專利名稱：高效節(jié)能的高純度蟲草素提取與生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種高效節(jié)能的高純度蟲草素提取與生產(chǎn)方法，屬于天然功能物 質(zhì)蟲草素的提取分離與高純度產(chǎn)品生產(chǎn)方法的創(chuàng)新技術(shù)。
背景技術(shù)：
到目前為止報道天然功能物質(zhì)蟲草素的提取方法主要為溶劑浸泡提取法， 超聲波法、索氏法和回流法等，以超聲波輔助的酸性水提取法效果最佳。蟲草 素的分離純化方法有離子交換樹脂法，活性炭吸附、氧化鋁柱層析、硅膠柱層
析和超臨界萃取等方法。其中以732陽離子交換樹脂法效果較好,可獲得一定 純度的蟲草素產(chǎn)品。到高純度蟲草素制備只有用制備型液相色譜法的報道。 這些工藝存在的缺點(diǎn)是
1) 提取過程復(fù)雜，提取效率低，溶劑用量大，濃縮等過程耗能大。
2) 離子交換樹脂法吸附量小，蟲草素與雜質(zhì)的分離效果不理想.
3) 用制備型液相色譜法純化精制的設(shè)備投資高，生產(chǎn)成本高，每次可制備 的量很少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于考慮上述問題而提供一種提取效率高、設(shè)備投資低、高 效節(jié)能的高純度蟲草素提取與生產(chǎn)方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案是本發(fā)明高效節(jié)能的高純度蟲草素提取與生產(chǎn)方法， 包括從蟲草子實(shí)體、菌絲體和和蟲草固體培養(yǎng)基中進(jìn)行提取、分離、精制和干 燥蟲草素四個步驟，其特征在于提取步驟釆用柱層析循環(huán)提取法，分離步驟采用大孔吸附樹脂吸附法，精制步驟釆用聚酰胺樹脂吸附和沉淀與結(jié)晶的方法， 干燥采用真空干燥法。
上述提取步驟釆用的柱層析循環(huán)提取法包括如下步驟
1) 將干燥的待提取的蟲草固體培養(yǎng)基、蟲草子實(shí)體或菌絲體材料粉碎至
40目以上；
2) 按待提取材料干重與提取溶劑之比或料液比為l:3 h8的比例，將材 料用提取溶劑或水在室溫下浸泡至完全吸漲；
3) 將充分吸漲的蟲草固體培養(yǎng)基、蟲草子實(shí)體或菌絲體材料與浸泡溶劑 一起轉(zhuǎn)入層析柱或類似容器中，柱高為柱直徑的5~10倍或以上；室溫下，用柱 層析洗脫的方法將蟲草素從層析柱內(nèi)的材料中洗脫出來；
4)用材料干重3~5倍體積的水在前后不同批次材料中循環(huán)提取2~3 次，即用純凈溶劑或水提取第三次，然后用它提取第二次，最后用它浸泡材料； 收集每條層析柱中最初的3 5倍體積的流出液作為提取液，第二個3 5倍體 積的流出液用于下一批材料的浸泡，第三個3 - 5倍體積的流出液用于下一批 材料的洗脫液。
上述步驟2 )如為濕材料則根據(jù)其含水量調(diào)整至上述料液比。
上述步驟3)柱高應(yīng)為柱直徑的5-10倍或以上，洗脫流速為每小時1 -
4BV。
上述分離步驟采用的大孔吸附樹脂法包括如下步驟
1) 樣品與加樣，用氫氧化鈉將提取液的pH調(diào)至堿性，將提取液直接流過
制備好的大孔吸附樹脂柱，加樣量因提取液中蟲草素與雜質(zhì)含量而異，加樣液 的體積為大孔樹脂柱體積的1 ~ 4倍量為宜，流速控制在每小時1 ~ 4BV;
2) 用2 4BV的堿性純凈水洗柱，可將絕大部分雜質(zhì)洗出，不損失蟲草素；
