殖性病癥"指與一定程度的異常細(xì)胞增殖有關(guān)的病癥。在一個實施方案中，細(xì)胞增殖性病癥是癌癥。"月中瘤，，在用于本文時指所有贅生性細(xì)胞生長和增殖，無論是惡性的還是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性細(xì)胞和組織。"誘導(dǎo)細(xì)胞死亡"的Wnt拮抗劑分子指使可存活細(xì)胞變?yōu)闊o法存活的Wnt拮抗劑。所述細(xì)胞是與相同組織類型的正常細(xì)胞相比具有異常的Wnt信號傳導(dǎo)活性的細(xì)胞。優(yōu)選地，如本文所定義，所述細(xì)胞是癌細(xì)胞。體外的細(xì)胞死亡可以在沒有補體和免疫效應(yīng)器細(xì)胞時測定以區(qū)分由抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)或補體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。如此，細(xì)胞死亡測定法可以使用熱滅活血清(即在沒有補體時)且在沒有免疫效應(yīng)器細(xì)胞時實施。為了測定Wnt拮抗劑是否能夠誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，可以相對于未處理細(xì)胞評估通過碘化丙錠(PI)、錐蟲藍(lán)(參見Moore等，Cytotechnology17:1-11(1995))或7AAD攝取所評估的膜完整性喪失。優(yōu)選的細(xì)胞死亡誘導(dǎo)性抗體、寡肽或其它有機分子是那些在BT474細(xì)胞中在PI攝取測定法中誘導(dǎo)PI攝取的。單詞"標(biāo)記物"在用于本文時指與抗體、寡肽或其它有機分子直接或間接偶聯(lián)從而產(chǎn)生"經(jīng)標(biāo)記的"或"帶標(biāo)記物的"抗體、寡肽或其它有機分子的可檢測化合物或組合物。標(biāo)記物可以是自身就可檢測的(例如放射性同位素標(biāo)記物或焚光標(biāo)記物)，或者在酶標(biāo)記物的情況中，可催化可檢測的底物化合物或組合物的化學(xué)改變。術(shù)語"細(xì)胞毒劑"在用于本文時指抑制或防止細(xì)胞的功能和/或引起細(xì)胞破壞的物質(zhì)。該術(shù)語意圖包括放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、p32和Lu的放射性同位素)；化療劑；酶及其片段，諸如溶核酶；抗生素；和毒素，諸如小分子毒素或者細(xì)菌、真菌、植物或動物起源的酶活毒素，包括其片段和/或變體；及下文披露的各種抗腫瘤劑或抗癌劑。下文描述了其它細(xì)胞毒劑。殺腫瘤劑引起腫瘤細(xì)胞的破壞。"化療劑，，指在治療癌癥中有用的化學(xué)化合物?；焺┑睦影ㄍ榛瘎╊?alkylatingagents),諸如塞替派(thiotepa)和CYTOXAN環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide);石黃酸烷基酯類(alkylsulfonates),諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和p泉泊舒凡(piposulfan);氮丙p定類(aziridines),i者嘖口苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和烏瑞替派(uredepa);乙撐亞胺類(ethylenimines)和曱基蜜胺類(methylamelamines),包括六曱蜜胺(altretamine)、三乙撐蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撐蜂酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撐石克代石岸酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羥曱蜜胺(trimethylolomelamine);番荔枝內(nèi)酉旨類(acetogenins)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone));5-9-四氬屈大麻酚(tetrahydrocannabinol)(屈大麻酚(dronabinol),MARINOL);(3-拉帕醌(lapachone);拉帕醇(lapachol);秋水仙素類(colchicines);白樺月旨酸(betulinicacid);喜杉于石成(camptothecin)(包4舌合成類似物才乇泊康(topotecan)(HYCAMTIN)、CPT-11(伊立替康(irinotecan),CAMPTOSAR)、乙酰喜樹堿、東復(fù)菪亭(scopoletin)和9-氨基喜樹堿)；苔蘚抑素(bryostatin);callystatin;CC-1065(包括其阿多來新(adozelesin)、卡折來新(carzelesin)和比折來新(bizelesin)合成類似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin);鬼臼酸(podophyllinicacid);替尼泊苦(teniposide);隱藻素類(cryptophycins)(特另'J是隱藻素1和隱藻素8);多拉司他汀(dolastatin);duocarmycin(包括合成類似物，KW-2189和CB1-TM1);艾榴塞洛素(eleutherobin);pancratistatin;sarcodictyin;〉每綿#卩素(spongistatin);氛芥類(nitrogenmustards),"i者^口苯丁酉交氛齊(cWorambudl)、蔡氛齊(chlornaphazine)、月旦石壽醜胺(cholophosphamide)、站,莫司汀(estramustine)、異環(huán)石粦酰胺(ifosfamide)、雙氯乙基曱胺(mechlorethamine)、鹽酉臾氧氛芥(mechlorethamineoxidehydrochloride)、美法倉(melphalan)、l斤氛芥(novembichin)、苯芥月旦甾醇(phenesterine)、〉發(fā)尼莫司汀(prednimustine)、曲石粦胺(trofosfamide)、尿嘧口定氮芥(uracilmustard);亞；肖脲類(nitrosoureas),i者i口卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、-畐莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine);抗生素類，諸如烯二炔類抗生素(enediyne)(如加利車霉素(calicheamicin),尤其是加利車霉素yll和加利車霉素(oil(參見例如Agnew,Chem.Intl.Ed.Engl.33:183-186(1994));蒽環(huán)類抗生素(dynemicin),包括dynemicinA;埃斯波霉素(esperamicin);以及新制癌素(neocarzinostatin)發(fā)色團和相關(guān)色蛋白烯二炔類抗生素發(fā)色團)、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放線菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮絲氨酸(azaserine)、博來霉素(bleomycin),放線菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋紅霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放線菌素D(dactinomydn)、柔紅霉素(daunorubicin)、i也4乇比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、ADRIAMYCIN多柔比星(doxorubicin)(包括嗎啉代多柔比星、氰基嗎啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星、及脫氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、4尹達(dá)比星(idarubicin)、麻西羅霉素(marcellomycin)、絲裂霉素類(mitomycins)諸如絲裂霉素C、霉酚酸(mycophenolicacid)、諾拉霉素(nogalamycin)、揪欖霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三鐵阿霉素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈佐星(streptozocin)、殺結(jié)核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、凈司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin);抗代謝物類，諸如曱氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU);葉酸類似物，諸如二曱葉酸(denopterin)、曱氨蟲萊呤、蟲萊酰三谷氨酸(pteropterin)、三曱曲沙(trimetrexate);嘌呤類似物，i者如氟達(dá)4立濱(fludarabine)、6-巰基嘌口令(mercaptopurine)、石克口米嘌口令(thiamiprine)、硫鳥。票呤(thioguanine);嘧咬類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苦、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞芬(cytarabine)、雙脫氧尿苦(dideoxyuridine)、去氧氟尿苦(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿芬(floxuridine);主,;敫素類，i者如卡魯睪酮(calusterone)、丙酉交屈j也名,酮(dromostanolonepropionate)、表石克力,酉孚(epitiostanol)、美i,火克(m印itiostane)、睪內(nèi)酉旨(testolactone);抗腎上腺類，諸如氨魯米特(aminoglutethimide)、米4乇坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane);葉酸補充劑，諸如亞葉酸(folinicacid);醋葡醛內(nèi)酯(aceglatone);醛磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside);氨基乙酰丙酉交(aminolevulinicacid);恩尿口密口足(eniluracil);安p丫口定(amsacrine);bestrabucil;t匕生群(bisantrene);依達(dá)曲沙、(edatraxate);地石粦酰胺(defosfamide);地美可辛(demecolcine);地吖醌(diaziquone);dfornithine;依利醋按(elliptiniumacetate);epothilone;依托格魯(etoglucid);硝酸《家；羥脲(hydroxyurea);香菇多糖(lentinan);氯尼達(dá)明(lonidamine);美登木素生物石咸類(maytansinoids)，諸如美登素(maytansine)和安絲菌素(ansamitocin);米4乇胍月宗(mitoguazone);米4乇蔥、酉昆(mitoxantrone);莫哌達(dá)醇(m叩idamol);二胺硝吖啶(nitracrine);噴司他丁(pentostatin);蛋氨氮芥(phenamet);p比柔比星(pirarubicin);洛索蒽醌(losoxantrone);2-乙基酰肼(ethylhydrazide);丙卡巴肼(procarbazine);PSK多糖復(fù)合物(JHSNaturalProducts,Eugene,OR);雷佐生(razoxane);根霉素(rhizoxin);西索菲蘭(sizofiran);蟲累i走錯(spirogermanium);纟田交《連孑包菌酉同臥復(fù)(tenuazonicacid);三亞胺醌(triaziquone);2,2',2"-三氯三乙胺；單端孢菌素類(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、桿孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidine));烏拉坦(urethan);長春地辛(vindesine)(ELDISINE,FILDESIN);達(dá)卡巴。秦(dacarbazine);甘露醇氮芥(mannomustine);二溴甘露醇(mitobronitol);二溴衛(wèi)矛醇(mitolactol);、派泊溴烷(pipobroman);gacytosine;阿糖胞苷(arabinoside)("Ara-C");塞替派(thiotepa);類紫杉醇(taxoids),例3口TAXOL⑧帕利j也塞(paclitaxel)(Bristol-MyersSquibbOncology,Princeton,N丄)、ABRAXANETM無克列莫佛的(Cremophor-free)清蛋白改造的纟內(nèi)米顆斗立劑型巾白利4也塞(AmericanPharmaceuticalPartners,Schaumberg,Illinois)和TAXOTERE⑧多西他塞(doxetaxel)(Rh6nePoulencRorer，Antony,France);苯丁酸氮芥(chlorambucil);吉西他濱(gemcitabine)(GEMZAR);6-石克鳥噤呤(thioguanine);巰基噤呤(mercaptopurine);曱氨蝶呤(methotrexate);賴類似物，"i者如順粕(cisplatin)和卡4白(carboplatin);長春石咸(vinblastine)(VELBAN);鉬；依托泊普(etoposide)(VP-16);異環(huán)磷酰胺(ifosfamide);米托蒽醌(mitoxantrone);長春新石成(vincristine)(ONCOVIN);奧沙利柏(oxaliplatin);亞葉酸(leucovorin);長春瑞濱(vinorelbine)(NAVELBINE);能滅瘤(novantrone);依達(dá)曲沙(edatrexate);道諾霉素(daunomycin);氨基蟲萊呤(aminopterin);伊本膦酸鹽(ibandronate);拓樸異構(gòu)酶抑制劑RFS2000;二氟曱基鳥氨酸(DMFO);類視黃酸(retinoids),諸如視黃酸(retinoicacid);卡培他濱(capecitabine)(XELODA);任何上述物質(zhì)的藥學(xué)可接受鹽、酸或衍生物；以及兩種或多種上述物質(zhì)的組合，諸如CHOP(環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿和潑尼松龍聯(lián)合療法的縮寫)和FOLFOX(奧沙利鉑(ELOXATIN)if關(guān)合5-FU和亞葉酸的治療方案的縮寫)。該定義還包括作用為調(diào)節(jié)、降低、阻斷、或抑制可促進癌生長的激素效果的抗激素劑，且常常是系統(tǒng)或全身治療的形式。它們自身可以是激素。例子包括抗雌激素類和選擇性雌激素受體調(diào)控劑類(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX⑧他莫昔芬)、EVISTA⑧雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羥基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)和FARESTON托瑞米芬(toremifene);抗孕酮類；雌激素受體下調(diào)劑類(ERD);功能為抑制或關(guān)閉卵巢的藥劑，例如促黃體生成激素釋放激素(LHRH)激動劑，諸如LUPRON⑧和ELIGARD醋酸亮丙瑞林(leuprolideacetate)、醋酸戈舍瑞4木(goserelinacetate)、醋酸布舍瑞林(buserelinacetate)和曲普瑞林(triptorelin);其它抗雄激素類，諸如氟他米特(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide);及抑制在腎上腺中調(diào)節(jié)雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制劑，諸如例如4(5)-咪唑、氨魯米特(aminoglutethimide)、MEGASE⑧醋酸曱地孕酮(megestrolacetate)、AROMASIN依西美坦(exemestane)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、RIVISOR⑧伏羅唑(vorozole)、FEMARA來曲唑(letrozole)和ARIMIDEX⑧阿那曲唑(anastrozole)。另夕卜，化療劑的這種定義包4舌二膦酸鹽類(bisphosphonates),i者如氯麟酉艾鹽(clodronate)(侈'J^t口BONEFOS⑧或OSTAC⑧)、DIDROCAL⑧依替膦酸鈉(etidronate)、NE-58095、ZOMETA⑧唑來膦酸/唑來膦酸鹽(zoledronicacid/zoledronate)、FOSAMAX阿倫膦酸鹽(alendronate)、AREDIA⑧帕米膦酸鹽(pamidronate)、SKELID⑧替魯膦酸鹽(tiludronate)或ACTONEL⑧利塞膦酸鹽(risedronate);以及曲沙他濱(troxacitabine)(1,3-二氧戊環(huán)核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，特別是抑制牽涉異常(abherant)細(xì)胞增殖的信號途經(jīng)中的基因表達(dá)的反義寡核苷酸，諸如例如PKC-a、Raf、H-Ras和表皮生長因子受體(EGF-R);疫苗，諸如THERATOPE疫苗和基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN疫苗、LEUVECTIN⑧疫苗和VAXID⑧疫苗；LURTOTECAN⑧拓樸異構(gòu)酶l抑制劑；ABARELIX⑧rmRH;lapatinibditosylate(ErbB-2和EGFR雙重酪氨酸激酶小分子抑制劑，也稱為GW572016);及任何上述物質(zhì)的藥學(xué)可接受鹽、酸或衍生物。"生長抑制劑"在用于本文時指在體外或在體內(nèi)抑制細(xì)胞，尤其是具有Wnt信號傳導(dǎo)活性的癌細(xì)胞生長的化合物或組合物。因此，生長抑制劑可以是顯著降低處于S期的此類細(xì)胞百分比的藥劑。生長抑制劑的例子包括阻斷細(xì)胞周期行進(處于S期以外的位置)的藥劑，諸如誘導(dǎo)G1停滯和M期停滯的藥劑。經(jīng)典的M期阻斷劑包括長春藥類(vincas)(長春新堿(vincristine)和長春堿(vinblastine))、紫杉烷類(taxanes)、和拓樸異構(gòu)酶II抑制劑諸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔纟工審素(daunorubicin)、依4乇泊苦(etoposide)和博來霉素(bleomycin)。那些阻滯G1的藥劑也溢出進入S期停滯，例如DNA烷化劑類諸如他莫昔芬(tamoxifen)、潑尼松(prednisone)、達(dá)卡巴。秦(dacarbazine)、雙氯乙基曱胺(mechlorethamine)、順鉑(cisplatin)、甲氨蝶令(methotrexate)、5-氟尿嘧咬(5-fluorouracil)和ara-C。更多信息可參見TheMolecularBasisofCancer,Mendelsohn和Israel編，第1章，題為"Cellcycleregulation,oncogenes,andantieioplasticdrugs",Murakaini等(WBSaunders,Philadelphia,1995),尤其是第13頁。紫杉烷類(帕利他塞(paclitaxel)和多西他賽(docetaxel))是衍生自紫杉樹的抗癌藥。衍生自歐洲紫杉的多西他賽(TAXOTERE,Rhone-PoulencRorer)是帕利他塞(TAXOL⑧，Bristol-MyersSquibb)的半合成類似物。帕利他塞和多西他賽促進由微管蛋白二聚體裝配成微管并通過防止解聚使微管穩(wěn)定，導(dǎo)致對細(xì)胞中有絲分裂的抑制。"多柔比星(Doxombicin)"是蒽環(huán)類抗生素。多柔比星的完整化學(xué)名是(8S-順式)-10-[(3-氨基-2,3,6-三脫氧-a-L-來蘇-吡喃己糖基)氧基]-7,8,9,10-四氫-6，8,11-三羥基-8-(羥基乙?；?-l-曱氧基-5,12-萘二酮。(8S-cis)-10-[(3-amino-2，3,6-trideoxy-a-L-lyxo-hexapyranosyl)oxy]-7,8,9，10-tetrahydro-6,8,ll-trihydroxy-8-(hydroxyacetyl)-l-methoxy-5,12-naphthacenedione術(shù)語"包裝插頁"用于指通常包括在治療用產(chǎn)品的商品包裝中的說明書，它們包含有關(guān)涉及此類治療用產(chǎn)品應(yīng)用的適應(yīng)征、用法、劑量、施用、禁忌癥和/或警告的信息。II.具體實施方案的描述本文所述Wnt拮抗劑能夠在體外結(jié)合Wnt配體，并能夠抑制或阻抑Wnt刺激的細(xì)胞信號傳導(dǎo)。另外，Wnt拮抗劑具有較長的體內(nèi)半衰期，并展現(xiàn)體內(nèi)抗腫瘤活性，其在小鼠MMTV乳房腫瘤模型中抑制Wnt-1驅(qū)動的腫瘤的生長。Wnt拮抗劑還能夠在自人畸胎瘤細(xì)胞系衍生的腫瘤異種移植物的小鼠中抑制生長。從用Wnt拮抗劑處理的小鼠中采集的再生組織表現(xiàn)為在生理學(xué)規(guī)范(physiologicalnorm)之內(nèi)。Wnt拮抗劑還能夠在體外抑制人腫瘤細(xì)胞系中的自分泌Wnt信號傳導(dǎo)。巻曲受體蛋白可以基于全長和細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域序列同一性兩者分成家族。這種分組以圖8和9中所示比對顯示。在該圖中加下劃線的殘基在所有Frz受體間(acrossalltheFrzreceptors)是保守的，而附陰影的殘基在同源分組間(acrosshomologousgroupings)是寸呆守的。Frz蛋白可以分成^口下家》美1)Frzl、Frz2、及Frz7,它們具有全長序列上68-77%的共享同源性和ECD上90。/。的共享同源性；2)Frz5和Frz8,它們具有全長序列上57°/。的共享同源性和ECD上80%的共享同源性；3)Frz9和Frz10,它們具有全長序列上61°/。的共享同源性和ECD上74。/。的共享同源性；4)Frz3和Frz6,它們具有全長序列上49%的共享同源性和ECD上50。/。的共享同源性；及5)Frz4(其與FrzlO展現(xiàn)全長序列上46。/。的共享同源性和ECD上48。/o的共享同源性)。Frzl、Frz2、及Frz7的家力矣與果蠅Frzl具有顯著的同源性，而Frz5和Frz8的家族與果蠅Frz2具有顯著的同源性，顯示它們分別負(fù)責(zé)平面細(xì)胞極性和Wnt信號傳導(dǎo)。Wnt配體-巻曲蛋白結(jié)合行為似乎在巻曲蛋白家族內(nèi)聚簇。相對于其它Frz蛋白，Wnt3a和Wnt5a兩者最快地結(jié)合Frz5、Frz8和Frz4，而Wnt3a以較慢的速率結(jié)合Frzl、Frz2、和Frz7。Wnt5a結(jié)合行為的幅度和線性性質(zhì)指示較低的結(jié)合親和力(相對于Wnt3a結(jié)合)，正如通過OCTETTM結(jié)合測定法所測定的。高親和力和低親和力受體兩者的存在可以賦予劇烈的和長期的信號傳導(dǎo)能力。Wnt拮抗劑抑制Wnt配體誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)的能力還表現(xiàn)為在巻曲蛋白家族內(nèi)聚簇。Frz5和Frz8兩者在基于細(xì)胞的測定法中顯示對Wnt3a信號的完全抑制和對Wnt5a信號的顯著抑制(實施例7)。Frz4、Frz2、和Frz7顯示對Wnt3a信號的顯著抑制。此發(fā)現(xiàn)映射了果蠅中的觀察結(jié)果，即dFrz2(與Frz5和Frz8具有同源性)強烈地激活Wnt途徑，而dFrzl(與Frzl、Frz2、及Frz7具有同源性)能微弱地激活Wnt途徑。雖然不限于具體的作用理論，但是本文所示數(shù)據(jù)指出使用Wnt拮抗劑所產(chǎn)生的基于細(xì)胞的Wnt信號傳導(dǎo)抑制數(shù)據(jù)與通過測量Wnt配體對Wnt拮抗劑的直接結(jié)合所獲得的數(shù)據(jù)相關(guān)，指出Wnt拮抗劑直接結(jié)合Wnt配體，如此阻斷它們結(jié)合細(xì)胞上的全長巻曲受體。本文所示數(shù)據(jù)進一步提供了如下驗證，即可以使用體外活性來預(yù)測Wnt拮抗劑的體內(nèi)Wnt信號傳導(dǎo)阻斷活性。如實施例中提出的使用Fz8-Fc的研究中所指出的，包含巻曲結(jié)構(gòu)域和免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域兩者的Wnt拮抗劑驚人地展現(xiàn)出比單獨的巻曲結(jié)構(gòu)域增加的對Wnt配體的結(jié)合親和力。例如，圖14顯示了在將FzECD結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)變?yōu)镕z(156)-Fc構(gòu)建體后結(jié)合親和力增加了兩個數(shù)量級以上。Fz(156)-Fc構(gòu)建體作為穩(wěn)定且高度有效的Wnt信號傳導(dǎo)抑制劑的發(fā)現(xiàn)(其中與Fc的偶聯(lián)導(dǎo)致結(jié)合親和力兩個數(shù)量級的增加)是非常意外的且不是顯而易見的。A.本發(fā)明的組合物和方法1.多肽本發(fā)明針對用于治療Wnt介導(dǎo)的病癥(包括癌癥)和用于抑制細(xì)胞Wnt信號傳導(dǎo)的組合物和方法。本發(fā)明一方面提供了如下Wnt拮抗劑，其是包含巻曲(Frz)結(jié)構(gòu)域構(gòu)件和免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域的嵌合分子。在此方面的具體實施方案中，F(xiàn)rz結(jié)構(gòu)域構(gòu)件和Fc結(jié)構(gòu)域是經(jīng)由接頭融合的。另一方面提供了這些Wnt拮抗劑用于抑制細(xì)胞Wnt信號傳導(dǎo)及用于治療Wnt介導(dǎo)的病癥(諸如癌癥)的用途。一方面，本發(fā)明提供了如下Wnt拮抗劑，其是含F(xiàn)rz結(jié)構(gòu)域構(gòu)件的嵌合分子，所述Frz結(jié)構(gòu)域構(gòu)件包含細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域"CRD(ECD)"的最低限度富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域(CRD)。CRD(ECD)是100至250個氨基酸的保守結(jié)構(gòu)基序，并通過10個高度保守的半胱氨酸限定。此蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域出現(xiàn)在兩類Wnt信號傳導(dǎo)家族中一一稱為巻曲蛋白的膜內(nèi)在Wnt受體蛋白，和稱為巻曲相關(guān)蛋白(sFRP)的分泌型胞外蛋白。一方面，本發(fā)明提供了如下Wnt拮抗劑，其是具有Frz結(jié)構(gòu)域構(gòu)件的嵌合分子，所述Frz結(jié)構(gòu)域構(gòu)件包含巻曲蛋白(諸如Frzl、Frz2、Frz3、Frz4、Frz5、Frz6、Frz7、Frz8、Frz9、或FrzlO)的CRD(ECD)。圖3B中提供了此類CRD(ECD)的例子。在具體的實施方案中，F(xiàn)rz結(jié)構(gòu)域構(gòu)件選自hFrzl(SEQIDNO:18)、hFrz2(SEQIDNO:19)、hFrz3(SEQIDNO:20)、hFrz4(SEQIDNO:21)、hFrz5(SEQIDNO:22)、hFrz6(SEQIDNO:23)、hFrz7(SEQIDNO:24)、hFrz8(SEQIDNO:25)、hFrz9(SEQIDNO:26)、及hFrzlO(SEQIDNO:27)的CRD(ECD)及其活性變體?；蛘?，F(xiàn)rz結(jié)構(gòu)域構(gòu)件包含例如來自分泌型巻曲相關(guān)蛋白(sFRP)(諸如sFRPl、sFRP2、sFRP3、sFRP4、或sFRP5)的CRD(ECD)。圖3B中提供了此類CRD(ECD)的例子。在具體的實施方案中，F(xiàn)rz結(jié)構(gòu)域構(gòu)件選自sFRPl(SEQIDNO:28)、sFRP2(SEQIDNO:29)、sFRP3(SEQIDNO:30)、sFRP4(SEQIDNO:31)、sFRP5(SEQIDNO:32)的CRD(ECD)或其活性變體?；蛘?，F(xiàn)rz結(jié)構(gòu)域構(gòu)件包含例如受體酪氨酸激酶Ror1和Ror2的CRD(ECD)。圖3B中提供了此類CRD(ECD)的例子。在具體的實施方案中，F(xiàn)rz結(jié)構(gòu)域構(gòu)件選自hRorl(SEQIDNO:33)和hRor2(SEQIDNO:34)的CRD(ECD)及其活性變體。另一方面，F(xiàn)rz結(jié)構(gòu)域構(gòu)件是Frz原或sFRP原序列(pro-Frzorpro-sFrpsequence),其例子顯示在圖3A中。