重組單純皰疹病毒及它感染和制備它的宿主細(xì)胞以及它們的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種重組病毒、制備該重組病毒的宿主細(xì)胞，感染有該病毒的宿主細(xì) 胞，W及所述重組病毒、制備該重組病毒的宿主細(xì)胞W及感染有該病毒的宿主細(xì)胞的應(yīng)用。 具體地說，本發(fā)明設(shè)及一種重組單純瘤疹病毒、制備該重組單純瘤疹病毒的宿主細(xì)胞，感染 有該重組單純瘤疹病毒的宿主細(xì)胞，W及所述重組單純瘤疹病毒、制備該重組單純瘤疹病 毒的宿主細(xì)胞和感染有該重組單純瘤疹病毒的宿主細(xì)胞的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 基因治療是現(xiàn)代生物醫(yī)藥治療手段的一項(xiàng)革命，而載體技術(shù)是基因治療成功的關(guān) 鍵。I型單純瘤疹病毒化SV-1)載體擁有廣泛的宿主細(xì)胞譜，能夠感染多種細(xì)胞并在細(xì)胞 中長時(shí)間持續(xù)表達(dá)攜帶的外源基因。由于其獨(dú)特的優(yōu)勢，目前已經(jīng)發(fā)展成最有前景的病毒 載體之一。
[0003] 腦啡膚巧NK)，是一種具有神經(jīng)遞質(zhì)功能的五膚，由前體腦啡膚（pro-enkphalin) 分裂產(chǎn)生。腦啡膚廣泛存在于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)，突觸前膜分泌的腦啡膚能夠作用于突 觸后膜相應(yīng)的腦啡膚受體，激活的受體打開相應(yīng)的巧離子通道，抑制P物質(zhì)（經(jīng)痛疼刺激而 釋放的活化痛覺傳導(dǎo)通路的一種神經(jīng)遞質(zhì)）的釋放等。由于腦啡膚受體的活化能夠抑制痛 覺傳導(dǎo)通路的活化，從而起到鎮(zhèn)痛的作用。因此，人們研發(fā)出了一系列的模仿腦啡膚結(jié)構(gòu)的 鎮(zhèn)痛藥一一阿片類藥物。
[0004] 在臨床上，阿片類藥物是目前治療慢性疼痛最有效的藥物之一。阿片類藥物是模 仿了內(nèi)源存在的腦啡膚結(jié)構(gòu)，能夠與腦啡膚突觸后膜上的受體結(jié)合，激活巧離子通道，從而 起到鎮(zhèn)痛的作用。
[0005] 長期的臨床實(shí)踐表明，阿片類藥物雖療效好，但是有著極為惡劣的毒副作用：（1) 首先是成癒性，臨床上發(fā)現(xiàn)，由于受到慢性疼痛的折磨需要長期間隔的對病人給藥，但是連 續(xù)給藥一周左右，患者明顯表現(xiàn)出對藥物的依賴渴求等"吸毒"樣反應(yīng)，停止給藥后病人會 出現(xiàn)嘔吐，失眠，流淚，焦慮等"戒毒"樣癥狀；（2)整個(gè)身體技能的不良反應(yīng)，由于除了在神 經(jīng)系統(tǒng)，在腎臟，大腸等細(xì)胞也有阿片類受體，運(yùn)些受體被激活后，引起了消化系統(tǒng)、呼吸系 統(tǒng)的一系列的不良反應(yīng)，具體可表現(xiàn)為便秘，盜汗，呼吸困難等等。
[0006] 正因?yàn)榘⑵愃幬镌谂R床應(yīng)用上的局限性，基因治療的發(fā)展為慢性疼痛的治療提 供了新的前景。而HSV作為基因治療的重要載體，具有較大的優(yōu)勢。在慢性疼痛的治療中， 也有一些針對服V-I開發(fā)的藥物，且取得了十分振奮人屯、的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
[0007] 但目前針對服V-I為載體開發(fā)的治療慢性疼痛的基因藥物中，目的基因的表達(dá)穩(wěn) 定性、藥物作用效果且藥物持續(xù)時(shí)間還有待進(jìn)一步提高。
