蛹蟲草抗腫瘤活性組分的提取方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種蛹蟲草抗腫瘤活性組分的提取方法：蛹蟲草子實(shí)體超低溫粉碎；得到超微粉水煮提取，沉淀再丙酮提??；得到沉淀溶解后過液相色譜，洗脫試劑依次為100%正己烷、25%乙酸乙酯-正己烷、100%乙酸乙酯；選取抗腫瘤活性最強(qiáng)組分過液相色譜，洗脫試劑依次為100%正己烷、10%乙酸乙酯-正己烷、15%乙酸乙酯-正己烷；選取抗腫瘤活性最強(qiáng)組分再過液相色譜，洗脫試劑為100%二氯甲烷，選取抗腫瘤活性最強(qiáng)組分即為本發(fā)明目的組分。該方法重復(fù)性好，得到的抗腫瘤活性組分可用于制備抗腫瘤藥物中。
【專利說明】蛹蟲草抗腫瘤活性組分的提取方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物制品加工【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種蛹蟲草抗腫瘤活性組分的提取方法，以及該活性組分在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]腫瘤是一種基因病，但并非是遺傳的，它是指細(xì)胞在致癌因素作用下，基因發(fā)生了改變，失去對(duì)其生長(zhǎng)的正常調(diào)控，導(dǎo)致單克隆性異常增生而形成的新生物。2008年，WHO發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，中國(guó)已經(jīng)成為世界第二大癌癥高發(fā)國(guó)，中國(guó)每年新增220萬名癌癥患者，約占全球癌癥病人總數(shù)的20%，尤其是肝癌、胃癌和肺癌成為主要的健康殺手。研究如何消滅癌癥、讓癌癥病人能生活地更好，是醫(yī)藥領(lǐng)域中的研究重點(diǎn)，因此尋找高效、低毒、選擇性強(qiáng)的有臨床應(yīng)用價(jià)值的理想的新型抗腫瘤藥物是一項(xiàng)長(zhǎng)期而艱巨的任務(wù)，從藥食兩用的無毒且原料廉價(jià)易得的中藥里尋找抗腫瘤藥物已成為抗腫瘤藥物開發(fā)的重要方向與希望所在。
[0003]冬蟲夏草是蟲草菌寄生在鱗翅目蝙蝠蛾科幼蟲中以其為載體的蟲菌復(fù)合體，含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、蟲草酸、核苷類物質(zhì)和多種氨基酸等活性物質(zhì)，味道清香，具有滋肺益氣、增精補(bǔ)腎、止血化痰、抑制腫瘤、止咳鎮(zhèn)靜、驅(qū)風(fēng)、散熱、駐容美顏、延緩衰老、提高機(jī)體免疫力之功效。
[0004]蛹蟲草(Cordycepsmilitaris),在分類學(xué)上與冬蟲夏草同歸于蟲草屬，是一種珍貴的藥用真菌，其化學(xué)成分和藥理作用與冬蟲夏草相似，在臨床上常替代冬蟲夏草入藥。由于野生蛹蟲草資源極為有限，不能滿足日益增加的市場(chǎng)需求，人工栽培蛹蟲草成為必需。目前，人工栽培蛹蟲草已獲成功，并實(shí)現(xiàn)了規(guī)?；a(chǎn)。
[0005]蛹蟲草具有多種與抗腫瘤作用相關(guān)的活性物質(zhì)，有些活性物質(zhì)如蟲草素、蟲草多糖等的抗腫瘤作用已研究得比較深入；而有些活性物質(zhì)如類胡蘿卜素、蛋白質(zhì)等在抗腫瘤方面的研究則較少。蛹蟲草活性物質(zhì)未能最大程度地得到開發(fā)與利用，所以研究具有抗腫瘤作用的新的活性物質(zhì)，不斷開拓現(xiàn)有活性物質(zhì)的新的生理活性和藥理作用具有重要意義，能為進(jìn)一步研究和開發(fā)蛹蟲草在醫(yī)藥方面的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和產(chǎn)業(yè)化背景。
[0006]傳統(tǒng)的蛹蟲草抗腫瘤活性組分的提取方法，如杜秀菊等發(fā)表的“蛹蟲草抗腫瘤和免疫活性部位的體外篩選”(食用菌學(xué)報(bào).2011.18(1):41-45)中公開了一種蛹蟲草子實(shí)體提取物制備方法:蛹蟲草子實(shí)體粉過60目篩后，用氯仿提取2小時(shí)，過濾，濾渣風(fēng)干后用乙酸乙酯提取2小時(shí)，過濾，濾渣風(fēng)干后用95%乙醇提取2小時(shí)，過濾，濾渣風(fēng)干后用30倍100°C蒸餾水提取2小時(shí)，400g離心20min后沉淀用15倍100°C 3%草酸銨溶液提取2小時(shí)，400g離心20min后沉淀用10倍100°C 5%Na0H溶液提取2小時(shí)，400g離心20min后上清液繼續(xù)用lmol/L鹽酸4°C中和，400g離心20min，對(duì)各步得到的濾液或上清液真空濃縮，冷凍干燥，得到各提取物組分。該蛹蟲草子實(shí)體有效成分的提取分離方法步驟繁雜，而且提取出的活性成分少。另外，采用這種傳統(tǒng)的溶劑萃取法進(jìn)行有效活性組分的提取，批次之間不具有重復(fù)性，即無法保證第一批萃取得到的物質(zhì)組分與第二批萃取得到的物質(zhì)組分之間的一致性。