本發(fā)明涉及姜葉三七、姜葉三七提取物、姜葉三七脂溶性提取物及姜葉三七揮發(fā)油的新用途，即在制備治療和/或預(yù)防肝癌藥物方面的新用途。

背景技術(shù)：
肝癌是指發(fā)生于肝臟的惡性腫瘤，包括原發(fā)性肝癌和轉(zhuǎn)移性肝癌兩種，人們?nèi)粘Ｕf的肝癌指的多是原發(fā)性肝癌。原發(fā)性肝癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，根據(jù)最新統(tǒng)計(jì)，全世界每年新發(fā)肝癌患者約六十萬，居惡性腫瘤的第五位。原發(fā)性肝癌按細(xì)胞分型可分為肝細(xì)胞型肝癌、膽管細(xì)胞型肝癌及混合型肝癌。大量的研究證實(shí)，腫瘤是一類細(xì)胞周期疾病，腫瘤的特征之一是細(xì)胞周期異常，使腫瘤細(xì)胞無限增殖，細(xì)胞周期的任何一個(gè)時(shí)相的生物合成被阻斷，都可使細(xì)胞周期的連續(xù)性中斷，腫瘤治療的中心環(huán)節(jié)就是阻斷腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡發(fā)生于所有的腫瘤組織中，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)?；熕幬镏饕ㄟ^誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡達(dá)到治療效果，因此，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡成為研究腫瘤治療的熱點(diǎn)。細(xì)胞凋亡的特征是細(xì)胞體積縮小，隨即與鄰近的細(xì)胞的連接喪失，彼此脫離，失去微絨毛，胞漿濃縮，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張呈泡狀并與細(xì)胞膜融合，線粒體無大的變化，核染色質(zhì)濃縮呈半月形，染色質(zhì)凝聚靠近于核膜周邊，核仁裂解，進(jìn)而細(xì)胞膜內(nèi)陷，形成凋亡小體，細(xì)胞凋亡的過程不導(dǎo)致溶酶體破裂，沒有細(xì)胞內(nèi)涵物外泄，故不引起炎癥反應(yīng)和次級(jí)損傷，Ca2+/Mg2+依賴核酸內(nèi)切酶活性增高，使DNA降解，DNA電泳表現(xiàn)為梯狀，目前這些變化已成為判斷細(xì)胞凋亡的重要指標(biāo)。但是并非意味核酸內(nèi)切酶的激活是細(xì)胞凋亡過程中所必需的，在有些細(xì)胞凋亡中不一定出現(xiàn)DNA電泳呈梯狀。細(xì)胞凋亡的發(fā)生是否需要新的RNA和蛋白質(zhì)的主動(dòng)合成，取決于細(xì)胞類型和誘導(dǎo)凋亡的因素，或許某些信號(hào)途徑需要新基因的表達(dá)，而有些不需要。也有報(bào)道凋亡細(xì)胞沒有DNA降解，提示DNA降解并非細(xì)胞凋亡過程中必不可少。細(xì)胞凋亡是一個(gè)非常復(fù)雜的生理和病理過程，機(jī)體內(nèi)、外多種因素可影響細(xì)胞凋亡的發(fā)生，并明顯受到分子遺傳學(xué)影響。不同的腫瘤細(xì)胞對(duì)不同藥物、或相同藥物的不同濃度敏感性不同，可以激活一種腫瘤細(xì)胞凋亡作用的物質(zhì)，可能對(duì)另一種腫瘤細(xì)胞無效。比如紫杉醇主要適用于卵巢癌和乳腺癌，對(duì)肺癌、大腸癌、黑色素瘤、頭頸部癌、淋巴瘤、腦瘤也都有一定療效。而治其他的癌癥則效果不佳?？傊?xì)胞凋亡的分子機(jī)制尚不清楚，有待于深入研究。姜葉三七為姜科植物姜葉三七Stahlianthusinvolucratus(KingexBak.)Craib的根狀莖及塊根。具清熱，利濕，止痛，解毒，止血之功效，用于淋濁，胃痛，口瘡，痔瘡，潰瘍，跌打損傷，蛇咬傷，外傷出血等癥，為廣西特色中藥材?！拔覈扑幱弥参镅芯竣鼋邠]發(fā)油化學(xué)成分分析”(發(fā)表于《色譜》1984年第1卷第1期)，用氣液色譜和氣液色譜-質(zhì)譜法對(duì)姜三七揮發(fā)油各成分進(jìn)行分享和鑒定，鑒定出二氫姜三七酮、α-蒎烯、茨烯、β-蒎烯、蒈烯、檸檬烯、桉葉素、芳樟醇、樟腦、α-胡椒烯、反-丁香烯、香樹烯、γ-衣蘭油烯、杜松烯、姜三七醌等15種成分。申請(qǐng)?zhí)枮镃N200510098945.2“一種姜葉三七的外用藥”，公開了由姜葉三七、鉆石風(fēng)、倒生蓮、滇崖爬藤、五角楓根、無腺磷木、絡(luò)石藤、乙醇組成的一種外用藥，對(duì)風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、跌打瘀痛、跌打損傷、外傷出血、關(guān)節(jié)疼痛、筋骨扭傷疼痛、筋骨疼痛、瘀腫疼痛、腰膝疼痛、關(guān)節(jié)酸痛、外傷瘀痛、軟組織挫傷療效確切，療程更短，效果更佳。此外，公開號(hào)為CN1814229的專利申請(qǐng)“一種土千年健祛濕鎮(zhèn)痛藥酒”、公開號(hào)為CN1742972的專利申請(qǐng)“一種四葉細(xì)辛外用藥”、公開號(hào)為CN1814230的專利申請(qǐng)“一種山野豌豆活絡(luò)鎮(zhèn)痛藥”、公開號(hào)為CN1814228的專利申請(qǐng)“一種矮人陀活絡(luò)傷濕止痛膏”、公開號(hào)為CN101766729的專利申請(qǐng)“祛濕止痛液及穴敷治療方法”均提及姜葉三七或土田七在跌打損傷或風(fēng)濕疾病方面的治療效果。