麒麟菜多糖在制備抗單純皰疹病毒藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了麒麟菜多糖在制備抗單純皰疹病毒藥物中的應用，麒麟菜多糖的平均分子質(zhì)量的范圍是1000-100000。本發(fā)明的麒麟菜多糖具有單獨抗單純皰疹病毒的作用。
【專利說明】麒麟菜多糖在制備抗單純皰疹病毒藥物中的應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于藥理學領域，涉及多糖硫酸酯作為制備抗單純皰疹病毒作用藥物的應用。尤其涉及到麒麟菜多糖和a-D- (1-6)-葡萄糖硫酸酯作為制備抗單純皰疹病毒作用藥物的應用。
技術背景
[0002]抱疫病毒科(Herpesviridae)分二個亞科:α抱疫病毒亞科、β抱疫病毒亞科及Y皰疹病毒亞科。單純皰疹病毒I型(HSV-1)和2型(HSV-2)即人皰疹病毒I型(HHV-1)和2型(HHV-2),兩種病毒均屬于皰疫病毒科、α皰疫病毒亞科、單純皰疫病毒屬,且在病毒結構、增殖機制等方面具有高度相似性。
[0003]單純皰疹病毒(HSV)為嗜神經(jīng)性病毒，能夠侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)，破壞神經(jīng)細胞的結構和功能。其中HSV-1是皰疹病毒性腦炎(HSE)的重要病原體，據(jù)統(tǒng)計約90%左右HSE由HSV-1引起。此外，HSV-1感染也可能是阿爾茨海默病(老年癡呆癥)的病原體之一。
[0004]HSV-1和HSV-2是廣泛存在的傳染性病原體，其感染呈全球分布。HSV抗體水平與年齡、社會經(jīng)濟狀況等直接相關。大多數(shù)欠發(fā)達國家及社會經(jīng)濟狀況較差的群體中，30歲以上人群HSV-1抗體的陽性率超過80%。HSV的傳播通過與病變皮膚組織的接觸完成。HSV-1主要在兒童時期經(jīng)口部傳播， 也可通過性接觸傳播，HSV-2則主要經(jīng)性接觸傳播。然而，近年來的研究表明，由HSV-1導致的生殖器感染的比例也呈現(xiàn)上升趨勢。在少數(shù)情況下，HSV也可在出生時垂直傳播。新生兒HSV感染發(fā)生比例雖然較少，但會導致嚴重的病理學后果。HSV-1主要引起口、喉、臉、眼、以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染，HSV-2主要引起生殖器感染，然而，兩種病毒的感染范圍并不嚴格局限于以上范圍。HSV感染的癥狀主要包括皮膚或者口、生殖器黏膜的水樣水泡。唇、HSV-1和HSV-2均為嗜神經(jīng)性病毒，能夠在從初始感染的上皮細胞轉移至神經(jīng)細胞，并在神經(jīng)細胞中建立潛伏感染從而躲避免疫系統(tǒng)的攻擊。當在受外界壓力或宿主免疫能力降低時，HSV可再次進入裂解性感染并在初始感染部位形成病變。
[0005]多糖硫酸酯是糖羥基上帶有硫酸基團的多糖，也稱硫酸多糖。近年來多糖的抗病毒活性得到了高度的重視，尤其是多糖硫酸酯的抗病毒活性的藥用前景。
[0006]葡聚糖有各種構型包括a-D- (1-6)、a-D- (l_3)、a_D- (1-4)、β-D- (1-3)、β-D- (1-4)、β-D- (1-6)。各種葡聚糖由于在構型、分子量、空間結、以及所含基團的差異導致其生物活性各有不同。如抗凝血劑、抗艾滋病病毒、抗腫瘤，但是其抗單純皰疹病毒的作用還未見其報道。
[0007]瓊枝麒麟菜(Eucheumagelatinae)是一類海洋植物,屬紅藻門，紅翔菜科,廣泛地分布在我國南海海域。瓊枝麒麟菜中含有豐富的多糖，主要由半乳糖組成，同時還含有少量的葡萄糖、木糖、塔羅糖和艾杜糖。近年來研究表明，麒麟菜多糖具有抗輻射、抗菌、抗腫瘤等作用。從1958年首次從海藻中提取得到抗病毒活性的物質(zhì)，到80年代發(fā)現(xiàn)合成和半合成的多糖硫酸酯是艾滋病病毒復制的有效的抑制劑，再到現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)多糖硫酸酯對腫瘤的抑制以及對流感病毒或是呼吸道合胞病毒的抑制作用，對多糖硫酸酯進一步發(fā)現(xiàn)抗病毒作用產(chǎn)生了極大的前景，目前未見硫酸酯多糖對單純皰疹病毒抗性的報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明目的在于提供一種抗單純皰疹病毒的藥物，為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采取的技術方案如下:
[0009]稱取一定量的瓊枝麒麟菜，將洗凈的瓊枝麒麟菜(使含水量不超過8%)用粉粹機粉碎，再將粉粹過后的瓊枝麒麟菜浸泡0.5h，然后用加熱回流裝置進行熱水提取多糖3h，冷卻至40°C左右后收集濾液，濾液用旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮至原濾液體積的2/3，然后直接加入3倍體積的95%的乙醇，并不斷攪拌，置4°C冰箱醇沉12h，四層紗布過濾，收集過濾物，待殘余酒精部分揮發(fā)后進行冷凍干燥，最終得到的白色纖維狀物質(zhì)即為瓊枝麒麟菜多糖。
[0010]將提取所得麒麟菜多糖進行單獨的細胞實驗，所用的細胞為非洲綠猴腎細胞(Vero)。實驗結果顯示，麒麟菜多糖具有明顯的抗單純皰疹病毒的效果。將提取所得麒麟菜多糖進行體外抗單純皰疹病毒機制研究，實驗結果顯示，麒麟菜多糖主要作用于HSV病毒感染早期階段，并能夠顯著地抑制HSV病毒RNA、DNA及蛋白質(zhì)的合成。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0011]圖1:麒麟菜多糖的紅外吸收譜圖
[0012]圖2:麒麟菜多糖及阿昔洛韋對VeiO細胞的細胞毒性實驗結果
[0013]圖3:麒麟菜多糖HSV-1的直接滅活作用(A)及抑制吸附作用(B)
[0014]圖4:麒麟菜多糖對HSV-1RNA合成(A)和DNA合成(B)的影響
[0015]圖5:免疫熒光觀察麒麟菜多糖對HSV-1病毒蛋白質(zhì)合成的影響
`[0016]圖6:ffestern-blotting檢測麒麟菜多糖對HSV-1病毒蛋白質(zhì)合成的影響
[0017]具體實施案例
[0018]本發(fā)明參照下面的案例進行詳細說明，但并不局限于此。
[0019]實施例1:麒麟菜多糖的制備
[0020]稱取一定量的瓊枝麒麟菜，將洗凈的瓊枝麒麟菜(使含水量不超過8%)用粉粹機粉碎，再將粉粹過后的瓊枝麒麟菜浸泡0.5h，然后用加熱回流裝置進行熱水提取多糖3h，冷卻至40°C左右后收集濾液，濾液用旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮至原濾液體積的2/3，然后直接加入3倍體積的95%的乙醇，并不斷攪拌，置4°C冰箱醇沉12h，四層紗布過濾，收集過濾物，待殘余酒精部分揮發(fā)后進行冷凍干燥，最終得到的白色纖維狀物質(zhì)即為瓊枝麒麟菜多糖，紅外光譜如圖1所示。
[0021]實施例2:麒麟菜多糖的細胞毒性研究
[0022]將所得麒麟菜多糖用純水配置為lmg/mL的水溶液，保存于_20°C備用。
[0023]將麒麟菜多糖倍比稀釋成不同濃度(起始濃度為500μ g/mL)，采用MTT法測定麒麟菜多糖的細胞毒性。
[0024]MTT實驗結果(見圖2)顯示，當麒麟菜多糖(EGP)濃度達到500 μ g/mL時Vero細胞的存活率為74.85%，陽性對照藥物阿昔洛韋(ACV) 500 μ g/mL時Vero細胞的存活率為79.41 %。可見麒麟菜多糖及阿昔洛韋對Vero細胞的毒性都非常小，各自的TC50值均>500g/mL。實施例3:麒麟菜多糖抗單純皰疹病毒HSV藥效研究[0025]a.按實施例1的方法，從瓊枝麒麟菜中提取麒麟菜多糖，平均分子量為45000，單糖硫酸基取代度為2.13。
[0026]b.將步驟a.制備的麒麟菜多糖，參照實施例2細胞毒性實驗的結果，制備成起始濃度為62.5μ g/mL的稀釋液，采用空斑減數(shù)實驗測定抗單純皰疹病毒活性。