3) 用1-2BV的20%~60%的低級醇的水溶液洗脫蟲草素，收集洗脫液，如果嚴(yán)格按照柱層析的加樣，水洗雜質(zhì)和蟲草素洗脫過程要求，并同時檢測流
出液中的蟲草素，使蟲草素洗脫液體積減少到約1/3-1BV;
4)將洗脫液減壓濃縮至約1/5 1/20體積，即為蟲草素分離液。 上述大孔吸附樹脂法的步驟1 )及步驟2 )的堿性為pH 9. 0。 上述大孔吸附樹脂法步驟3)用1-2BV的40%的乙醇或甲醇的酸性或
pH3. O的水溶液洗脫蟲草素。
上述精制步驟釆用醇聚酰胺樹脂吸附和沉淀與結(jié)晶的方法；
1) 在蟲草素分離液中加入2 5倍體積的95%~100%的醇類，充分混合后， 在室溫15°C ~ 35°C下放置2 ~ 12小時或以上，減壓過濾或離心除去沉淀；
2) 濾液或離心上清液減壓濃縮至水相，置于0 ~ 10°C下結(jié)晶過夜，離心得 蟲草素粗制品；
3) 蟲草素粗制品用水或醇加熱溶解，4。C結(jié)晶，離心分離沉淀，反復(fù)結(jié)晶 一至多次，至溶液無色、結(jié)晶為純白色為止。
4) 蟲草素結(jié)晶中尚有微量的色素，需要除去時，用蒸餾水將結(jié)晶完全溶解， 溶液流過聚酰胺樹脂柱，并用2 ~ 3BV的蒸餾水洗柱，收集過柱液和洗柱液,減壓 濃縮至可結(jié)晶的體積，0 10。C結(jié)晶，結(jié)晶真空干燥，得純度為98%或以上的蟲 草素精品。
4)用材料干重3 ~ 5倍體積的水在前后不同批次材料中循環(huán)提取2 ~ 3次， 即用純凈溶劑或水提取第三次，然后用它提取第二次，最后用它浸泡材料；收集 每條層析柱中最初的3 5倍體積的流出液作為提取液，第二個3-5倍體積的 流出液用于下一批材料的浸泡，第三個3 5倍體積的流出液用于下一批材料的 洗脫液。
上述醇聚酰胺樹脂吸附和沉淀與結(jié)晶方法的步驟l)釆用95%的食用級乙醇。
7上述醇聚酰胺樹脂吸附和沉淀與結(jié)晶方法的步驟1 )的室溫是15° C ~ 35°C。
本發(fā)明的高效節(jié)能的高純度蟲草素提取與生產(chǎn)方法，其與現(xiàn)有技術(shù)相比， 具有如下優(yōu)點(diǎn)
l)設(shè)備投資少。本工藝不需要復(fù)雜的提取、分離和純化設(shè)備,不需要渣液 分離設(shè)備.整個提取、分離和純化過程可在簡單的容器和層析柱內(nèi)完成.使用本 工藝的提取分離和純化裝置只需要現(xiàn)有生產(chǎn)設(shè)備投資的1/3 - 1/2。
2) 提取分離全過程在室溫下進(jìn)行，不需加熱，提取溶劑用量和最終提取液 體積只有材料干重的約4倍，提取液不需要濃縮，可直接進(jìn)入樹脂分離步驟.可 節(jié)約大量能源、人工和減少因髙溫提取所引起的有效成分變化和損失。
3) 提取過程釆用高效的柱層析洗脫方法。并通過溶劑循環(huán)法，用少量體積 的提取液可使提取率達(dá)到95%~1001
4) 分離步驟釆用高吸附與分離能力的大孔吸附樹脂吸附分離法.對蟲草素 的吸附量大，吸附穩(wěn)定，對大多數(shù)雜質(zhì)的吸附力小.分離效果好.
5) 純化與精制步驟釆用了聚酰胺樹脂吸附和沉淀與結(jié)晶法.不需要特殊設(shè) 備,每次可處理大量樣品.可根據(jù)產(chǎn)品純度要求，靈活調(diào)整重結(jié)晶次數(shù).
6) 提取和分離步驟可通過多條層析柱組合成一條連續(xù)自動的生產(chǎn)線，不間 斷地獲得提取物和分離純化產(chǎn)品.