[0007]又如朱麗娜等發(fā)表的“蛹蟲草子實(shí)體中N6- (2-羥乙基)_腺苷的分離純化及抗腫瘤作用”(食用菌學(xué)報(bào).2013.20(1):62-65)中公開了一種目標(biāo)化合物的分離純化方法，它將蛹蟲草子實(shí)體粉末加入蒸餾水中100°C提取2小時(shí)，重復(fù)提取2次，合并提取液，然后以該提取液進(jìn)行后續(xù)目標(biāo)成分的提取。該方法屬于傳統(tǒng)的中藥有效成分的提取方法，即以水提的上清進(jìn)行有效成分的提取，而對(duì)水提的沉淀卻沒有進(jìn)行深入的研究，這有可能導(dǎo)致大量活性組分的丟失，從而阻礙了蛹蟲草在抗腫瘤藥物開發(fā)方面的進(jìn)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對(duì)以上現(xiàn)有技術(shù)的不足，突破現(xiàn)有中藥有效組分提取的限制，提供一種蛹蟲草抗腫瘤活性組分的提取方法，該方法以在細(xì)胞水平上沒有抗腫瘤活性的蛹蟲草子實(shí)體水提沉淀為原料，經(jīng)丙酮浸提后再用制備液相色譜技術(shù)活性導(dǎo)向分離出強(qiáng)活性抗腫瘤活性組分。
[0009]本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為:
[0010]一種蛹蟲草中抗腫瘤活性組分的提取方法，該方法包括以下步驟:
[0011]1、超低溫粉碎:
[0012]取烘干的蛹蟲草子實(shí)體為原料，放入超微粉碎機(jī)中進(jìn)行超微粉碎，同時(shí)粉碎全過程用2~10°C的水作為超微破碎機(jī)內(nèi)部冷卻液，超微粉碎時(shí)間為5-20min，得到超微粉。
[0013]上述粉碎時(shí)間優(yōu)選為12min。
[0014]2、溶劑提取:
[0015]2.1水煮:在超微粉中加入超純水，超純水的加入量為超微粉質(zhì)量的8~10倍，100°C加熱3~10小時(shí)進(jìn)行提取，離心取沉淀，然后重復(fù)I~3次，將得到的沉淀合并，干燥，得到粗品A。
[0016]該步是與目前傳統(tǒng)的中藥有效組分或有效成分提取的最大不同。傳統(tǒng)的中藥中活性組分或活性成分的提取方法都是以水提的上清為中間原料進(jìn)行有效成分的提取，中醫(yī)學(xué)上中藥飲用也是如此，水煮后取上清液為患者飲用，因?yàn)榘闯Ｒ?guī)理解，沸水煎煮后藥材中的有效成分便溶于液體中，故上清液中包含了所需的有效組分。而恰恰是這種認(rèn)識(shí)的局限性，限制了目前物種中活性組分或活性成分的開發(fā)，使得很多有效組分或有效成分被當(dāng)做廢渣倒掉、沒有進(jìn)一步被發(fā)現(xiàn)和開發(fā)利用。這也并非是因?yàn)榇蠖鄶?shù)研究者忽視了廢渣中有效組分或有效成分存在的可能性，而是因?yàn)閺U渣在體外可能不具有抗腫瘤活性或活性很弱，如該步得到的粗品A經(jīng)檢測(cè)在細(xì)胞水平上是沒有抗腫瘤活性的，這樣的檢測(cè)結(jié)果使得大多數(shù)研究者放棄了對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步分析和研究，從而導(dǎo)致了大量活性組分的丟失。本發(fā)明通過 申請(qǐng)人:的深入研究、分析和實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞水平上沒有抗腫瘤活性的水提沉淀具有目的有效組分存在的可能性，從而從水提沉淀、出發(fā)，通過大量的實(shí)驗(yàn)探索和工藝優(yōu)化，最后總結(jié)出一套即本發(fā)明所述的蛹蟲草抗腫瘤活性組分的提取方法，最終成功提取到目的有效活性組分。
[0017]2.2丙酮沉淀:在粗品A中加入丙酮，丙酮的加入量為粗品A質(zhì)量的2~4倍，室溫下浸提12~36小時(shí)，離心后取沉淀，然后重復(fù)I~3次，將得到的沉淀合并，干燥，得到粗品B。
[0018]上述離心的轉(zhuǎn)速優(yōu)選為6000rpm。[0019]上述干燥優(yōu)選為在60°C鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)進(jìn)行。
[0020]3、色譜分離:
[0021]3.1取粗品B用50%乙酸乙酯-正己烷溶液(即乙酸乙酯與正己烷以1:1的體積比配比而成)溶解至濃度為50mg/ml，S0.45y m有機(jī)微孔濾膜，然后通過制備液相色譜進(jìn)行分離，洗脫方式為100%正己烷等度洗脫10min，25%乙酸乙酯-正己烷溶液(即乙酸乙酯與正己烷以1:3的體積比配比而成)等度洗脫25min，100%乙酸乙酯等度洗脫15min，檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm，得到各組分經(jīng)體外抗腫瘤活性篩選后，選取活性最強(qiáng)的組分旋蒸濃縮后真空干燥，得到組分A。
[0022]該步溶劑的選擇非常重要，經(jīng)過試驗(yàn)，50%乙酸乙酯-正己烷溶液中乙酸乙酯對(duì)粗品B能全部溶解，正己烷對(duì)粗品B為部分溶解，而選用50%乙酸乙酯-正己烷溶液可以做到使粗品B溶解至50mg/ml，洗脫時(shí)采用100%正己烷、25%乙酸乙酯-正己烷溶液、100%乙酸乙酯的洗脫順序，使粗品B中物質(zhì)組分被盡量分開，有利于目的有效組分的提取，提高提取率。