[0027]c.步驟b.所用空斑減數(shù)實驗方法如下:將處于對數(shù)生長期的Vero細胞用DMEM生長液調(diào)整至細胞密度為2.0X 105cells/ml，加入24孔培養(yǎng)板中，0.5ml/孔；待細胞長成單層后，棄培養(yǎng)液，用滅菌PBS洗I遍，加入病毒稀釋液(30-40PFU/孔)與不同濃度藥物稀釋液各100 μ I (起始濃度為62.5μ g/mL)，37°C、5% C02培養(yǎng)2h，吸棄病毒液，隨后加入含相應藥物濃度的覆蓋液(維持液+0.5%羧甲基纖維素)Iml/孔。每個藥物濃度設3個復孔，同時設病毒對照組和正常細胞對照組。于37°C、5% C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h后，吸棄覆蓋液，用10%甲醒固定細胞15min, 1%結晶紫染色15min,沖洗干凈平板,晾干；統(tǒng)計空斑數(shù),計算空斑抑制率。以藥物濃度的對數(shù)值為橫坐標，以空斑抑制率為縱坐標作圖，根據(jù)空斑抑制率結果做出病毒對藥物的敏感性曲線，計算藥物的半數(shù)抑制濃度(IC50)。空斑抑制率=(病毒對照組空斑數(shù)-藥物處理組空斑數(shù)/ (病毒對照組空斑數(shù))X 100%。
[0028]d.步驟c.空斑減數(shù)實驗所用病毒株為單純皰疹病毒I型(HSV-1，F(xiàn)株)(ATCCVR733);單純皰疹病毒2型(HSV_2，333株)；臨床分離得到的阿昔洛韋耐藥病毒株:HSV-1106 株、HSV-1153 株及 HSV-1Blue 株。
[0029]實驗結果表明:麒麟菜多糖具有很好的抗單純皰疹病毒的活性，此抗病毒活性不 僅僅對標準株而且對臨床分離得到的阿昔洛韋耐藥株同樣具有非常好的效果，而且其抗病毒活性還要強于陽性對照藥阿昔洛韋。麒麟菜多糖對各病毒的IC50值分別為:HSV-1F株，
0.66 μ g/mL ；HSV-2333 株，2.12yg/mL ；HSV-1106 株，l.llyg/mL ；HSV-1153 株，1.24 μ g/mL ；HSV-lBlue株，1.48 μ g/mL ;結果顯示麒麟菜多糖有非常好的抗HSV活性(表1)。
[0030]表1麒麟菜多糖的細胞毒性、抗病毒活性及治療指數(shù)
[0031]
【權利要求】
1.麒麟菜多糖在制備抗單純皰疹病毒藥物中的應用，優(yōu)選的，麒麟菜多糖的平均分子質(zhì)量的范圍是1000-100000。
2.根據(jù)權利要求1所述的應用，所述的麒麟菜多糖通過如下方法制備而成:稱取一定量的瓊枝麒麟菜，將洗凈的瓊枝麒麟菜(使含水量不超過8% )用粉粹機粉碎，再將粉粹過后的瓊枝麒麟菜浸泡20-40min，然后用加熱回流裝置進行熱水提取多糖2-4h，冷卻至35-45°C左右后收集濾液，濾液用旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮至原濾液體積的2/3，然后直接加入3倍體積的95%的乙醇，并不斷攪拌，置4°C冰箱醇沉12h，四層紗布過濾，收集過濾物，待殘余酒精部分揮發(fā)后進行冷凍干燥，最終得到的白色纖維狀物質(zhì)即為瓊枝麒麟菜多糖。
3.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于:所述的皰疹病毒為I型單純皰疹病毒。
4.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于:所述的皰疹病毒為2型單純皰疹病毒。
5.根據(jù)權利要求1所述的應用，其特征在于:所述的皰疹病毒為臨床阿昔洛韋耐藥的I型單純皰 疹病毒。
【文檔編號】A61K31/737GK103751202SQ201410024107
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2014年1月17日 優(yōu)先權日:2014年1月17日
【發(fā)明者】王一飛, 王懷玲, 金富軍, 利奕成, 劉秋英 申請人:廣州暨南生物醫(yī)藥研究開發(fā)基地有限公司