在具體的實施方案中，F(xiàn)rz結(jié)構(gòu)域構(gòu)件選自hFrzl(SEQIDNO:35)、hFrz2(SEQIDNO:36)、hFrz3(SEQIDNO:37)、hFrz4(SEQIDNO:38)、hFrz5(SEQIDNO:39)、hFrz6(SEQIDNO:40)、hFrz7(SEQIDNO:41)、hFrz8(SEQIDNO:42)、hFrz9(SEQIDNO:43)、hFrzlO(SEQIDNO:44)、sFRPl(SEQIDNO:45)、sFRP2(SEQIDNO:46)、sFRP3(SEQIDNO:47)、sFRP4(SEQIDNO:48)、及sFRP5(SEQIDNO:49)及其活性變體。又一方面，F(xiàn)rz結(jié)構(gòu)域構(gòu)件書f生自成熟Frz、sFRP或hRor序列，其例子顯示在圖3B中。在具體的實施方案中，F(xiàn)rz結(jié)構(gòu)域構(gòu)件選自hFrzl(SEQIDNO:50)、hFrz2(SEQIDNO:51)、hFrz3(SEQIDNO:52)、hFrz4(SEQIDNO:53)、hFrz5(SEQIDNO:54)、hFrz6(SEQIDNO:55)、hFrz7(SEQIDNO:56)、hFrz8(SEQIDNO:57)、hFrz9(SEQIDNO:58)、hFrzlO(SEQIDNO:59)、sFRPl(SEQIDNO:60)、sFRP2(SEQIDNO:61)、sFRP3(SEQIDNO:62)、sFRP4(SEQIDNO:63)、sFRP5(SEQIDNO:64)、hRorl(SEQIDNO:65)、和hRor2(SEQIDNO:66)及其活性變體。在具體的實施方案中，嵌合Wnt拮抗劑分子的Frz結(jié)構(gòu)域構(gòu)件和免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域是通過接頭融合的。在一個實施方案中，所述接頭是肽接頭。在另一個實施方案中，所述接頭選自ESGGGGVT(SEQIDNO:69)、LESGGGGVT(SEQIDNO:70)、GRAQVT(SEQIDNO:71)、WRAQVT(SEQIDNO:72)、及ARGRAQVT(SEQIDNO:73)。任選地，接頭可以包括來自Frz結(jié)構(gòu)域構(gòu)件或Fc結(jié)構(gòu)域的、活性所需的最低限度殘基以外的別的氨基酸殘基。這些接頭還可以包含除來自Frz結(jié)構(gòu)域構(gòu)件或Fc結(jié)構(gòu)域構(gòu)件的那些之外的別的氨基酸殘基。在一個實施方案中，Wnt拮抗劑是包含F(xiàn)rz8CRD(ECD)和Fc結(jié)構(gòu)域的Frz8-Fc嵌合體。在有些實施方案中，F(xiàn)rz8-Fc嵌合體進一步包含接頭，諸如肽接頭。在進一步的實施方案中，F(xiàn)rz8-Fc進一步包含前導(dǎo)序列。在具體的實施方案中，F(xiàn)rz結(jié)構(gòu)域構(gòu)件包含F(xiàn)rz8蛋白(SEQIDNO:8)的氨基酸1-156。在另一個實施方案中，所述Fc構(gòu)件是人Fc。在進一步的實施方案中，所述Fc構(gòu)件是人IgGFc。在又一個實施方案中，F(xiàn)rz8-Fc具有通過接頭與人IgGFc融合的包含F(xiàn)rz8蛋白氨基酸l-156的Frz結(jié)構(gòu)域構(gòu)件。在進一步的實施方案中，F(xiàn)rz8-Fc是具有圖4B中所示氨基酸序列(SEQIDNO:74)的嵌合體。在用于實施例和附圖時，除非另有說明，"Frz8-Fc"指圖4B中所示的嵌合體(SEQIDNO:74)。在進一步的實施方案中，Wnt拮抗劑是包含F(xiàn)rz5CRD(ECD)和Fc結(jié)構(gòu)域的Frz5-Fc嵌合體。在有些實施方案中，F(xiàn)rz5-Fc嵌合體進一步包含接頭，諸如肽接頭。在進一步的實施方案中，F(xiàn)rz5-Fc進一步包含前導(dǎo)序列。在具體的實施方案中，F(xiàn)rz結(jié)構(gòu)域構(gòu)件包含F(xiàn)rz5蛋白(SEQIDNO:5)的氨基酸27-155。在另一個實施方案中，所述Fc構(gòu)件是人Fc。在進一步的實施方案中，所述Fc構(gòu)件是人IgGFc。在又一個實施方案中，F(xiàn)rz5-Fc具有通過接頭與人IgGFc融合的前導(dǎo)序列和包含成熟Frz5蛋白氨基酸27-155的Frz結(jié)構(gòu)域構(gòu)件。在進一步的實施方案中，F(xiàn)rz5-Fc是具有圖7A所示氨基酸序列(SEQIDNO:75)的嵌合體。在用于實施例和附圖時，除非另有說明，"Frz5-Fc"指圖7A中所示的嵌合體(SEQIDNO:75)。類似地，進一步的實施方案包括Frzl-Fc、Frz2-Fc、Frz3陽Fc、Frz4-Fc、Frz6-Fc、Frz7-Fc、Frz9-Fc、Frz-10陽Fc、sFRPl-Fc、sFRP2-Fc、sFRP3-Fc、sFRP4-Fc和sFRP5-Fc嵌合體，其包含F(xiàn)rz結(jié)構(gòu)域構(gòu)件和Fc構(gòu)件，所述Frz結(jié)構(gòu)域構(gòu)件包含來自每種相應(yīng)Frz或sFRP蛋白的FrzCRD(ECD)。在有些實施方案中，F(xiàn)rz-Fc嵌合體進一步包含接頭，諸如肽接頭。在進一步的實施方案中，這些嵌合體包含前導(dǎo)序列。在有些實施方案中，所述Fc構(gòu)件是人Fc。在進一步的實施方案中，所述Fc構(gòu)件是人IgGFc。在進一步的實施方案中，這些嵌合體具有通過接頭與人IgGFc融合的前導(dǎo)序列和FrzCRD(ECD)。在進一步的實施方案中，這些嵌合體具有圖7A、7B和7C中所示的氨基酸序列(SEQIDNO:76-88)。在用于實施例和附圖時，除非另有說明，"Frzl-Fc、Frz2-Fc、Frz3-Fc、Frz4-Fc、Frz6-Fc、Frz7-Fc、Frz9-Fc、Frz-10-Fc、sFRPl-Fc、sFRP2-Fc、和sFRP4-Fc"指圖7A、7B和7C中(SEQIDNO:76-85及87)所示的相應(yīng)嵌合體。Wnt拮抗劑在體內(nèi)是穩(wěn)定的。先前利用附著于Fc構(gòu)件的巻曲結(jié)構(gòu)域的構(gòu)建體在體內(nèi)被快速降解，使它們不適于用作治療性化合物(Hsieh,J-C.等,PNAS,96:3546-3551(1999))。本文所述Wnt拮抗劑比先前構(gòu)建體實質(zhì)性更長地保持體內(nèi)穩(wěn)定性。如實施例4(圖13)所示，F(xiàn)rz8-FcWnt拮抗劑展現(xiàn)約4天的體內(nèi)半衰期。因而，本發(fā)明提供了在給哺乳動物施用后具有至少l天、2天、3天、或4天的體內(nèi)半衰期的Wnt拮抗劑。此外，如實施例3(圖ll)所示，Wnt拮抗劑比先前構(gòu)建體實質(zhì)性更長地在體內(nèi)保持活性。在一個實施方案中，在給哺乳動物施用Wnt拮抗劑后其活性持續(xù)至少30分鐘、l小時、2小時、3小時、4小時、5小時、6小時、8小時、IO小時、12小時、14小時、16小時、18小時、20小時、22小時、24小時、30小時、36小時、40小時、44小時、48小時、52小時、56小時、60小時、64小時、68小時、72小時、80小時、90小時、或100小時。如下測量活性，例如如實施例3和11中所提出的那樣對施用Wnt拮抗劑的哺乳動物的血清測試抑制Wnt信號傳導(dǎo)的能力，或使用本領(lǐng)域已知的其它方法。2.核酸本發(fā)明一方面提供了編碼本文所述Wnt拮抗劑的核酸。在具體的實施方案中，核酸編碼如下Wnt拮抗劑，其包含hFrzl(SEQIDNO:18)、hFrz2(SEQIDNO:19)、hFrz3(SEQIDNO:20)、hFrz4(SEQIDNO:21)、hFrz5(SEQIDNO:22)、hFrz6(SEQIDNO:23)、hFrz7(SEQIDNO:24)、hFrz8(SEQIDNO:25)、hFrz9(SEQIDNO:26)、hFrzlO(SEQIDNO:27)、sFRPl(SEQIDNO:28)、sFRP2(SEQIDNO:29)、sFRP3(SEQIDNO:30)、sFRP4(SEQIDNO:31)、sFRP5(SEQIDNO:32)、hRorl(SEQIDNO:33)、或hRor2(SEQIDNO:34)的CRD(ECD)。在其它的實施方案中，核酸編碼包含選自下組的Frz或sFRP蛋白原(pro-Frzorpro-sFrpprotein)的Wnt拮抗劑hFrzl(SEQIDNO:35)、hFrz2(SEQIDNO:36)、hFrz3(SEQIDNO:37)、hFrz4(SEQIDNO:38)、hFrz5(SEQIDNO:39)、hFrz6(SEQIDNO:40)、hFrz7(SEQIDNO:41)、hFrz8(SEQIDNO:42)、hFrz9(SEQIDNO:43)、hFrzl0(SEQIDNO:44)、sFRPl(SEQIDNO:45)、sFRP2(SEQIDNO:46)、sFRP3(SEQIDNO:47)、sFRP4(SEQIDNO:48)、及sFRP5(SEQIDNO:49)。在其它實施方案中，核酸編碼包含選自下組的成熟Frz、sFRP或hRor蛋白的Wnt拮抗劑hFrzl(SEQIDNO:50)、hFrz2(SEQIDNO:51)、hFrz3(SEQIDNO:52)、hFrz4(SEQIDNO:53)、hFrz5(SEQIDNO:54)、hFrz6(SEQIDNO:55)、hFrz7(SEQIDNO:56)、hFrz8(SEQIDNO:57)、hFrz9(SEQIDNO:58)、hFrzlO(SEQIDNO:59)、sFRPl(SEQIDNO:60)、sFRP2(SEQIDNO:61)、sFRP3(SEQIDNO:62)、sFRP4(SEQIDNO:63)、sFRP5(SEQIDNO:64)、hRorl(SEQIDNO:65)、和hRor2(SEQIDNO:66)。在其它實施方案中，核酸編碼如下Wnt拮抗劑，其包括Frz8-Fc(SEQIDNO:74)、Frz5-Fc(SEQIDNO:75)、Frzl-Fc(SEQIDNO:76)、Frz2-Fc(SEQIDNO:77)、Frz3-Fc(SEQIDNO:78)、Frz4-Fc(SEQIDNO:79)、Frz6-Fc(SEQIDNO:80)、Frz7-Fc(SEQIDNO:81)、Frz9-Fc(SEQIDNO:82)、FrzlO-Fc(SEQIDNO:83)、sFRPl-Fc(SEQIDNO:84)、sFRP2(SEQIDNO:85)、sFRP3-Fc(SEQIDNO:86)、sFRP4-Fc(SEQIDNO:87)、或sFRP5-Fc(SEQIDNO:88)。在一個具體的實施方案中，核酸編碼Frz8-Fc,并包含SEQIDNO:122(圖5D)中所示核酸序列。在另一個實施方案中，核酸編碼Frz5-Fc，并包含SEQIDNO:119(圖5C)中所示核酸序列。在進一步的實施方案中，核酸編碼Frzl-Fc、Frz2-Fc、Frz3-Fc、Frz4-Fc、Frz6-Fc、Frz7-Fc、Frz9-Fc、Frzl0-Fc、sFRPl-Fc、sFRP2、sFRP3-Fc、sFRP4-Fc、或sFRP5-Fc,并包含圖5(A-H)中所示核酸序列。例如，核酸包括Frzl-Fc(SEQIDNO:115)、Frz2-Fc(SEQIDNO:116)、Frz3陽Fc(SEQIDNO:117)、Frz4-Fc(SEQIDNO:118)、Frz5-Fc(SEQIDNO:119)、Frz6扁Fc(SEQIDNO:120)、Frz7-Fc(SEQIDNO:121)、Frz8-Fc(SEQIDNO:122)、Frz9-Fc(SEQIDNO:123)、FrzlO-Fc(SEQIDNO:124)、sFRPl-Fc(SEQIDNO:125)、sFRP2-Fc(SEQIDNO:126)、sFRP3-Fc(SEQIDNO:127)、sFRP4-Fc(SEQIDNO:128)、或sFRP5陽Fc(SEQIDNO:129)。本發(fā)明的另一方面提供了在高嚴(yán)格性條件下與上文所述核酸雜交的核酸。3.Wnt拮抗劑變體在本文所述Wnt拮抗劑多肽之外，可以制備Wnt拮抗劑變體。此類變體可以通過將合適的核普酸變化導(dǎo)入編碼DNA中，和/或通過期望變體的合成來制備。本領(lǐng)域技術(shù)人員會領(lǐng)會，氨基酸變化可以改變Wnt拮抗劑的翻譯后加工，諸如改變糖基化位點的數(shù)目或位置或改變膜錨定特征。Wnt拮抗劑變體包括例如一個或多個結(jié)構(gòu)域中氨基酸殘基中的突變或氨基酸變體，然而其仍保持生物學(xué)活性。Wnt拮抗劑變體還包括具有至少一處氨基酸刪除或添加但仍保持生物學(xué)活性的Wnt拮抗劑。氨基酸殘基的添加或刪除尤其可以在連接Frz結(jié)構(gòu)域構(gòu)件與Fc結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列周圍的區(qū)域中發(fā)生，無論此區(qū)域是否含有接頭。Wnt拮抗劑變體與參照Wnt拮抗劑多肽序列具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94°/。、95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸序列同一性。一般而言，此類變體展現(xiàn)出與參照序列相比基本上相同的或?qū)嵸|(zhì)性更大的對Wnt蛋白的結(jié)合親和力，例如至少0.75X、0.8X、0.9X、l.OX、1.25X或1.5X,基于本領(lǐng)域接受的結(jié)合測定法定量單位/度量。在具體的實施方案中，Wnt拮抗劑變體是嵌合分子，其包含與hFrzl(SEQIDNO:18)、hFrz2(SEQIDNO:19)、hFrz3(SEQIDNO:20)、hFrz4(SEQIDNO:21)、hFrz5(SEQIDNO:22)、hFrz6(SEQIDNO:23)、hFrz7(SEQIDNO:24)、hFrz8(SEQIDNO:25)、hFrz9(SEQIDNO:26)、hFrzlO(SEQIDNO:27)、sFRPl(SEQIDNO:28)、sFRP2(SEQIDNO:29)、sFRP3(SEQIDNO:30)、sFRP4(SEQIDNO:31)、sFRP5(SEQIDNO:32)、hRorl(SEQIDNO:33)、或hRor2(SEQIDNO:34)的CRD(ECD)具有至少70。/。、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%氨基酸序列同一性的Frz結(jié)構(gòu)域構(gòu)件。在其它實施方案中，Wnt拮抗劑變體是嵌合分子，其包含與選自hFrzl(SEQIDNO:35)、hFrz2(SEQIDNO:36)、hFrz3(SEQIDNO:37)、hFrz4(SEQIDNO:38)、hFrz5(SEQIDNO:39)、hFrz6(SEQIDNO:40)、hFrz7(SEQIDNO:41)、hFrz8(SEQIDNO:42)、hFrz9(SEQIDNO:43)、hFrz10(SEQIDNO:44)、sFRPl(SEQIDNO:45)、sFRP2(SEQIDNO:46)、sFRP3(SEQIDNO:47)、sFRP4(SEQIDNO:48)、及sFRP5(SEQIDNO:49)的Frz或sFRP蛋白原具有至少70%、75°/。、80o/。、85%、86。/o、87o/o、88o/o、89。/o、90%、91o/o、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%氨基酸序列同一性的Frz結(jié)構(gòu)域構(gòu)件。在其它實施方案中，Wnt拮抗劑變體是嵌合分子，其包含與選自hFrzl(SEQIDNO:50)、hFrz2(SEQIDNO:51)、hFrz3(SEQIDNO:52)、hFrz4(SEQIDNO:53)、hFrz5(SEQIDNO:54)、hFrz6(SEQIDNO:55)、hFrz7(SEQIDNO:56)、hFrz8(SEQIDNO:57)、hFrz9(SEQIDNO:58)、hFrzlO(SEQIDNO:59)、sFRPl(SEQIDNO:60)、sFRP2(SEQIDNO:61)、sFRP3(SEQIDNO:62)、sFRP4(SEQIDNO:63)、sFRP5(SEQIDNO:64)、hRorl(SEQIDNO:65)、及hRor2(SEQIDNO:66)的成熟Frz、sFRP或hRor蛋白具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98。/o或99。/。氨基酸序列同一性的Frz結(jié)構(gòu)域構(gòu)件。在其它實施方案中，Wnt拮抗劑變體是嵌合分子，其包含與Frz8-Fc(SEQIDNO:74)、Frz5畫Fc(SEQIDNO:75)、Frzl-Fc(SEQIDNO:76)、Frz2誦Fc(SEQIDNO:77)、Frz3-Fc(SEQIDNO:78)、Frz4-Fc(SEQIDNO:79)、Frz6-Fc(SEQIDNO:80)、Frz7-Fc(SEQIDNO:81)、Frz9-Fc(SEQIDNO:82)、FrzlO-Fc(SEQIDNO:83)、sFRPl-Fc(SEQIDNO:84)、sFRP2(SEQIDNO:85)、sFRP3-Fc(SEQIDNO:86)、sFRP4-Fc(SEQIDNO:87)、及sFRP5-Fc(SEQIDNO:88)具有至少70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%氨基酸序列同一性的Frz結(jié)構(gòu)域構(gòu)件。"百分比(％)氨基酸序列同一性"定義為在比對兩個序列時與參照(親本)多肽序列中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分比。為了測定百分比氨基酸同一性，對序列進行比對，并在必要時引入缺口以獲取最大百分比序列同一性，不將保守替代視為序列同一性的一部分。測定百分比同一性的氨基酸序列比對規(guī)程對于本領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。通常使用公眾可得到的計算機軟件，諸如BLAST、BLAST2、ALIGN2或Megalign(DNASTAR)軟件來比對肽序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可決定用于測量比對的適宜參數(shù)，包括對所比較序列全長獲得最大比對所需的任何算法。在比對氨基酸序列時，給定氨基酸序列A相對于(to)、與(with)、或針對(against)給定氨基酸序列B的°/。氨基酸序列同一性(或者可表述為具有或包含相對于、與、或針對給定氨基酸序列B的某一。/。氨基酸序列同一性的給定氨基酸序列A)可如下計算%氨基酸序列同一性=X/Yx100其中X是通過序列比對程序或算法的A和B比對而評分為相同匹配的氨基酸殘基數(shù)，且Y是B中的氨基酸殘基總數(shù)。、若氨基酸序列A的長度與氨基酸序列B的長度不相等，則A相對于B的％氨基酸序列同一性將不等于B相對于A的。/。氨基酸序列同一性。"分離的"或"純化的"肽、多肽、蛋白質(zhì)或生物學(xué)活性片段是與/由其天然環(huán)境的一種成分分開和/或回收的。污染性成分包括通常會干擾該多肽的診斷或治療用途的物質(zhì)，可包括酶、激素、和其它蛋白質(zhì)性質(zhì)或非蛋白質(zhì)性質(zhì)的物質(zhì)。將如下制備物視為基本上分離的，所述制備物根據(jù)非期望污染性物質(zhì)(污染物).的干重具有優(yōu)選小于30%,優(yōu)選小于20%，10%,且優(yōu)選小于5%的污染物。分離的重組生成的肽/多肽或其生物學(xué)活性部分優(yōu)選基本上不含培養(yǎng)基，即培養(yǎng)基所占肽/多肽制備物的體積優(yōu)選小于20%、優(yōu)選小于約10%,且優(yōu)選小于約5%。污染物的例子包括細(xì)胞碎片、培養(yǎng)基、及體外合成肽/多肽過程中所使用和生成的物質(zhì)。本文所述Wnt拮抗劑中的變異可以例如使用關(guān)于保守和非保守突變的任何技術(shù)和指導(dǎo)方針來產(chǎn)生，例如美國專利No.5,364,934中所提出的。變異可以是一個或多個編碼抗體或多肽的密碼子的替代、刪除或插入，其導(dǎo)致與天然序列抗體或多肽相比氨基酸序列中的變化。任選地，變異是通過在Wnt拮抗劑的一個或多個結(jié)構(gòu)域中用任何其它氨基酸替代至少一個氨基酸實現(xiàn)的。確定哪個氨基酸殘基可以被插入、替代或刪除而不會不利地影響期望活性的指導(dǎo)可以通過比較Wnt拮抗劑的序列與同源的已知蛋白質(zhì)分子的序列，并使高度同源性的區(qū)域中產(chǎn)生的氨基酸序列變化的數(shù)目最小化而發(fā)現(xiàn)。氨基酸替代可以是用另一個具有相似結(jié)構(gòu)和/或化學(xué)性質(zhì)的氨基酸替代一個氨基酸的結(jié)果，諸如用絲氨酸替代亮氨酸，即保守氨基酸替代。任選地，插入、刪除或替代可以在大約1至5個氨基酸的范圍中?？梢匀缦麓_定容許的變異，即在序列中系統(tǒng)地產(chǎn)生氨基酸的插入、刪除或替代，并對所得的變體測試全長或成熟天然序列所展現(xiàn)的活性。Wnt拮抗劑可以通過許多常規(guī)技術(shù)中的任一種來制備?？梢曰瘜W(xué)合成期望的肽片段。備選的方法牽涉通過酶促消化生成抗體或多肽片段，例如通過用已知在由特定氨基酸殘基限定的位點處切割蛋白質(zhì)的酶處理蛋白質(zhì)，或通過用合適的限制酶消化DNA并分離期望片段來實現(xiàn)。另一種合適的技術(shù)牽涉分離并擴增編碼期望抗體或多肽片段的DNA片段，其通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)實現(xiàn)。在PCR中的5，和3，引物上采用限定DNA片段的期望端的寡核苷酸。在具體的實施方案中，表A中優(yōu)選替代的標(biāo)題下顯示了感興趣的保守替代。如果此類替代導(dǎo)致生物學(xué)活性變化，那么可導(dǎo)入表A中稱為"例示替代"的更實質(zhì)變化，或如下文參照氨基酸分類進一步所述，并篩選產(chǎn)物。<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>方面的效果差異顯著的替代來實現(xiàn)(a)替代區(qū)域中多肽主鏈的結(jié)構(gòu)，例如作為(折疊)片層或螺旋構(gòu)象，(b)靶位點處分子的電荷或疏水性，或(C)側(cè)鏈的體積。根據(jù)共同的側(cè)鏈特性，天然存在殘基可如下分組(1)疏水性的正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、lie;(2)中性、親水性的Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;(3)酸性的Asp、Glu;(4)石威性的:His、Lys、Arg;(5)影響鏈取向的殘基Gly、Pro;及(6)芳香族的Trp、Tyr、Phe。非保守替代需要用這些類別之一的成員替換另一個類別的。還可以將此類替代殘基引入保守替代位點中，或更優(yōu)選地，引入剩余(非保守的)位點中。變異可以使用本領(lǐng)域中已知的方法來產(chǎn)生，諸如寡核苷酸介導(dǎo)的(定點)誘變、丙氨酸掃描、及PCR誘變?？梢詫λ寺〉腄NA實施定點誘變[Carter等，Nucl.AcidsRes.，13:4331(1986);Zoller等,Nucl.AcidsRes"10:6487(1987)]、盒式誘變[Wells等，Gene,34:315(1985)]、限制性選擇誘變[Wells等,Philos.Trans.R.Soc.LondonSerA，317:415(1986)]或其它已知的才支術(shù)以生成本發(fā)明的Wnt拮抗劑。還可以采用掃描氨基酸分析以沿著連續(xù)的序列鑒定一個或多個氨基酸。相對較小的、中性氨基酸是優(yōu)選的掃描氨基酸之一。此類氨基酸包括丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、及半胱氨酸。丙氨酸通常是此組中優(yōu)選的掃描氨基酸，因為其消除了超出p-碳外的側(cè)鏈，且不太可能改變變體的主鏈構(gòu)象[Cunningham和Wells,Science,244:1081-1085(1989)]。通常還優(yōu)選丙氨酸，因為其是最常見的氨基酸。進一步地，其在掩蔽位置和暴露位置兩者中被頻繁發(fā)現(xiàn)[Creighton，TheProteins,(W.H.Freeman&Co.,N.Y.);Chothia,J.Mol.Biol.，150:1(1976)]。若丙氨酸替代不能產(chǎn)生足夠量的變體，則可以使用電子等排(isoteric)氨基酸。不涉及維持Wnt拮抗劑的正確構(gòu)象的任何半胱氨酸殘基一般也可以用絲氨酸替代以改善分子的氧化穩(wěn)定性，并阻止異常交聯(lián)。相反地，可以將半胱氨酸鍵添加至Wnt拮抗劑以改善其穩(wěn)定性(特別在抗體是抗體片段諸如Fv片段時)。替代變體的特別優(yōu)選的類型牽涉替代親本抗體(例如人源化抗體或人抗體)的一個或多個高變區(qū)殘基。一般地，選擇用于進一步開發(fā)的所得變體相對于生成它們的親本抗體會具有改善的生物學(xué)性質(zhì)。用于生成此類替代變體的一種便利方式牽涉使用噬菌體展示的親和力成熟。簡言之，使數(shù)個高變區(qū)位點(例如6-7個位點)突變以在每個位點生成所有可能的氨基酸替代。如此生成的抗體變體以單價形式從絲狀噬菌體顆粒中展現(xiàn)出來，作為每個顆粒內(nèi)包裝的與Mi3基因m產(chǎn)物融合的融合物。然后對噬菌體展示的變體篩選如本文所公開的其生物學(xué)活性(例如結(jié)合親和力)。為了鑒定用于修飾的候選高變區(qū)位點，可以實施丙氨酸掃描誘變以筌定顯著促成抗原結(jié)合的高變區(qū)殘基?；蛘?另外，分析抗原-抗體復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)以鑒定Wnt拮抗劑和Wnt蛋白之間的接觸點可能是有益的。依照本文詳述的技術(shù)，此類接觸殘基和鄰近殘基是替代候選。一旦生成此類變體，則對該組變體進行本文所述篩選，并可以選擇在一種或多種相關(guān)測定法中具有優(yōu)越性質(zhì)的抗體以用于進一步開發(fā)。Wnt拮抗劑的共價修飾包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。一種類型的共價修飾包括使Wnt拮抗劑的靶定氨基酸殘基與有機衍生化試劑反應(yīng)，所述有機衍生化試劑能夠與Wnt拮抗劑的選定側(cè)鏈或N末端或C末端殘基起反應(yīng)。用雙功能試劑進行的衍生化可用于例如將Wnt拮抗劑交聯(lián)至不溶于水的支持基質(zhì)或表面以在用于純化Wnt拮抗劑的方法中使用。常用的交聯(lián)劑包括例如l,l-二(重氮乙?；?-2-苯乙烷、戊二醛、N-羥基琥珀酰亞胺酯(例如與4-疊氮水楊酸的酯)、同雙功能亞氨酸酯(包括二琥珀酰亞氨基酯，諸如3，3'-二硫代二-(琥珀酰亞氨基丙酸酯))、雙功能馬來酰亞胺(諸如二-N-馬來酰亞胺-l,8-辛烷)及諸如3-[(對疊氮苯基)二硫代]丙亞氨酸曱酯的試劑。其它修飾包括谷氨酰胺?；吞於０孵；鶜埢擋０范謩e成為相應(yīng)的谷氨?；吞於；鶜埢?，脯氨酸和賴氨酸的羥化，絲氨?；蛱K氨?；鶜埢牧u基基團的磷酸化，賴氨酸、精氨酸、和組氨酸的側(cè)鏈a-氨基基團的曱基"f匕[T.E.Creighton，Proteins:StructureandMolecularProperties,W.H.Freeman&Co.,SanFrancisco,pp.79-86(1983)],N末端胺的乙?；叭魏蜟末端羧基基團的酰胺化。Wnt拮抗劑的另一種類型的共價修飾包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)，其包括改變Wnt拮抗劑的Frz、Wnt或sFRP多肽結(jié)構(gòu)域的天然糖基化樣式。"改變天然糖基化樣式"定義為刪除在構(gòu)件結(jié)構(gòu)域的天然序列中找到的一個或多個碳水化合物模塊(或是通過除去潛在的糖基化位點或是通過以化學(xué)和/或酶的手段刪除糖基化)，和/或添加天然序列構(gòu)件結(jié)構(gòu)域中不存在的一個或多個糖基化位點。此外，該短語包括天然蛋白的糖基化的定性變化，牽涉所存在的各種碳水化合物模塊的性質(zhì)和比例的變化?？贵w和其它多肽的糖基化通常或是N連接的或是O連接的。N連接的指碳水化合物模塊附著于天冬酰胺殘基的側(cè)鏈。三肽序列天冬酰胺-x-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸(其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸)是碳水化合物模塊酶促附著于天冬酰胺側(cè)鏈的識別序列。如此，多肽中任一種這些三肽序列的存在創(chuàng)建潛在的糖基化位點。O連接的糖基化指糖類N-乙酰半乳糖胺、半乳糖、或木糖之一附著于羥基氨基酸，其最通常是絲氨酸或蘇氨酸，雖然也可以使用5-羥脯氨酸或5-羥賴氨酸。如下方便地實現(xiàn)在Wnt拮抗劑中添加糖基化位點，即改變氨基酸序列，使得其包含一個或多個上文所述三肽序列(用于N連接糖基化位點)。還可以如下產(chǎn)生改變，即將一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基添加或替代至原始(即變異前)Wnt拮抗劑的序列中。任選地，該序列可以經(jīng)由DNA水平上的變化而改變，具體是在預(yù)選的堿基上突變編碼該序列的DNA,使得生成會翻譯成期望氨基酸的密碼子。在Wnt拮抗劑上增加碳水化合物模塊的數(shù)目的另一種方法是通過糖苷與多肽的化學(xué)或酶促偶聯(lián)。此類方法在本領(lǐng)域中有記載，例如1987年9月11曰公布的WO87/05330及Aplin和Wriston,CRCCrit.Rev.Biochem.，pp.259-306(1981)。Wnt拮抗劑上存在的碳水化合物模塊的消除可以通過化學(xué)或酶學(xué)方法或通過突變替代編碼充當(dāng)糖基化靶物的氨基酸殘基的密碼子而實現(xiàn)?