[0023]3.2取組分A用100% 乙酸乙酯50度超聲至剛好溶解至濃度為50mg/ml，過0.45 μm有機(jī)微孔濾膜，然后通過制備液相色譜進(jìn)行分離，洗脫方式為100%正己烷等度洗脫lOmin，10%乙酸乙酯-正己烷溶液(即乙酸乙酯與正己烷以1:9的體積比配比而成)等度洗脫50min，15%乙酸乙酯-正己烷溶液(即乙酸乙酯與正己烷以3:17的體積比配比而成)等度洗脫20min，檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm，得到各組分經(jīng)體外抗腫瘤活性篩選后，選取活性最強(qiáng)的組分旋蒸濃縮后真空干燥，得到組分B。
[0024]該步洗脫采用的洗脫劑(10%乙酸乙酯-正己烷溶液、15%乙酸乙酯-正己烷溶液)不同于3.1中，通過洗脫率的不同，將原本被一個(gè)濃度洗脫下來的組分進(jìn)行分開洗脫，有利于后續(xù)有效組分的獲得。
[0025]3.3取組分B用100% 二氯甲烷50度超聲至剛好溶解至濃度為50mg/ml，過0.45 μm有機(jī)微孔濾膜，然后通過制備液相色譜進(jìn)行分離，洗脫方式為100% 二氯甲烷等度洗脫40min,檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm，得到各組分經(jīng)體外抗腫瘤活性篩選后，選取活性最強(qiáng)的組分，旋蒸濃縮后真空干燥，即為本發(fā)明目的抗腫瘤活性組分。
[0026]該步只采用二氯甲烷一種洗脫劑進(jìn)行洗脫就可以完成組分分離目的，因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)二氯甲烷對(duì)組分B的溶解能力不是很強(qiáng)，所以使用該一種洗脫劑就可以把物質(zhì)組分分離開，這不僅節(jié)省了試劑使用，而且更為重要的是，使用單種試劑使在大規(guī)模生產(chǎn)過程中單物質(zhì)循環(huán)使用成為可能，這將大大節(jié)省制備成本。
[0027]上述制備液相色譜的填料優(yōu)選為粒徑10 μ m的硅膠、大小為150 X 250mm。
[0028]上述體外抗腫瘤活性篩選是指采用實(shí)時(shí)無標(biāo)記動(dòng)態(tài)細(xì)胞分析技術(shù)實(shí)時(shí)檢測(cè)加藥后人肺癌A549細(xì)胞和人肝癌Hep-G2細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，同時(shí)可獲得藥物介導(dǎo)的細(xì)胞效應(yīng)曲線，通過該曲線判斷該藥物是否抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。與傳統(tǒng)方法(MTT)對(duì)比優(yōu)勢(shì)在于，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，步驟少，人為誤差小。采用無標(biāo)記方法，不存在標(biāo)記效率問題，并且對(duì)細(xì)胞無損傷，細(xì)胞在最接近生理狀態(tài)下進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果準(zhǔn)確度高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果客觀，重復(fù)性好，不需設(shè)置重復(fù)孔。該方法可以很好地判斷待測(cè)組分的抗腫瘤活性，因?yàn)樵趯?shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，各待測(cè)組分對(duì)這兩種細(xì)胞的抑制基本是同步的，即不存在第I號(hào)組分對(duì)人肺癌A549細(xì)胞抑制作用最好而第2組分對(duì)人肝癌Hep-G2細(xì)胞抑制作用最好的情況，基本上選取的目的組分要么對(duì)兩種細(xì)胞的抑制作用都是最好的，要么對(duì)其中一種細(xì)胞抑制作用最好、而另一種細(xì)胞所有的組分抑制效果都比較差。
[0029]本發(fā)明還進(jìn)一步提供上述蛹蟲草抗腫瘤活性組分在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。該活性組分作為有效成分按常規(guī)方法與藥學(xué)上可接受的任何載體制成各類藥用制劑。
[0030]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下顯著優(yōu)點(diǎn)和有益效果:
[0031]1、本發(fā)明采用超微粉碎機(jī)進(jìn)行低溫超微粉碎，以破除蛹蟲草子實(shí)體堅(jiān)硬的細(xì)胞壁，有利于內(nèi)容物的溶出，有效提高了蛹蟲草子實(shí)體中抗腫瘤活性組分的提取率；