圖l是本發(fā)明從蟲草和蟲草培養(yǎng)基中提取分離和生產(chǎn)高純度蟲草素的工 藝流程圖2是本發(fā)明干燥的蟲草子實(shí)體和蟲草固體培養(yǎng)基的吸水飽和曲線圖； 圖3是本發(fā)明材料粉碎度對提取效率的影響的示意圖；圖4是本發(fā)明不同浸泡時間對干燥的蟲草固體培養(yǎng)基(A )和蟲草子實(shí)
體(B )蟲草素提取率的影響的示意圖5是本發(fā)明柱層析提取溫度和流速對蟲草子實(shí)體中蟲草素提取的影 響的示意圖6是本發(fā)明柱高與柱直徑之比對蟲草素柱層析提取率的影響的示意
圖7是本發(fā)明柱層析提取與浸泡提取的提取效率比較的示意圖8是本發(fā)明柱層析循環(huán)提取與非循環(huán)提取蟲草素的效果比較的示意
圖9是本發(fā)明用高效液相色譜檢測蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品(A)和本法生產(chǎn)的 蟲草素產(chǎn)品(B )的示意圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例
本發(fā)明的流程圖如圖l所示，發(fā)明高效節(jié)能的蟲草素提取與生產(chǎn)方法，包 括有提取、分離、精制和干燥四個步驟，其中提取步驟釆用柱層析提取法,分 離步驟采用大孔樹脂吸附法，精制步驟采用聚酰胺樹脂吸附和沉淀結(jié)晶法。
上述高效節(jié)能的蟲草素提取與生產(chǎn)方法的過程包括如下步驟
1) 將千燥的待提取的蟲草固體培養(yǎng)基或蟲草子實(shí)體材料粉碎至約20目. 材料不宜過細(xì)，否則溶劑流動困難；
2) 按待提取材料干重與提取溶劑之比或料液比為l:4(蟲草固體培養(yǎng)基) 或1: 6 (蟲草子實(shí)體)的比例，室溫下浸泡材料，至材料完全吸漲，如干燥的蟲草 固體培養(yǎng)基浸泡6小時，干燥的蟲草子實(shí)體浸泡1小時，濕材料根據(jù)其含水量 調(diào)整至上述料液比；
3) 將充分吸漲的蟲草固體培養(yǎng)基或蟲草子實(shí)體材料與浸泡溶劑一起轉(zhuǎn)入 層析柱或類似容器中，室溫下，用柱層析洗脫的方法將蟲草素從層析柱內(nèi)的材料中洗脫出來。為達(dá)到高效率提取的目的，洗脫過程必須嚴(yán)格按照柱層析中物 質(zhì)洗脫的方法；層析柱中材料的高度應(yīng)為柱直徑的5~10倍或以上，洗脫流速
為約2BV/小時，柱內(nèi)液面必須始終高于材料；
4) 柱內(nèi)流出的洗脫液以材料干重的4倍體積為單位分開收集，第一個4
倍體積的洗脫液含有高濃度的蟲草素，作為蟲草素提取液直接用于樹脂吸附分 離；第二個4倍體積的洗脫液含有較低的蟲草素，用于下一批材料的浸泡；第
三個4倍體積的洗脫液中蟲草素含量很低，用于下一批材料的提取液；這樣，每 份純凈水在前后不同批次的材料中由含量低到高的次序循環(huán)提取3次.每份材 料實(shí)際上經(jīng)過材料干重12倍提取的提取液提取，而最終收集的提取液體積只有 材料干中的4倍體積；大規(guī)模連續(xù)生產(chǎn)時，用3或4條層析柱組合成一條連續(xù) 自動的生產(chǎn)線，可以不間斷地收取提取液進(jìn)入下一道大孔樹脂分離工序；
5) 大孔樹脂柱的制備，DM130大孔樹脂分別用0. 1M鹽酸，0. l薩aOH和95% 食用酒精分別浸泡12小時，純凈水充分洗滌，裝柱后再水洗2 ~ 3BV;
6) 樣品與加樣，用鹽酸將提取液的pH調(diào)至約9. O，然后將提取液以2BV/ 小時的流速加入制備好的大孔吸附樹脂柱；加樣量因提取液中蟲草素與雜質(zhì)含 量而異，加樣液的體積以不超過大孔樹脂柱體積的4倍量(1BV)為佳；加樣時盡 量不要沖動樹脂柱的上部；
7) 待樣品完全流入柱內(nèi)后，用2 4BV的pH 9. 0的堿性純凈水洗柱，可將 絕大部分雜質(zhì)洗出，不損失蟲草素，水洗體積通常不超過4BV，否則有蟲草素?fù)p 失；