；瘜W(xué)去糖基化技術(shù)在本領(lǐng)域中是已知的，并記載于例如Hakimuddin等，Arch.Biochem.Biophys"259:52(1987)及Edge等，Anal.Biochem,，118:131(1981)。多肽上碳水化合物模塊的酶促切割可以通過多種內(nèi)切和外切糖苷酶的使用來實現(xiàn)，如Thotakura等，Meth.Enzymol.,138:350(1987)所述。Wnt拮抗劑的另一種類型的共價修飾包括以美國專利No.4,640,835、4，496,689、4,301,144、4,670,417、4,791，192或4,179,337中提出的方式將序列連接至多種非蛋白質(zhì)性質(zhì)的聚合物之一，例如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、或聚氧化烯?？贵w或多肽還可以包載于通過例如凝聚技術(shù)或界面聚合而制備的微膠嚢(例如分別為羥曱基纖維素或明膠微膠嚢和聚(曱基丙烯酸曱酯)微膠嚢)中，膠體藥物投遞系統(tǒng)(例如脂質(zhì)體、清蛋白微球體、微乳劑、納米顆粒和納米膠嚢)中，或粗滴乳狀液中。此類技術(shù)披露于Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,第20版，Gennaro，A.,編,(2000)。本發(fā)明的Wnt拮抗劑還可以以這樣一種方式修飾，使得其形成具有別的嵌合物性質(zhì)的分子，所述分子包含與另一種異源多肽或氨基酸序列融合的Wnt拮抗劑(即Frz-、sFRP-或Ror-Fc嵌合物)。在一個實施方案中，此嵌合分子包含Wnt拮抗劑與標(biāo)簽多肽的融合物，所述標(biāo)簽多肽提供抗標(biāo)簽抗體能選擇性結(jié)合的表位。表位標(biāo)簽一般置于Wnt拮抗劑的氨基端或羧基端。Wnt拮抗劑的此類加表位標(biāo)簽形式的存在可以使用針對標(biāo)簽多肽的抗體來檢測。同樣，表位標(biāo)簽的提供使Wnt拮抗劑能夠使用抗標(biāo)簽抗體或結(jié)合表位標(biāo)簽的另一種類型的親和基質(zhì)通過親和純化而被容易地純化。多種標(biāo)簽多肽和它們相應(yīng)的抗體在本領(lǐng)域中是公知的。例子包括多組氨酸(poly-his)或多-組氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)標(biāo)簽；流感HA標(biāo)簽多肽及其抗體12CA5[Field等,Mol.Cell.Biol"8:2159-2165(1988)];c-myc標(biāo)簽及其8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10抗體[Evan等，MolecularandCellularBiology,5:3610-3616(1985)];及單純皰滲病毒糖蛋白D(gD)標(biāo)簽及其抗體[Paborsky等，ProteinEngineering,3(6):547-553(1990)]。其它標(biāo)簽多肽包括Flag肽[H叩p等，BioTechnology,6:1204-1210(1988)];KT3表位肽[Martin等，Science,255:192-194(1992)];a-微管蛋白表位肽[Skinner等，J.Biol.Chem.,266:15163-15166(1991)];及T7基因10蛋白肽標(biāo)簽[Lutz-Freyermuth等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:6393-6397(1990)]。在備選的實施方案中，Wnt拮抗劑包含變體Fc構(gòu)件。例如，F(xiàn)c區(qū)可以包含人Fc區(qū)序列(例如人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4Fc區(qū))，其在一個或多個氨基酸位置(包括鉸鏈半胱氨酸)處包含氨基酸修飾(例如替代)。在一個實施方案中，此類變體與參照Fc多肽序列具有至少70。/。、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸序列同一性。在一個實施方案中，F(xiàn)c區(qū)變體可以展現(xiàn)出改變的新生兒Fc受體(FcRn)結(jié)合親和力。此類變體Fc區(qū)可以在Fc區(qū)氨基酸位置238、252、253、254、255、256、265、272、286、288、303、305、307、309、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、386、388、400、413、415、424、433、434、435、436、439或447中的任何一個或多個處包含氨基酸修飾，其中Fc區(qū)中殘基的編號方式是如Kabat中EU索引的編號方式。對FcRn具有降低的結(jié)合的Fc區(qū)變體可以在Fc區(qū)氨基酸位置252、253、254、255、288、309、386、388、400、415、433、435、436、439或447(EU索引/Kabat編號方式)中的任何一個或多個處包含氨基酸修飾?；蛘?，展現(xiàn)出對FcRn的結(jié)合增加的變體在Fc區(qū)氨基酸位置238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434(EU索引/Kabat編號方式)中的任何一個或多個處包含氨基酸修飾。在另一個實施方案中，F(xiàn)c區(qū)變體可以展現(xiàn)出對Fc丫R的結(jié)合降低，并在Fc區(qū)位置238、239、248、249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、292、293、294、295、296、298、301、303、322、324、327、329、333、335、338、340、373、376、382、388、389、414、416、419、434、435、437、438或439(EU索引/Kabat編號方式)處包含氨基酸修飾。在又一個實施方案中，F(xiàn)c區(qū)變體可以展現(xiàn)出對FcyRII的結(jié)合降低，并在Fc區(qū)氨基酸位置238、265、269、270、292、294、295、298、303、324、327、329、333、335、338、373、376、414、416、419、435、438或439(EU索引/Kabat編號方式)中的任何一個或多個處包含氨基酸修飾。在進一步的實施方案中，F(xiàn)c區(qū)變體可以展現(xiàn)出對FcYRJI的結(jié)合增強，并在Fc區(qū)氨基酸位置238、265、269、270、292、294、295、298、303、324、327、329、333、338、373、376、414、416、419、435、438或439(EU索引/Kabat編號方式)中的任何一個或多個處包含氨基酸修飾。在進一步的實施方案中，感興趣的Fc區(qū)變體可以展現(xiàn)出對FcgRIII的結(jié)合降低，并在Fc區(qū)氨基酸位置238、239、249、252、254、265、268、269、270、272、278、289、293、294、295、296、301、303、322、327、329、338、340、373、376、382、388、389、416、434、435或437(EU索引/Kabat編號方式)中的任何一個或多個處包含氨基酸修飾。在進一步的實施方案中，具有改變的(即改善的或削弱的)Clq結(jié)合和/或4卜體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)的Fc區(qū)變體記載于W099/51642。此類變體可以在Fc區(qū)氨基酸位置270、322、326、327、329、331、333或334中的任何一個或多個處包含氨基酸替代。還可參見涉及Fc區(qū)變體的Duncan和Winter,Nature322:738-40(1988);美國專利5,648,260;美國專利5,624,821及W094/29351。B.Wnt拮抗劑的制備以下描述主要涉及通過培養(yǎng)經(jīng)包含Wnt拮抗劑多肽編碼核酸的載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞來生成Wnt拮抗劑多肽。當(dāng)然，可以采用備選方法(其在本領(lǐng)域是公知的)來制備此類Wnt拮抗劑。例如，合適的氨基酸序列或其部分可以通過使用固相技術(shù)的直接肽合成來生成[參見例如Stewart等，Solid-PhasePeptideSynthesis,W.H.FreemanCo.,SanFrancisco,CA(1969);Merrifield,J.Am.Chem.Soc.,85:2149-2154(1963)]。體外蛋白質(zhì)合成可以使用手動技術(shù)或通過自動化來實施。可以實現(xiàn)自動化合成，例如4吏用AppliedBiosystems肽合成儀(FosterCity,CA)使用制造商的說明書來實現(xiàn)。Wnt拮抗劑多肽的各個部分可以使用化學(xué)或酶促方法來分開地化學(xué)合成并組合以生成期望的序列。1.編碼Wnt拮抗劑多肽的DNA的分離可以自cDNA文庫獲得編碼Wnt拮抗劑的拮抗劑或任何期望構(gòu)件結(jié)構(gòu)域(諸如Frz或sFRP)序列的DNA，該cDNA文庫是從認(rèn)為擁有此類序列并以可檢測水平表達(dá)此類序列的組織中制備的。因而，人Frz或sFRP序列DNA可以方便地獲自從人組織中制備的cDNA文庫。期望的DNA序列基因還可以獲自基因組文庫或通過已知的合成規(guī)程(例如自動化核酸合成)獲得?？梢杂迷O(shè)計的^t笨針(諸如至少約20-80個石威基的寡核苷酸)篩選文庫以鑒定感興趣基因或由其編碼的蛋白質(zhì)。用所選擇的探針篩選cDNA或基因組文庫可以使用標(biāo)準(zhǔn)規(guī)程(諸如記載于Sambrook等，MolecularCloning:ALaboratoryManual(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中的)來進行。分離編碼Wnt拮抗劑多肽及其構(gòu)件的基因的備選方法是使用PCR方法[Sambrook等，見上文；Dieffenbach等，PCRPrimer:ALaboratoryManual(ColdSpringHarborLaboratoryPress,1995)]。篩選cDNA文庫的技術(shù)在本領(lǐng)域是公知的。選作探針的寡核苷酸序列應(yīng)當(dāng)有足夠的長度，并且是足夠明確的以使得假陽性降至最低。寡核苷酸優(yōu)選的方法在本領(lǐng)域是公知的，并包括使用放射性標(biāo)記物(像"P-標(biāo)記的ATP)、生物素化或酶標(biāo)記。雜交條件(包括中等嚴(yán)格性和高度嚴(yán)格性)在Sambrook等，見上文中有提供。56此類文庫篩選方法中鑒定的序列可以與公共數(shù)據(jù)庫(諸如GenBank)或其它私有序列數(shù)據(jù)庫中存儲且可獲得的其它已知序列相比較和比對。分子的規(guī)定區(qū)域內(nèi)或整個全長序列的序列同一性(或是在氨基酸水平或是在核苷酸水平)可以使用本領(lǐng)域已知的及本文所述的方法來測定。編碼Fc免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的DNA序列可以衍生自分泌期望Fc亞型的單抗的雜交瘤細(xì)胞。可以如下獲得具有蛋白質(zhì)編碼序列的核酸，即使用本文首次公開的推理氨基酸序列，并在需要時如Sambrook等，見上文所述的那樣使用常規(guī)引物延伸規(guī)程來篩選選擇的cDNA或基因組文庫以檢測前體，并處理可能還沒有逆轉(zhuǎn)錄成cDNA的mRNA中間體。2.宿主細(xì)胞的選擇和轉(zhuǎn)化將宿主細(xì)胞用本文所述用于Wnt拮抗劑多肽生成的表達(dá)或克隆載體轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化，并在為了誘導(dǎo)啟動子、選擇轉(zhuǎn)化體、或擴增編碼期望序列的基因而適當(dāng)改良的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。技術(shù)人員無需過度實驗就可以選擇培養(yǎng)條件，諸如培養(yǎng)基、溫度、pH等。一般而言，用于使細(xì)胞培養(yǎng)物生產(chǎn)力最大化的原理、方案、及實踐技術(shù)可參見MammalianCellBiotechnology:APracticalApproach,M.Butler,編(IRLPress,1991)和Sambrook等，見上文。真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染和原核細(xì)胞轉(zhuǎn)化的方法對于普通技術(shù)人員是已知的，例如，CaCl2、CaP04、脂質(zhì)體介導(dǎo)的和電穿孔。根據(jù)使用的宿主細(xì)胞，使用對于此類細(xì)胞適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)技術(shù)來實施轉(zhuǎn)化。采用氯化鈣的鈣處理(如記載于Sambrook等，見上文的)或電穿孔一般用于原核生物。根癌土壤桿菌(jgra6acten'wmz^me/ac/era)感染用于某些才直物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，如Shaw等，Gene,23:315(1983)和1989年6月29日公布的WO89/05859所記載的。對于沒有此類細(xì)胞壁的哺乳動物細(xì)胞，可以采用Graham和vanderEb,Virology,52:456-457(1978)的磷酸4丐沉淀方法。哺乳動物細(xì)胞宿主系統(tǒng)轉(zhuǎn)染的一般性方面已經(jīng)記載于美國專利No.4,399,216。典型地，依照VanSolingen等，J.Bact.,130:946(1977)和Hsiao等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),76:3829(1979)的方法來實施向酵母中的轉(zhuǎn)化。然而，還可以使用用于將DNA導(dǎo)入細(xì)胞的其它方法，諸如通過核顯微注射、電穿孔、與完整細(xì)胞進行的細(xì)菌原生質(zhì)體融合、或聚陽離子，例如Polybrene、多鳥氨酸。對于轉(zhuǎn)化哺乳動物細(xì)胞的各種技術(shù)，參見Keown等，MethodsinEnzymology,185:527-537(1990)和Ma勵ur等，Nature,57336:348-352(1988)。適于克隆或表達(dá)本文載體中的DNA的宿主細(xì)胞包括原核細(xì)胞、酵母細(xì)胞、或高等真核細(xì)胞。合適的原核生物包括但不限于真細(xì)菌，諸如革蘭氏陰性的或革蘭氏陽性的生物體，例如腸桿菌科，諸如大腸桿菌。多種大腸桿菌菌林是公眾可獲得的，諸如大腸桿菌K12菌抹MM294(ATCC31,446);大腸桿菌X1776(ATCC31,537);大腸桿菌菌林W3110(ATCC27，325)及K5772(ATCC53,635)。其它合適的原核宿主細(xì)胞包括腸桿菌科(五"&ra&"eWaceae)，諸如埃希氏菌屬(&c/7en'c/^)(例如大腸桿菌或大腸埃希氏桿菌(Eco//))、腸桿菌屬0&2feraZ^c^")、歐文氏菌屬(5nWm'a)、克雷伯氏菌屬(尺/6&&//")、變形菌屬(iVoew)、沙門氏菌屬(Sa/mo"e〃a)(例如鼠傷寒沙門氏菌(>S"a/mcwe〃a/yp/H'wwn'"m))、沙雷氏菌屬(5^rah'a)(例如粘質(zhì)沙雷氏菌(5^rra"a))、及志賀氏菌屬(幼/<^//(3)、以及芽孢桿菌屬(^ZC////)(諸如枯草芽孢桿菌CB.w^7/s)和地衣芽孢桿菌(及//c/zem/om^)(例如1989年4月12曰公開的DD266,710中所披露的地衣芽孢桿41P))、假單胞菌屬CP"^fo/wwoy)(諸如銅綠假單胞菌CPaen^'mwa))、及鏈霉菌屬(5^eptomyces)。這些例子是例示性的而非限制性的。菌抹W3110是一種具體的優(yōu)選宿主或親本宿主，因為其是供重組DNA產(chǎn)物發(fā)酵用的常用宿主菌抹。優(yōu)選地，宿主細(xì)胞分泌最少量的蛋白水解酶。例如，可以修飾菌抹W3110以在編碼宿主內(nèi)源性蛋白質(zhì)的基因中產(chǎn)生遺傳突變，此類宿主的例子包括大腸桿菌W3110菌林1A2(其具有完整基因型to;^4);大腸桿菌W3110菌抹9E4(其具有完整基因型to,x4/^3);大腸桿菌W3110菌抹2707(ATCC55,244)(其具有完整基因型to"J5f^gF-/ac」/69ow/r);大腸桿菌W3110菌抹37D6(其具有完整W3110菌抹40B4(其是含非卡那霉素抗性deg尸刪除突變的菌抹37D6);及具有1990年8月7日公告的美國專利No.4,946，783所披露的突變型周質(zhì)蛋白酶的大腸桿菌菌抹?；蛘撸w外克隆方法(例如PCR或其它核酸聚合酶反應(yīng))是合適的。全長抗體、抗體片段、及抗體融合蛋白可以在細(xì)菌中生成，特別是在不需要糖基化和Fc效應(yīng)器功能時，諸如在治療性抗體偶聯(lián)至細(xì)胞毒劑(例如毒素)且免疫偶聯(lián)物自身在腫瘤細(xì)胞破壞中顯示功效時。全長抗體在循環(huán)中具有較長的半衰期。大腸桿菌中的生成是較快的且較合算。對于在細(xì)菌中表達(dá)參見例如美國專利5，648,237(Carter等)、美國專利5，789，199(Joly等)、及美國專利5,840，523(Simmons等)(其描述了使表達(dá)和分泌優(yōu)化的翻譯起始區(qū)(TIR)和信號序列)，本文收錄這些專利作為參考。表達(dá)后，抗體以可溶性級分從大腸桿菌細(xì)胞漿中分離，并可以通過例如蛋白A或G柱(取決于同種型)來純化?？梢詫嵤┳罱K的純化，其類似于用于純化例如CHO細(xì)胞中表達(dá)的抗體的方法。在原核生物之外，真核微生物(諸如絲狀真菌或酵母)是適于Wnt拮抗劑多肽編碼載體的克隆或表達(dá)宿主。釀酒酵母或卑酒糖酵母(Sacc/^rawyc^cerev&ae)是常用的低等真核宿主微生物。其它的包括粟酒裂殖糖酵母(5t/2/zoacc/zara附y(tǒng)ces;om6e)(Beach和Nurse,Nature,.290:140[1981];1985年5月2日公布的EP139,383);克魯維氏酵母屬(尺/wyveraw;;ce力宿主(美國專利No.4,943,529;Fleer等，Bio/Technology,9:968-975(1991))，諸如例如乳克魯維氏酵母(K/acto)(MW98-8C，CBS683，CBS4574;Louvencourt等，J.Bacteriol.，154(2):737-742[1983])、脆壁克魯維氏酵母(I/rag/fe)(ATCC12,424)、保加利亞克魯維氏酵母(KZm/g(3n'c^)(ATCC16,045)、威克曼氏克魯維氏酵母(vWcferam//)(ATCC24,178)、Kwa/"7(ATCC56,500)、果蠅克魯維氏酵母(K<imop/z//orww)(ATCC36,906);VandenBerg等,Bio/Technology,8:135(1990))、耐熱克魯維氏酵母(KAermoto/era""、及馬克斯克魯維氏酵母(K,腦,"x/朋M5);亞羅酵母屬Gwrow/a)(EP402,226);巴斯德畢赤氏酵母(尸/c/n'a戸to"'5)(EP183,070;Sreekrishna等,J.BasicMicrobiol"28:265-278[1988]);假絲酵母屬(C朋Ada);瑞氏木霉(7Hc/20&rma"ew'a)(EP244,234);粗糙月永孑包霉(他,，racra扁)(Case等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76:5259-5263[1979]);許旺氏酵母屬(Sc/w朋m'om少ce力，諸如西方許旺氏酵母真菌，諸如例如脈孢霉菌(7Veww/ora)、青霉屬(尸ew'c/〃&m)、彎頸霉屬宿主，諸如構(gòu)巢曲霉(Am'(iw/(ms0(Balance等,Biochem.Biophys.Res.Commun.，112:284-289[1983];Tilburn等，Gene,26:205-221[1983];Yelton等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:1470-1474[1984])及黑曲霉(Am.ge。(Kelly和Hynes,EMBOJ.,4:475-479[1985])。甲基營養(yǎng)型酵母在本文中是合適的，并包括但不限于選自下列屬的、能夠在曱醇上生長的酵母漢遜氏酵母屬(1990年10月31日公布的EP394,538);及絲狀,及曲霉屬(v4^erg/〃—(Z/araemJa)、假絲酵母屬、克勒克氏酵母屬(K/oecfera)、畢赤氏酵母屬(尸/c/w'a)、糖酵母屬(Sacc/wram少ce"、球擬酵母屬(7bnJo戸^)、及紅酵母屬(;/70^tora/a)。這類酵母例示性的特定種類的列表可參見C.Anthony,TheBiochemistryofMethylotrophs,269(1982)。適于表達(dá)糖基化Wnt拮抗劑多肽的宿主細(xì)胞衍生自多細(xì)胞生物體。無脊推動物細(xì)胞的例子包括昆蟲細(xì)胞(諸如果蠅S2及夜蛾(Spodoptera)Sf9),以及植物細(xì)胞，諸如棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、牽?；?、番茄、及煙草的細(xì)胞培養(yǎng)物。已經(jīng)鑒定出很多桿狀病毒抹和變體及相應(yīng)的來自下組宿主的許可性昆蟲宿主細(xì)胞，諸如草地夜蛾(S/ocfo;^ra/n^peWa)(毛蟲)、埃及伊蚊(」eJ^(蚊子)、白紋伊蚊(J^fesa/k^/"w)(蚊子)、黑腹果錄(Drow;/7z7awe/朋ogos^r)(果繩)，及家蠶Cgowxmon')。用于轉(zhuǎn)染的多種病毒林是公眾可獲得的(例如苜蓿尺蠖04wtograp/zaca/^brm'ca)NPV的L-1變體和家蠶NPV的Bm-5抹)，并且此類病毒可以用作依照本發(fā)明的本文中的病毒，特別是用于轉(zhuǎn)染草地夜蛾細(xì)胞。然而，興趣最大的是脊推動物細(xì)胞，而且使培養(yǎng)(組織培養(yǎng))中的脊推動物細(xì)胞增殖已經(jīng)成為常規(guī)規(guī)程。有用的哺乳動物宿主細(xì)胞系的例子是經(jīng)SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CVl系(COS-7，ATCCCRL1651);人胚腎系(293細(xì)胞或為了在懸浮培養(yǎng)中生長而亞克隆的293細(xì)胞，Graham等，J.GenVirol.36:59(1977));幼年倉鼠腎細(xì)胞(BHK，ATCCCCL10);中國倉鼠卵巢細(xì)胞/-DHFR(CHO，Urlaub等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980));小鼠塞托利(sertoli)細(xì)胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23:243-251(1980));猴腎細(xì)胞(CV1ATCCCCL70);非洲綠猴腎細(xì)胞(VERO-76,ATCCCRL-1587);人宮頸癌細(xì)胞(HELA,ATCCCCL2);犬腎細(xì)胞(MDCK,ATCCCCL34);牛鼠(buffalorat)肝細(xì)胞(BRL3A,ATCCCRL1442);人肺細(xì)胞(W138，ATCCCCL75);人肝細(xì)胞(HepG2,HB8065);小鼠乳房胂瘤(MMT060562,ATCCCCL51);TRI細(xì)胞(Mather等，AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982》；MRC5細(xì)胞；FS4細(xì)胞；及人肝瘤(hepatoma)系(HepG2)。將宿主細(xì)胞用上文所述供Wnt拮抗劑多肽生成用的表達(dá)或克隆載體轉(zhuǎn)化，并在為了誘導(dǎo)啟動子、選擇轉(zhuǎn)化體、或擴增編碼期望序列的基因而適當(dāng)改良的常規(guī)營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。3.可復(fù)制載體的選擇和使用60本發(fā)明的一方面提供了插入供克隆(DNA的擴增)用的或供表達(dá)用的可復(fù)制載體中的編碼Wnt拮抗劑多肽的核酸(例如cDNA或基因組DNA)。多種載體是公眾可獲得的。載體可以是例如質(zhì)粒、粘粒、病毒顆粒、或噬菌體形式。合適的核酸序列可以通過多種規(guī)程而插入載體中。一般而言，使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)將DNA插入合適的限制性內(nèi)切核酸酶位點中。載體構(gòu)件一^殳包括但不限于以下一種或多種信號序列、復(fù)制起點、一種或多種標(biāo)志基因、增強子元件、啟動子、及轉(zhuǎn)錄終止序列。含有一種或多種這些構(gòu)件的合適載體的構(gòu)建釆用對于技術(shù)人員已知的標(biāo)準(zhǔn)連接技術(shù)。Wnt拮抗劑不僅可以直接重組生成，而且還可以作為含異源多肽(其可以是在成熟蛋白或多肽的N端的信號序列或具有特定切割位點的其它多肽)的融合多肽而重組合成。一般而言，信號序列可以是載體的構(gòu)件，或者其可以是插入載體中的Wnt拮抗劑多肽編碼DNA的一部分。信號序列可以是原核信號序列，其選自例如堿性磷酸酶、青霉素酶、lpp、或熱穩(wěn)定的腸毒素II前導(dǎo)。對于酵母分泌，信號序列可以是例如酵母轉(zhuǎn)化酶前導(dǎo)、a-因子前導(dǎo)(包括糖酵母屬和克魯維氏酵母屬a-因子前導(dǎo)序列，后者記載于美國專利No.5,010，182)、或酸性磷酸酶前導(dǎo)、白色假絲酵母(C.a/6/cam)葡糖淀粉酶前導(dǎo)(1990年4月4日公布的EP362,179)、或1990年11月15日公布的WO90/13646所記載的信號。在哺乳動物細(xì)胞表達(dá)中，可以使用哺乳動物信號序列來指導(dǎo)蛋白質(zhì)分泌，諸如來自相同或相關(guān)物種的分泌性多肽的信號序列，以及病毒分泌前導(dǎo)。表達(dá)載體和克隆載體都含有使得載體能夠在一種或多種所選擇的宿主細(xì)胞中復(fù)制的核酸序列。用于多種細(xì)菌、酵母、和病毒的此類序列是公知的。來自質(zhì)粒pBR322的復(fù)制起點適用于大多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌，2p質(zhì)粒起點適用于酵母，而各種病毒起點(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)對于哺乳動物細(xì)胞中的克隆載體是有用的。表達(dá)和克隆載體典型地會包含選擇基因(也稱為選擇標(biāo)志)。典型的選擇基因編碼下述蛋白質(zhì)，其(a)賦予對抗生素或其它毒素(例如氨節(jié)青霉素、新霉素、曱氨蝶呤、或四環(huán)素)的抗性，(b)補充營養(yǎng)缺陷型缺陷，或(c)提供不能從復(fù)合培養(yǎng)基獲得的關(guān)鍵營養(yǎng)物，例如編碼芽孢桿菌D-丙氨酸消旋酶的基因。適用于哺乳動物細(xì)胞的選擇標(biāo)志的例子是那些使得有能力攝取Wnt拮抗劑編碼核酸的細(xì)胞得以鑒定的選擇標(biāo)志，諸如DHFR或胸苷激酶。在釆用野生型DHFR時，適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞是DHFR活性缺陷的CHO細(xì)胞系，其制備和增殖如Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216(1980)所述的。適合酵母中使用的選擇基因是酵母質(zhì)粒YRp7中存在的/^7基因[Stinchcomb等，Nature,282:39(1979);Kingsman等，Gene,7:141(1979);Tschemper等,Gene,10:157(1980)]。trpl基因提供了供缺乏在色氨酸中生長能力的酵母突變型菌抹(例如ATCCNo.44076或PEP4-1[Jones,Genetics,85:12(1977)])用的選擇標(biāo)志。表達(dá)和克隆載體通常包含與Wnt拮抗劑編碼核酸序列可操作連接的啟動子以指導(dǎo)mRNA合成。多種潛在宿主細(xì)胞所識別的啟動子是7>知的。適于與原核宿主一起使用的啟動子包括(3-內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動子系統(tǒng)[Chang等,Nature,275:615(1978);Goeddel等，Nature,281:544(1979)]、石咸性磷酸酶、色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)[Goeddd，NucleicAcidsRes.,8:4057(1980);EP36,776]、及雜合啟動子，諸如tac啟動子[deBoer等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80:21-25(1983)]。細(xì)菌系統(tǒng)中使用的啟動子還會包含與編碼Wnt拮抗劑多肽的DNA可操作連接的Shine-Dalgamo(S.D.)序列。