[0032]2、本發(fā)明采用制備液相色譜進(jìn)行物質(zhì)組分的分離純化，運(yùn)用先進(jìn)的技術(shù)對(duì)細(xì)胞水平上是沒有抗腫瘤活性的水提沉淀進(jìn)行分離純化，通過對(duì)各個(gè)分離步驟的試劑選擇、工藝條件和工藝參數(shù)的優(yōu)化，以及各個(gè)分離步驟之間良好的協(xié)同作用，最終成功提取到抗腫瘤活性組分，相對(duì)于傳統(tǒng)的溶劑萃取法，該抗腫瘤活性組分的提取方法不但穩(wěn)定性好，重復(fù)性好，得到的物質(zhì)組分批次之間一致性高，而且提取率高，得到的活性組分具有強(qiáng)抗腫瘤活性；
[0033]3、本發(fā)明通過人肺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)和人肝癌Hep_G2細(xì)胞生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)來判定蛹蟲草抗腫瘤活性組分的體外抗腫瘤能力，并設(shè)陽性對(duì)照，結(jié)果直觀、易判斷；
[0034]4、本發(fā)明蛹蟲草抗腫瘤活性組分的提取方法工藝簡(jiǎn)單，易于實(shí)施，具有快速、高效、重復(fù)性好、穩(wěn)定可控、分離純化制備量大、適用于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)等特點(diǎn)，所得的蛹蟲草抗腫瘤活性組分可用于研發(fā)制備抗腫瘤藥物，而由于該活性組分抗腫瘤有效成分含量高，使用該活性組分進(jìn)行 制備抗腫瘤藥物時(shí)有效成分含量高，可以滿足不同制劑載體形式對(duì)有效成分含量的需求；
[0035]5、本發(fā)明拓展了抗腫瘤藥物或保健食品的原料來源，擴(kuò)大了蛹蟲草子實(shí)體的應(yīng)用范圍，使蛹蟲草子實(shí)體成為抗腫瘤藥物的有效組分原料，顯著提高了蛹蟲草子實(shí)體的附加值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0036]圖1所示的是實(shí)施例1 (3) Ca)步驟得到的色譜分離圖；
[0037]圖2所示的是實(shí)施例1 (3) (b)步驟得到的色譜分離圖；
[0038]圖3所示的是實(shí)施例1 (3) (c)步驟得到的色譜分離圖；
[0039]圖4所示的是實(shí)施例1制備的蛹蟲草抗腫瘤活性組分抑制人肺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞實(shí)時(shí)檢測(cè)圖，其中C310-6-2為目的組分，hlxa為環(huán)磷酰胺；
[0040]圖5所示的是實(shí)施例1制備的蛹蟲草抗腫瘤活性組分抑制人肝癌Hep_G2細(xì)胞生長(zhǎng)的的細(xì)胞實(shí)時(shí)檢測(cè)圖，其中C310-6-2為目的組分，hlxa為環(huán)磷酰胺。
【具體實(shí)施方式】
[0041]以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步具體描述。應(yīng)該指出，以下具體說明都是例示性的，旨在對(duì)本發(fā)明提供進(jìn)一步的說明。除非另有說明，本發(fā)明使用的所有科學(xué)和技術(shù)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬【技術(shù)領(lǐng)域】人員通常理解的相同含義。
[0042]實(shí)施例1:蛹蟲草抗腫瘤活性組分的提取
[0043]1、原料、材料:[0044]蛹蟲草子實(shí)體為本實(shí)驗(yàn)室生產(chǎn)。
[0045]2、試劑:
[0046]超純水由密立博純水儀生產(chǎn)；丙酮購自天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；色譜級(jí)乙酸乙酯、正己燒、二氯甲燒購自Honeywell公司。
[0047]3、儀器設(shè)備:
[0048]超微粉碎機(jī)購自山東三清不銹鋼設(shè)備有限公司；臺(tái)式冷凍離心機(jī)購自Thermo公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購自上海亞容生化儀器廠；IOymsilica DAC150購自江蘇迪沃特儀器設(shè)備科技有限公司。
[0049]蛹蟲草子實(shí)體抗腫瘤活性組分的提取步驟如下:
[0050]( I)超低溫粉碎:
[0051]取烘干的蛹蟲草子實(shí)體為原料，稱取150g烘干的蛹蟲草子實(shí)體，放入超微粉碎機(jī)中進(jìn)行超微粉碎，同時(shí)粉碎全過程用2~10°C的水作為超微破碎機(jī)內(nèi)部冷卻液，以降低粉碎溫度，確保有效成分的釋放和生物活性的穩(wěn)定，超微粉碎時(shí)間為5-20min，經(jīng)過實(shí)踐摸索12min為最宜,得到超微粉。
[0052](2)溶劑提取:
[0053](a)水煮:在超微粉中加入超純水，超純水的加入量為超微粉質(zhì)量的8~10倍，100°C加熱3~10小時(shí) 進(jìn)行提取，6000rpm離心取沉淀，然后重復(fù)兩次，將三次得到的沉淀合并，在60°C鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)干燥，得到粗品A。