8) 用1 ~ 2BV的40%的PH3. 0酸性乙醇洗脫蟲草素，收集40%乙醇洗脫液, 如果層析技術(shù)好，裝柱、加樣、水洗雜質(zhì)和蟲草素洗脫等過程控制得好，蟲草素 可在相對較窄的色譜帶集中流出，如結(jié)合洗脫液中蟲草素的檢測，可使蟲草素 洗脫液體積減少到1/3-1BV,蟲草素與一條深黑色的色素帶幾乎同時移動，可作為層析洗脫時的目測指標(biāo)；
9) 將40%乙醇洗脫液減壓濃縮至約1/10體積，即為蟲草素分離液；
10) 在蟲草素分離液中加入4倍體積的95%的食用級乙醇，充分混合后， 在15°C~ 35°C的室溫放置約12小時或以上，減壓過濾或離心除去沉淀；
11) 濾液或離心上清液減壓濃縮至水相，置于4°C冰箱內(nèi)結(jié)晶過夜，離心 得蟲草素粗制品；
12) 蟲草素粗制品用水或醇加熱溶解，4。C結(jié)晶，離心分離沉淀，反復(fù)結(jié) 晶一至多次，至溶液無色、結(jié)晶為純白色為止。
13) 所得白色結(jié)晶尚含有微量色素.用蒸餾水將結(jié)晶完全溶解，溶液流過 聚酰胺樹脂柱，并用2 ~ 3BV的蒸餾水洗柱，收集過柱液和洗柱液，減壓濃縮至可 結(jié)晶的體積，0 10。C結(jié)晶，結(jié)晶真空干燥，可得純度為98%或以上的蟲草素精
權(quán)利要求
1、一種高效節(jié)能的高純度蟲草素提取與生產(chǎn)方法，包括從蟲草子實(shí)體、菌絲體和和蟲草固體培養(yǎng)基中進(jìn)行提取、分離、精制和干燥蟲草素四個步驟，其特征在于提取步驟采用柱層析循環(huán)提取法，分離步驟采用大孔吸附樹脂吸附法，精制步驟采用聚酰胺樹脂吸附和沉淀與結(jié)晶的方法，干燥采用真空干燥法。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的高效節(jié)能的高純度蟲草素提取與生產(chǎn)方法，其 特征在于上述提取步驟采用的柱層析循環(huán)提取法包括如下步驟1) 將干燥的待提取的蟲草固體培養(yǎng)基、蟲草子實(shí)體或菌絲體材料粉碎至 40目以上；2) 按待提取材料干重與提取溶劑之比或料液比為1:3 L8的比例，將材 料用提取溶劑或水在室溫下浸泡至完全吸漲；3) 將充分吸漲的蟲草固體培養(yǎng)基、蟲草子實(shí)體或菌絲體材料與浸泡溶劑 一起轉(zhuǎn)入層析柱或類似容器中，柱高為柱直徑的5~10倍或以上；室溫下，用柱 層析洗脫的方法將蟲草素從層析柱內(nèi)的材料中洗脫出來；4)用材料干重3~5倍體積的水在前后不同批次材料中循環(huán)提取2~3 次，即用純凈溶劑或水提取第三次，然后用它提取第二次，最后用它浸泡材料； 收集每條層析柱中最初的3-5倍體積的流出液作為提取液，第二個3-5倍體積的流出液用于下一批材料的浸泡，第三個3 - 5倍體積的流出液用于下一批 材料的洗脫液。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的高效節(jié)能的高純度蟲草素提取與生產(chǎn)方法，其 特征在于上述步驟2 )如為濕材料則根據(jù)其含水量調(diào)整至上述料液比。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的高效節(jié)能的高純度蟲草素提取與生產(chǎn)方法，其 特征在于上述步驟3 )柱高應(yīng)為柱直徑的5 ~ 10倍或以上，洗脫流速為每小時1- 4BV。
5、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的高效節(jié)能的高純度蟲草素提取與生產(chǎn)方法，其 特征在于上述分離步驟釆用的大孔吸附樹脂法包括如下步驟1) 樣品與加樣，用氫氧化鈉將提取液的pH調(diào)至堿性，將提取液直接流過 制備好的大孔吸附樹脂柱，加樣量因提取液中蟲草素與雜質(zhì)含量而異，加樣液 的體積為大孔樹脂柱體積的1 ~ 4倍量為宜，流速控制在每小時1 ~ 4BV;2) 用2 4BV的堿性純凈水洗柱，可將絕大部分雜質(zhì)洗出，不損失蟲草素；3) 用1-2BV的20%~60%的低級醇的水溶液洗脫蟲草素，收集洗脫液， 如果嚴(yán)格按照柱層析的加樣，水洗雜質(zhì)和蟲草素洗脫過程要求，并同時檢測流 出液中的蟲草素，使蟲草素洗脫液體積減少到約1 /3 ~ 1BV;4) 將洗脫液減壓濃縮至約1/5 ~ 1/20體積，即為蟲草素分離液。