適于與酵母宿主一起使用的啟動序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶的啟動子[Hitzeman等，J.Biol.Chem.,255:2073(1980)]或其它糖酵解酶(諸如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脫氬酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、磷酸葡萄糖異構(gòu)酶、及葡糖激酶)的啟動子[Hess等，J.Adv.EnzymeReg.,7:149(1968);Holland,Biochemistry,17:4900(1978)]。其它酵母啟動子(其是具有額外優(yōu)勢即轉(zhuǎn)錄受生長條件控制的誘導(dǎo)型啟動子)是下組蛋白質(zhì)的啟動子區(qū)醇脫氫酶2、異細(xì)胞色素(isocytochrome)C、酸性磷酸酶、與氮代謝有關(guān)的降解酶、金屬硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、及負(fù)責(zé)麥芽糖和半乳糖利用的酶。適于在酵母表達(dá)中使用的載體和啟動子在EP73,657中有進一步的描述。在哺乳動物宿主細(xì)胞中來自載體的Wnt拮抗劑多肽轉(zhuǎn)錄受到如下啟動子控制，例如自病毒(諸如多瘤病毒、禽痘病毒U989年7月5日公布的UK2,211,504)、腺病毒(諸如腺病毒2)、牛乳頭狀瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨細(xì)胞病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、乙型肝炎病毒及猿病毒40(SV40))基因組、異源哺乳動物啟動子(例如肌動蛋白啟動子或免疫球蛋白啟動子)、及自熱^木克啟動子獲得的啟動子，倘若此類啟動子與宿主細(xì)胞系統(tǒng)相容的話。高等真核生物轉(zhuǎn)錄編碼Wnt拮抗劑多肽的DNA可以通過將增強子序列插入載體中而得以增加。增強子是對啟動子起作用而增加其轉(zhuǎn)錄的順式作用DNA元件，通常為約10-300bp。目前已知許多來自哺乳動物基因(珠蛋白、彈性蛋白酶、清蛋白、曱胎蛋白、及胰島素)的增強子序列。典型地，然而，會使用來自真核細(xì)胞病毒的增強子。例子包括復(fù)制起點的晚期側(cè)上的SV40增強子(bp100-270)、巨細(xì)胞病毒早期啟動子增強子、復(fù)制起點的晚期側(cè)上的多瘤病毒增強子、及腺病毒增強子。增強子可以在Wnt拮抗劑多肽編碼序列的5，或3，位置剪接入載體中，但優(yōu)選位于啟動子的5，位點。真核宿主細(xì)胞(酵母、真菌、昆蟲、植物、動物、人、或來自其它多細(xì)胞生物體的有核細(xì)胞)中使用的表達(dá)載體還會包含轉(zhuǎn)錄終止及使mRNA穩(wěn)定所必需的序列。此類序列通?？色@自真核生物的或病毒的DNA或cDNA的5，非翻譯區(qū)，偶爾地3，非翻譯區(qū)。這些區(qū)域包含作為編碼Wnt拮抗劑的mRNA的非翻譯部分中的多腺苷酸化片段轉(zhuǎn)錄的核苷酸區(qū)段。適于改編后在重組脊推動物細(xì)胞培養(yǎng)物中合成Wnt拮抗劑多肽的其它方法、載體和宿主細(xì)胞記載于Gething等，Nature,293:620-625(1981);Mantei等,Nature,281:40-46(1979);EP117,060;及EP117,058。4.培養(yǎng)宿主細(xì)月包本發(fā)明的一方面才是供了包含編碼Wnt拮抗劑的核酸的宿主細(xì)胞。用于生成本發(fā)明的Wnt拮抗劑多肽的宿主細(xì)胞可以在多種培養(yǎng)基中培養(yǎng)。商品化的培養(yǎng)基(諸如Ham氏FlO(Sigma)、極限必需培養(yǎng)基(MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、及Dulbecco氏改良Eagle氏培養(yǎng)基((DMEM)Sigma))適于培養(yǎng)宿主細(xì)月包。此外，Ham等，Meth.Enz.58:44(1979);Barnes等，Anal.Biochem.102:255(1980),美國專利No.4,767,704;4,657,866;4,927,762;4,560,655;或5,122,469;WO90/03430;WO87/00195;或美國專利Re.30,985中所述的任何培養(yǎng)基可以用作宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基。任何這些培養(yǎng)基可以在需要時補充激素和/或其它生長因子(諸如胰島素、運鐵蛋白、或表皮生長因子)、鹽類(諸如氯化鈉、4丐、鎂、及磷酸鹽)、緩沖劑(諸如HEPES)、核苷酸(諸如腺苷和胸芬)、抗生素(諸如GENTAMYCINTM藥物)、痕量元素(定義為通常以微摩爾范圍中的終濃度存在的無機化合物)、及葡萄糖或等同能源。還可以包括本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的適當(dāng)濃度的任何其它必需的補充物。培養(yǎng)條件63(諸如溫度、pH等)就是那些先前與選擇用于表達(dá)的宿主細(xì)胞一起使用的，而且對于普通技術(shù)人員是顯而易見的。5.檢測基因擴增/表達(dá)基于本文所提供的序列，基因擴增和/或表達(dá)可以在樣品中直接測量，例如使用適當(dāng)標(biāo)記的探針通過常規(guī)Southem印跡、Northern印跡(用以定量m脂A的轉(zhuǎn)錄)[Thomas,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:52015205(1980)]、斑點印跡(DNA分析)、或原位雜交來實現(xiàn)?；蛘撸梢圆捎媚茏R別特定雙鏈體的抗體，所述雙鏈體包括DNA雙鏈體、RNA雙鏈體、及DNA-RNA雜合雙鏈體或DNA-蛋白質(zhì)雙鏈體。繼而可以標(biāo)記抗體，并可以實施測定法，其中雙鏈體結(jié)合至表面，使得在表面上形成雙鏈體后，可以檢出雙鏈體所結(jié)合的抗體的存在?；蛘撸虮磉_(dá)可以通過免疫學(xué)方法(諸如細(xì)胞或組織切片的免疫組織化學(xué)染色和細(xì)胞培養(yǎng)物或體液的測定法)來測量以直接定量基因產(chǎn)物的表達(dá)。對于免疫組織化學(xué)染色和/或體液測定法有用的抗體可以是單克隆的或多克隆的，而且可以在任何哺乳動物中制備。方便地，抗體可以針對本文所鑒Wnt拮抗劑融合且編碼特定抗體表位的外源序列而制備。6.Wnt拮抗劑的純化可以從培養(yǎng)基或從宿主細(xì)胞溶胞產(chǎn)物中回收各種形式的Wnt拮抗劑多肽。若膜結(jié)合的，則可以使用合適的去污劑溶液(例如Triton-X100)或通過酶促切割而將其從所述膜中釋放。Wnt拮抗劑多肽的表達(dá)中所采用的細(xì)胞可以通過多種物理或化學(xué)手段(諸如冷凍-融化循環(huán)、超聲處理、機械石皮石爭、或細(xì)胞溶胞劑)來破壞?？赡芟Ｍ麖闹亟M細(xì)胞蛋白或多肽中純化Wnt拮抗劑多肽。如下規(guī)程是合適的純化M^程的例示通過在離子交換柱上分級；乙醇沉淀；反相HPLC;硅土上或陽離子交換樹脂(諸如DEAE)上的層析；層析聚焦；SDS-PAGE;硫酸銨沉淀；使用例如S印hadexG-75的凝膠過濾；蛋白ASepharose柱以除去污染物，諸如IgG;及金屬螯合柱以結(jié)合加表位標(biāo)簽形式的Wnt拮抗劑?？梢圆捎玫鞍踪|(zhì)純化的多種方法，而且此類方法在本領(lǐng)域中是已知的，并記載于例^口Deutscher,MethodsinEnzymology，182(1990);Scopes,ProteinPurification:PrinciplesandPractice,Springer-Verlag,NewYork(1982)。所選擇的純化步驟會取決于例如所使用的生成方法和所生成的特定Wnt拮抗劑多肽的性質(zhì)。在使用重組技術(shù)時，Wnt拮抗劑多肽可以在細(xì)胞內(nèi)、周質(zhì)空間中生成，或直接分泌至培養(yǎng)基中。若Wnt拮抗劑多肽在細(xì)胞內(nèi)生成，則作為第一步，通過例如離心或超濾來除去顆粒碎片(或是宿主細(xì)胞或是溶胞碎片)。Carter等，Bio/Technology10:163-167(1992)描述了用于分離分泌到大腸桿菌周質(zhì)空間中的抗體的規(guī)程。簡言之，在醋酸鈉(pH3.5)、EDTA、及苯曱基石黃酰氟(PMSF)存在下在約30分鐘里融解(thaw)細(xì)胞漿。細(xì)胞碎片可以通過離心來除去。若Wnt拮抗劑多肽被分泌至培養(yǎng)基中，則一般首先使用商品化的蛋白質(zhì)濃縮濾器(例如Amicon或MilliporePellicon超濾單元)來濃縮來自此類表達(dá)系統(tǒng)的上清液。任何上述步驟中可以包括蛋白酶抑制劑(諸如PMSF)以抑制蛋白水解，且可以包括抗生素以阻止外來污染物的生長。自細(xì)胞制備的Wnt拮抗劑多肽組合物可以使用例如羥磷灰石層析、凝膠電泳、透析、及親和層析來純化，且親和層析是優(yōu)選的純化技術(shù)。作為親和配體的蛋白A的適合性取決于抗體中存在的任何免疫球蛋白Fc結(jié)構(gòu)域的種類和同種型。蛋白A可以用于純化基于人yl、丫2或Y4重鏈的抗體(Lindmark等，J.Immunol.Meth.62:1-13(1983》。蛋白G推薦用于所有的小鼠同種型和人^(Guss等，EMBOJ.5:1567-1575(1986))。親和配體所附著的基質(zhì)最經(jīng)常是瓊脂糖，但其它基質(zhì)是可用的。機械穩(wěn)定性基質(zhì)(諸如可控孔徑玻璃或聚(苯乙烯二乙晞)苯)容許獲得比瓊脂糖更快的流速和更短的加工時間。若Wnt拮抗劑多肽包含CH3結(jié)構(gòu)域，則BakerbondABXTM樹脂(J.T.Baker，Phillipsburg,NJ)可用于純化。其它用于蛋白質(zhì)純化的技術(shù)(諸如離子交換柱上的分級、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的層析、肝素SEPHAROSETM上的層析、陰離子或陽離子交換樹脂(諸如多天冬氨酸柱)上的層析、層析聚焦、SDS-PAGE、及碌L酸銨沉淀)也是可用的，這取決于待回收的抗體。任何初步的純化步驟后，包含感興趣抗體和污染物的混合物可以進行低pH疏水相互作用層析，其中使用pH約2.5-4.5的洗脫緩沖液，優(yōu)選在j氐鹽濃度(例如約0-0.25M鹽)實施。C.藥用配制劑本發(fā)明的一方面提供了包含Wnt拮抗劑和至少一種藥學(xué)可接受的載體或賦形劑的組合物。通過將具有期望純度的Wnt拮抗劑與任選的藥學(xué)可接受的載體、貝武形齊寸或穩(wěn)、定齊寸(Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,第20版，A.Gennaro，編(2000))混合，以凍干配制劑或水溶液的形式，制^1照本發(fā)明使用的Wnt拮抗劑的治療用配制劑供貯存。"藥學(xué)可接受的載體"包括與藥物施用相容的任何及所有溶劑、分散介質(zhì)、涂層、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑等。合適載體或稀釋劑的別的例子包括但不限于水、鹽水、Finger氏溶液、右旋糖溶液、及5%人血清清蛋白。還可以使用脂質(zhì)體和非水媒介，諸如不揮發(fā)性油。除非常規(guī)媒介或藥劑與活性化合物不相容，涵蓋這些組合物的使用。組合物中還可以摻入補充性的活性化合物?？山邮艿妮d體、賦形劑或穩(wěn)定劑在所采用的劑量和濃度對接受者是無毒的，而且包括緩沖劑，諸如醋酸鹽、Tris、磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和曱硫氨酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基千基銨；氯化己烷雙胺；苯扎氯銨、苯索氯銨；酚、丁醇或苯曱醇；對羥基苯甲酸烴基酯，諸如對羥基苯曱酸曱酯或丙酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和間曱酚)；低分子量(少于約10個殘基)多肽；蛋白質(zhì)，諸如血清清蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA;張力調(diào)節(jié)劑(tonicifier),諸如海藻糖和氯化鈉；糖類，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；表面活性劑，諸如聚山梨酯；成鹽反荷離子，諸如鈉；金屬復(fù)合物(例如Zn-蛋白質(zhì)復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑，諸如TWEEN⑧、PLURONICS⑧或聚乙二醇(PEG)?？贵w優(yōu)選包含濃度在5-200mg/ml間，優(yōu)選在10-100mg/ml間的抗體。本文中的配制劑還可含有超過一種正被治療的具體適應(yīng)癥所必需的活性化合物，優(yōu)選那些具有互補活性且彼此沒有不利影響的。例如，在特定的Wnt拮抗劑之外，可以期望在一種配制劑中包含別的抗體，例如結(jié)合Wnt蛋白上不同表位的抗體、針對完全不同的Wnt蛋白的抗體、或針對一些其它靶物(諸如影響Wnt介導(dǎo)的病癥發(fā)展(growth)的生長因子)的抗體?；蛘?另外，組合物可以進一步包含化療劑、細(xì)胞毒劑、細(xì)胞因子、生長抑制劑、抗激素齊'J、和/或保心藥。此類分子以組合方式以對于預(yù)期目的有效的量適當(dāng)?shù)卮嬖??；钚猿煞诌€可以包載于例如通過凝聚技術(shù)或通過界面聚合制備的微膠66嚢中(例如分別是羥曱基纖維素或明膠微膠嚢和聚(曱基丙烯酸曱酯M鼓膠嚢)、在膠狀藥物投遞系統(tǒng)中(例如脂質(zhì)體、清蛋白微球體、微乳劑、納米顆粒和納米膠嚢)、或在粗滴乳狀液中。此類技術(shù)公開于Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,第20版,A.Gennaro，編(2000)。用于體內(nèi)施用的配制劑必須是無菌的。這可以容易地通過使用無菌濾膜過濾來實現(xiàn)。本文中的治療用組合物通常置于具有無菌存取口的容器中，例如具有皮下注射針可刺穿的塞子的靜脈內(nèi)溶液袋或藥瓶。施用的路徑依照已知的方法，例如通過靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、大腦內(nèi)、肌肉內(nèi)、目艮內(nèi)、動脈內(nèi)或損傷內(nèi)路徑，表面施用，或通過持續(xù)釋放系統(tǒng)來注射或輸注。本發(fā)明的藥用組合物的劑量和期望藥物濃度可以有所變化，取決于預(yù)想的具體用途。施用的合適劑量或路徑的確定完全在普通技術(shù)人員的技術(shù)范圍內(nèi)。動物實驗提供了用于確定人療法的有效劑量的可靠指導(dǎo)。有效劑量的物種間定標(biāo)可以遵《盾Mordenti,J.禾口Chappell，W,"Theuseofinterspeciesscalingintoxicokinetics",于ToxicokineticsandNewDrugDevelopment,Yacobi等,纟扁,PergamonPress,NewYork1989,第42-96頁規(guī)定的原則而實施。在采用本發(fā)明的物質(zhì)或分子的體內(nèi)施用時，正常劑量數(shù)量可以從每天約10ng/kg至高達(dá)100mg/kg哺乳動物體重或更多變化，優(yōu)選約1|ig/kg/天至10mg/kg/天變化，這取決于施用的路徑。文獻中提供了有關(guān)投遞的具體劑量和方法的指導(dǎo)；參見例如美國專利No.4,657,760;5,206,344;或5,225，212。不同配制劑將對不同治療用化合物和不同病癥有效，例如，靶向一種器官或組織的施用可能必須以與針對另一種器官或組織的方式不同的方式投遞。若期望在具有適于治療需要施用某種物質(zhì)或分子的任何疾病或病癥的釋放特征的配制劑中持續(xù)釋放施用該物質(zhì)或分子，則涵蓋所述物質(zhì)或分子的微嚢化。持續(xù)釋放制劑的合適例子包括含有抗體的固體疏水性聚合物半透性基質(zhì)，所述基質(zhì)處于定型產(chǎn)品形式，例如薄膜、或微膠嚢。用于持續(xù)釋放的重組蛋白的微嚢化已經(jīng)成功實施于人生長激素(rhGH)、干擾素-aj(rhIFN-a,1)、白介素-2、及薩rgpl20。Johnson等，Nat.Med.,2:795-799(1996);Yasuda,Biomed.Ther"27:1221-1223(1993);Hora等，Bio/Technology，8:755-758(1990);Cleland,"DesignandProductionofSingleImmunizationVaccinesUsingPolylactidePolyglycolideMicrosphereSystems,"于VaccineDesign:TheSubunitandAdjuvantApproach,Powell和Newman,編，(PlenumPress:NewYork,1995)，pp.439-462;WO97/03692,WO96/40072，WO96/07399;及美國專利No.5,654,010。由于聚乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA)聚合物的生物相容性和寬范圍的生物可降解性質(zhì)，可以使用其來開發(fā)這些蛋白質(zhì)的持續(xù)釋放配制劑。PLGA的降解產(chǎn)物(乳酸和乙醇酸)可以在人體內(nèi)快速清除。此外，該聚合物的可降解性可以調(diào)整為數(shù)月至數(shù)年，取決于其分子量和組成。Lewis,"Controlledreleaseofbioactiveagentsfromlactide/glycolidepolymer",于M.Chasin和R.Langer(編),BiodegradablePolymersasDrugDeliverySystems(MarcelDekker:NewYork,1990)，pp.1-41。持續(xù)釋放基質(zhì)的別的例子包括聚酯、水凝膠(例如聚(2-羥乙基-曱基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美國專利No.3,773,919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸Y乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物諸如LUPRONDEPOT(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林構(gòu)成的可注射微球體)及聚-D-(-)-3-羥基丁酸。D.治療Wnt介導(dǎo)的病癥的方法法，包括給所述哺乳動物施用治療有效量的Wnt拮抗劑。在一個實施方案中，所述病癥是與Wnt信號傳導(dǎo)活性的表達(dá)異常(例如增加)有關(guān)的細(xì)胞增殖性病癥。在另一個實施方案中，所述病癥源自Wnt蛋白的表達(dá)增加。在又一個實施方案中，所述細(xì)月包增殖性病癥是癌癥，諸如例如結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、乳腺癌、與涉及HSC的多種病癥有關(guān)的癌癥(諸如白血病和多種其它血液相關(guān)癌癥)、及涉及神經(jīng)元增殖性病癥的癌癥(包括腦瘤，諸如神經(jīng)力交質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、腦脊膜瘤、許旺氏細(xì)胞瘤、垂體瘤、原始性神經(jīng)外胚層瘤(PNET)、髓母細(xì)胞瘤、顱咽管瘤、及松果體區(qū)腫瘤(pinealregiontumor))。通過施用Wnt拮抗劑治療細(xì)胞增殖性病癥在如下一項或多項中導(dǎo)致可觀察和/或可測量的降低或消失癌細(xì)胞數(shù)目減少或癌細(xì)胞消失；腫瘤大小的降低；癌細(xì)胞浸潤到周圍器官中，包括癌傳播到軟組織和骨中受到抑制(即一定程度的減緩，優(yōu)選停止)；腫瘤轉(zhuǎn)移受到抑制(即一定程度的減緩，優(yōu)選停止)；肺瘤生長受到一定程度的抑制；和/或與特定癌癥有關(guān)的一種或多種癥狀得到一定程度的減輕；發(fā)病率和死亡率降低，及生命質(zhì)量提高。就Wnt拮抗劑可預(yù)防癌細(xì)胞生長和/或殺死現(xiàn)有癌細(xì)胞的程度而言，它可以是抑制細(xì)胞的和/或毒害細(xì)胞的。這些征候或癥狀的減輕還可以由患者感受到。用于評估成功治療和改善疾病的以上參數(shù)是可通過內(nèi)科醫(yī)師所熟悉的常規(guī)規(guī)程容易測量的。對于癌癥療法，功效可以通過例如評估病情進展前時間(TDP)和/或測定應(yīng)答率(RR)來測量?？梢匀缦聹y定轉(zhuǎn)移，即通過腫瘤分期(staging)測試和通過骨掃描和針對鈣水平和其它酶的測試以測定對骨的擴散。還可以進行CT掃描以在該區(qū)域中找尋對骨盆和淋巴結(jié)的擴散。使用胸部X射線和通過已知方法進行的肝臟酶水平測量來分別找尋對肺和肝的轉(zhuǎn)移。用于監(jiān)測疾病的其它路徑包括經(jīng)直腸超聲檢查法(TRUS)和經(jīng)直腸針吸活組織4全查(TRNB)。在一個具體的實施方案中，Wnt拮抗劑的施用降低了肺瘤負(fù)荷(例如降低了癌癥的大小或嚴(yán)重性)。在又一個具體的實施方案中，Wnt拮抗劑的施用殺死癌癥。E.抑制細(xì)胞中Wnt信號傳導(dǎo)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供了抑制細(xì)胞中Wnt信號傳導(dǎo)的方法，包括使細(xì)胞與有效量的Wnt拮抗劑接觸。在一個實施方案中，所述細(xì)胞包含在哺乳動物(優(yōu)選人)內(nèi)，且施用量是治療有效量。在又一個實施方案中，抑制Wnt信號傳導(dǎo)進一步導(dǎo)致對細(xì)胞生長的抑制。在進一步的實施方案中，所述細(xì)胞是癌細(xì)胞。使用對于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法來測量對細(xì)胞增殖的抑制。例如，用于測量細(xì)胞增殖的便利測定法是CellTiter-GloTM發(fā)光細(xì)胞生存力測定法(LuminescentCellViabilityAssay),其可購自Promega(Madison,WI)。；亥測定法基于所存在的ATP(其是代謝活性細(xì)胞的指標(biāo))的定量而測定培養(yǎng)物中活細(xì)月包的數(shù)目。參見Crouch等(1993)J.Immunol.Meth.160:81-88,美國專利No.6602677。該測定法可以以96孔或384孔形式進行，4吏其適應(yīng)自動化高通量篩選(HTS)。參見Cree等(1995)AnticancerDrugs6:398-404。測定規(guī)程牽涉將單一試劑(CellTiter-Glo⑧試劑)直接添加至培養(yǎng)的細(xì)胞。這導(dǎo)致細(xì)胞溶胞，并產(chǎn)生螢光素酶反應(yīng)所生成的發(fā)光信號。發(fā)光信號與所存在的ATP量成比例，所述所存在的ATP量與培養(yǎng)物中存在的活細(xì)胞的數(shù)目成正比?？梢酝ㄟ^光度69計或CCD相機成像裝置來記錄數(shù)據(jù)。發(fā)光輸出以相對光單位(RLU)表示。F.調(diào)控Wnt靶基因表達(dá)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供了在特征在于激活的或過量的Wnt信號傳導(dǎo)的細(xì)胞中調(diào)控Wnt靶基因表達(dá)的方法，包括使細(xì)胞與有效量的Wnt拮抗劑接觸。在一個實施方案中，由于Wnt信號傳導(dǎo)而使Wnt靶基因過表達(dá)，而與Wnt拮抗劑的接觸的結(jié)果降低了Wnt靶基因的表達(dá)。在另一個實施方案中，Wnt靶基因選自軸蛋白2、APCDD1、Gadl、Saxl、c-myc、細(xì)月包周期蛋白D1、PPAR5、4足胃液素、簇蛋白(clusterin)、存活蛋白(survivin)、環(huán)氧合酶、fra-l、骨橋蛋白(osteopontin)、uPAR、密蛋白(claudin)-l、CD44、MMP-7/9/11/14/26、IGFBP-4、Met、BMP4、sox-9、組蛋白脫乙?；?、VEGF。在又一個實施方案中，由于Wnt信號傳導(dǎo)而使Wnt靶基因表達(dá)不足，而與Wnt拮抗劑的接觸的結(jié)果恢復(fù)Wnt靶基因的表達(dá)。在進一步的實施方案中，Wnt靶基因選自Leftyl、Lefty2、sFRPl、Fzd5、fas抗原、胱天蛋白酶3、整聯(lián)蛋白f37、ae整聯(lián)蛋白、hathl、脂肪酸結(jié)合蛋白2、muc-2、kruppel樣因子-4、碳酸酐酶-11、肝配蛋白(Ephrin)Bl、EphB2R、EphB3R、muc-3、組織相容性2、Q區(qū)基因座l、(32-微球蛋白。使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法(包括那些本文所述的和以下實施例中所提出的)來測定靶基因的表達(dá)。G.4全測Wnt蛋白存在的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供了在樣品中檢測Wnt蛋白存在的方法，包括使所述樣品與Wnt拮抗劑接觸，其中Wnt拮抗劑和Wnt蛋白之間復(fù)合物的存在或結(jié)合的水平指示W(wǎng)nt蛋白和/或Wnt信號傳導(dǎo)的存在。在一個實施方案中，該方法進一步包括測定Wnt信號傳導(dǎo)的水平是否異常。在該實施方案中，將所述樣品中的Wnt蛋白結(jié)合水平與已知具有生理學(xué)正常Wnt蛋白表達(dá)和/或Wnt信號傳導(dǎo)的第二樣品中的水平進行比較。與第二樣品相比的可疑樣品中的結(jié)合水平高于或低于生理學(xué)正常樣品中的結(jié)合水平指示異常的Wnt信號傳導(dǎo)。在另一個實施方案中，Wnt信號傳導(dǎo)或異常Wnt信號傳導(dǎo)的存在指示W(wǎng)nt介導(dǎo)的病癥(諸^口癌癥)的存在。H.Wnt途徑及與其有關(guān)的病癥1.Wnt信號傳導(dǎo)途徑Wnt信號傳導(dǎo)途徑是一種異常復(fù)雜的信號傳導(dǎo)過程，其牽涉在所述途徑中施加不同水平控制的多種蛋白質(zhì)。所述途徑的這種多水平緊密調(diào)控指示其在細(xì)胞生物學(xué)中的重要性。盡管調(diào)控機制復(fù)雜，但是所述途徑的啟動信號是通過Wnt對巻曲(Frz)受體的結(jié)合而產(chǎn)生的。有效的信號進一步要求存在LRP(LDL受體相關(guān)蛋白)類的別的單次跨膜分子，具體地是LRP5和LRP6。Wnt可以進一步與LRP結(jié)合以與巻曲蛋白形成三聚體復(fù)合物。LRP的胞質(zhì)尾繼而與軸蛋白(另一種下游成分)相互作用。散亂蛋白(一種直接與巻曲蛋白相互作用的胞質(zhì)成分)也可以直接與軸蛋白相互作用，如此形成巻曲蛋白、LRP、Dsh及軸蛋白的四重復(fù)合物。這種與軸蛋白的相互作用從"降解復(fù)合物"(下文所討論的)中釋放P-聯(lián)蛋白，用于Wnt信號傳導(dǎo)途徑中隨后的下游活性。在細(xì)胞外部，Wnt信號傳導(dǎo)受到能結(jié)合Wnt由此使其與其受體隔絕的多種蛋白質(zhì)的抑制。此組中包括分泌型巻曲相關(guān)蛋白(sFRP,Jones等，Bioessays2002;24:81l-820)和Wnt抑制因子-l(WIF-l,Hsieh,J.C.等，Nature1999;398:431-436)。在人中，sFRP家族包括5個成員(例如sFRP-l，sFRP-2...sFRP-5)，每個包含與Frz受體的富含半胱氨酸區(qū)域(CRD)共享30-50°/。序列同源性的CRD。(Melkonyan,H.S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1997;94:13636-13641)。認(rèn)為sFRP與Frz受體形成功能抑制性復(fù)合物，因此是天然拮抗劑，但是生物學(xué)是復(fù)雜的，在有些情況中，其甚至可以起激動Wnt活性的作用。(Uren，A.等，J.Biol.Chem.2000;275:4374-4382)。另一類胞外Wnt抑制劑是Dickkopf(Dkk)。[Brott,B.K.等，Mol.CellBiol.2002;22:6100-6110;Fedi,P.等,J.Biol.Chem.1999;274:19465-19472]。Dkk家族的三個成員(例如Dkk-l、Dkk-2和Dkk-4)可以通過滅活細(xì)胞表面受體LRP-5和LRP-6(規(guī)范途徑的必需成分)而拮抗Wnt信號傳導(dǎo)。[Mao,J.H.等,Mol.Cell2001;7:801-809;Pinson,K.I.等，Nature2000;407:535-538]。Dkk與LRP5/6及單次跨膜受體Kremen1(Krm-l)或Kremen2(Krm-2)形成三重復(fù)合物[Mao等，Gene2003;302:179-183;Mao等，Nature2002;417:664-667;Mao等，Nature2001;411:321-325]。該復(fù)合物繼而經(jīng)受胞吞作用，由此從細(xì)胞表面除去LRP5/6受體。結(jié)果，Dkk可以選擇性拮抗規(guī)范Wnt信號傳導(dǎo)，而不影響非規(guī)范信號傳導(dǎo)。規(guī)范Wnt信號傳導(dǎo)激活的特點是蛋白質(zhì)l3-聯(lián)蛋白的水平升高。P-聯(lián)蛋白是組成型生成的，且以單體蛋白集合存在于細(xì)胞質(zhì)中。[Papkoff，J.等，Mol.CellBiol.1996;16:2128-2134]。用于控制P-聯(lián)蛋白胞質(zhì)水平的主要機制是經(jīng)由募集成大的多蛋白復(fù)合物("降解復(fù)合物，，)后的直接物理降解。該復(fù)合物的中心支架是由軸蛋白以及供(3-聯(lián)蛋白、腺瘤性結(jié)腸息肉(APC)、糖原合酶激酶3卩(GSK3卩)、酪蛋白激酶Ia(CKIa)及蛋白質(zhì)磷酸酶2A(PP2A)結(jié)合的位點提供的[Hinoi,T.