一種聚乙二醇修飾的微管蛋白聚合劑多肽及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及藥物領(lǐng)域，具體涉及具有促進(jìn)微管蛋白聚合，治療實體腫瘤的多肽。此多肽經(jīng)過了聚乙二醇修飾，其序列為mPEG-SC10k-SWAAGSYFWQG是全新的序列，它們可以在體外促進(jìn)微管蛋白聚合，并在體內(nèi)試驗中提高荷瘤小鼠生存率，具有潛在的新藥開發(fā)價值。
【專利說明】—種聚乙二醇修飾的微管蛋白聚合劑多肽及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及聚乙二醇修飾的微管蛋白聚合劑及其應(yīng)用，具體涉及具有促進(jìn)微管蛋白聚合、可治療實體腫瘤的的多肽。
【背景技術(shù)】 [0002]近年來隨著醫(yī)學(xué)研究的深入，發(fā)現(xiàn)微管蛋白在實體腫瘤生長中扮演著重要角色。微管是細(xì)胞骨架的主要組成部分，由微管蛋白和P-微管蛋白異二聚體組成，具有中空管狀結(jié)構(gòu)的特點。此外，還有一種r微管蛋白，它不是微管的組成成分，但參與微管的組裝。微管具有聚合和解聚的動力學(xué)特性，在維持細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞分裂、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及物質(zhì)輸送等過程中起著重要作用。微管在細(xì)胞分裂前期聚合成為紡錘體，而紡錘體在有絲分裂中牽引染色體向兩極移動進(jìn)入兩個子細(xì)胞中，完成細(xì)胞增殖。微管的組裝過程是^1-和0-微管蛋白異性二聚體之間緊密的非共價相互作用，這一過程是受GTP水解驅(qū)動的。異性二聚體不斷地在微管的正極生長，在負(fù)極收縮，并且維持動態(tài)穩(wěn)定。當(dāng)微管的動態(tài)穩(wěn)定性被破壞時，細(xì)胞的有絲分裂過程就有可能被阻止，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。由于微管在細(xì)胞分裂中具有極其重要的作用，現(xiàn)已成為抗腫瘤藥物研究的重要靶點之一。
[0003]促進(jìn)微管蛋白聚合的微管蛋白聚合劑有紫杉醇等化合物，多用于腫瘤治療。這類化合物其特點是作用于微管的長春堿位點的微管蛋白解聚劑。研究表明，紫杉醇與細(xì)胞接觸后會誘發(fā)DNA斷裂，引起細(xì)胞凋亡。此外，它還能誘導(dǎo)細(xì)胞中腫瘤壞死因子a (TNF-a)基因的表達(dá)，提高蛋白質(zhì)，包括MAP激酶和Raf-1激酶的酪氨酸殘基的磷酸化水平。1992年12月，美國FDA批準(zhǔn)了紫杉醇用于乳腺癌和卵巢癌的治療。紫杉醇有3個重要的因素限制了它在臨床上的應(yīng)用:(1)紫杉醇在數(shù)種紅豆杉屬植物中含量很低，使來源受到限制；(2)水溶性相對較低，吸收能力差；(3)用紫杉醇處理過的癌細(xì)胞會過量表達(dá)P-糖蛋白，具有多向抗藥性。
[0004]SffAAGSYFffQG是一個全新的序列，前期的研究表明，該多肽經(jīng)反復(fù)體內(nèi)外活性評價證實具有較好的抑瘤效果，能夠顯著促進(jìn)微管蛋白聚合。然而上述多肽的半衰期短，擬用臨床人的給藥是每天靜脈滴注，這給患者帶來了一定的痛苦。
[0005]文獻(xiàn)報道中，對分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾或改造是解決半衰期較短、需連續(xù)給藥問題的常用方法，其中以化學(xué)修飾應(yīng)用最為廣泛，常用的化學(xué)修飾劑有聚乙二醇(polye thyleneglycol, PEG)、葡聚糖、聚氨基酸、聚酸酐等。PEG具有無毒、無免疫原性、水溶性好的特點，被美國食品與藥物管理局(FDA)認(rèn)可作為藥品的輔助原料和修飾劑。蛋白質(zhì)類藥物經(jīng)PEG修飾后，分子量增加，腎小球的濾過率減少，PEG的屏障作用保護(hù)了蛋白質(zhì)不易被蛋白水解酶水解，同時減少了中和抗體的產(chǎn)生，這些均有助于蛋白質(zhì)類藥物生物半衰期的延長。目前已有多種PEG修飾的蛋白質(zhì)類藥物上市銷售。但PEG修飾同時也可能影響蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性，其影響大小與修飾劑、修飾條件及蛋白質(zhì)本身的性質(zhì)有關(guān)。對于具體的蛋白質(zhì)，其最佳修飾需通過制備PEG修飾的蛋白質(zhì)及生物活性研究來決定。合成小分子多肽的PEG修飾研究起步較晚，但已引起不少研究者的關(guān)注。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]發(fā)明目的
本發(fā)明針對mPEG-SC-SWAAGSYFWQG做了進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)其在降低給藥頻率的情況下對多種腫瘤有治療作用。
[0007]技術(shù)方案
一種聚乙二醇修飾的微管蛋白聚合劑多肽，其特征在于其序列為mPEG-SC1(lk-SWAAGSYFWQG。mPEG-SC的分子量為5000-20000。一種聚乙二醇修飾的微管蛋白聚合劑多肽在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特征在于所述的腫瘤為起源于人的胃部、皮膚、頭頸部、甲狀腺、胰腺、肺臟、食管、乳腺、腎臟、膽囊、結(jié)腸/直腸、卵巢、子宮、子宮頸、前列腺、膀胱、睪丸的原發(fā)/繼發(fā)的癌或肉瘤。