[0054](b)丙酮沉淀:在粗品A中加入丙酮，丙酮的加入量為粗品A質(zhì)量的3倍，室溫下浸提12~36小時(shí)，6000rpm離心后取沉淀，然后重復(fù)兩次，將三次得到的沉淀合并，在60°C鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)干燥，得到粗品B。
[0055](3)色譜分離:
[0056](a)取粗品B用50%乙酸乙酯-正己烷溶液溶解至濃度為50mg/ml，過0.45 μ m有機(jī)微孔濾膜，然后通過制備液相色譜進(jìn)行分離，制備液相色譜的填料為粒徑10 μ m的硅膠(silica)、大小為150X 250mm，檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm，流速為700ml/min ;洗脫方式為100%正己烷等度洗脫10min，25%乙酸乙酯-正己烷溶液25min，100%乙酸乙酯15min，結(jié)果如圖1所示，得到各組分經(jīng)體外抗腫瘤活性篩選后，選取活性最強(qiáng)的組分旋蒸濃縮后真空干燥，得到組分C3-10做下一步分離純化。
[0057](b)取組分C3-10用100%乙酸乙酯50度超聲至剛好溶解至濃度為50mg/ml，過0.45 μ m有機(jī)微孔濾膜，然后通過制備液相色譜進(jìn)行分離，制備液相色譜的填料粒徑10 μ m的硅膠(silica)、大小為150X250mm,檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm,流速為700ml/min ;洗脫方式為100%正己烷等度洗脫lOmin，10%乙酸乙酯-正己烷溶液50min，15%乙酸乙酯-正己烷溶液20min，結(jié)果如圖2所示，得到各組分經(jīng)體外抗腫瘤活性篩選后，選取活性最強(qiáng)的組分蒸濃縮后真空干燥，得到組分C310-6做下一步分離純化。
[0058](c)取組分C310-6用100% 二氯甲烷50度超聲至剛好溶解至濃度為50mg/ml，過0.45 μ m有機(jī)微孔濾膜，然后通過制備液相色譜進(jìn)行分離，制備液相色譜的填料為粒徑10 μ m的硅膠(silica)、大小為150X250mm,檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm,流速為600ml/min ;洗脫方式為100% 二氯甲烷等度洗脫40min，結(jié)果如圖3所示，得到各組分經(jīng)體外抗腫瘤活性篩選后，選取活性最強(qiáng)的組分，蒸濃縮后真空干燥，得到組分C310-6-2，共21g，即為本發(fā)明目的抗腫瘤活性組分。
[0059]經(jīng)NMR氫譜、NMR碳譜、質(zhì)譜等鑒定，C310_6_2主要含有麥角留醇及其他未知物。
[0060]實(shí)施例2:抑制人肺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng)試驗(yàn)
[0061]主要材料與試劑:
[0062]人肺癌A549細(xì)胞由艾森生物(杭州)有限公司贈(zèng)送；F_12K培養(yǎng)基由Gibco公司贈(zèng)送；環(huán)磷酰胺購自天津金世制藥有限公司。
[0063]空白對(duì)照孔:不加藥物；
[0064]陽性對(duì)照孔:加環(huán)磷酰胺；
[0065]實(shí)驗(yàn)孔:加實(shí)施例1所得的抗腫瘤活性組分C310-6-2。
[0066]細(xì)胞培養(yǎng):
[0067]在5%C02，37 °C，飽和濕度下，用F-12K (10%FBS+1%PS)培養(yǎng)基培養(yǎng)人肺癌A549細(xì)胞，選取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。 細(xì)胞計(jì)數(shù)后用培養(yǎng)基稀釋為約5.7萬/mL的細(xì)胞懸液。
[0068]細(xì)胞生長(zhǎng)情況監(jiān)測(cè):
[0069]將細(xì)胞實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)儀放入5%C02，37°C飽和濕度培養(yǎng)箱中。取8孔板，每孔加入150 μ LF-12K培養(yǎng)基，放入細(xì)胞實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)儀中走基線，走完基線后取出八孔板，每孔加入稀釋好的Α549細(xì)胞懸液345 μ L，至每孔細(xì)胞數(shù)約2萬，靜置3min，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞是否均勻。每孔加入5 μ L稀釋好的藥物至終濃度為所需藥物濃度，用相同濃度的環(huán)磷酰胺作為陽性對(duì)照組，含0.1%DMS0的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組，放入細(xì)胞實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)儀中檢測(cè)，檢測(cè)完畢時(shí)拍照記錄。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示，結(jié)果表明:本發(fā)明提取得到的蛹蟲草抗腫瘤活性組分C310-6-2在12.5 μ g/ml時(shí)能達(dá)到近100%抑制人肺癌細(xì)胞A549的生長(zhǎng)。