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的高效節(jié)能的高純度蟲草素提取與生產(chǎn)方法，其 特征在于上述步驟1)及步驟2 )的堿性為pH 9. 0。
7、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的高效節(jié)能的高純度蟲草素提取與生產(chǎn)方法，其 特征在于上述步驟3)用1 ~ 2BV的40%的乙醇或甲醇的酸性或pH3. 0的水溶液 洗脫蟲草素。
8、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的高效節(jié)能的高純度蟲草素提取與生產(chǎn)方法，其 特征在于上述精制步驟釆用醇聚酰胺樹脂吸附和沉淀與結(jié)晶的方法；1) 在蟲草素分離液中加入2-5倍體積的95%~100%的醇類，充分混合后， 在室溫放置2 ~ 12小時或以上，減壓過濾或離心除去沉淀；2) 濾液或離心上清液減壓濃縮至水相，置于0~10eC下結(jié)晶過夜，離心得 蟲草素粗制品；3) 蟲草素粗制品用水或醇加熱溶解，4。C結(jié)晶，離心分離沉淀，反復(fù)結(jié)晶 一至多次，至溶液無色、結(jié)晶為純白色為止；4)蟲草素結(jié)晶中尚有微量的色素.需要除去時,用蒸餾水將結(jié)晶完全溶解，溶液流過聚酰胺樹脂柱，并用2 ~ 3BV的蒸餾水洗柱，收集過柱液和洗柱液，減壓 濃縮至可結(jié)晶的體積，0 1(TC結(jié)晶，結(jié)晶真空干燥，得純度為98%或以上的蟲 草素精品。4)用材料干重3 ~ 5倍體積的水在前后不同批次材料中循環(huán)提取2 ~ 3次，即用純凈溶劑或水提取第三次，然后用它提取第二次，最后用它浸泡材料；收集 每條層析柱中最初的3 ~ 5倍體積的流出液作為提取液，第二個3~5倍體積的 流出液用于下 一 批材料的浸泡，第三個3 ~ 5倍體積的流出液用于下 一批材料的 洗脫液。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的高效節(jié)能的高純度蟲草素提取與生產(chǎn)方法，其 特征在于上述步驟l)釆用95%的食用級乙醇。
10、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的高效節(jié)能的高純度蟲草素提取與生產(chǎn)方法，其 特征在于上述步驟l)的室溫是15。C 35。C。
全文摘要
本發(fā)明是一種高效節(jié)能的高純度蟲草素提取與生產(chǎn)方法。包括從蟲草子實(shí)體、菌絲體和蟲草固體發(fā)酵培養(yǎng)基中提取、分離、精制和干燥蟲草素四個步驟，其中提取步驟采用柱層析循環(huán)提取法；分離步驟采用大孔吸附樹脂吸附法；精制步驟采用聚酰胺樹脂吸附和沉淀與結(jié)晶的方法；干燥步驟采用真空干燥法。本發(fā)明由于采用了以上新的方法和工藝；提取過程中不需加熱，提取液不需要離心或過濾分離，也不需要濃縮而直接上大孔吸附樹脂吸附，使用簡單的提取分離設(shè)備和最少量的提取溶劑，可使提取率達(dá)到95％以上；生產(chǎn)的蟲草素產(chǎn)品純度達(dá)到98％以上。是一種提取率高、設(shè)備投資低、高效節(jié)能的高純度蟲草素的提取與生產(chǎn)方法。
文檔編號C07H19/00GK101475620SQ20091003661
公開日2009年7月8日 申請日期2009年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月13日
發(fā)明者李海航 申請人:華南師范大學(xué)