[0008] 神經(jīng)生長因子（NG巧是一種具有神經(jīng)元營養(yǎng)和促突觸生長雙重生物學(xué)功能的神 經(jīng)細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子，其主要功能是促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)的生長發(fā)育并維持其正常生理功能，促 進(jìn)損傷的神經(jīng)再生和修復(fù)。目前NGF在神經(jīng)內(nèi)外科、骨科、眼科、耳鼻喉科、兒科和內(nèi)分泌科 都有著顯著的療效，主要用于周圍神經(jīng)損傷和脊髓損傷、煩腦損傷、中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血、缺 氧的輔助治療、早老性癡呆、糖尿病性周圍神經(jīng)病變及化療藥（紫杉醇、長春新堿、順銷）等 引起的末梢神經(jīng)病變，也可W適用于感覺神經(jīng)、交感神經(jīng)及中樞膽堿能神經(jīng)營養(yǎng)不良及發(fā) 育不良等病癥。
[0009] 目前市場上銷售的神經(jīng)生長因子均提取自小鼠頌下腺，主要商品為恩經(jīng)復(fù)、蘇膚 生和金路捷。鼠NGF有如下缺點(diǎn)：（1)鼠NGF和人NGF蛋白序列有10%的差異，療效可能有 差異，且具有免疫原性，可能誘發(fā)抗體反應(yīng)；（2)鼠源病毒的交叉污染隱患；(3)生產(chǎn)依賴活 體動(dòng)物。人神經(jīng)生長因子由于提取困難或者重組工藝缺陷，一直未有產(chǎn)品上市。
[0010] 因此，開發(fā)出一種有效再生和修復(fù)損傷神經(jīng)的藥物也勢在必行，并且該藥物的穩(wěn) 定性、作用效果和持續(xù)時(shí)間需要有一定的保障。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是為了克服W上缺陷，提供一種能夠穩(wěn)定表達(dá)、作用效果好 且持續(xù)時(shí)間長地治療慢性疼痛或神經(jīng)損傷的重組單純瘤疹病毒，所述單純瘤疹病毒載體是 通過使單純瘤疹病毒缺失了編碼感染細(xì)胞多膚34. 5 (ICP34. 5)的基因和編碼感染細(xì)胞多 膚4QCP4)的基因、W及可選擇的缺失編碼感染細(xì)胞多膚27QCP27)的基因得到的，所述目 的基因的插入位點(diǎn)包括插入在所述單純瘤疹病毒載體的潛伏相關(guān)轉(zhuǎn)錄子編碼區(qū)（LAT區(qū)）， 并且在LAT區(qū)的啟動(dòng)子下游。該重組單純瘤疹病毒攜帶的目的基因能夠在感染所述重組單 純瘤疹病毒的細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，且作用效果好，持續(xù)時(shí)間長。
[0012] 優(yōu)選的，所述目的基因?yàn)榫幋a腦啡膚或神經(jīng)生長因子的基因。
[0013] 優(yōu)選的，所述單純瘤疹病毒分離自亞洲人種。
[0014] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種制備病毒的宿主細(xì)胞，其中，所述病毒為W上所 述的重組單純瘤疹病毒，所述細(xì)胞具有表達(dá)編碼感染細(xì)胞多膚4的基因W及可選擇的表達(dá) 編碼感染細(xì)胞多膚27的基因。
[0015]本發(fā)明的第=個(gè)目的是提供一種感染有病毒的宿主細(xì)胞，其中，所述病毒為如上 所述的重組單純瘤疹病毒，所述細(xì)胞具有表達(dá)編碼感染細(xì)胞多膚4的基因W及可選擇的表 達(dá)編碼感染細(xì)胞多膚27的基因。
[0016] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供如上所述的重組單純瘤疹病毒、如上所述的制備病毒 的宿主細(xì)胞和/或如上所述的感染有病毒的宿主細(xì)胞在制備用于治療慢性疼痛、神經(jīng)損傷 和/或戒毒的藥物中的應(yīng)用。