[0070]實(shí)施例3:抑制人肝癌Hep_G2細(xì)胞生長(zhǎng)試驗(yàn)
[0071]主要材料與試劑:
[0072]人肝癌H印-G2細(xì)胞由天大科技園贈(zèng)送；MEM培養(yǎng)基由Gibco公司贈(zèng)送；環(huán)磷酰胺購自天津金世制藥有限公司。
[0073]空白對(duì)照孔:不加藥物；
[0074]陽性對(duì)照孔:加環(huán)磷酰胺；
[0075]實(shí)驗(yàn)孔:加實(shí)施例1所得的抗腫瘤活性組分C310-6-2。
[0076]細(xì)胞培養(yǎng):
[0077]在5%C02，37°C，飽和濕度下，用MEM (10%FBS、1%PS)培養(yǎng)基人肺癌H印-G2細(xì)胞，選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。細(xì)胞計(jì)數(shù)后用培養(yǎng)基稀釋為約5.7萬/mL的細(xì)胞懸液。
[0078]細(xì)胞生長(zhǎng)情況監(jiān)測(cè):
[0079]將細(xì)胞實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)儀放入5%C02，37°C飽和濕度培養(yǎng)箱中。取8孔板，每孔加入150 μ LMEM培養(yǎng)基，放入細(xì)胞實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)儀中走基線，走完基線后取出八孔板，每孔加入稀釋好的ifep-G2細(xì)胞懸液345 μ L，至每孔細(xì)胞數(shù)約4萬，靜置3min，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞是否均勻。每孔加入5 μ L稀釋好的藥物至終濃度為所需要藥物濃度，用相同濃度的環(huán)磷酰胺作為陽性對(duì)照組，含0.1%DMS0的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照組，放入細(xì)胞實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)儀中檢測(cè)，檢測(cè)完畢時(shí)拍照記錄。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，結(jié)果表明:本發(fā)明提取得到的蛹蟲草抗腫瘤活性組分C310-6-2在12.5 μ g/ml時(shí)能達(dá)到近100%抑制人肝癌細(xì)胞!fep-G2生長(zhǎng)。
[0080]實(shí)施例4:C310-6-2抗Lewis腫瘤實(shí)驗(yàn)
[0081]主要材料與試劑:
[0082]lewis肺癌瘤株(第6代)購自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué)保藏中心)；環(huán)磷酰胺片購自天津金世制藥有限公司；C57BL/6小鼠(18~22g)(動(dòng)物許可證號(hào):SCXK (京)2012-0001，合格證號(hào):11400700020779)購自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；吐溫80由北京博潤(rùn)萊特科技有限公司分裝。
[0083]本實(shí)施例擬在采用lewis荷瘤小鼠模型考察C310-6-2抗肺癌腫瘤作用。具體步驟如下:
[0084]1、小鼠Lewis肺癌荷瘤模型建立
[0085]取接種腫瘤8-13天狀態(tài)良好的荷瘤小鼠脫曰處死，體表酒精消毒，在無菌(超凈臺(tái))環(huán)境下剝離小鼠腫瘤至盛有生理鹽水的無菌平皿，剪至小塊，將小塊腫瘤放入組織勻漿器，按體積比1:3左右加入生理鹽水勻漿，勻漿液倒入50ml無菌離心管，備用。用Iml注射器在C57小鼠右腋下注射接種0.2ml，腫瘤細(xì)胞混懸液的制備均在無菌條件下(超凈工作臺(tái)中)完成。從取出腫瘤腹水至腫瘤接種完畢在60分鐘內(nèi)完成。
[0086]2、藥物制備方法
[0087]C310-6 -2灌胃劑:稱取一定重量的C310-6-2樣品至研缽中，加入所需溶劑體積2%吐溫-80，充分研磨后再加入所需體積的生理鹽水，混勻，備用。
[0088]環(huán)磷酰胺灌胃劑:去掉環(huán)磷酰胺片的薄膜衣后進(jìn)行稱取，稱取一定重量至研缽中，加入所需體積的生理鹽水，充分研磨、混勻，備用。
[0089]3、分組及給藥方法
[0090]將60只實(shí)驗(yàn)小鼠共分為6組，每組10只，雌雄各半，分為①混合物低劑量(27mg/kg)組、②混合物中劑量(80mg/kg)組、③混合物高劑量(240mg/kg)組、④環(huán)磷酰胺組、⑤模型組、⑥空白組，以上除空白組及模型組外，其余各組在注射腫瘤混懸液后，均每日給藥一次，每次每只0.2ml，連續(xù)給藥10天，空白組及模型組在相同給藥時(shí)間及給藥時(shí)長(zhǎng)灌胃給予2%吐溫-80水溶液，連續(xù)灌胃10天。