[0008]有益效果
為了延長多肽SWAAGSYFWQG的半衰期，我們采用不同分子量的聚乙二醇(PEG)對此多肽進(jìn)行了修飾，發(fā)現(xiàn)mPEG-SC1Qk-SWAAGSYFWQG具有延長半衰期，但又不影響其體內(nèi)外活性的特點。一個多 肽的修飾產(chǎn)物屬于一個新型分子，往往與修飾前的分子在活性上產(chǎn)生不同的效果。本發(fā)明針對上述聚乙二醇修飾的微管蛋白聚合劑mPEG-SC1Qk-SWAAGSYFWQG對多種腫瘤有治療作用進(jìn)行了大量的體內(nèi)外活性研究，發(fā)現(xiàn)給藥頻率降低的情況下，mPEG-SC10k-SWAAGSYFWQG對抑制多種腫瘤生長保持了很好的活性，拓展了其社會價值和經(jīng)濟(jì)價值。
【具體實施方式】
[0009]實施例1
聚乙二醇修飾的微管蛋白聚合劑對體外微管蛋白聚合與解聚的作用。
[0010]取新鮮牛腦組織，剝?nèi)ツX膜和大的血管，剪碎，用冷MES緩沖液洗滌1-2次，以每克腦組織0.5-lml的比例加入MES緩沖液，在4°C下，用電動勻漿器勻漿；4°C，105000g離心lh，取上清，加入等體積的微管聚合緩沖液，37°C水浴保溫30min。26°C，105000g離心lh，取沉淀，加入約1/10勻漿體積的冷MES緩沖液，輕輕攪拌或用勻漿器將沉淀碾碎；將懸液放冰浴30min，使沉淀完全溶解。用Lowry’ s法測定蛋白含量(SDS聚酰胺凝膠電泳法)。微管蛋白用MES緩沖液稀釋至4-5mg/ml，置液氮中保存。取冷凍的微管蛋白溶液，快速用常溫水沖其壁，使之融化，放入冰浴，用MES緩沖液稀釋至所需濃度(2-3mg/ml)，加入ATP至lmmol/1。以從冰浴中馬上取出的微管蛋白溶液在分光光度計350nm處調(diào)定為“O”點。然后將比色杯在37°C溫度下測定微管蛋白溶液的OD值，連續(xù)20-30min,記錄溫度-吸光值曲線(T-OD曲線)，重復(fù)三次。
[0011]抑制率計算:抑制率(％)=(對照管“0D”值一加藥管“0D”值)/對照管“0D” 實驗組設(shè)五個劑量:0.75μΜ、1.5μΜ、3μΜ、12μΜ、24μΜ，陽性對照組紫杉醇劑量
3 μ Μ，空白組加入等體積的溶劑DMSO ;按上述操作測定吸光值。結(jié)果，隨聚乙二醇修飾的微管蛋白聚合劑濃度增加，聚合抑制率逐漸升高，說明有聚合能力的微管蛋白隨藥物濃度的增加而不斷增強(qiáng)。
[0012]實施例2聚乙二醇修飾的微管蛋白聚合劑對體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的生長和存活I(lǐng)C50。
[0013]采用MTT比色法。將對數(shù)生長的U937細(xì)胞，以1.0X 105加入96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h，實驗孔、陽性藥物對照孔分別加入不同濃度的實驗藥物聚乙二醇修飾的微管蛋白聚合劑和陽性對照藥物紫杉醇；空白組加入相同體積的溶劑。每孔設(shè)五個復(fù)孔，培養(yǎng)4811，分別在他、211、811、1411、2011、2411、3611、，4811 每孔加入 MTT，作用 4h 后，加入 DMS0，孵育30min，在酶標(biāo)儀620nm處測定吸光度A值，按公式腫瘤細(xì)胞生長抑制率=(1_實驗組吸光值/對照組吸光值)X 100%。計算出實驗藥物的IC50為3.13 μ M。
[0014]實施例3
用腫瘤模型檢測聚乙二醇修飾的微管蛋白聚合劑的體內(nèi)活力。
[0015]建立U937腫瘤模型，陽性對照藥物紫杉醇；空白組加入相同體積的溶劑，實驗組設(shè)3個劑量:0.75、1.5μΜ、3μΜ mg/Kg。21天后，觀察小鼠存活數(shù)量，計算存活率。結(jié)果顯示，聚乙二醇修飾的微管蛋白聚合劑可有效地保護(hù)小白鼠，提高荷瘤小鼠的生存率，生存率達(dá)到89 .1%。
【權(quán)利要求】
1.一種聚乙二醇修飾的微管蛋白聚合劑多肽2，其特征在于其序列為mPEG-SC10k-SWAAGSYFWQG。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種聚乙二醇修飾的微管蛋白聚合劑多肽，其特征在于所述的mPEG-SC的分子量為10000。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種聚乙二醇修飾的微管蛋白聚合劑多肽在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用，其特 征在于所述的腫瘤為起源于人的胃部、皮膚、頭頸部、甲狀腺、胰腺、肺臟、食管、乳腺、腎臟、膽囊、結(jié)腸/直腸、卵巢、子宮、子宮頸、前列腺、膀胱、睪丸的原發(fā)/繼發(fā)的癌或肉瘤。
【文檔編號】A61P35/00GK103923173SQ201410020906
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年1月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月17日
【發(fā)明者】邢將軍, 許劉華, 彭立軍, 任世闊, 華俊國, 曹銘, 劉加根, 劉明明, 汪士金, 施新華, 劉偉峰, 嚴(yán)明 申請人:南通誠信氨基酸有限公司