[0017] 本發(fā)明通過缺失所述單純瘤疹病毒編碼感染細(xì)胞多膚34. 5的基因和編碼感染細(xì) 胞多膚4的基因、W及可選擇的缺失編碼感染細(xì)胞多膚27的基因，并在LAT區(qū)啟動(dòng)子的下 游插入目的基因，實(shí)現(xiàn)了目的基因能夠穩(wěn)定的表達(dá)，且作用效果好，治療持續(xù)時(shí)間長的目 的。另外，本發(fā)明還具有如下的優(yōu)點(diǎn)：（1)給藥特異性，避免了全身給藥引發(fā)的副作用化及 藥物彌散；(2)避免了手術(shù)、穿刺等對神經(jīng)系統(tǒng)的二次機(jī)械損傷；(3)避免藥物的依賴性W 及相關(guān)的副作用等等。另外，在所述單純瘤疹病毒優(yōu)選分離自亞洲人種的情況下，所制備的 重組單純瘤疹病毒更適合亞洲人種的侵染和治療。
[0018] 本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)將在隨后的【具體實(shí)施方式】部分予W詳細(xì)說明。
【具體實(shí)施方式】
[0019] W下對本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解的是，此處所描述的具體 實(shí)施方式僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0020] -方面，本發(fā)明提供了一種重組單純瘤疹病毒，所述重組單純瘤疹病毒包括單純 瘤疹病毒載體和目的基因，其中，所述單純瘤疹病毒載體是通過使單純瘤疹病毒缺失了編 碼感染細(xì)胞多膚34. 5的基因和編碼感染細(xì)胞多膚4的基因、W及可選擇的缺失編碼感染細(xì) 胞多膚27的基因得到的，所述目的基因的插入位點(diǎn)包括插入在所述單純瘤疹病毒載體的 LAT區(qū)，并且在所述LAT區(qū)的啟動(dòng)子下游。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明，所述編碼ICP34. 5的基因、編碼ICP27的基因和編碼ICP4的基因均 為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，并且也能夠通過登錄相關(guān)的數(shù)據(jù)庫查到，例如，可W通過登錄 Genebank數(shù)據(jù)庫查詢到相關(guān)的核巧酸序列，運(yùn)些均是本領(lǐng)域技術(shù)人員具有的常規(guī)技術(shù)手 段，本發(fā)明在此不再寶述。
[0022] 根據(jù)本發(fā)明，所述單純瘤疹病毒的LAT區(qū)被認(rèn)為在HSV潛伏的建立、維持和激活過 程中起重要作用。其具體的基因序列也為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，并且也能夠通過登錄相 關(guān)的數(shù)據(jù)庫或相關(guān)的公開出版物查到，例如，可W通過登錄Genebank數(shù)據(jù)庫查詢到相關(guān)的 核巧酸序列，本發(fā)明在此也不再寶述。
[0023] 本發(fā)明需要說明的是，術(shù)語"單純瘤疹病毒載體的LAT區(qū)"與術(shù)語"單純瘤疹病毒 的LAT區(qū)"是等同的。
[0024] 根據(jù)本發(fā)明，將ICP34. 5基因和ICP4基因W及可選的ICP27基因敲除，同時(shí)在單 純瘤疹病毒載體的LAT區(qū)插入所述目的基因可有效實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，即，使目的基因穩(wěn) 定地表達(dá)，實(shí)現(xiàn)較好的作用效果W及較長的作用時(shí)間，并且本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，同時(shí)刪除 編碼ICP34. 5的基因和編碼ICP4的基因，能夠獲得更高的病毒載體目的產(chǎn)物的得率。
[00巧]本發(fā)明