[0091]4、觀察指標(biāo)
[0092]4.1大體狀態(tài)
[0093]每日對(duì)小鼠進(jìn)行體重、飲食量的稱定并記錄，于最后一次計(jì)算小鼠除瘤后的體重凈重。
[0094]4.2瘤重及腫瘤抑制率
[0095]每日對(duì)小鼠右腋下進(jìn)行觀察，于最后一次給藥24h后，解剖并取出腫瘤組織，稱取腫瘤重量，按下述公式計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)抑制率。
[0096]
麵_率=歷歷里變壓.1.賴
麵麵麵量
[0097]4.3肺組織重量及癌變肺部轉(zhuǎn)移率
[0098]于最后一次給藥24h后，解剖并取出肺組織，稱取肺組織重量，并觀察肺組織是否有變化并統(tǒng)計(jì)有肺癌轉(zhuǎn)移的小鼠數(shù)量。[0099]5、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)
[0100]各組別小鼠相應(yīng)數(shù)據(jù)均以表示，采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，各組別采用one-wayANOVA檢驗(yàn)。結(jié)果如表1所示。
[0101]由表1可知，C310-6-2在給予劑量為240mg/kg，服藥天數(shù)為10天時(shí)與Lewis肺癌腫瘤模型小鼠比較有極顯著差異(p〈0.01)，此劑量與環(huán)磷酰胺組比較無明顯差異。
[0102]在肺轉(zhuǎn)移方面，各組均出現(xiàn)20%_50%的肺轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0103]在凈體重變化方面，C310-6-2各給藥組及環(huán)磷酰胺組均出現(xiàn)體重下降現(xiàn)象，且各組與模型組及空白組比較均有極顯著差異(P〈0.0I)。
[0104]在給藥治療期間，C310-6-2各給藥組小鼠體重均出現(xiàn)先下降、后波動(dòng)上升繼而維持平穩(wěn)的狀態(tài)；環(huán)磷酰胺組則為先下降后維持在低體重狀態(tài)；模型組與空白則均為波動(dòng)上升后維持在一定體重水平。
[0105]在給藥治療期間，C310-6-2各給藥組小鼠平均飲食量均表現(xiàn)出給藥中期較高，首尾期較低的表現(xiàn)；環(huán)磷酰胺組飲食量一直保持在較低水平；空白組飲食量一直保持在較高水平；模型組則表現(xiàn)為飲食量逐漸減少。
[0106]綜上所述，推測(cè)C310-6-2在給藥劑量為240mg/kg、服藥劑量為10天時(shí)，其對(duì)小鼠Lewis肺癌模型具有較好的療效，但服藥機(jī)體可能會(huì)出現(xiàn)體重下降現(xiàn)象，但其引起的不良反應(yīng)強(qiáng)度要小于環(huán)磷酰胺。
[0107]實(shí)施例5:C310-6-2抗小鼠H22腫瘤實(shí)驗(yàn)
[0108]主要材料與試劑:
[0109]H22肝癌瘤株(第4代)購自購自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué)保藏中心)；環(huán)磷酰胺片購自天津金世制藥有限公司；KM小鼠(18~22g)(動(dòng)物許可證號(hào):SCXK (京)2012-0001，合格證號(hào):11400700020779)購自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；吐溫80由北京博潤(rùn)萊特科技有限公司分裝。
[0110]本實(shí)施例擬在采用H22荷瘤小鼠模型考察C310-6-2抗肝癌腫瘤作用。具體如下:
[0111]1、小鼠H22肝癌荷瘤模型建立
[0112]取接種腫瘤8-13天狀態(tài)良好的荷瘤小鼠脫白處死，體表酒精消毒，在無菌(超凈臺(tái))環(huán)境下剝離小鼠腫瘤至盛有生理鹽水的無菌平皿，剪至小塊，將小塊腫瘤放入組織勻漿器，按體積比1:3左右加入生理鹽水勻漿，勻漿液倒入50ml無菌離心管，備用。用Iml注射器在KM小鼠右腋下注射接種0.2ml，腫瘤細(xì)胞混懸液的制備均在無菌條件下(超凈工作臺(tái)中)完成。從取出腫瘤至腫瘤接種完畢在60分鐘內(nèi)完成。
[0113]2、藥物制備方法
[0114]C310-6-2灌胃劑:稱取一定重量的C310-6-2樣品至研缽中，加入所需溶劑體積2%吐溫-80，充分研磨后再加入所需體積的生理鹽水，混勻，備用。
[0115]環(huán)磷酰胺灌胃劑:去掉環(huán)磷酰胺片的薄膜衣后進(jìn)行稱取，稱取一定重量至研缽中，加入所需體積的生理鹽水，充分研磨、混勻，，備用。
[0116]3、分組及給藥方法
[0117]將60只試驗(yàn)小鼠共分為6組，每組10只，雌雄各半，分為①C310-6-2低劑量(27mg/kg)組、② C310-6-2 中劑量(80mg/kg)組、③ C310-6-2 高劑量(240mg/kg)組、④環(huán)磷酰胺組、⑤模型組、⑥空白組，以上各組除模型組及空白組外在注射腫瘤混懸液后，均每日給藥一次，每次每只0.3ml，連續(xù)給藥10天；模型組與空白組每日灌胃等體積2%吐溫80水溶液，連續(xù)10天。