等，J.Biol.Chem,2000;275:34399-34406;Ikeda等，Oncogene2000;19:537-545;Yamamoto等，J.Biol.Chem.1999;274:10681-10684;Kishida等,J.Biol.Chem.1998;273:10823-10826;Ikeda等,EMBOJ.1998;17:1371-1384]。形成后，該復(fù)合物通過GSK3卩介導(dǎo)的軸蛋白和APC磷酸化、以及PP2A而穩(wěn)定化。GSK3p然后磷酸化P-聯(lián)蛋白，由此讓它被含P-轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白重復(fù)的蛋白((3-TrCP)所識別，由此將其靶向遍在蛋白化和蛋白體降解。[Aberle等，EMBOJ.1997;16:3797-804;Latres等，Oncogene1999;18:849-54;Liu等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA1999;96:6273-8]。雖然與軸蛋白/APC/GSK3(3復(fù)合是p-聯(lián)蛋白降解的主要機制，但是已有顯示備選的降解途徑牽涉通過與Siah-l和APC的C端復(fù)合而誘導(dǎo)的遍在蛋白化。[Matsuzawa等,Mol.Cell2001;7:915-926;Liu等,Mol.Cell2001;7:927-936]。在其作為轉(zhuǎn)錄因子的角色外，P-聯(lián)蛋白進一步牽涉細(xì)胞粘附。[Nelson等，Science2004;303:1483-1487;Ilyas等，J.Pathol.1997;182:128-137]。P-聯(lián)蛋白可以在細(xì)胞間接觸(稱為粘附連接)的細(xì)胞表面位點處找到，在那里其與E-鈣粘著蛋白及cx-聯(lián)蛋白復(fù)合。如此，E-鈣粘著蛋白表達(dá)的任何增加會將P-聯(lián)蛋白指導(dǎo)至細(xì)胞膜，由此消減胞質(zhì)水平，并繼而抑制Wnt信號傳導(dǎo)。此外，E-鈣粘著蛋白-聯(lián)蛋白復(fù)合物的分解可以增加游離(3-聯(lián)蛋白的胞質(zhì)水平，由此剌激轉(zhuǎn)錄活性。[Nelson等，見上文]。如此，通過釋力文(3-聯(lián)蛋白進行的細(xì)胞表面受體cRON、表皮生長因子受體(EGFR)及c-ErbB2活化也可以刺激規(guī)范Wnt信號傳導(dǎo)。其它信號傳導(dǎo)途徑可以激活或促進Wnt信號傳導(dǎo)的效應(yīng)。例如，整聯(lián)蛋白信號傳導(dǎo)可以導(dǎo)致P-聯(lián)蛋白的核轉(zhuǎn)運[Eger等,Oncogene2004;23:2672-2680],而經(jīng)由胰島素樣生長因子(IGF)的信號傳導(dǎo)可以通過"吸收"可用的GSK3P——由此阻止"降解復(fù)合物"的形成而激活Wnt信號傳導(dǎo)。在規(guī)范的信號傳導(dǎo)中，啟動步驟牽涉在LRP5/6存在下Wnt^"Frz的結(jié)合。[Mao等，Mol.Cell2001;7:801-809;Pinson等，Nature2000;407:535-538]。此三聚體復(fù)合物的形成具有兩種下游后果。第一種是散亂蛋白(Dsh)向細(xì)胞表面的募集及其通過酪蛋白激酶k(CIs)發(fā)生的磷酸化[Kishida等，J.Biol.Chem.2001;276:33147-33155]。磷酸化的Dsh可以與Fmt1和GSK3(3形成復(fù)合鉤，其繼而可以抑制GSK3P的活性。第二種，Wnt/Frz/LRP5M三重復(fù)合物促進LRP5/6介導(dǎo)的軸蛋白降解。其凈效應(yīng)是使負(fù)責(zé)磷酸化(3-聯(lián)蛋白的降解復(fù)合物失穩(wěn)定化。在沒有磷酸化時，(3-聯(lián)蛋白不被遍在蛋白化，由此逃脫降解，如此提高胞內(nèi)水平和向細(xì)胞核易位的可用性。13-聯(lián)蛋白轉(zhuǎn)運至細(xì)胞核的方式尚未完全清楚，但是已經(jīng)牽涉與核轉(zhuǎn)運蛋白APC的相互作用[Rosin-Arbesfeld等，Nature2000;406:1009-1012;Neufeld等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA2000;97:12085-12090],以及;^go;w和Sc/9/7eg/e^。[Townsley等，NatureCellBiol.2004;6:626-633]。一旦在細(xì)胞核中，(3-聯(lián)蛋白取代轉(zhuǎn)錄阻抑物Groucho而與T細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子/淋巴樣增強子結(jié)合因子-1(TCF/LEF)DNA結(jié)合蛋白結(jié)合。在沒有卩-被聯(lián)蛋白取代時，TCF/LEF與Groucho復(fù)合以阻抑Wnt"靶基因"的表達(dá)。通過與各種組蛋白脫乙?；?HDAC)的相互作用進一步介導(dǎo)Groucho的抑制效應(yīng)，認(rèn)為所述組蛋白脫乙?；甘笵NA對轉(zhuǎn)錄激活有折射能力(refractive)。[Cavallo等，Nature1998;395:604-8;Chen等，GenesDev.1999;13:2218-30]。TCF轉(zhuǎn)錄阻抑物復(fù)合物轉(zhuǎn)變成轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合物進一步牽涉組蛋白乙酰基轉(zhuǎn)移酶(諸如Creb結(jié)合蛋白(CBP)/p300)以及其它激活因子(諸如Brg-l)的募集。[Takemam等,J.CellBiol.2000;149:249-54;Barker等,Cell2002;109:47-60;Brantjes等，Biol.Chem.2002;383:255-261;Roose等，Biochim.BiophysActa-Rev.Cancer1999;1424:M23-M37]。卩-聯(lián)蛋白-TCF復(fù)合物和染色質(zhì)之間的相互作用還可以由Leg/e^fBc/力和尸j《6^w來介導(dǎo)。Kramps等，Cell2002;109:47-60;Thompson等，Nat.CellBiol.2002;4:367-73;Parker等，Development2002;129:2565-76。圖l描繪了處于"關(guān)閉"或無活性狀態(tài)以及"開啟"或活性狀態(tài)的規(guī)范Wnt信號傳導(dǎo)途徑的簡略概要。2.與Wnt信號傳導(dǎo)活性有關(guān)的病癥Wnt信號傳導(dǎo)途徑的失調(diào)可能是由編碼各種Wnt信號傳導(dǎo)途徑成分的基因中的體細(xì)胞突變引起的。例如，異常Wnt信號傳導(dǎo)活性已經(jīng)與如下病癥中的Wnt配體過表達(dá)聯(lián)系起來非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)[You等，Oncogene2004;23:6170-6174]、慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)[Lu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA2004;101:3118-3123]、胃癌[Kim等，Exp.Oncol.2003;25:211-215;Saitohetal.,Int.J.Mol.Med.2002;9:515-519]、頭頸鱗狀細(xì)胞癌(麗SCC)[Rhee等，Oncogene2002;21:6598-6605]、結(jié)腸直腸癌[Holcombe等，J,Clin.Pathol-Mol.Pathol.2002;55:220-226]、卵巢癌[Ricken等，Endocrinology2002;143:2741-2749]、基底細(xì)胞癌(BCC)[LoMuzio等，AnticancerRes.2002;22:565-576]及乳腺癌。此外，各種Wnt配體調(diào)節(jié)分子(諸如sFRP和WIF-l)的降低已經(jīng)與如下病癥聯(lián)系起來乳腺癌[Klopocki等，Int.J.Oncol.2004;25:641-649;Ugolini等，Oncogene2001;20:5810-5817;Wissmann等，J.Pathol.2003;201:204-212]、膀胱癌[Stoehr等,LabInvest.2004;84:465-478;Wissmann等，見上文]、間皮瘤[Lee等，Oncogene2004;23:6672-6676]、結(jié)腸直腸癌[Suzuki等，NatureGenet2004;36:417-422;Kim等，Mol.CancerTher.2002;1:1355-1359;Caldwell等,CancerRes.2004;64:883-888]、前列腺癌[Wissman等，見上文]、NSCLC[Mazieres等，CancerRes.2004;64:4717-4720]、及肺癌[Wissman等，見上文]。用本發(fā)明的Wnt拮抗劑分子拮抗Wnt信號傳導(dǎo)會治療這些癌癥。繼續(xù)地，因Frz-LRP受體復(fù)合物的各種成分過表達(dá)而3)起的異常Wnt信號傳導(dǎo)也已經(jīng)與某些癌癥聯(lián)系起來。例如，LRP5過表達(dá)已經(jīng)與骨肉瘤聯(lián)系起來[Hoang等，Int.J.Cancer2004;109:106-111],而Frz過表達(dá)已經(jīng)與癌癥聯(lián)系起來，諸如前列腺癌[Wissmann等，見上文]、HNSCC[Rhee等，Oncogene2002;21:6598-6605]、結(jié)腸直腸癌[Holcombe等，見上文]、卵巢癌[Wissman等，見上文]、食管癌[Tanaka等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1998;95:10164-10169]及胃癌[Kirikoshi等，Int.J.Oncol.2001;19:111-115]。此外，Wnt信號傳導(dǎo)途徑成分(諸如散亂蛋白)的過表達(dá)已經(jīng)與癌癥聯(lián)系起來諸如前列腺癌[Wissmann等，見上文]、乳腺癌[Nagahata等，CancerSci.2003;94:515-518]、間皮瘤[Uematsu等，CancerRes.2003;63:4547-4551]及宮頸癌[Okino等，Oncol.Rep.2003;10:1219-1223]。Frat-l過表達(dá)已經(jīng)與癌癥(諸如胰腺癌、食管癌、宮頸癌、乳腺癌及胃癌)聯(lián)系起來。[Saitoh等，Int.J.Oncol.2002;20:785-789;Saitoh等，Int.J.Oncol.2001;19:311-315]。軸蛋白功能喪失(LOF)突變已經(jīng)與肝細(xì)胞癌[Satoh等，NatureGenet.2000;24:245-250;Taniguchi等,Oncogene2002;21:4863-4871]及髓母細(xì)胞瘤[Dahmen等，CancerRes.2001;61:7039-7043;Yokota等,Int.J.Cancer2002;101:198-201]聯(lián)系起來。用本發(fā)明的Wnt拮抗劑阻斷Wnt-Frz相互作用會減輕與Frz或LRP的過表達(dá)有關(guān)的癌癥。最后，許多癌癥已經(jīng)與經(jīng)由對"降解復(fù)合物"的破壞(諸如(3-聯(lián)蛋白中的功能獲得突變或APC中的功能喪失突變)而活化p-聯(lián)蛋白聯(lián)系起來。P-聯(lián)蛋白降解的降低導(dǎo)致細(xì)胞中較大量的功能性|3-聯(lián)蛋白，然后其引起靶基因轉(zhuǎn)錄升高，導(dǎo)致異常細(xì)胞增殖。例如,編碼(3-聯(lián)蛋白的基因(即CTNNBl)中的突變已經(jīng)與癌癥聯(lián)系起來，諸如胃癌[Clements等，CancerRes.2002;62:3503-3506;Park等，CancerRes.1999;59:4257-4260]、結(jié)腸直腸癌[Morin等,Science1997;275:1787-1790;Ilyas等，Proc.NatlAcad.Sci.USA1997;94:10330-10334]、腸的類癌[Fujimori等，CancerRes.2001;61:6656-6659]、卵巢癌[Sunaga等，GenesChrom.Cancer2001;30:316-321]、肺的腺癌[Sunaga等,見上文]、子宮內(nèi)膜癌[Fukuchi等，CancerRes.1998;58:3526-3528;Kobayashi等，Japan.J.CancerRes.1999;90:55-59;Mirabelli-Primdahl等，CancerRes.1999;59:3346-3351]、肝細(xì)胞癌[Satoh等，見上文；Wong等，Cancer2001;92:136-145]、肝母細(xì)胞瘤[Koch等，CancerRes.1999;59:269-273]、髓母細(xì)胞瘤[Koch等，Int.J.Cancer2001;93:445-449]、胰腺癌[Abraham等，Am.J.Pathol.2002;160:1361-1369]、曱狀腺癌[Garcia-Rostan等，CancerRes.1999;59:1811-1815;Garcia-Rostan等，Am.J.Pathol.2001;158:987-996]、前列腺癌[Chesire等，Prostate2000;45:323-334;Voeller等，CancerRes.1998;58:2520-2523]、黑素瘤[Reifenberger等，Int.J.Cancer2002;100:549-556]、毛母質(zhì)瘤[Chan等，NatureGenet.1999;21:410-413]、維爾姆斯氏(Wilms)瘤[Koesters等，J.Pathol.2003;199:68-76〗、胰母細(xì)胞瘤[Abraham等，Am.J.Pathol.2001;159:1619-1627]、月旨肪肉瘤[Sakamoto等，Arch.Pathol.LabMed.2002;126:1071-1078]、青少年鼻咽血管纖維瘤[Abraham等，Am.J.Pathol.2001;158:1073-1078]、硬纖維瘤[Tejpar等，Oncogene1999;18:6615-6620;Miyoshi等，Oncol.Res.1998;10:591-594]、滑膜肉瘤[Saito等，J.Pathol.2000;192:342-350]。而功能喪失性突變已經(jīng)與癌癥聯(lián)系起來，諸如結(jié)腸直腸癌[Fearon等，Cell19卯；61:759-767;Rowan等，Proc.NatlAcad.Sci.USA2000;7597:3352-3357〗、黑素瘤[Reifenberger等，Int.J.Cancer2002;100:549-556;Rubinfeld等，Science1997;275:1790-1792]、髓母細(xì)胞瘤[Koch等，Int.J.Cancer2001;93:445-449;Huang等，Am.J.Pathol.2000;156:433-437]及硬纖維瘤[Tejpar等，Oncogene1999;18:6615-6620;Alman等，Am丄Pathol.1997;151:329-334]。因|3-聯(lián)蛋白異?；钚?由此激活Wnt途徑)所引起的癌癥適于用本發(fā)明的Wnt拮抗劑治療。3.Wnt信號傳導(dǎo)和致癌作用Wnt途徑具有許多轉(zhuǎn)錄終點或靶基因。這些中的大多數(shù)對于某些類型是特異性的一一這在發(fā)育信號傳導(dǎo)途徑中是尋常的。這與胞外信號實現(xiàn)的基因控制的基礎(chǔ)機制相一致，其中細(xì)胞而非信號決定應(yīng)答的性質(zhì)。然而，在細(xì)胞類型特異性的基因外，Wnt信號傳導(dǎo)還控制較廣泛誘導(dǎo)的基因，包括Wnt信號傳導(dǎo)途徑的成分及最可能被Wnt-(3-聯(lián)蛋白-TCF級聯(lián)所激活的基因。研究的對象以期更好地理解隱藏于癌癥發(fā)生之下的事件。P-聯(lián)蛋白進行的靶基因不適當(dāng)激活如此可以導(dǎo)致生物體中的疾病狀態(tài)，即使在靶基因自身中可能沒有任何體細(xì)胞突變。Ilyas完成了大多數(shù)惡性腫瘤獲得的Hanahan和Weinberg表型列表的修訂，包括"不適當(dāng)?shù)母杉?xì)胞表型/無限的復(fù)制潛力"、"逃脫凋亡"、"組織侵入和轉(zhuǎn)移"、"生長信號的自給自足"、"對生長抑制劑的不敏感性"、"終末分化的失敗"、"逃脫免疫應(yīng)答"、及"持續(xù)的血管發(fā)生"。Ilyas,J.Pathol.2005;205:130-144;Hanahan和Weinberg,Cell2000;100:57-70。對受Wnt信號傳導(dǎo)調(diào)控的基因的分析(包括如微列陣分析所顯示的(3-聯(lián)蛋白的靶基因或改變的表達(dá))顯示直接來自異常Wnt信號傳導(dǎo)或經(jīng)由對靶基因作用而來自異常Wnt信號傳導(dǎo)的干擾可以給予幾乎所有這些"贅生性表型"。Ilyas，M.，J.Pathol.2005;205:130-144。在表l中給出了Wnt信號傳導(dǎo)的例示靶物列表。上調(diào)的基因靶物以黑體顯示，而下調(diào)的那些是斜體的?？梢栽趹?yīng)用本發(fā)明的Wnt拮抗劑后矯正由于激活的和/或過量的Wnt信號傳導(dǎo)的結(jié)果而引起的此類靶基因的異常表達(dá)。不適當(dāng)?shù)母杉?xì)胞表型逃脫調(diào)亡組織4菱入和轉(zhuǎn)移生長信號的自給自足對生長抑制劑的不敏感性終末分化的失敗逃脫免疫應(yīng)答持續(xù)的血管發(fā)生表lWnt靶基因和表型效應(yīng)簇蛋白(7)存活蛋白(8)環(huán)氧合酶—2(9)Fra-l(lO)骨橋蛋白(7)uPAR(10)密蛋白-1(11)CD44(12)MMP-7/9/11/14/26(7)IGFBP-4(7)Met(13)整^蛋白"7「5JBMP4(14)淑A/(75」^脈凝趁合蛋力2^她c2州&'甲戸/存西子4(7。凌》沐齒/州Sox9(17)組蛋白脫乙?；?(7)y2-微球蛋白(V)-VEGF(18)-細(xì)胞周期蛋白D1(2)PPARS(3)—促胃液素(4)_淑奢白錄柳一癌癥日益被視為"干細(xì)胞，，疾病(Taipale等，Nature2001;411:349-54),即干細(xì)胞不適當(dāng)?shù)募せ詈?或維持。已有顯示W(wǎng)nt信號傳導(dǎo)對于維持干細(xì)胞是必需的[He等，NatureGenet.2004;36:1117-1121;Reya等，Nature2003;423:409-414;Willert等,Nature2003;423:448-452]。在腸中，TCF4是卩-聯(lián)蛋白的主要核結(jié)合因子，而且TCF4敲除小鼠未能在小腸中形成干細(xì)胞的實情進一步支持規(guī)范Wnt信號傳導(dǎo)在干細(xì)胞維持中的作用[Korinek等，Nat.Genet.1998;19:379-83;Pinto等，GenesDev.2003;17:1709-13;Kuhnert等，Proc.Natl.Acad.Sc.USA2004;101:66-71]。基質(zhì)金屬蛋白酶基因(MMP)表明了Wnt信號傳導(dǎo)對多種生物學(xué)過程的效應(yīng)。已有顯示MMP7、MMP14和MMP26指導(dǎo)(3-聯(lián)蛋白的靶物[Marchenko等，Int.J.Biochem.CellBiol.2004;36:942-956;Takahashi等，Oncogene2002;21:5861-5867;Brabletz等，Am.J.Pathol.1999;155:1033-1038]，而發(fā)現(xiàn)其它MMP由腸的腺瘤直接表達(dá)[Paoni等，Physiol.Genomics2003;15:228-235]。MMP是分解間質(zhì)膠原由此讓腫瘤細(xì)胞獲得表型"組織侵入和轉(zhuǎn)移"的蛋白水解酶。酶活性還容許釋放基質(zhì)中的潛伏生長因子，其與腫瘤細(xì)胞自身分泌的其它生長因子一起會促成"生長信號的自給自足'，。[Coussens等，Science2002;295:2387-2392;Egeblad等，NatureRev.Cancer2002;2:161-174]。MMP還可以作用于骨橋蛋白(次級Wnt誘導(dǎo)的靶物)[Paoni等，見上文]以釋放片段，其與血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)((3-聯(lián)蛋白的直接靶物)一起促成"持續(xù)血管發(fā)生"的特征。[Zhang等，CancerRes.2001;61:6050-6054;Agnihotri等，J.Bio.Chem.2001;276:28261-28267]。雖然Wnt信號傳導(dǎo)途徑可以在配體受體相互作用下游的多個水平激活，但是有確鑿的證據(jù)提示對胞外配體-受體相互作用成分的抑制在降低致腫瘤性中是有效的，即使啟動Wnt信號傳導(dǎo)的事件可能已經(jīng)在下游發(fā)生。例如，Ilyas在最近的綜述中報道了在數(shù)種結(jié)腸直腸癌細(xì)胞系中對Wnt信號的抑制導(dǎo)致致腫瘤性降低。[Ilyas,見上文]。此外，不起作用的巻曲受體(Frz7胞外域)向癌瘤細(xì)胞系(SK-CO-1)中的轉(zhuǎn)染恢復(fù)了正常的P-聯(lián)蛋白表型。由于純合APC:突變，該細(xì)胞系具有活性Wnt信號傳導(dǎo)。此外，此類細(xì)胞在體內(nèi)轉(zhuǎn)移時也未顯示肺瘤形成。Vincan等，Differentiation2005;73:142-153。這表明胞外水平對Wnt信號傳導(dǎo)的抑制可以下調(diào)因下游胞內(nèi)Wnt信號傳導(dǎo)途徑成分的激活引起的Wnt信號傳導(dǎo)。這進一步提示抑制Wnt-Frz相互作用的抑制劑諸如本發(fā)明的Wnt拮抗劑對任何Wnt介導(dǎo)的病癥具有治療性益處，不管Wnt信號傳導(dǎo)是以何種具體方式#皮激活的。4.結(jié)腸癌中的異常Wnt信號傳導(dǎo)最初發(fā)現(xiàn)Wnt信號傳導(dǎo)成分APC的缺陷在遺傳性癌癥綜合征家族性腺瘤性息肉病(FAP)中是關(guān)鍵的。遺傳得到一個缺陷型APC等位基因的FAP患者在其壽命的早年中形成大量的結(jié)腸息肉、或腺瘤。此類息肉以其中第二APC等位基因被滅活的上皮細(xì)胞的克隆贅疣(clonaloutgrowth)形式形成。這些FAP腺瘤的累積效應(yīng)不可避免地導(dǎo)致腺癌的出現(xiàn)，表現(xiàn)為別的癌基因或腫瘤抑制基因(諸如K-Ras、p53及Smad4)中的突變的或多或少的有序積累。此外，APC的缺失也在大多數(shù)散發(fā)性結(jié)腸直腸癌中發(fā)生。Kinzler等，Cell87:159-170(1996)。APC的突變滅活通過導(dǎo)致P-聯(lián)蛋白的穩(wěn)定化和最終核轉(zhuǎn)運及Wnt信號傳導(dǎo)而由此轉(zhuǎn)化上皮細(xì)胞。有趣的是，包含串聯(lián)TCF結(jié)合位點的報道質(zhì)粒(諸如pTOPFLASH)(正常情況下僅在Wnt信號傳導(dǎo)后轉(zhuǎn)錄)經(jīng)由卩-聯(lián)蛋白/TCF-4轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的組成型激活而在APC突變型癌細(xì)胞中不適當(dāng)?shù)剞D(zhuǎn)錄。在APC未突變的結(jié)腸直腸癌的其它例子中，支架蛋白軸蛋白-2是突變的[Liu等，NatureGenet.26:146-147(2000)]或者(3-聯(lián)蛋白是突變的，從而除去N端Ser/Thr破壞基序。[Morin等，Science275:1787-1790(1997)]。如此，結(jié)腸直腸癌不僅與APC缺陷有聯(lián)系，而且與(3-聯(lián)蛋白/TCF-4轉(zhuǎn)錄激活的不適當(dāng)持續(xù)有聯(lián)系。還有報道，TCF-4突變導(dǎo)致結(jié)腸直腸癌中相同靶基因(如微列陣所顯示的)的激活，如通過在隱窩千細(xì)胞和祖細(xì)胞中的缺陷型APC表達(dá)所觀察到的。VandeWetering等，Cell111:241-250(2002)。一旦Wnt級聯(lián)被激活，則APC一腺瘤細(xì)胞無限地維持其祖細(xì)胞狀態(tài)。結(jié)果，可能的是，對Wnt信號傳導(dǎo)的激活在結(jié)腸直腸癌的癌癥發(fā)生中是必需的先兆，并且對Wnt信號傳導(dǎo)的抑制可以是治療和/或預(yù)防該病癥發(fā)作的有效手段。5.造血干細(xì)胞中的Wnt信號傳導(dǎo)在來自多能造血干細(xì)胞(HSC)的譜系定向祖細(xì)胞的過程中，造血干細(xì)胞產(chǎn)生循環(huán)系統(tǒng)的成熟血細(xì)胞。同樣顯而易見的是，Wnt信號傳導(dǎo)促成HSC的自我更新和維持，且功能失常的Wnt信號傳導(dǎo)是因HSC引起的各種病癥(諸如白血病和多種其它血液相關(guān)癌癥)的原因。Reya等，Nature434:843-850(2005);Baba等，Immunity23:599-609(2005);Jamieson等，N.Engl.J.Med.351(7):657-667(2004)。在干細(xì)胞轉(zhuǎn)變成定向髓樣祖細(xì)胞時，Wnt信號傳導(dǎo)通常降低。Reya等，Nature423:409-414(2003)。不僅Wnt配體本身是HSC所生成的，而且Wnt信號傳導(dǎo)也是有活性的，由此提示自分泌或旁分泌調(diào)節(jié)。Rattis等，Curr.Opin.Hematol.11:88-94(2004);Reya等，Nature423:409-414(2003)。另夕卜，(3-聯(lián)蛋白和Wnt3a兩者都促進鼠HSC和祖細(xì)胞的自我更新，而對人造血祖細(xì)胞的應(yīng)用Wnt-5A在體外促進未分化祖細(xì)胞的擴充。Reya等，見上文；Willert等，Nature423:448-452(2003);VanDenBerg等，Blood92:3189-3202(1998)。在HSC外，顯而易見的是，胚胎干細(xì)胞、表皮干細(xì)胞及上皮干細(xì)胞應(yīng)答或依賴Wnt信號傳導(dǎo)而維持在未分化的、增殖中的狀態(tài)。Willert等，見上文；Korinek等,Nat.Genet.19:379-383(1998);Sato等，Nat.Med.10:55-63(2004);Gat等,Cell95:605-614(1998);Zhu等,Development126:2285-2298(1999)。因此，本發(fā)明的Wnt拮抗劑對Wnt信號傳導(dǎo)的抑制可能是治療由功能失常的血細(xì)胞生成引起的病癥(諸如白血病和各種血液相關(guān)癌癥，諸如急性、'隄性、淋巴樣及髓細(xì)胞性白血病、骨髓增生異常綜合征(myelodysplasticsyndrome)及骨髓增殖性病癥(myeloproliferativedisorder))中的一種療法。這些包括骨髓瘤、淋巴瘤(例如何杰金氏(Hodgkin)和非何杰金氏)、慢性和非進行性貧血(chronicandnonprogressiveanemia)、進ft性和癥4犬性血纟田月包在夾乏癥(progressiveandsymptomaticbloodcelldeficiencies)、真性紅纟田月包增多癥(polycythemiavera)、特發(fā)性或原發(fā)性血小板增多癥(essentialorprimarythrombocythemia)、特發(fā)性骨髓纖維化(idiopathicmyelofibrosis)、慢性骨髓單才亥細(xì)月包'I"生白血病(chronicmyelomonocyticleukemia,CMML)、套纟田月包'淋巴瘤(mantlecelllymphoma)、皮月夫T纟田月包'淋巴瘤(cutaneousT-celllymphoma)、瓦爾登斯特"f侖氏巨球蛋白血癥(Waldenstrommacroglobinemia)。6.白血病中的Wnt信號傳導(dǎo)不受調(diào)節(jié)的Wnt信號傳導(dǎo)途徑激活是白血病發(fā)生的先兆。Reya等，見上文。存在支持髓樣和淋巴樣譜系兩者的致癌生長是依賴于Wnt信號傳導(dǎo)的實驗證據(jù)。已經(jīng)將Wnt信號傳導(dǎo)與調(diào)節(jié)慢性和急性兩種形式的髓樣白血病聯(lián)系起來。來自慢性髓細(xì)胞性白血病患者的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞祖細(xì)胞(GMP)和來自對療法耐受性的患者的原始細(xì)胞危象細(xì)胞(blastcrisiscell)展現(xiàn)激活的Wnt信號傳導(dǎo)。Jamieson等，見上文。此外，通過軸蛋白異位表達(dá)實現(xiàn)的對P-聯(lián)蛋白的抑制在體外降低了白血病細(xì)胞再次鋪板(replating)能力，提示慢性髓細(xì)胞80性白血病前體細(xì)胞的生長及更新依賴于Wnt信號傳導(dǎo)。同樣，Wnt過表達(dá)使GMP獲得長期自我更新的干細(xì)胞樣性質(zhì)。Jamieson等，見上文。該發(fā)現(xiàn)進一步支持如下假設(shè)，即Wnt信號傳導(dǎo)對于血液譜系的正常發(fā)育是必需的，但是異常Wnt信號傳導(dǎo)導(dǎo)致祖細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。本發(fā)明的Wnt拮抗劑對于治療這些類型的白血病會是有用的。最近的研究還提示淋巴樣瘤形成可能也受到Wnt信號傳導(dǎo)的影響。Wnt-16在攜帶E2A-PbX易位的前B細(xì)胞白血病細(xì)胞系中過表達(dá)，提示自分泌Wnt活性可能促成瘤發(fā)生。McWhirter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:11464-11469(1999)。Wnt信號傳導(dǎo)在正常B細(xì)胞祖細(xì)胞的生長和存活中的作用進一步支持這種看法。Reya等，Immunity13:15-24(2000);Ranheim等，Blood105:2487-2494(2005)。還提出了對Wnt的自分泌依賴性用于調(diào)節(jié)多發(fā)性骨髓瘤(終末分化B細(xì)胞的一種癌癥)的生長。Derksen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA101:6122_6127(2004)。還發(fā)現(xiàn)原發(fā)性骨髓瘤和骨髓瘤細(xì)胞系表達(dá)穩(wěn)定化的(即不依賴于降解復(fù)合物)。雖然在Wnt信號傳導(dǎo)成分中不存在突變，但是數(shù)種成分(包括Wnt-5A和Wnt-10B)的過表達(dá)提示腫瘤依賴性和癌癥自我更新不必依賴于Wnt信號傳導(dǎo)途徑成分中出現(xiàn)的突變，而僅依賴于該途徑自身的組成型激活。Reya等，見上文。通過結(jié)合過表達(dá)的Wnt，本發(fā)明的Wnt拮抗劑會是治療B細(xì)胞白血病中的有效治療劑。自我更新中的、多能干細(xì)胞向髓樣祖細(xì)胞的轉(zhuǎn)變是通過下調(diào)Wnt信號傳導(dǎo)來實現(xiàn)的。Reya等，Nature423:409-414(2003)。類似地，在淋巴樣祖細(xì)胞中卩-聯(lián)蛋白的穩(wěn)定表達(dá)恢復(fù)了多項分化選擇，雖然此類細(xì)胞缺乏典型地與任一細(xì)胞類型有關(guān)的標(biāo)志物。Baba等，Immunity23:599-609(2005)。如此，強烈提示的是，本發(fā)明的Wnt拮抗劑對Wnt信號傳導(dǎo)的抑制可以是治療白血病(諸如髓樣和淋巴樣白血病，包括急性和慢性髓細(xì)胞性白血病以及急性和慢性淋巴樣白血病)中的有效療法。7.神經(jīng)病癥中的異常Wnt信號傳導(dǎo)還觀察到經(jīng)由P-聯(lián)蛋白進行的Wnt信號傳導(dǎo)激活可以增加神經(jīng)祖細(xì)胞的循環(huán)和擴充，而且此類信號傳導(dǎo)的喪失可導(dǎo)致祖細(xì)胞區(qū)室的喪失。Chenn等,Science297:365-369(2002);Zechner等，Dev.Biol.258:406-418(2003)。正如Wnt信號傳導(dǎo)的正常激活可以促進神經(jīng)元千細(xì)胞的自我更新那樣，異常Wnt途徑激活在神經(jīng)系統(tǒng)中可能是致瘤性的。支持該結(jié)論的實驗證據(jù)是如下發(fā)現(xiàn)，即髓母細(xì)胞瘤(一種兒科小腦腦瘤)在(3-聯(lián)蛋白和軸蛋白兩者中含有突變，由此提示髓母細(xì)胞瘤源于原始祖細(xì)胞，其在應(yīng)答不受控制的Wnt信號傳導(dǎo)時被轉(zhuǎn)化。Zurawel等，CancerRes.58:896-899(1998);Dahmen等，CancerRes.61:7039-7043(2001);Baeza等，Oncogene22:632-636(2003)。如此，強烈提示的是，本發(fā)明的Wnt拮抗劑對Wnt信號傳導(dǎo)的抑制可以是治療各種神經(jīng)元增殖性病癥中的有效療法,所述神經(jīng)元增殖性病癥包括腦瘤，諸如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、腦脊膜瘤、許旺氏細(xì)胞瘤、垂體瘤、原始性神經(jīng)外胚層瘤(PNET)、髓母細(xì)胞瘤、顱咽管瘤、松果體區(qū)腫瘤(pinealregiontumor)、及非癌性神經(jīng)纖維瘤病。8.乳腺癌中的異常Wnt信號傳導(dǎo)在干細(xì)胞有待明確分離的乳房組織中，Wnt轉(zhuǎn)基因小鼠形成乳房腫瘤的研究提示了Wnt在祖細(xì)胞命運或維持中的控制作用。與來自過表達(dá)其它癌基因的小鼠的肺瘤形成鮮明對比，這些腫瘤中擁有干細(xì)月包和祖細(xì)胞性質(zhì)的個體細(xì)胞的頻率升高。[Liu等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA101:4158-4163(2004);Li等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA100:15853-15858(2003)]。這提示W(wǎng)nt途徑在其將干細(xì)胞和祖細(xì)胞靶向轉(zhuǎn)化的能力中可能是獨特的，并提示在正常乳房上皮的更新中的關(guān)鍵作用。如此，本發(fā)明的Wnt拮抗劑對Wnt信號傳導(dǎo)的抑制可能是治療乳腺癌中的有效療法。圖32顯示了人乳腺癌中的活性Wnt信號傳導(dǎo)。圖32A顯示了在正常的(A-1)、低等級的(A-2)和高等級的(A-3)人乳腺腫瘤中的Wnt-l表達(dá)(如通過體外雜交所示的)，其最初報道于Wong等，J.Pathol.196:145(2002)。圖32B顯示了乳腺癌患者中(3-聯(lián)蛋白的核(B-l)定位和胞質(zhì)(B-2)定位(如通過IHC所示的)。還顯示的是Kaplan-Meier存活曲線(B-3)，其顯示了與所示(3-聯(lián)蛋白表達(dá)樣式相關(guān)的患者存活概率。該數(shù)據(jù)最初報道于Lin等，P.N.A.S.(USA)97(8):4262-66(2000)。圖32C是Wnt-l表達(dá)的微列陣分析，其比較了來自沒有癌癥的患者的正常乳房與從患有her-2陰性的浸潤性導(dǎo)管癌的患者中分離的組織。9.衰老中的Wnt信號傳導(dǎo)Wnt信號傳導(dǎo)途徑還可能在衰老和年齡相關(guān)病癥中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。如BrackAS等，Science,317(5839):807-10(2007)中所報道，觀察到來自老年小鼠的肌肉干細(xì)胞在它們開始增殖時從生肌性(myogenic)譜系轉(zhuǎn)變至生纖維性(fibrogenic)譜系。此轉(zhuǎn)變與老年生肌性祖細(xì)胞中規(guī)范Wnt信號傳導(dǎo)途徑活性的升高有關(guān)，并可以被Wnt抑制劑所抑制。另外，來自老年小鼠的血清成分結(jié)合巻曲蛋白，并可以解釋老年細(xì)胞中升高的Wnt信號傳導(dǎo)。將Wnt3A注射入年幼的再生中的月/L肉中降^氐了增殖，并增加了結(jié)締組織的沉積。已經(jīng)將Wnt信號傳導(dǎo)途徑進一步與使用衰老加速的Klotho小鼠模式的研究中的衰老過程聯(lián)系起來，在所述研究中確定Klotho蛋白在物理上與Wnt蛋白相互作用，并抑制Wnt蛋白。LiuH等，Science,317(5839):803-6(2007)。在細(xì)胞培養(yǎng)物才莫型中，Wnt-Klotho相互作用導(dǎo)致對Wnt生物學(xué)活性的抑制，而來自Klotho缺陷型動物的組織和器官顯示了Wnt信號傳導(dǎo)增加的證據(jù)。因而，Wnt拮抗劑可以作為治療劑用于降低衰老的效應(yīng)，并用于治療年齡相關(guān)疾病。I.具體配制劑的施用模式1.一般考慮因素將藥用組合物配制成與其預(yù)想的施用路徑相容，所述施用路徑包括靜脈內(nèi)、真皮內(nèi)、皮下、口服(例如吸入)、經(jīng)皮(即表面)、經(jīng)粘膜、及直腸施用。用于胃腸外、真皮內(nèi)、或皮下應(yīng)用的溶液或懸浮液可以包括無菌稀釋劑，諸如注射用水、鹽水溶液、不揮發(fā)性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑；抗細(xì)菌劑，諸如苯曱醇或?qū)αu基苯曱酸曱酯；抗氧化劑，諸如抗壞血酸或亞硫酸氬鈉；螯合劑，諸如乙二胺四乙酸(EDTA);緩沖劑，諸如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；及供調(diào)節(jié)張力用的試劑，諸如氯化鈉或右旋糖。pH可以用酸或堿來調(diào)節(jié)，諸如鹽酸或氫氧化鈉。胃腸外制劑可以裝在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多劑量小瓶中。2.可注射配制劑適合用于注射的藥用組合物包括無菌水溶液(在水溶性的情況中)或分散體和供即時制備無菌可注射溶液或分散體用的無菌粉劑。對于靜脈內(nèi)施用，合適的載體包括生理鹽水、抑菌水、CREMOPHOREL(BASF,Parsippany,N丄)或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)。在所有情況中，組合物必須是無菌的，并應(yīng)當(dāng)是流體的，從而能使用注射器來施用。此類組合物在制備和貯存過程中應(yīng)當(dāng)是穩(wěn)定的，并必須針對來自微生物(諸如細(xì)菌和真菌)的污染提供保護。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，其包含例如水、乙醇、多元醇(諸如甘油、丙83二醇、及液態(tài)聚乙二醇)、及合適的混合物?？梢岳缤ㄟ^使用涂層(諸如卵磷脂)、在分散體的情況中通過維持所要求的粒度、及通過使用表面活性劑來維持適當(dāng)?shù)牧鲃有?。各種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑(例如對羥苯曱酸酯、氯丁醇、酚、抗壞血酸、及硫柳汞)可以抗擊微生物污染。等滲劑(例如糖類，多元醇諸如甘露醇、山梨醇，及氯化鈉)可以包括在組合物中。可延遲吸收的組合物包括諸如單硬脂酸鋁和明膠等試劑。可以如下制備無菌可注射溶液，即在根據(jù)需要含有一種成分或成分組合的合適溶劑中摻入需要量的活性化合物(例如本發(fā)明的任何調(diào)控性物質(zhì)/分子)，接著滅菌。一般地，分散體通過將活性化合物摻入無菌媒介中而制備，所述無菌媒介含有基礎(chǔ)分散介質(zhì)及其它所需成分。供制備無菌可注射溶液用的無菌粉劑的制備方法包括真空干燥和冷凍干燥，其自無菌溶液產(chǎn)生含有活性成分和任何所需成分的粉末。3.系統(tǒng)施用系統(tǒng)施用也可以是經(jīng)粘膜的或經(jīng)皮的。對于經(jīng)粘膜或經(jīng)皮施用，選擇能滲透靶物屏障的滲透劑。經(jīng)粘膜滲透劑包括去污劑、膽汁鹽、及梭鏈孢酸(fusidicacid)衍生物。鼻腔噴霧或栓劑可以用于經(jīng)粘膜施用。對于經(jīng)皮施用，活性化合物配制成軟膏劑、油膏劑、凝膠劑、或乳膏?；衔镞€可以以用于直腸投遞的栓劑(例如含諸如可可脂及其它甘油酯等基質(zhì))或保留灌腸劑形式制備。4.載體在一個實施方案中，活性化合物與保護該化合物免于從身體內(nèi)快速消除的載體一起制備，諸如受控釋放配制劑，包括植入物和微嚢化投遞系統(tǒng)?？梢允褂蒙锟山到獾幕蛏锵嗳莸木酆衔?，諸如乙烯-乙酸乙烯、聚(酸)酐、聚乙醇酸、膠原、多正酯、及聚乳酸。此類材料可以購自ALZACorporation(MountainView,CA)和NOVAPharmaceuticals,Inc.(LakeElsinore，CA),或由本領(lǐng)域技術(shù)人員制備。脂質(zhì)體懸浮液也可以用作藥學(xué)可接受載體。這些可以依照本領(lǐng)域^支術(shù)人員已知的方法(諸如Eppstein等，美國專利No.4,522,811,1985中的方法)來制備。5.單位劑量可以創(chuàng)建單位劑量形式的口服配制劑或胃腸外組合物以促進施用和劑量均一。單位劑量形式指適合作為供待治療受試者用的單劑的物理離散單元，其包含與所需藥用載體組合的治療有效數(shù)量的活性化合物。單位劑量形式的規(guī)格由下列因素規(guī)定，并直接取決于下列因素活性化合物的獨特性質(zhì)和具體期望的治療效果，及活性化合物復(fù)合的內(nèi)在限制。6.基因療法組合物可以將核酸分子插入載體中并用作基因療法載體?；虔煼ㄝd體可以通過例如靜脈內(nèi)注射、局部施用(Nabel和Nabel，美國專利No.5,328,470，1994)，或通過立體定向(stereotactic)注射(Chen等，ProcNatlAcadSciUSA.91:3054-7(1994))而投遞給受試者。基因療法載體的藥用制劑可包括可接受稀釋劑，或可包含其中埋置有基因投遞媒介的緩慢釋放基質(zhì)。或者，若可以從重組細(xì)胞中完整地生成完全的基因投遞載體(例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體)，則藥用制劑可包括生成基因投遞系統(tǒng)的一種或多種細(xì)胞。7.劑量藥用組合物和方法可以進一步包含通常在Wnt拮抗劑的施用中應(yīng)用的其它治療活性化合物。在要求施用Wnt拮抗劑的疾患治療或預(yù)防中，合適劑量水平一般會是約0.01至500mg/kg患者體重/天，其可以以單劑或多劑施用。優(yōu)選地，劑量水平會是約0.1至約250mg/kg/天，更優(yōu)選約0.5至約100mg/kg/天。合適的劑量水平可以是約0.01至250mg/kg/天，約0.05至100mg/kg/天，或約0.1至50mg/kg/天。在該范圍內(nèi)，劑量可以是0.05至0.5，0.5至5或者5至50mg/kg/天。對于口服施用，組合物優(yōu)選以包含1.0至1000毫克活性成分，具體地，1.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、50.0、75.0、100.0、150.0、200.0、250.0、300.0、400.0、500.0、600.0、750.0、800.0、900.0、及1000.0毫克活性成分的片劑形式提供，用于根據(jù)癥狀調(diào)整給待治療患者的劑量?；衔锟梢砸悦刻?至4次，優(yōu)選每天一次或兩次的方案施用。然而，對于任何特定患者的具體劑量水平和劑量頻率可以有所變化，而且會取決于多種因素，包括所采用的具體化合物的活性、該化合物的代謝穩(wěn)定性和作用長度、年齡、體重、一般健康、性別、飲食、施用的模式和次數(shù)(time)、排泄速率、藥物組合、特定疾患的嚴(yán)重程度、及宿主正在接受的療法。8.組合物的試劑盒組合物(例如藥用組合物)可以與施用說明書一起包括在試劑盒、容器、85包裝、或分配器中。在以試劑盒形式提供時，組合物的不同組分可以包裝在分開的容器中，并在臨使用前混合。組分的這種分開包裝可以容許長期的貯存，而不喪失活性組分的功能。試劑盒還可以在分開的容器中包括促進特定測試(諸如診斷測試或組織定型)實施的試劑。(a)容器或器亞試劑盒中包括的試劑可以在任何種類的容器中提供，使得不同組分的壽命得到保存，并不受容器材料吸收或改變。例如，封口的玻璃安瓿可以裝有凍干的調(diào)控物質(zhì)/分子和/或緩沖劑，其已經(jīng)在中性、非反應(yīng)性氣體(諸如氮氣)下包裝。安瓿可以由任何合適的材料構(gòu)成，諸如玻璃、有機聚合物(諸如聚碳酸酯、聚苯乙烯等)、陶瓷、金屬或通常用于容納試劑的任何其它材料。合適容器的其它例子包括可以由與安瓿類似的物質(zhì)制成的簡單瓶子，和包封，其可以由箔襯里的內(nèi)部構(gòu)成，諸如鋁或合金。其它容器包括試管、小瓶、燒瓶、瓶子、注射器等。容器可具有無菌存取口，諸如具有可被皮下注射針頭刺穿的塞子的瓶子。其它容器可具有由可容易拆除的膜所分開的兩個隔室，所述可容易拆除的膜在移動后容許各組分混合。可拆除的膜可以是玻璃、塑料、橡膠等。(b)說明材料試劑盒還可以提供說明材料。說明書可以印刷在紙或其它基片上，和/或以電子可讀的々某介4是供，諸如軟盤、CD-ROM、DVD-ROM、Zip盤、錄像帶、激光盤、錄音磁帶等。詳細(xì)的說明書可以不是與試劑盒在物理上結(jié)合的，使用者可以登陸試劑盒制造商或銷售商指定的因特網(wǎng)網(wǎng)址，或以電子郵件提供。9.聯(lián)合療法在某些實施方案中，包含Wnt拮抗劑的藥用配制劑與至少一種別的治療劑和/或佐劑聯(lián)合施用。在某些實施方案中，別的治療劑是化療劑、生長抑制劑、或細(xì)胞毒劑(像毒素)諸如美登木素生物堿、加利車霉素、抗生素、放射性同位素、溶核酶等。上文所述此類聯(lián)合療法涵蓋聯(lián)合施用(其中兩種或更多種治療劑包括在同一或分開的配制劑中)和分開施用，在分開施用的情況中，Wnt拮抗劑的施用可以在施用別的治療劑和/或佐劑之前、同時、和/或之后發(fā)生。Wnt拮抗劑還可以與放射療法聯(lián)合使用。10.藥物本發(fā)明提供了Wnt拮抗劑在制備可用于治療Wnt介導(dǎo)的病癥的藥物中的用途。在一個具體的方面中，所述Wnt介導(dǎo)的病癥是癌癥。包括以下實施例以表明本發(fā)明優(yōu)選的實施方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會，以下實施例中所公開的技術(shù)代表發(fā)明人所發(fā)現(xiàn)的、在本發(fā)明的實施中運行良好的技術(shù)，如此可以認(rèn)為這些技術(shù)構(gòu)成實施本發(fā)明的優(yōu)選4莫式。然而，依照本公開，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)領(lǐng)會，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的前提下，可以在所公開的具體實施方案中產(chǎn)生許多變化，且仍獲得相像的或類似的結(jié)果。通過提及明確而完整地收錄整篇說明書中所引用的所有參考文獻。實施例l:通用方案哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)物將人腎上皮(HEK)293細(xì)月包(ATCC#CRL-1573)、人卵巢PA1細(xì)胞(ATCC#CRL-1572)在50/50Dulbecco改良的Eagle高葡萄糖培養(yǎng)基、Ham氏F12(其已經(jīng)補充了10%胎牛血清)中培養(yǎng)。將人畸胎瘤衍生的NTer2(ATCC#CRL-1973)和Tera2(ATCC#HTB-106)細(xì)胞在補充有15。/。胎牛血清的McCoy氏培養(yǎng)基中維持，而將NCCIT細(xì)胞(ATCC#CRL-2073)在補充有10。/。胎牛血清的RPMI中維持。在37。C于5。/。C02中給所有細(xì)胞系進一步補充2mM谷氨酰胺及l(fā)。/。青霉素-鏈霉素。轉(zhuǎn)染和螢光素酶測定法作為轉(zhuǎn)染的準(zhǔn)備，在轉(zhuǎn)染前24小時將(1)500，000個HEK293細(xì)胞及(2)IOO,OOO個PAI細(xì)胞(ATCC#CRL-1572)、NCCIT、NTera2或Tera2細(xì)胞鋪入12孔皿(Nuc)的各個孔中。用0.375jxgTOPglow(Upstate，Cat#21-204)、0.05mgLEF1、O.OlmgSV40RL以及Fugene(Roche)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染后24小時，更換培養(yǎng)基，并在收獲之前不對細(xì)胞進行處理，或?qū)?xì)胞僅用Wnt3a、僅用Wnt5a、或用血清樣品再處理20-24小時。在完全培養(yǎng)基中為所示細(xì)胞系制備所有的稀釋物。將細(xì)胞收獲在50-100W1XSJC裂解緩沖液(20mMTrispH8.0、137mMNaCl、lmMEGTA、1%TritonX-100、10%甘油、1.5mMMgCl2、lmMDTT、50mMNaF、lmMNaV04及蛋白酶抑制劑)中，并使用Dual-Glo螢光素酶測定試劑盒(Promega,Part#TM058)來對雙份的10pl進行測定，并以Envision發(fā)光計(PerkinElmer)檢測。將螢光素酶活性相對于iew7/a活性標(biāo)準(zhǔn)化。實施例2:Frz-Fc嵌合分子的構(gòu)建克隆和表達(dá)Frz8(173)-Fc和Frz8(156)-Fc圖4A和B顯示了Frz8(156)-Fc和Frz8(173)-Fc嵌合構(gòu)建體的序列。圖4A顯示了較長的Frz8(173)序列。以灰色顯示的(即前24個N端氨基酸殘基)是前導(dǎo)信號序列。以下劃線顯示的(即殘基25-27)是丙氨酸殘基，其可能存在于成熟蛋白中或可能不存在于成熟蛋白中。以劃上方框的文本顯示的(即殘基157-173)是區(qū)分較長Frz8(173)嵌合構(gòu)建體與較短Frz8(Frzl56)嵌合構(gòu)建體的Frz8受體額外序列。以粗體顯示的(即殘基174-182)是接頭序列，而斜體形式的序列(即殘基183-409)是Fc區(qū)。圖4B顯示了較短的Frz(156)最低限度CRD(ECD)結(jié)構(gòu)域序列。以灰色顯示的(即前24個N端氨基酸殘基)是前導(dǎo)信號序列。以下劃線顯示的(即殘基25-27)是丙氨酸殘基，其可能存在于成熟蛋白中或可能不存在于成熟蛋白中。以粗體顯示的(即殘基157-164)是接頭序列，而斜體形式的序列(即殘基165-391)是Fc區(qū)。如下構(gòu)建Frz8(156)-Fc構(gòu)建體。將編碼巻曲蛋白8殘基1-156的cDNA亞克隆入pRK衍生的質(zhì)粒的EcoRI和XhoI位點。雖然優(yōu)選天然的人cDNA，但是也可以使用編碼相同蛋白質(zhì)序列的備選序列(例如鼠的)。在這種克隆規(guī)程中，將Frz8的羧基末端經(jīng)由短接頭區(qū)(例如殘基LESGGGGVT)(SEQIDNO:70)而融合至人IgG效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域(Fc)的氨基末端以創(chuàng)建Frz8-Fc融合物。最終的構(gòu)建體編碼Frz8的156個殘基。使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)(Ausubd等(編),2003,CurrentProtocolsinMolecularBiology,4巻，JohnWiley&Sons)來實施克隆。在中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞中表達(dá)蛋白質(zhì)?；蛘?，可以使用編碼長度與之前所述不同的Frz8的一定長度(例如1-173)的cDNA。另夕卜，還可以使用備選的接頭序列(例如ESGGGGVT)(SEQIDNO:69)。Frz-Fc和sFRP-Fc構(gòu)建體以與為Frz8所述規(guī)程類似的方式，構(gòu)建具有巻曲結(jié)構(gòu)域構(gòu)件(其包含F(xiàn)rzl、Frz2、Frz3、Frz4、Frz5、Frz6、Frz7、Frz9、FrzlO、sFRPl、sFRP2、sFRP3、sFRP4、或sFRP5)的Wnt拮抗劑的構(gòu)建體。使用XhoI和AscI來將Frz2、Frz3、Frz4、Frz5、及sFRP3亞克隆入pRK衍生的質(zhì)粒。使用ClaI和XhoI來將Frzl、Frz6、Frz7、Frz9、FrzlO、及sFRP4亞克隆入pRK衍生的質(zhì)粒，而使用ClaI和AscI來將sFRPl、sFRP2、及sFRP5亞克隆入pRK衍生的質(zhì)粒。與Frz8構(gòu)建體一樣，將Frz結(jié)構(gòu)域的羧基末端經(jīng)由短接頭區(qū)而融合至人IgG效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域(Fc)的氨基末端以創(chuàng)建嵌合Wnt拮抗劑。圖7(A、B、及C)顯示了這些構(gòu)建體的例示性氨基酸序列。前導(dǎo)信號序列以粗體顯示，斜體指示非天然前導(dǎo)序列。接頭是加下劃線的，而Fc構(gòu)件以斜體顯示。圖5(A-H)(SEQIDNO:115-129)提供了這些Wnt拮抗劑構(gòu)建體的例示性核酸序列。可以制備備選的構(gòu)建體以優(yōu)化體內(nèi)活性或穩(wěn)定性，或提供其它有益特征，諸如例如升高的溶解度、改良的結(jié)合特征。這些構(gòu)建體可以包括與上文所述Wnt拮抗劑的接頭不同的接頭。例如，如下制備了Frz3-Fc嵌合蛋白(SEQIDNO:114)的備選構(gòu)建體，即使用BstXI和XhoI來將Frz3結(jié)構(gòu)域亞克隆入pRK衍生的質(zhì)粒，并使用LESGGGGVT(SEQIDNO:70)肽接頭來將Frz3結(jié)構(gòu)域與Fc結(jié)構(gòu)域融合。蛋白質(zhì)分離使用PROSEP(Millipore)蛋白A偶聯(lián)樹脂通過親和捕捉而將Wnt拮抗劑嵌合蛋白分離至大于90%的純度。通過流經(jīng)Superdex200(GE-Healthcare)凝膠過濾柱將較高等級的聚集體與二聚體分開。通過Edmund降解來證實蛋白質(zhì)身份和除去信號序列的氨基端加工。估計最終蛋白質(zhì)的純度大于98%(圖10)。材料在純化后的內(nèi)毒素水平是完全的(complete)并小于l.OEU/mg。實施例3:Frz8-Fc嵌合分子的血清穩(wěn)定性Frz8(173)-Fc嵌合構(gòu)建體的血清穩(wěn)定性的最初研究表明該構(gòu)建體具有有限的體內(nèi)半衰期。體內(nèi)不穩(wěn)定性可能是因為巻曲受體構(gòu)件的EC結(jié)構(gòu)域(ECD)中存在蛋白酶切割位點。實施例2中所述Frz8(156)-Fc構(gòu)建體展現(xiàn)出比Frz8(173)-Fc升高的血清穩(wěn)定性。給無胸腺棵鼠靜脈內(nèi)注射10mg/kgFrz8(173)-Fc或Frz8(156)-Fc。在規(guī)定的時間點收集血清，并分析總蛋白質(zhì)和活性蛋白質(zhì)。圖llA顯示了人Fc的免疫印跡，其用于檢測lpL血清中存在的蛋白質(zhì)并與25嗎效應(yīng)的純化的蛋白質(zhì)(P)進行比較。Frz8(156)-Fc在施用后72小時在血清中是可檢測的，而Frz8(173)-Fc過了30分鐘便檢測不到。通過測量HEK293細(xì)胞中對Wnt3a依賴性TOPglow報道活性的抑制來測定所收集的血清中Frz8(156)-Fc和Frz8(173)-Fc的活性。雖然對使用2.5pg/mL的純化的Frz8(156)-Fc和Frz8(173)-Fc進行的處理觀察到相當(dāng)?shù)捏w外效力，但從蛋白質(zhì)施用后30分鐘收集的用Frz8(173)-Fc處理的小鼠的血清中僅回收到部分的抑制活性。相比之下，可以從施用后長達(dá)24小時的用Frz8(156)-Fc處理的小鼠的血清中回收到更有力的抑制活性，其中可檢測水平的抑制持續(xù)至少72小時(圖11B)。這些研究表明在體內(nèi)Frz8(156)分子比基于Frz8(173)的分子更穩(wěn)定。另外，F(xiàn)rz8(173)-Fc具有亞最適功效，而且^f叉起降低腫瘤體積增加速率的作用(與縮小起始腫瘤體積形成對比)。這種亞最適功效顯示于圖12,其顯示了肺瘤體積隨時間的曲線圖，這源自使用各種Wnt信號傳導(dǎo)構(gòu)件-Fc嵌合拮抗劑(包括Frz8(173)-Fc分子)的處理。在該測定法中，將MMTV-WNT-1腫瘤移植入無胸腺棵鼠的乳房脂肪墊中，并在X軸上箭頭所示時間點靜脈內(nèi)施用藥物。實施例4:Frz8(156)-Fc的體內(nèi)藥動學(xué)通過給棵鼠靜脈內(nèi)施用l、5、或20mg/kg單劑Frz8(156)-Fc或腹膜內(nèi)施用20mg/kg單劑Frz8(156)-Fc來測試該蛋白質(zhì)的體內(nèi)藥動學(xué)。如圖13所報道及以下本實施例所進一步討論的，所有劑量的Frz8-Fc藥劑在棵鼠中展現(xiàn)兩階段消除。在IV或IP單劑后，F(xiàn)rz8-Fc展現(xiàn):(1)與劑量成正比的暴露，(2)IP劑量給藥后的快速吸收，。)約2S-30ml/天的清除，及(4)約4天的半衰期。生物利用度系數(shù)，AUC1P/AUCIV=92%。動物方案基于施用藥物的數(shù)量和施用方式，將雌性無胸腺棵鼠分成4組，12只。組l:Frz8-Fc，lmg/kg，IV;組2:Frz8-Fc，5mg/kg,IV;組3:Frz8-Fc20mg/kg,IV;及組4:Frz8-Fc，20mg/kg,IP。依照分組指派，每只動物接受一劑Frz8-Fc的IV或IP推注。施用的劑量體積(5-10mL/kg)隨劑量給藥溶液的濃度和每種動物的重量而變化。IV劑量給藥經(jīng)由尾靜脈來施行。依照如下規(guī)程，從每種動物收集約125pl血液。將血清!^存在-70。C,直至通過ELISA進行測定。取出樣品，使得11=3只動物/時間點。額外的動物用于服藥前(predose)樣品收集和/或空白小鼠血清收集。使用交替的(alternative)眼睛，通過眶后放血收集每只動物前二個時間點的血液。對于最后一個時間點，經(jīng)由心臟穿刺(cardiacstick)收集血液，并將約lml等分成2管。一個樣品將用于測定Frz8-Fc濃度，而另一個將保留用于研究用途。在每個血液收集時間點后，每只動物接受10ml鹽水IP推注作為補液。在異氟醚麻醉下實施眶后放血，并在氯胺酮(ketamine)/曱苯嚷。秦(xylazine)混合物下發(fā)生終末放血。最終采血后，在麻醉下經(jīng)由頸脫位法對動物實施安樂死。結(jié)果圖13A是來自用Frz8-Fc處理的小鼠的純凈血清的免疫印跡，其顯示了自20或5mg/kg1.V.或20mg/kg1.P.兩者在7天及之后的血清中的檢測。在4、7、10或14天，自各只小鼠采集樣品。對于對照，自未處理小鼠采集血清樣品，將Frz8-Fc蛋白添加至20)ig/m1,并將樣品在37。C溫育2小時，然后將樣品用SDS加樣緩沖液處理(標(biāo)記為2h);來自未處理小鼠的純凈血清還作為陰性對照電泳(標(biāo)記為S)。'圖13B和13C是從藥動學(xué)研究中測定的Frz8-Fc血清水平的圖解匯總。特定的時期包括在16天(圖13B)和2天(圖13C)里進行的評估。