[0118]4、觀察指標(biāo)
[0119]4.1大體狀態(tài)
[0120]每日對(duì)小鼠進(jìn)行體重、飲食量的稱定并記錄，于最后一次計(jì)算小鼠除瘤后的體重凈重。
[0121]4.2瘤重及腫瘤抑制率
[0122]每日對(duì)小鼠右腋下進(jìn)行觀察，于最后一次給藥24h后，解剖并取出腫瘤組織，稱取腫瘤重量，按下述公式計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)抑制率。
[0123]
【權(quán)利要求】
1.一種蛹蟲草抗腫瘤活性組分的提取方法，其特征在于包括以下步驟: (1)超低溫粉碎: 取烘干的蛹蟲草子實(shí)體為原料，放入超微粉碎機(jī)中進(jìn)行超微粉碎，同時(shí)粉碎全過程用2~10°C的水作為超微破碎機(jī)內(nèi)部冷卻液，超微粉碎時(shí)間為5-20min，得到超微粉； (2)溶劑提取: 水煮:在超微粉中加入超純水，超純水的加入量為超微粉質(zhì)量的8~10倍，100°C加熱3~10小時(shí)進(jìn)行提取，離心取沉淀，然后重復(fù)I~3次，將得到的沉淀合并，干燥，得到粗品A ； 丙酮沉淀:在粗品A中加入丙酮，丙酮的加入量為粗品A質(zhì)量的2~4倍，室溫下浸提12~36小時(shí)，離心后取沉淀，然后重復(fù)I~3次，將得到的沉淀合并，干燥，得到粗品B ； (3)色譜分離: 取粗品B用50%乙酸乙酯-正己烷溶液溶解至濃度為50mg/ml，然后通過制備液相色譜進(jìn)行分離，洗脫方式為100%正己烷等度洗脫10min，25%乙酸乙酯-正己烷溶液等度洗脫25min, 100%乙酸乙酯等度洗脫15min，檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm，得到各組分經(jīng)體外抗腫瘤活性篩選后，選取活性最強(qiáng)的組分旋蒸濃縮后真空干燥，得到組分A ； 取組分A用100%乙酸乙酯50度超聲至剛好溶解至濃度為50mg/ml,然后通過制備液相色譜進(jìn)行分離，洗脫方式為100%正己烷等度洗脫lOmin，10%乙酸乙酯-正己烷溶液等度洗脫50min，15%乙酸乙酯-正己烷溶液等度洗脫20min，檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm，得到各組分經(jīng)體外抗腫瘤活性篩選后，選取活性最強(qiáng)的組分旋蒸濃縮后真空干燥，得到組分B ； 取組分B用100% 二氯甲烷50度超聲至剛好溶解至濃度為50mg/ml，然后通過制備液相色譜進(jìn)行分離，洗脫方式為100% 二氯甲烷等度洗脫40min，檢測(cè)波長(zhǎng)為260nm，得到各組分經(jīng)體外抗腫瘤活性篩選后，選取活性最強(qiáng)的組分，旋蒸濃縮后真空干燥，即為本發(fā)明目的抗腫瘤活性組分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛹蟲草抗腫瘤活性組分的提取方法，其特征在于:所述步驟(1)中粉碎時(shí)間為12min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛹蟲草抗腫瘤活性組分的提取方法，其特征在于:所述步驟(2)中離心的轉(zhuǎn)速為6000rpm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛹蟲草抗腫瘤活性組分的提取方法，其特征在于:所述步驟(2)中干燥在60°C鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)進(jìn)行。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛹蟲草抗腫瘤活性組分的提取方法，其特征在于:所述步驟(3)中制備液相色譜的填料為粒徑IOym的硅膠、大小為150X250mm。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛹蟲草抗腫瘤活性組分的提取方法，其特征在于:所述步驟(3)中溶解液在進(jìn)行制備液相色譜之前先用0.45 μ m有機(jī)膜抽濾。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛹蟲草抗腫瘤活性組分的提取方法，其特征在于:所述步驟(3)中體外抗腫瘤活性篩選是指進(jìn)行抑制人肺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng)試驗(yàn)和抑制人肝癌Hep-G2細(xì)胞生長(zhǎng)試驗(yàn)。
8.權(quán)利要求1所述的蛹蟲草抗腫瘤活性組分在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K36/068GK103751225SQ201410041855
【公開日】2014年4月30日 申請(qǐng)日期:2014年1月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年1月27日
【發(fā)明者】張耀洲, 陳玉嬌, 崔今松, 舒特俊, 陳劍清 申請(qǐng)人:正源堂（天津）生物科技有限公司