所有劑量的Frz8-Fc在棵鼠中展現(xiàn)兩階段消除施用。曲線表示預(yù)測的濃度，而各個數(shù)據(jù)點表示來自各個小鼠的Frz8-Fc蛋白的平均血清水平，正如通過ELISA所測定的。圖13D是Frz8-Fc藥動學(xué)兩階段模型的參數(shù)匯總。在通過i.p.或i.v.路徑服用20mg/kg時，在注射一天內(nèi)達(dá)到相當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)血清水平，且直到7天該蛋白質(zhì)在血清中都是檢測得到的。在i.p.劑量給藥20mg/kg后，蛋白質(zhì)被快速吸收，其中T隨為約8h且生物利用度(AUCIP/AUC1V)為92%。蛋白質(zhì)清除為約25-30mL/d/kg,且半衰期為約4天。實施例5:Frz-Fc分子的結(jié)合親和力Fc結(jié)構(gòu)域添加至Frz8(156)結(jié)構(gòu)域?qū)е聦nt3a的結(jié)合親和力升高2個數(shù)量級以上。圖14表明Frz8-ECD在連接至二聚Fc結(jié)構(gòu)域后阻斷Wnt3a信號傳導(dǎo)ICso曲線圖。圖14B的凝膠證實了分離的Frz8(156)CRD(ECD)的純度。顯示的是(a)未減小的Frz8(156)ECD(第l道)；(b)分子量標(biāo)志物(第2道);及減小的Frz8ECD(156)(第3道)。該凝膠表明用于結(jié)合測定法的Frz8ECD是完整的，并大致以預(yù)期的分子量電泳。實施例6:Frz-Fc嵌合物的結(jié)合活性ELISA對于Wnt拮抗劑的PK評估，將384孔ELISA微量滴定板(NuncMaxisorp,Rochester,NY)的各孔用PBS中1i!g/ml濃度的家兔抗人Fc(JacksonImmunoResearch,Westgrove,PA)(25昭/孑L)包被。在4。C溫育過夜后，倒掉家兔抗人Fc溶液，并用4(Vl/孔封閉緩沖液(含0.5%BSA和10ppmProclin的PBS)封閉平板。在溫和搖動下在室溫溫育60分鐘后，將家兔抗人Fc包被的平板用清洗緩沖液(含0.05%Tween20⑧及10ppmProclin的PBS)清洗3次。將巻曲蛋白-Fc標(biāo)準(zhǔn)品(濃度范圍為0.78-100ng/ml的稀釋系列)，和在測定緩沖液(含0.5%BSA、0.05%Tween20⑧及10ppmProclin的PBS)中稀釋成測定范圍的樣品添加至測定平板(25(il/孔)。在溫和搖動下在室溫溫育120分鐘后，將測定平板用清洗緩沖液清洗6次。使用在測定稀釋液中稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的山羊抗人IgG-Fc(JacksonImmunoResearch)(25|11/孔)來檢測剩余的所結(jié)合的Frz-Fc。適當(dāng)?shù)娘@色(10-25分鐘)后，用lM磷酸(25pl/孔)來停止酶促反應(yīng)。在450nm波長及630nm參照波長處讀取測定平板。通過針對使用4參數(shù)算法的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合比較樣品OD來測定樣品濃度。BIAcore圖15表明Wnt3a對Frz8(l-156)-Fc嵌合物的直接結(jié)合。將該嵌合蛋白以約1700個響應(yīng)單位胺偶聯(lián)至BiocoreTM(BIAcore,Inc.Piscataway,NJ.)CM5傳感器芯片，基本上如Chen,Y.等，J.Mol.Biol.293:865-881(1999)所述。簡言之，依照供應(yīng)商的說明書用鹽酸N-乙基-N，-(3-二曱基氨基丙基)-碳二亞胺(EDC)和N—羥基琥珀酰亞胺(NHS)活化羧曱基化右旋糖苷生物傳感器芯片(CM5，BIAcoreInc.)。注入1M乙醇胺以封閉未反應(yīng)基團。然后注射估計濃度為0.5叫/ml的Wnt3a,并通過作為時間函數(shù)的響應(yīng)單位變化來評估結(jié)合。發(fā)現(xiàn)Wnt3a結(jié)合Frz8-Fc。如圖15所示，Wnt3a和Frz-Fc的結(jié)合導(dǎo)致超過對照蛋白(大腸桿菌表達(dá)的非天然Wnt3a)1000個響應(yīng)單位的高度顯著增加。OCTET4吏用OCTETTM-QK系統(tǒng)(Fort6Bio，Inc.，MenloPark,CA)來測量Wnt拮抗劑與Wnt配體Wnt3a和Wnt5a相互作用的能力。該系統(tǒng)容許測量生物傳感器表明的蛋白質(zhì)結(jié)合。如下進行測定法，即首先將Wnt拮抗劑分子之一(20ug/mL)與抗人IgGFc特異性生物傳感器一起在含0.5。/。CHAPS的磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中溫育10分鐘。通過在含0.5。/。CHAPS的PBS中清洗1.5分鐘來除去未結(jié)合的Wnt拮抗劑。然后將Wnt3a或Wnt5a(5.0ug/mL)添加至該測定法，并與結(jié)合至生物傳感器表面的Wnt拮抗劑分子一起在含0.5。/。CHAPS的PBS中溫育5分鐘。在相同的緩沖液中監(jiān)測Wnt拮抗劑分子和Wnt配體之間的相互作用。所有的測定步驟均在室溫在150uL體積中實施。圖16顯示了該結(jié)合測定法的結(jié)果，其中圖16A顯示了來自Wnt3a^j"Frzl-FrzlO-Fc嵌合體的結(jié)合的數(shù)據(jù)，圖Wnt5a^"Frzl-FrzlO-Fc嵌合體和sFRP-Fc嵌合體的結(jié)合的數(shù)據(jù)。OCTETTM測定法表明Wnt3a和Wnt5a兩者結(jié)合Fz8-Fc、Fz5-Fc、及Fz4-Fc最快(相對于其它Frz蛋白)，且Wnt3a以較慢的速率結(jié)合Fzl-Fc、Fz2-Fc、及Fz7-Fc。Wnt-5a結(jié)合曲線的幅度和線性性質(zhì)表明相對于Wnt3a結(jié)合的較低結(jié)合親和力，正如本結(jié)合測定法所測定的。OCTETTM結(jié)合數(shù)據(jù)的幅度表明sFRP-Fc蛋白所具有的對Wnt3a的親和力類似于對Frzl、Frz2、及Frz7所觀察到的，而且些微低于對Frz5和Frz8所觀察到的。實施例7:Wnt拮抗劑對Wnt信號傳導(dǎo)的抑制一一細(xì)胞測定法使用經(jīng)TOPglow報道質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的293(人腎)細(xì)胞來實施細(xì)胞測定法。作為轉(zhuǎn)染的準(zhǔn)備，在轉(zhuǎn)染前24小時將大約500,000個HEK293鋪入12孔皿(Nuc)的孑L中。用0.375(igTOPglow(Upstate,Cat#21-204)、0.05mgLEFl、0.0lmgSV40RL以及Fugene(Roche)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染后24小時，更換培養(yǎng)基，并在收獲之前不對細(xì)胞進行處理，或?qū)?xì)胞僅用Wnt3a、僅用Wnt5a、或用Wnt拮抗劑再處理20-24小時。在完全培養(yǎng)基中為所示細(xì)胞系制備所有的稀釋物。將細(xì)胞收獲在50-100ji11XSJC裂解緩沖液(20mMTrispH8.0、137mMNaCl、lmMEGTA、1%TritonX-100、10%甘油、1.5mMMgCl2、lmMDTT、50mMNaF、lmMNaV04及蛋白酶抑制劑)中，并使用Dual-GloTM螢光素酶測定試劑盒(Promega，Part#TM058)來對雙份的lO(il進行測定，并以Envision發(fā)光計(PerkinElmer)檢測。將螢光素酶活性相對于iem'〃a活性標(biāo)準(zhǔn)化。在報道分子外還用Frz4和Lrp5轉(zhuǎn)染有待用Wnt5a處理的細(xì)胞。這些額外成分的存在容許Wnt5a引起的Wnt途徑激活，以依照規(guī)范途徑行進。MikelsAJ和NusseR.,PLOSBiol.4:el15(2006)。用100ng/mlWnt3a處理Wnt3a活化的細(xì)胞，而用lug/mlWnt5a處理Wnt5a活化的細(xì)胞。如圖17A和B所示，F(xiàn)rz-Fc拮抗劑不同程度地抑制Wnt信號傳導(dǎo)。Frz5-Fc和Frz8-Fc兩者都顯示了對Wnt3a信號的完全抑制，并顯著抑制了Wnt5a信號。Frz4-Fc、Frz2-Fc、及Frz7-Fc顯示了對Wnt3a信號的顯著抑制。實施例8:Wnt拮抗劑的相對IC50如下測定Wnt拮抗劑的相對IC50,即如實施例7所述測量經(jīng)TOPglow螢光素酶TCF報道質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的U20S(人骨肉瘤)細(xì)胞中Wnt拮抗劑對Wnt信號傳導(dǎo)的抑制。通過Wnt3a活化獲得細(xì)胞中的初始Wnt信號傳導(dǎo)。將Frz-Fc的3倍稀釋系列應(yīng)用至細(xì)胞過^復(fù)(圖18)。如本測定法所測定的，Wnt3a以亞納摩爾IC50結(jié)合Frz8-Fc、Frz5-Fc、及Frz4-Fc(其中Frz8-Fc具有0.04nM的IC50,Frz5-Fc具有0.20nM的IC50,而Frz4-Fc具有0.48nM的IC50)，并以納摩爾IC50結(jié)合Frz2-Fc和Frz7-Fc(其中Frz2-Fc具有1.2nM的IC50，而Frz2-Fc具有1.4nM的IC50)實施例9:作為藥物響應(yīng)的藥效學(xué)標(biāo)志物的Wnt乾基因作為(3-聯(lián)蛋白免疫組織化學(xué)分析的備選，使用Wnt的轉(zhuǎn)錄靶物來監(jiān)測對Wnt信號傳導(dǎo)活性的抑制。具有自分泌Wnt信號傳導(dǎo)的細(xì)胞系顯示了升高的已知Wnt靶基因表達(dá)，而且這種表達(dá)受到Wnt3a體外處理以及Frz8-Fc的調(diào)節(jié)。NTera-2細(xì)胞的RNA分析表明Frz8-Fc處理影響所測試的Wnt靶基因的表達(dá)。如此，可以作為治療功效的指標(biāo)來追蹤這些基因的表達(dá)。作為這些觀察的延伸，這些Wnt輩巴基因的表達(dá)可以用作i貪斷性工具以鑒定這沖羊的癌癥，其由Wnt信號傳導(dǎo)驅(qū)動且有可能是抗Wnt治療劑的候選物。在體外對經(jīng)純化的Wnt3a、Fz8CRD-Fc、或?qū)φ盏鞍踪|(zhì)處理的PA-1細(xì)胞實施體外比較性基因表達(dá)分析以測定Wnt靶基因用以指示畸胎瘤細(xì)胞中對Wnt信號傳導(dǎo)的體內(nèi)抑制的適合性。對經(jīng)Wnt3a、Frz8-Fc、或?qū)φ誇c蛋白處理的PA-1細(xì)胞中分離的RNA進行微列陣分析，并測定所示基因表達(dá)水平響應(yīng)外源添加的Wnt3a、Frz8-Fc、及對照Fc蛋白時的變化。對于微列陣分析，將細(xì)胞用所示蛋白質(zhì)一式三份處理，并使用RNAeasy試劑盒(Qiagen)來分離總RNA。在Affymetrix人類基因組U133基因芯片集(RubinfeldB等，NatBiotechnol2006;24:205-9)上進行陣列分析。具體的探針和引物集顯示于圖20。Wnt信號傳導(dǎo)的先前鑒定的靶物(諸如軸蛋白2、APCDD1、及Gadl)的表達(dá)水平通過Wnt3a處理而上調(diào)或通過Frz8-Fc處理而下調(diào)(圖19A)。此外，一些基因(諸如Lefty2(A)、Leftyl(B)、sFRPl、及Fzd5)由Wnt3a下調(diào)，并通過用Frz8-Fc抑制Wnt信號傳導(dǎo)而上調(diào)(圖19A)。隨后通過qRT-PCR進行的基因表達(dá)分析顯示這些轉(zhuǎn)錄物在NTera-2、Tera-2、及NCCIT細(xì)胞中受到Wnt3a和Fz8CRD-Fc類似地調(diào)節(jié)。在體內(nèi)APCDD1、Gadl、及Fzd5在上文所述體外分析中最一致調(diào)控的基因之中，因此選擇它們作為供體內(nèi)肺瘤異種移植物研究用的Wnt響應(yīng)性的潛在標(biāo)志物。從功效研究結(jié)束時收集的異種移植物樣本中純化肺瘤組織RNA,并如先前所述(RubinfeldB等，NatBiotechnol2006;24:205-9)實施Wnt響應(yīng)性轉(zhuǎn)錄物的定量逆轉(zhuǎn)錄-PCR(qRT-PCR)分析。使用AACt法來測定每種基因的倍數(shù)誘導(dǎo)，且相對于甘油醛-3-磷酸脫氬酶來表示結(jié)果。具體的探針和引物集顯示于圖20。所有反應(yīng)一式兩份進行，并將至少兩次測定的平均值土SEM繪圖。與在體外看到的效果類似，治療劑量的Frz8-Fc的處理降低了APCDD1和Gadl基因的表達(dá)，并提高了來自NTera-2異種移植物的腫瘤中Fzd5的表達(dá)(圖19B)。雖然CD4hFc處理后所有基因均有一般性的非特異性下調(diào)，但這些變化與用Frz8-Fc處理的胂瘤中看到的那些相比是統(tǒng)計學(xué)不顯著的。這些觀察結(jié)果顯示Frz8-Fc在體內(nèi)的抗腫瘤發(fā)生效應(yīng)是針對靶基因的，而且這些基因的表達(dá)水平可以用于監(jiān)測潛在的抗Wnt治療劑的功效。實施例10:Wnt拮抗劑對具有同種異基因移植物和人異種移植物的小鼠中腫瘤生長的抑制效應(yīng)本實施例所列出的研究表明Wnt拮抗劑在治療表達(dá)Wnt的腫瘤中是有用的。Wnt-1-MMTV模型的情況中基本上完全的腫瘤消退表明Wnt拮抗劑對強烈Wnt驅(qū)動的肺瘤的效應(yīng)。然而，Wnt拮抗劑對PA-1和NTer2腫瘤的顯著效應(yīng)還反映了治療可能不完全是Wnt驅(qū)動的腫瘤的強治療潛力。動物使用雌性C57B16小鼠(TheJacksonLaboratory)來進行MMTV-Wntl腫瘤的傳代(passaging)。-使用實'瞼動物護理和4吏用委員會(InstitutionalAnimalCareandUseCommittee)批準(zhǔn)的方案來實施小鼠的維持和體內(nèi)規(guī)程。MMTV-Wnt模型-同種異基因移植物圖21的線性示意圖描繪了用于轉(zhuǎn)染以創(chuàng)建Wnt動物模型的載體構(gòu)建體。該構(gòu)建體^f莫仿通過MMTA病毒插入而觀察到的組成型Wnt信號傳導(dǎo)活化，如Tsujomoto等，Cell55:619-625(1988)及Li等，Oncogene19:1002-1009(2000)所述。MMTV-Wnt1轉(zhuǎn)基因腫瘤在小鼠中的傳代將來自MMTV-Wntl轉(zhuǎn)基因小鼠的腫瘤通過在乳房脂肪墊中手術(shù)植入而在C57B16小鼠中連續(xù)傳代達(dá)6至10代。在無菌條件下從轉(zhuǎn)基因小鼠中收集腫瘤組織，將其在HBSS中漂洗，并切成小塊。用氯胺酮(75-80mg/kg)和曱苯噻。秦(7.5-15mg/kg)的混合物來麻醉受體小鼠，在皮膚下插入腫瘤碎塊，朝向第三乳房月旨肪墊(thetumorfragmentinsertedundertheskinrostraltothethirdmammaryfatpad)，并使用縫合夾(woundclips)來閉合皮膚。將腫瘤傳代最多達(dá)10代，且在前2代后，對腫瘤組織進行組織學(xué)檢查以證實其是乳房起源的且繼續(xù)表達(dá)Wnt。6-12個月內(nèi)在小鼠中形成乳腺癌。使用從這些小鼠中分離的肺瘤來創(chuàng)建下文所述移植物;漢型。體內(nèi)研究對于測試Wnt拮抗劑在MMTV-Wnt模型中功效的體內(nèi)研究，通過皮下注射從經(jīng)浸漬的腫瘤組織中獲得的細(xì)胞來導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞。在無菌條件下從移植有來自Wnt轉(zhuǎn)基因小鼠(上文所述的)的腫瘤的小鼠中收集腫瘤組織，將其在PBS或HBSS中漂洗，切成小塊，并浸漬入HBSS，其使用細(xì)胞解離試劑盒(Sigma)進行。將細(xì)胞在無菌HBSS中清洗兩次，并在HBSS中的50%Matrigel溶液中懸浮。將細(xì)胞懸浮液皮下接種入無胸腺棵鼠的乳房脂肪墊中，其中體積不超過150nl/小鼠。對于使用NTera2或PA-1動物模型的體內(nèi)研究，如所述的那樣培養(yǎng)細(xì)胞，并在生長處于對數(shù)期時收獲細(xì)胞。將細(xì)胞懸浮在HBSS中的50%Matrigel溶液中，并以8乂106個細(xì)胞/小鼠(NTera2)或10xl(^個細(xì)胞/小鼠(PA-1)的濃度皮下接種入無胸腺棵鼠中。每天對腫瘤進行監(jiān)測，并在接種后7-12天進行測量。將動物分組，各組具有在150-250mn^范圍內(nèi)的相同腫瘤體積均值。分組后l-2天開始Wnt拮抗劑處理，并每天一次給小鼠腹膜內(nèi)(IP)或靜脈內(nèi)(IV)給藥100-200plWnt拮抗劑、陰性對照蛋白CD4-Fc、或PBS陰性對照。隨后的藥物處理每周重復(fù)2-3次，并持續(xù)3-4周。每周兩次測量腫瘤體積。在腫瘤體積達(dá)到2500mmS時處死動物。研究過程中通過眼窩靜脈放血來收集血液，并通過SDS-PAGE接著通過使用HRP或熒光偶聯(lián)的抗人Fc的免疫印跡和檢測來對血清測定治療劑的水平，并通過治療劑抑制Wnt3a活化TOPglow活性的能力(如實施例7所述的)來對血清測定治療劑活性。同種異基因移植物肺瘤Wnt拮抗劑對腫瘤同種異基因移植物生長的抑制效應(yīng)通過i.p.或i.v.路徑進行的Frz8-Fc處理在處理過程中導(dǎo)致快速的腫瘤消退及持續(xù)的抑制，而陰性對照蛋白CD4-Fc相對于PBS處理沒有效果。處理終止后對經(jīng)處理的小鼠監(jiān)測3周，最終觀察到腫瘤再生長。圖22表明通過腹膜內(nèi)(IP)劑量給藥的Frz8-Fc對無胸腺棵鼠中MMTV-Wnt腫瘤移植物的功效。圖22A的曲線圖顯示了通過每周二次腹膜內(nèi)注射而施用PBS、CD4-Fc(10mg/kg/天)或Frz8-Fc(10mg/kg/天)的包含MMTV-Wnt-l肺瘤移植物的棵鼠。每組具有l(wèi)l只小鼠，且在開始處理前各組的平均腫瘤體積是226mm3。將腫瘤體積均值對時間繪圖，并在X軸上通過箭頭指示了處理日。在第25天，處死對照組，并停止給處理組施用藥物。圖22B是四個處理組中隨時間的腫瘤體積均值和胂瘤體積均值％變化的列表匯總。注意，在圖22B中，F(xiàn)rz8-Fc拮抗劑處理后的胂瘤體積均值導(dǎo)致腫瘤體積從226mm^宿小至處理開始后第5天的約219mm3，及第18天的約67mm3。這分別表示腫瘤大小降低4%和70%。在該研究中，接受Frz-Fc拮抗劑施用的胂瘤與對照動物相比顯示了腫瘤大小的消退。這表明本發(fā)明的Frz-Fc拮抗劑作為單一藥劑是殺腫瘤的，并作為抗癌治療劑是有用的。圖23顯示了通過靜脈內(nèi)(IV)劑量給藥的Frz8-Fc對無胸腺棵鼠中MMTV-Wnt腫瘤移植物的功效。圖23A的曲線圖顯示了通過每周三次靜脈內(nèi)注射而施用PBS、CD4-Fc(10mg/kg/天)或Frz8-Fc(10mg/kg/天)的包含MMTV-Wnt-l肺瘤移植物的棵鼠。每組具有l(wèi)l只小鼠，且在開始處理前各組97的平均腫瘤體積是226mm3。本研究中第四組(高標(biāo)尺)包括10只在研究開始時具有375mm^中瘤體積均值的小鼠，它們通過每周三次靜脈內(nèi)注射而用Frz8-Fc(10mg/kg/天)處理。將腫瘤體積均值對時間繪圖，并在X軸上通過箭頭指示了處理日。在第25天，處死對照組，并停止給處理組施用藥物。圖23B是四個處理組中隨時間的腫瘤體積均值和腫瘤體積均值。/。變化的列表匯總。注意，在所有用Frz-Fc處理的小鼠中，肺瘤負(fù)荷從平均226mmS降低至處理開始后第4天的平均體積179mm3，及第18天后的73mm3。這分別表示肺瘤體積降〗氐21°/。和67%。對于高標(biāo)尺組，腫瘤體積v(人平均376mmS降^f氐至處理第4天的225mm3，及第18天的53mm3。這分別表示腫瘤體積降低39°/。和86%。從經(jīng)處理的小鼠中獲得的血清對Wnt信號傳導(dǎo)的抑制效應(yīng)從經(jīng)處理的小鼠中分離的血清對Wnt信號傳導(dǎo)的抑制報道在圖24中，其中圖24A顯示了從IP處理的小鼠中分離的血清的結(jié)果，而IV處理的結(jié)果顯現(xiàn)在圖24B中。數(shù)據(jù)表示為條形圖，其顯示了TOPglow測定法(如實施例7所述的)中的Wnt信號傳導(dǎo)拮抗劑活性。樣品依照處理、小鼠研究數(shù)目和稀釋度而分組出現(xiàn)。TOPglow基因報道測定法中的相對螢光素酶活性顯示在Y軸上。用約40ng/ml純化的Wnt3a處理除NA(對照)外的所有樣品。所有其它蛋白質(zhì)對照以5嗎/ml存在于培養(yǎng)基中。人異種移植物胂瘤Wnt拮抗劑對天然衍生的人腫瘤模型的抑制將充當(dāng)它們在治療人癌癥中的有效性的進一步指標(biāo)。對人腫瘤衍生的細(xì)胞系測試自分泌Wnt信號傳導(dǎo)的證據(jù)，其與PA-1畸胎瘤細(xì)胞系中看到的類似，作為測試Wnt拮抗劑活性的有效性的指示。與展現(xiàn)出不受Frz8-Fc抑制的低基礎(chǔ)信號傳導(dǎo)的293細(xì)胞相比，畸胎瘤衍生的NTera-2、Tera-2、及NCCIT細(xì)胞系展現(xiàn)出可以受到Frz8-Fc抑制的基礎(chǔ)WnH言號傳導(dǎo)(圖25A)。然而，所有四種畸胎瘤細(xì)胞系似乎都表達(dá)Wnt受體，因為信號傳導(dǎo)可以通過Wnt3a處理而受到進一步刺激，這可以被Frz8-Fc阻斷(圖25B)。這些結(jié)果表明畸胎瘤細(xì)胞系表達(dá)可能促成其致瘤性的Wnt。因此對這些系評估在無胸腺棵鼠中的腫瘤形成，并基于腫瘤形成的一致性，選擇NTera-2和PA-1用于體內(nèi)功效研究。Wnt拮抗劑對NTera2胂瘤異種移植物生長的抑制效應(yīng)相對于對照小鼠，用Wnt拮抗劑Frz8-Fc處理展現(xiàn)NTera2腫瘤異種移植物的小鼠導(dǎo)致腫瘤體積降低大約50%且腫瘤質(zhì)降低大約70%。圖26顯示了Frz8-Fc處理對無胸腺棵鼠中NTera2腫瘤異種移植物生長的抗腫瘤功效。通過每周三次腹膜內(nèi)注射來給攜帶NTera2腫瘤異種移植物的無胸腺棵鼠施藥，首劑15mg/kg/天的PBS、CD4-Fc和Frz8-Fc,后續(xù)劑10mg/kg/天。每組具有20只小鼠，且在處理開始前各組的平均腫瘤體積是200mm3。本研究的第四組包括10只在研究開始時具有336mm^中瘤體積均值的小鼠，它們通過每周三次腹膜內(nèi)注射而用Frz8-Fc(1Omg/kg/天)處理。圖26A是例示性規(guī)程流程圖，而圖26B的曲線圖描繪了隨時間的腫瘤體積均值，其中處理日通過X軸上的箭頭指示。圖26C的條形圖描繪了研究的第20天處死該組中所有動物時的腫瘤重量均值。圖26D和26E分別是腫瘤體積均值和胂瘤體積均值％變化的列表匯總。.從具有NTera2腫瘤異種移植物的小鼠中獲得的血清對Wnt信號傳導(dǎo)的抑制效應(yīng)圖27的條形圖顯示了自NTera2腫瘤研究中各個動物分離的血清的Frz8-FcWnt拮抗劑在TOPglow測定法中的Wnt信號傳導(dǎo)拮抗劑活性。相對螢光素酶活性(Y軸)通過從對照和Frz8-FcWnt拮抗劑的TOPglow測定法中測量。不向細(xì)胞中添加額外的純化的Wnt或Wnt條件化培養(yǎng)基。這些結(jié)果表明Wnt信號傳導(dǎo)減弱與這些用Frz8-FcWnt拮抗劑處理的小鼠中肺瘤大小降低有關(guān)。Wnt拮抗劑對PA-l胂瘤異種移植物生長的抑制效應(yīng)用Wnt拮抗劑Frz8-Fc處理展現(xiàn)PA-l肺瘤異種移植物的小鼠導(dǎo)致處理的12天內(nèi)腫瘤生長的顯著降低。在這種模型中，肺瘤在處理期結(jié)束時小了大約50%，肺瘤塊比對照小鼠中的肺瘤顯著要'J、。圖28表明Frz8-Fc處理對無胸腺棵鼠中PA-l肺瘤異種移植物生長的抗腫瘤功效。通過每周三次腹膜內(nèi)注射來給攜帶PA-1腫瘤異種移植物的無胸腺棵鼠施用(首劑)15mg/kg/天的PBS、CD4-Fc或Frz-Fc，后續(xù)劑10mg/kg/天。每組具有13只小鼠，且在處理開始前各組的平均腫瘤體積是168mm3。圖28A是例示性規(guī)程流程圖，而圖28B的曲線圖描繪了隨時間的腫瘤體積均值，其中處理日通過X軸上的箭頭指示。圖28C是處死時胂瘤重量均值的曲線圖。在細(xì)胞接種后第58天(處理開始后第32天)處死小鼠，并對腫瘤進行切除和稱重。將腫瘤重量均值土SEM作為分組的函數(shù)繪圖。圖28D和28E分別是腫瘤體積均值和腫瘤體積均值％變化的列表匯總。實施例ll:接受MMTV胂瘤移植并用Frz8-Fc和Frz5-FcWnt拮抗劑處理的小鼠中的Wnt信號傳導(dǎo)Frz8-Fc和Frz5-FcWnt拮抗劑對WnH言號傳導(dǎo)的效應(yīng)Frz5-Fz如Frz8-Fc—樣有效地抑制Wnt3a誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)。用10mg/kg的Frz8-Fc、Frz5-Fz、或CD4-Fc(作為陰性對照)處理具有MMTV腫瘤(大小約400-800mm3)的無胸腺棵鼠。處理后5小時，通過心臟穿刺從小鼠中收集血清，并如實施例7所述的那樣在用Wnt3a活化并用TOPglow轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞上分析Wnt抑制效應(yīng)。用約40ng/ml純化的Wnt3a處理除NA(對照)外的所有樣品。所有其它蛋白質(zhì)對照以5嗎/ml存在于培養(yǎng)基中。圖29顯示了用Frz8-Fc或Frz5-Fz處理的小鼠中的抑制水平。Frz8-Fc或Frz5-Fz的處理導(dǎo)致類似水平的對Wnt3a誘導(dǎo)的信號傳導(dǎo)的抑制。Frz8-Fc和Frz5-FcWnt拮抗劑對軸蛋白2表達(dá)的效應(yīng)Frz8-Fc和Frz5-Fz化合物抑制體內(nèi)Wnt信號傳導(dǎo)，如通過對Wnt靶基因軸蛋白2的調(diào)控所測定的。用10mg/kg的Frz8-Fc、Frz5-Fz、或CD4-Fc(作為陰性對照)處理具有MMTV腫瘤(大小約400-800mm3)的無胸腺棵鼠。處理后5小時，通過心臟穿刺從小鼠中收集血清。使用QIAGENRNAEASY試劑盒(Qiagen,Valencia,CA)從腫瘤細(xì)胞中提取RNA，并如實施例9所述的那樣分析軸蛋白2的表達(dá)。自用Frz8-Fc或Frz5-Fz處理的小鼠獲得的樣品中觀察到軸蛋白2水平降低，表明這些化合物能夠抑制體內(nèi)Wnt信號傳導(dǎo)。圖30顯示了Frz8-Fc和Frz5-Fz處理的腫瘤中降低的軸蛋白2表達(dá)，其中圖30A顯示了相對于GAPDH表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化的表達(dá)，而圖30B顯示了相對于rpll9表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化的表達(dá)。實施例12:用Wnt拮抗劑處理的再生組織Wnt信號傳導(dǎo)在再生組織(諸如皮膚、腸、和造血細(xì)胞)的自我更新中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，并且Dkkl對Wnt信號傳導(dǎo)的抑制可以不利地影響這些組織在成年小鼠中的體系結(jié)構(gòu)。以下實施例檢查在與用于獲得抗腫瘤功效相同的條件下暴露于Frz8-Fc是否對小鼠中的腸和皮膚有任何效應(yīng)。14次處理(一周三次)后從在MMTV-Wntl腫瘤模型中處理的小鼠(實施例10所述的)中收集組織，并通過免疫組織化學(xué)對切片進行(3-聯(lián)蛋白蛋白質(zhì)染色。對皮膚和各種腸區(qū)室的分析揭示了在所有組的處理小鼠中這些組織的體系結(jié)構(gòu)在形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為正常，在腸帕內(nèi)特(Paneth)細(xì)胞(圖31A)和皮膚毛嚢(圖31B)中具有典型的胞質(zhì)和核(3-聯(lián)蛋白染色樣式。此外，9次處理(一周三次)后從使用NTera-2模型的動物中收集的皮膚和腸的組織學(xué)和免疫組織化學(xué)分析也揭示了對照組和處理組之間沒有差異。這表明可以抑制腫瘤生長的治療方案的Frz8-Fc處理對皮膚和腸的組織更新沒有不利影響。實施例13本實施例描述了Wnt拮抗劑的各種生產(chǎn)方法。Wnt拮抗劑在大腸桿菌中的表達(dá)本實施例說明了通過大腸桿菌中的重組表達(dá)來制備未糖基化形式的Wnt才吉4元劑。首先使用所選擇的PCR引物擴增編碼Wnt拮抗劑的DNA序列。引物應(yīng)當(dāng)含有與所選擇的表達(dá)載體上的限制酶位點對應(yīng)的限制酶位點。可以采用多種表達(dá)載體。合適載體的例子是包含氨卡青霉素和四環(huán)素抗性基因的pBR322(衍生自大腸桿菌，參見Bolivar等，Gene,2:95(1977))。將該載體用限制酶消化，并去磷酸化。然后將PCR擴增的序列連接入載體中。載體優(yōu)選包括編碼抗生素抗性基因的序列、trp啟動子、多His前導(dǎo)(其包括前6個STII密碼子、多His序列、及腸激酶切割位點)、Wnt拮抗劑編碼區(qū)、入轉(zhuǎn)錄終止子、及argU基因。然后使用Sambrook等，見上文所述方法，使用連接混合物來轉(zhuǎn)化所選擇的大腸桿菌菌抹。轉(zhuǎn)化體通過它們在LB平板上生長的能力來鑒定，然后選擇抗生素抗性菌落。分離質(zhì)粒DNA,并通過限制性分析和DNA測序來證實。可以將所選擇的克隆在液體培養(yǎng)基(諸如補充有抗生素的LB肉湯)中培養(yǎng)過夜。隨后可以將過夜培養(yǎng)物用于接種更大規(guī)模的培養(yǎng)。然后將細(xì)胞培養(yǎng)至期望的光密度，在此期間開啟表達(dá)啟動子。將細(xì)胞再培養(yǎng)數(shù)小時后，可以通過離心來收獲細(xì)胞?？梢允褂枚喾N本領(lǐng)域已知的試劑來溶解通過離心而獲得的細(xì)胞沉淀物，然后可以在容許蛋白質(zhì)緊密結(jié)合的條件下使用金屬螯合柱來純化溶解的Wnt拮抗劑蛋白。使用如下規(guī)程，可以在大腸桿菌中表達(dá)加有多His標(biāo)簽形式的Wnt拮抗劑。首先使用所選擇的PCR引物擴增編碼Wnt拮抗劑的DNA序列。引物可含101有與所選擇的表達(dá)載體上的限制酶位點對應(yīng)的限制酶位點，及其它有用的序列，其提供高效且可靠的翻譯起始、金屬螯合柱上的快速純化、及用腸激酶進行的蛋白水解消除。然后將PCR擴增的、加有多His標(biāo)簽的序列連接入表達(dá)載體中，該載體載體用于轉(zhuǎn)化基于菌抹52(W3110flihA(tonA)longalErpoHts(htpRts)clpP(lacIq))的大腸桿菌宿主。首先將轉(zhuǎn)化體在30。C在搖動情況下在含有50mg/ml羧千青霉素的LB中培養(yǎng)，直至O.D.600達(dá)到3-5。然后將培養(yǎng)物在CRAP培養(yǎng)基(其如下制備，即混合500mL水中的3.57g(NH4)2S04、0.71g二水合檸檬酸鈉、1.07gKCl、5.36gDifco酵母提取物、5.36gSheffieldhycaseSF，以及110mMMPOSpH7.3、0.55%(w/v)葡萄糖和7mMMgS04)中稀釋50-100倍，并在30。C在搖動情況下培養(yǎng)大約20-30小時。取出樣品以通過SDS-PAGE分析來檢驗表達(dá)，并將大量的培養(yǎng)物離心以使細(xì)胞沉淀。將細(xì)胞沉淀物冷凍直至純化和重折疊。將來自0.5至1L發(fā)酵液的大腸桿菌漿(6-10g沉淀物)以10倍體積(w/v)重懸浮于7M胍，20mMTrispH8緩沖液中。添加固體亞石克酸鈉和連四石克酸鈉以分別獲得0.1M和0.02M的終濃度，并在4。C攪動溶液過夜。該步驟導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，其中所有的半胱氨酸殘基通過亞硫酸化(sulfitolization)而被封閉。將溶液在Beckman超速離心機中以40,000rpm離心30分鐘。將上清液用3-5倍體積的金屬螯合柱緩沖液(6M胍，20mMTrispH7.4)稀釋，并過濾通過0.22微米濾器以澄清。將澄清后的提取物加載至在金屬螯合柱緩沖液中平衡的5mlQiagenNi-NTA金屬螯合柱上。用含有50mM咪唑(Calbiochem，Utrol等級)pH7.4的額外緩沖液(additionalbuffer)清洗該柱。用含有250mM咪唑的緩沖液洗脫蛋白質(zhì)。將含有期望蛋白質(zhì)的級分合并，并貯存在4。C。通過280nm的吸光度來估算蛋白質(zhì)濃度，使用基于其氨基酸序列的計算消光系數(shù)。通過將樣品緩慢地稀釋至新鮮制備的重折疊緩沖液中而使蛋白質(zhì)重折疊，所述重折疊緩沖液含20mMTrispH8.6、0.3MNaCl、2.5M尿素、5mM半胱氨酸、20mM甘氨酸和lmMEDTA。選擇重折疊體積，使得最終的蛋白質(zhì)濃度在50至100ug/ml之間。將重折疊溶液在4。C溫和攪動12-36小時。通過添力口TFA至0.4。/。的終濃度(pH約3)來淬滅重折疊反應(yīng)。在進一步純化蛋白質(zhì)之前，將溶液過濾通過0.22微米濾器，并添加乙腈至2-10%終濃度。將重折疊的蛋白質(zhì)在PorosRl/H反相柱上層析，其中使用0.1%TFA的流動緩沖液以及用從10至80%的乙腈梯度洗脫。在SDS-PAGE上分析具有A280吸光度的級分的等分試樣，并合并含有同質(zhì)重折疊蛋白質(zhì)的級分。一般而言，大多數(shù)蛋白質(zhì)的正確重折疊種類在最低的乙腈濃度洗脫，因為這些種類是最緊密的，從而保護它們的疏水內(nèi)部免于與反相樹脂相互作用。聚集種類通常在較高的乙腈濃度洗脫。除了將錯誤折疊形式的蛋白質(zhì)與期望形式分開之外，反相步驟還從樣品中清除內(nèi)毒素。將含有期望的折疊的Wnt拮抗劑多肽的級分合并，并使用朝向溶液的溫和氮氣流來除去乙腈。將蛋白質(zhì)通過透析或通過使用在配制緩沖液中平衡的G25Superfine(Pharmacia)樹脂的凝膠過濾而配制至含有0.14M氯化鈉和4%甘露醇的20mMHepespH6.8中，并無菌過濾。Wnt拮抗劑在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)本實施例說明了通過哺乳動物細(xì)胞中的重組表達(dá)來制備潛在糖基化形式的Wnt拮抗劑。采用載體pRK5(參見EP307,247，1989年3月15日公布)作為表達(dá)載體。任選地，使用諸如Sambrook等，見上文所述的連接方法，用容許插入Wnt拮抗劑DNA的所選擇的限制酶將Wnt拮抗劑DNA連接入pRK5中。為了本實施例的目的，所得的載體稱為pRK5-WA。在一個實施方案中，所選擇的宿主細(xì)胞可以是293細(xì)胞。在組織培養(yǎng)平板中于培養(yǎng)基(諸如補充有胎牛血清，任選地，營養(yǎng)成分和/或抗生素的DMEM)中將人293細(xì)胞(ATCCCCL1573)培養(yǎng)至匯合。將約10嗎pRK5-WADNA與約liig編碼VARNA基因的DNA[Thimmappaya等，Cell,31:543(1982)]混合，并溶解于500fi1lmMTris-HCl、O.lmMEDTA、0.227MCaCl2t。將500ji150mMHEPES(pH7.35)、280mMNaCl、1.5mMNaP04逐滴添加至該混合物，并容許沉淀物在25。C形成10分鐘。將沉淀物懸浮，并添加至293細(xì)胞，并容許在37。C沉降約4小時。吸去培養(yǎng)基，并添力口2mlPBS中的20。/。甘油達(dá)30秒。然后用無血清培養(yǎng)基清洗293細(xì)胞，添加新鮮培養(yǎng)基，并將細(xì)胞溫育約5天。轉(zhuǎn)染后約24小時，除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基(單獨的)或含有200)iCi/ml"S-半胱氨酸和200iiCi/ml"S-曱硫氨酸的培養(yǎng)基更換。溫育12小時后，收集條件化培養(yǎng)基，在旋轉(zhuǎn)濾器上濃縮，并加載至15。/。SDS凝膠上?？梢詫⑻幚砗蟮哪z干燥，并暴露于膠片達(dá)所選擇的一段時間以揭示W(wǎng)nt拮抗劑多肽的存在。含經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的培養(yǎng)物可以進行進一步的溫育(在無血清培養(yǎng)基中)，并在所選4奪的生物測定法中測試該培養(yǎng)基。在備選的技術(shù)中，可以將Wnt拮抗劑瞬時導(dǎo)入293細(xì)胞中，其使用Somparyrac等，Proc.Natl.Acad.Sci.,12:7575(1981)所述的硫酸右旋糖香法進行。將293細(xì)胞在旋轉(zhuǎn)燒瓶中培養(yǎng)至最大限度密度，并添加700pgpRK5-WADNA。首先通過離心從旋轉(zhuǎn)燒瓶中濃縮細(xì)胞，并用PBS清洗。將DNA-右旋糖苷沉淀物在細(xì)胞沉淀物上溫育4小時。將細(xì)胞用20%甘油處理90秒，用組織培養(yǎng)基清洗，并再次導(dǎo)入裝有組織培養(yǎng)基、5嗎/ml牛胰島素和0.1fig/ml牛運鐵蛋白的旋轉(zhuǎn)燒瓶中。約4天后，將條件化培養(yǎng)基離心，并過濾以除去細(xì)胞和碎片。然后可以將含有所表達(dá)的Wnt拮抗劑的樣品濃縮，并通過任何所選擇的方法(諸如透析和/或柱層析)來純化。在另一個實施方案中，可以在CHO細(xì)胞中表達(dá)Wnt拮抗劑?？梢允褂靡阎脑噭?諸如CaP04或DEAE-右旋糖苷)來將pRK5-WA轉(zhuǎn)染入CHO細(xì)胞中。如上所述，可以溫育細(xì)胞培養(yǎng)物，并將培養(yǎng)基用培養(yǎng)基(單獨的)或含有放射性標(biāo)記物(諸如"S-曱硫氨酸)的培養(yǎng)基更換。在確定存在Wnt拮抗劑多肽后，可以用無血清培養(yǎng)基更換培養(yǎng)基。優(yōu)選地，將培養(yǎng)物溫育約6天，然后收獲條件化培養(yǎng)基。然后可以將含有所表達(dá)的Wnt拮抗劑的培養(yǎng)基濃縮，并通過任何所選擇的方法來純化。還可以在宿主CHO細(xì)胞中表達(dá)加有表位標(biāo)簽的Wnt拮抗劑?？梢詫nt拮抗劑從pRK5載體中亞克隆出來。亞克隆插入物可以進行PCR,用以以符合讀碼框的方式與所選擇的表位標(biāo)簽(諸如多His標(biāo)簽)融合入桿狀病毒表達(dá)載體中。然后可以將加有多His標(biāo)簽的Wnt拮抗劑插入物亞克隆入SV40驅(qū)動的載體中，該載體含有供選擇穩(wěn)定克隆用的選擇標(biāo)志，諸如DHFR。最后，可以用SV40驅(qū)動的載體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞(如上文所述)?？梢匀缟衔乃龅哪菢訉嵤?biāo)記以檢驗表達(dá)。然后可以將含有所表達(dá)的加有多His標(biāo)簽的Wnt拮抗劑的培養(yǎng)基濃縮，并通過任何所選擇的方法(諸如通過N產(chǎn)-螯合親和層析)來純化。還可以將Wnt拮抗劑通過瞬時表達(dá)規(guī)程而在CHO和/或COS細(xì)胞中表達(dá)，或通過另一種穩(wěn)定表達(dá)規(guī)程而在CHO細(xì)胞中表達(dá)。使用如下規(guī)程來實施CHO細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)。將蛋白質(zhì)表達(dá)為IgG構(gòu)建體(免疫粘附素)，其中將相應(yīng)蛋白質(zhì)的可溶形式(例如胞外結(jié)構(gòu)域)的編碼序列融合至含有鉸鏈、CH2和CH2結(jié)構(gòu)域的IgGl恒定區(qū)序列和/或是加有多His標(biāo)簽的形式。PCR擴增后，在CHO表達(dá)載體中亞克隆相應(yīng)DNA,其使用如Ausubel等,CurrentProtocolsofMolecularBiology,單元3.16,JohnWileyandSons(1997)所述的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。構(gòu)建在感興趣DNA的5，和3，具有相容限制性位點的CHO表達(dá)載體，用以容許cDNA的便利改組。用于CHO細(xì)胞中表達(dá)的載體如Lucas等，Nucl.AcidsRes.24:9(1774-1779(19%)所述的，并使用SV40早期啟動子/增強子以驅(qū)動感興趣cDNA和二氬葉酸還原酶(DHFR)的表達(dá)。DHFR表達(dá)容許轉(zhuǎn)染后選擇質(zhì)粒的穩(wěn)定維持。使用商品化轉(zhuǎn)染試劑SUPERFECTt⑧(Quiagen)、DOSPER⑧或FUGENE⑧(BoehringerMannheim),將12ug期望質(zhì)粒DNA導(dǎo)入大約10x106個010細(xì)胞中。如Lucas等，見上文所述的那樣培養(yǎng)細(xì)胞。將大約3x107個細(xì)胞冷凍在安瓿中，用于如下文所述那樣的進一步培養(yǎng)和生產(chǎn)。將裝有質(zhì)粒DNA的安吾瓦通過放置入水浴而融化，并通過渦旋而混合。將內(nèi)含物吸入裝有10ml培養(yǎng)基的離心管中，并在1000rpm離心5分鐘。吸出上清液，并將細(xì)胞重懸浮于10ml選擇性培養(yǎng)基(含有5%0.2jam滲濾胎牛血清的PS20，經(jīng)0.2pm過濾)。然后將細(xì)胞等分至裝有90mL選擇性培養(yǎng)基的100mL旋轉(zhuǎn)器中。l-2天后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移入裝有150mL選擇性生長培養(yǎng)基的250mL旋轉(zhuǎn)器中，并在37。C溫育。再過2-3天后，以3x1()S個細(xì)胞/mL接種250mL、500mL和2000mL旋轉(zhuǎn)器。通過離心和在生產(chǎn)培養(yǎng)基中重懸浮來用新鮮培養(yǎng)基更換細(xì)胞培養(yǎng)基。雖然可以采用任何合適的CHO培養(yǎng)基，但是實際上可以使用1992年6月16日公告的美國專利No.5,122,469所述生產(chǎn)培養(yǎng)基。以1.2x106個細(xì)胞/mL接種3L生產(chǎn)旋轉(zhuǎn)器。第0天，測定細(xì)胞數(shù)目和pH。第1天，對旋轉(zhuǎn)器取樣，并開始噴入經(jīng)過過濾的空氣。第2天，對旋轉(zhuǎn)器取樣，將溫度變動至33。C，并添加30mL500g/L葡萄糖和0.6mL10。/。消泡劑(例如35%聚二曱基硅氧烷乳齊'J,DowCorning365醫(yī)學(xué)級乳劑)。貫穿整個生產(chǎn)過程，根據(jù)需要調(diào)節(jié)pH以將其保持在約7.2。IO天后，或直至生存力下降低于70%時，通過離心并過濾通過0.2iim濾器來收獲細(xì)胞培養(yǎng)物。將濾液貯存在4。C，或立即加載至純化柱上。對于加有多His標(biāo)簽的構(gòu)建體，使用Ni-NTA柱(Qiagen)來純化蛋白質(zhì)。純化之前，將咪唑添加至條件化培養(yǎng)基至5mM的濃度。將條件化培養(yǎng)基以4-5ml/min的流速泵至6mlNi-NTA柱上，該柱已經(jīng)在含有0.3MNaCl和5mM咪唑的20mMHepespH7.4緩沖液中平衡。加載后，用另外的平衡緩沖液清洗105該柱，并用含有0.25M咪唑的平衡緩沖液洗脫蛋白質(zhì)。隨后將高度純化的蛋白質(zhì)用25mlG25Superfine(Pharmacia)柱來脫鹽至含有10mMHepes、0.14MNaCl和4。/。甘露醇pH6.8的貯存緩沖液中，并貯存在-80。C。如下從條件化培養(yǎng)基中純化免疫粘附素(含F(xiàn)c的)構(gòu)建體。將條件化培養(yǎng)基泵至5ml蛋白A柱(Pharmacia)上，該蛋白A柱已經(jīng)在20mM磷酸鈉緩沖液pH6.8中平衡。加載后，用平衡緩沖液徹底清洗該柱，之后，用100mM檸檬酸pH3.5洗脫。通過將lml級分收集入裝有275^L1MTris緩沖液pH9的試管中而使洗脫的蛋白質(zhì)立即中和。隨后如上文關(guān)于加有多His標(biāo)簽的蛋白質(zhì)所述那樣使高度純化的蛋白質(zhì)脫鹽至貯存緩沖液中。通過SDS-PAGE并通過Edman降解進行的N末端氨基酸測序來評估同質(zhì)性。Wnt拮抗劑在酵母中的表達(dá)以下方法描述了Wnt拮抗劑在酵母中的重組表達(dá)。首先，構(gòu)建酵母表達(dá)載體，用于來自ADH2/GAPDH啟動子的Wnt拮抗劑胞內(nèi)生成或分泌。將編碼Wnt拮抗劑的DNA和啟動子插入選擇質(zhì)粒中的合適限制酶位點以指導(dǎo)Wnt拮抗劑的細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。為了分泌，可以將編碼Wnt拮抗劑的DNA連同編碼ADH2/GAPDH啟動子、天然Wnt拮抗劑信號肽或其它哺乳動物信號肽、或例如酵母a-因子或轉(zhuǎn)化酶分泌信號/前導(dǎo)序列、和接頭序列(在需要時)的DNA—起克隆入所選擇的質(zhì)粒，用于表達(dá)Wnt拮抗劑。然后可以將酵母細(xì)胞(諸如酵母菌抹ABllO)用上文所述表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，并在所選擇的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)。可以如下對經(jīng)轉(zhuǎn)化的酵母上清液進行分析，即用10%三氯乙酸沉淀，并通過SDS-PAGE分離，接著用考馬斯藍(lán)染料將凝膠染色。隨后可以如下分離并純化重組Wnt拮抗劑，即通過離心從發(fā)酵培養(yǎng)基中除去酵母細(xì)胞，然后使用所選擇的筒式過濾器(cartridgefilter)來濃縮培養(yǎng)基?？梢允褂盟x擇的柱層析樹脂來進一步純化含有Wnt拮抗劑的濃縮液。Wnt拮抗劑在經(jīng)桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)以下方法描述了Wnt拮抗劑在經(jīng)桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞中的重組表達(dá)。將編碼Wnt拮抗劑的序列融合在桿狀病毒表達(dá)載體內(nèi)所包含的表位標(biāo)簽的上游。此類表位標(biāo)簽包括多His標(biāo)簽和免疫球蛋白標(biāo)簽(像IgG的Fc區(qū))?？梢圆捎枚喾N質(zhì)粒，包括自商品化質(zhì)粒諸如pVL1393(Novagen)衍生的質(zhì)粒。簡言之，使用與5，和3，區(qū)互補的引物通過PCR來擴增編碼Wnt拮抗劑的序列或Wnt拮抗劑編碼序列的期望部分，諸如編碼跨膜蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的序列或編碼成熟蛋白的序列(若該蛋白質(zhì)是細(xì)胞外的)。5，引物可以摻入位于側(cè)翼的(所選擇的)限制酶位點。然后將產(chǎn)物用那些所選擇的限制酶消化，并亞克隆入表達(dá)載體。使用Lipotectin(購自GIBCO-BRL)通過將上述質(zhì)粒和BACULOGOLDTM病毒DNA(Pharmingen)共轉(zhuǎn)染入草地夜蛾(5)wfifo/^rayh^^erafo,"Sf9")細(xì)胞(ATCCCRL1711)而產(chǎn)生重組桿狀病毒。在28。C溫育4-5天后，收獲所釋放的病毒，并用于進一步擴增。如O'Reilley等，Baculovirusexpressionvectors:ALaboratoryManual,Oxford:OxfordUniversityPress(1994)所述實施病毒感染和蛋白質(zhì)表達(dá)。然后可以通過例如N產(chǎn)-螯合親和層析如下純化所表達(dá)的加有多His標(biāo)簽的Wnt拮抗劑。如Rupert等，Nature,362:175-179(1993)所述的那樣從經(jīng)重組病毒感染的Sf9細(xì)胞中制備提取物。簡言之，將Sf9細(xì)胞清洗，在超聲處理緩沖液(25mLHepespH7.9、12.5mMMgCl2、O.lmMEDTA、10%甘油、0.1%NP-40、0.4MKC1)中懸浮，并在水上超聲處理2次達(dá)20秒。通過離心來澄清超聲處理物，并將上清液在加樣緩沖液(50mM磷酸鹽、300mMNaCl、10%甘油，pH7.8)中稀釋50倍，并通過0.45pm濾器過濾。制備具有5mL柱床體積的Ni2+-NTA瓊脂糖柱(購自Qiagen)，用25mL水清洗，并用25mL加樣緩沖液平衡。將過濾后的細(xì)胞提取物以每分鐘0.5mL加載至該柱上。用加樣緩沖液將該柱清洗至基線A28。，在該點開始收集級分。接著，用第二清洗緩沖液(50mM磷酸鹽、300mMNaCl、10%甘油，pH6.0)清洗該柱，其洗脫非特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)。再次達(dá)到A28o基線后，用第二清洗緩沖液中0至500mM咪唑梯度對該柱進行展開。收集lmL級分，并通過SDS-PAGE和銀染色或使用偶聯(lián)有堿性磷酸酶的N產(chǎn)-NTA(Qiagen)進行的Western印跡來分析。收集含有所洗脫的加有His,o標(biāo)簽的Wnt拮抗劑的級分，并針對加樣緩沖液透析?；蛘?，可以使用已知的層析技術(shù)(包括例如蛋白A或蛋白G柱層析)來實施加有IgG標(biāo)簽的(或加有Fc標(biāo)簽的)Wnt拮抗劑的純化。使用親和層析來純化Wnt拮抗劑多肽天然或重組Wnt拮抗劑多肽可以通過蛋白質(zhì)純化領(lǐng)域中的多種標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來純化。例如使用對感興趣Wnt拮抗劑多肽特異性的抗體通過免疫親和層析來純化Wnt拮抗劑多肽原、成熟Wnt拮抗劑多肽、或Wnt拮抗劑前(pre-)多肽。一般而言，通過將Wnt拮抗劑多肽共價偶聯(lián)至活化的層析樹脂而構(gòu)建免疫親和柱?；蛘?，可以使用固定化的蛋白A樹脂(諸如ProSepA(Millipore))從培養(yǎng)基中直接純化含有Fc結(jié)構(gòu)域的Wnt拮抗劑。或是通過硫酸銨沉淀或是通過固定化蛋白A(PharmaciaLKBBiotechnology,Piscataway,N丄)上的純化來從免疫血清中制備多克隆免疫球蛋白。類似地，通過硫酸銨沉淀或固定化蛋白A上的層析來從小鼠腹水中制備單克隆抗體。將部分純化的免疫球蛋白共價附著至層析樹脂，諸如CnBr活化的SEPHAROSEtm(PharmaciaLKBBiotechnology)。依照制造商的說明書，將抗體偶聯(lián)至樹脂，封閉樹脂，并清洗衍生樹脂?？梢酝ㄟ^從含有可溶形式的Wnt拮抗劑的細(xì)胞中制備級分而在Wnt拮抗劑多肽的純化中利用這種免疫親和柱。通過添加去污劑或通過本領(lǐng)域公知的其它方法來溶解全細(xì)胞或經(jīng)由差速離心獲得的亞細(xì)胞級分而衍生這種制備物?；蛘?，可以將含有信號序列的可溶性Wnt拮抗劑多肽以有用數(shù)量分泌至培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基中。使含有可溶性Wnt拮抗劑多肽的制備物流過免疫親和柱，并在容許Wnt拮抗劑多肽優(yōu)先吸附的條件(例如存在去污劑時的高離子強度緩沖液)下清洗該柱。然后，在破壞抗體/Wnt拮抗劑結(jié)合的條件(例如低pH緩沖液，諸如大約pH2-3，或高濃度離液劑諸如尿素或硫氰酸根離子)下洗脫柱，并收集Wnt拮抗劑多肽。參考書目1.HeTC,SparksAB,RagoC,etal.Identificationofc-MYCasatargetoftheAPCpathway.Science1998;281:1509-1512.2.TetsuO,McCormickF.Beta-cateninregulatesexpressionofcyclinDlincoloncarcinomacells.Nature1999;398:422-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u)域的接頭。17.權(quán)利要求16的Wnt拮抗劑，其中所述4妄頭包含選自下組的肽ESGGGGVT(SEQIDNO:69)、LESGGGGVT(SEQIDNO:70)、GRAQVT(SEQIDNO:71)、WRAQVT(SEQIDNO:72)、及ARGRAQVT(SEQIDNO:73)。18.—種Wnt拮抗劑，其包含選自下組的多肽Frz8-Fc(SEQIDNO:74)、Frz5-Fc(SEQIDNO:75)、Frzl-Fc(SEQIDNO:76)、Frz2-Fc(SEQIDNO:77)、Frz3畫Fc(SEQIDNO:78)、Frz4-Fc(SEQIDNO:79)、Frz6-Fc(SEQIDNO:80)、Frz7-Fc(SEQIDNO:81)、Frz9-Fc(SEQIDNO:82)、FrzlO-Fc(SEQIDNO:83)、sFRPl畫Fc(SEQIDNO:84)、sFRP2(SEQIDNO:85)、sFRP3-Fc(SEQIDNO:86)、sFRP4-Fc(SEQIDNO:87)、及sFRP5-Fc(SEQIDNO:88)。19.一種組合物，其包含至少一種藥學(xué)可接受載體或賦形劑和權(quán)利要求1-18的任何Wnt拮抗劑。20.—種編碼權(quán)利要求l-18的任何Wnt拮抗劑的核酸序列。21.權(quán)利要求20的核酸，其進一步包含含有與所述核酸可操作連接的控制序列的載體。22.權(quán)利要求21的載體，其進一步包含宿主細(xì)胞。23.權(quán)利要求22的宿主細(xì)胞，其選自哺乳動物、昆蟲、大腸桿菌和酵母細(xì)胞。24.—種制品，其包含權(quán)利要求19的組合物和容器；其中所述Wnt拮抗劑裝在所述容器內(nèi)，且所述容器進一步包含(a)附于所述容器的標(biāo)簽，或(b)所述容器里的包裝插頁，其提及所述Wnt拮抗劑的用途，指出所述組合物用于Wnt介導(dǎo)的病癥的治療性處理或診斷性檢測的用途。25.—種抑制細(xì)胞中Wnt信號傳導(dǎo)的方法，其包括使所述細(xì)胞與有效量的權(quán)利要求1-18的任何Wnt拮抗劑接觸。26.權(quán)利要求25的方法，其中所述細(xì)胞包含在哺乳動物內(nèi)，且施用的量是治療有效量。27.權(quán)利要求25的方法，其中所述Wnt信號傳導(dǎo)源自Wnt信號傳導(dǎo)成分經(jīng)由體細(xì)胞突變的激活。28.權(quán)利要求25的方法，其中所述對Wnt信號傳導(dǎo)的抑制導(dǎo)致對所述細(xì)胞生長的抑制。29.權(quán)利要求28的方法，其中所述細(xì)胞是癌細(xì)胞。30.—種在患有Wnt介導(dǎo)的病癥的哺乳動物中治療所述病癥的方法，其包4舌給所述哺乳動物施用治療有效量的依照權(quán)利要求l-18中任一項的Wnt拮抗劑。31.權(quán)利要求30的方法，其中所述病癥是與異常Wnt信號傳導(dǎo)活性有關(guān)的細(xì)胞增殖性病癥。32.權(quán)利要求31的方法，其中所述異常Wnt信號傳導(dǎo)活性源自Wnt蛋白表達(dá)的升高。33.權(quán)利要求31的方法，其中所述細(xì)胞增殖性病癥是癌癥。34.權(quán)利要求33的方法，其中所述癌癥選自結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、乳腺癌、白血病、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、及髓母細(xì)胞瘤。35.—種用于檢測Wnt蛋白存在的方法，其包括使樣品與依照權(quán)利要求1-18中任一項的Wnt拮抗劑接觸，其中(a)復(fù)合物的存在或(b)Fz/Fc拮抗劑和Wnt蛋白之間的結(jié)合水平指示W(wǎng)nt蛋白和/或信號傳導(dǎo)的存在。36.權(quán)利要求35的方法，其中該方法進一步包括確定Wnt信號傳導(dǎo)水平是否異常，該方法進一步包括將所述樣品中的結(jié)合水平與已知具有生理學(xué)正常Wnt信號傳導(dǎo)的第二樣品中的水平進行比較，其中所述樣品中的結(jié)合水平高于或低于所述第二樣品中的結(jié)合水平指示異常的Wnt信號傳導(dǎo)。37.權(quán)利要求36的方法，其中所述異常Wnt信號傳導(dǎo)進一步指示W(wǎng)nt介導(dǎo)的病癥的存在。38.權(quán)利要求37的方法，其中所述Wnt介導(dǎo)的病癥是癌癥。39.—種在特征在于激活的或過量的Wnt信號傳導(dǎo)的細(xì)胞中調(diào)控Wnt靶基因表達(dá)的方法，其包括使所述細(xì)胞與有效量的權(quán)利要求1-18中任一項的Wnt拮抗劑接觸。40.—種治療性處理Wnt介導(dǎo)的癌癥的方法，其包括施用治療有效量的權(quán)利要求l-18中任一項的Wnt拮抗劑，其中所述拮抗劑的施用阻滯所述癌癥任何隨后的大小增加或嚴(yán)重程度進展。41.權(quán)利要求40的方法，其中所述Wnt拮抗劑的施用導(dǎo)致所述癌癥大小或嚴(yán)重程度降低。42.權(quán)利要求40的方法，其中所述Wnt拮抗劑的施用降低所述癌癥的腫瘤負(fù)荷。43.權(quán)利要求40的方法，其中所述Wnt拮抗劑的施用殺死所述癌癥。44.Wnt拮抗劑在制備用于治療細(xì)胞增殖性病癥的藥物中的用途，所述Wnt拮抗劑包含(a)巻曲結(jié)構(gòu)域構(gòu)件，和(b)Fc結(jié)構(gòu)域，其中所述巻曲結(jié)構(gòu)域構(gòu)件包含自選自下組的蛋白質(zhì)衍生的多肽(i)巻曲(Frz)蛋白，(ii)分泌型巻曲相關(guān)蛋白(sFRP)蛋白，及(iii)Ror蛋白，而且進一步地其中所述Wnt拮抗劑的活性在體內(nèi)持續(xù)至少1小時。45.權(quán)利要求44的用途，其中所述Wnt拮抗劑的活性在體內(nèi)持續(xù)至少5小時。46.Wnt拮抗劑在制備用于治療細(xì)胞增殖性病癥的藥物中的用途，所述Wnt拮抗劑包含(a)巻曲結(jié)構(gòu)域構(gòu)件，和(b)Fc結(jié)構(gòu)域，其中所述巻曲結(jié)構(gòu)域構(gòu)件包含自選自下組的蛋白質(zhì)衍生的多肽(i)巻曲(Frz)蛋白，(ii)分泌型巻曲相關(guān)蛋白(sFRP)蛋白，及(iii)Ror蛋白，而且進一步地其中所述Wnt拮抗劑的體內(nèi)半衰期為至少l天。47.權(quán)利要求46的用途，其中所述Wnt拮抗劑的體內(nèi)半衰期為至少2天。48.權(quán)利要求44-47中任一項的用途，進一步包含連接所述巻曲結(jié)構(gòu)域構(gòu)件與所述Fc結(jié)構(gòu)域的接頭。49.權(quán)利要求48的用途，其中所述接頭是選^^下組的肽ESGGGGVT(SEQIDNO:69)、LESGGGGVT(SEQIDNO:70)、GRAQVT(SEQIDNO:71)、WRAQVT(SEQIDNO:72)、及ARGRAQVT(SEQIDNO:73)。50.權(quán)利要求44-49中任一項的用途，其中所述細(xì)胞增殖性病癥是癌癥。51.權(quán)利要求50的用途，其中所述癌癥選自結(jié)腸癌、結(jié)腸直腸癌、乳腺癌、白血病、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、及髓母細(xì)胞瘤。全文摘要本發(fā)明提供了包含自卷曲蛋白、分泌型卷曲相關(guān)蛋白或Ror蛋白衍生的Frz結(jié)構(gòu)域構(gòu)件和Fc免疫球蛋白構(gòu)件的嵌合Wnt拮抗劑，及其在細(xì)胞Wnt信號傳導(dǎo)和Wnt介導(dǎo)的病癥(包括癌癥)的治療和診斷性檢測中的用途。文檔編號C07K14/435GK101600449SQ200780040506公開日2009年12月9日申請日期2007年9月7日優(yōu)先權(quán)日2006年9月8日發(fā)明者保羅·波拉基斯,維尼塔·I·德阿爾梅達(dá),詹姆斯·A·厄恩斯特,邦尼·魯賓費爾德申請人:健泰科生物技術(shù)公司