在現(xiàn)有公開文獻(xiàn)中，或提到姜葉三七的揮發(fā)油成分，或提到姜葉三七治療跌打損傷等疾病的效果，但未見公開使用姜葉三七、姜葉三七提取物、姜葉三七脂溶性提取物及姜葉三七揮發(fā)油用于治療腫瘤、各種癌癥的效果，尚未有人公開姜葉三七可用于治療肝癌，亦沒有報(bào)道公開姜葉三七對(duì)肝癌細(xì)胞周期、增殖或凋亡的影響。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供姜葉三七植物在制備治療和/或預(yù)防肝癌藥物的應(yīng)用；本發(fā)明的目的是提供姜葉三七提取物在制備治療和/或預(yù)防肝癌藥物的應(yīng)用；本發(fā)明的目的是提供姜葉三七揮發(fā)油提取物在制備治療和/或預(yù)防肝癌藥物的應(yīng)用；本發(fā)明的另一目的是提供姜葉三七揮發(fā)油的制備方法。姜葉三七為姜科植物姜葉三七Stahlianthusinvolucratus(KingexBak.)Craib的根狀莖、塊根。秋末冬初葉片枯黃后采挖，除去雜質(zhì)，洗凈，置沸水中稍燙，曬干。收載于《廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)》1990年版第8頁。姜葉三七的別名有三七姜、姜葉三七、土田七、竹葉三七、姜葉三七、雞心七、紅沙姜、尖三七、拖顛槍(壯族)、內(nèi)消子、打不死等。根據(jù)發(fā)明人對(duì)姜葉三七植物、姜葉三七提取物、姜葉三七脂溶性提取物以及姜葉三七揮發(fā)油進(jìn)行臨床研究和藥效學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)姜葉三七植物、姜葉三七提取物、姜葉三七脂溶性提取物以及姜葉三七揮發(fā)油能夠通過抑制肝癌細(xì)胞增殖、影響肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，以及影響肝癌細(xì)胞周期的改變，達(dá)到抗腫瘤活性、治療肝癌的功效。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明人通過對(duì)姜葉三七揮發(fā)油的有效成分進(jìn)行有目的提取及含量控制以后，使其用于治療和/或預(yù)防癌癥的效果更顯著。姜葉三七揮發(fā)油與其他姜葉三七提取物相比，對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2更具有顯著的抑制作用，可有效抑制細(xì)胞周期的正常轉(zhuǎn)換，使細(xì)胞在G1期堆積，細(xì)胞阻滯于G1期，從而阻止細(xì)胞的有絲分裂，使細(xì)胞增殖受到抑制。本發(fā)明專利臨床應(yīng)用的安全性較高，在肝癌的藥物治療中不失為一種好藥，其拓寬了中藥制劑治療肝癌的新方法，在不能開展介入治療的基層醫(yī)院尤為適用。因此，申請(qǐng)人提供姜葉三七植物、姜葉三七提取物、姜葉三七脂溶性提取物、姜葉三七揮發(fā)油用于制備治療和/或預(yù)防肝癌藥物方面的新用途。本發(fā)明公開了姜葉三七提取物在制備治療和/或預(yù)防肝癌藥物的應(yīng)用，所述姜葉三七提取物的制備包括以下步驟：取姜葉三七根莖切碎，加水煎煮提取兩次，第一次加入藥材重量2-6倍量的水煎煮，沸騰后煮1-3小時(shí)，第二次加入藥材重量1-4倍量的水煎煮1-3小時(shí)，過濾，混合兩次煎煮液，濃縮至藥材總重量的0.5-2倍，即得。本發(fā)明公開了姜葉三七提取物在制備治療和/或預(yù)防肝癌藥物的應(yīng)用，所述姜葉三七提取物的制備還包括以下步驟：取姜葉三七根莖切碎，加入乙醇回流提取2-3次，第一次加入2-6倍體積百分比為40-70％的乙醇，提取1-3小時(shí)，第二次加入1-4倍量體積百分比為40-70％的乙醇提取1-3小時(shí)，合并煎液，過濾，回收乙醇，制成干膏，即得。本發(fā)明還公開了姜葉三七脂溶性成分提取物在制備治療和/或預(yù)防肝癌藥物的應(yīng)用，所述姜葉三七脂溶性成分提取物的制備包括以下步驟：取姜葉三七根莖切碎，加石油醚回流提取2-3次，每次加入藥材總重量3-5倍的石油醚，提取時(shí)間為1-3小時(shí)，合并提取液，過濾，回收石油醚，得姜葉三七脂溶性成分提取物。本發(fā)明公開了姜葉三七脂溶性成分提取物在制備治療和/或預(yù)防肝癌藥物的應(yīng)用，所述姜葉三七脂溶性成分提取物的制備還可以包括以下步驟：取姜葉三七根莖切碎，加乙酸乙酯回流提取2-3次，每次加入藥材總重量3-5倍的乙酸乙酯，提取時(shí)間為1-3小時(shí)，合并提取液，過濾，回收乙酸乙酯，得姜葉三七脂溶性成分提取物。本發(fā)明公開了姜葉三七脂溶性成分提取物在制備治療和/或預(yù)防肝癌藥物的應(yīng)用，所述姜葉三七脂溶性成分提取物的制備還可以包括以下步驟：取姜葉三七根莖切碎，加水飽和正丁醇回流提取2-3次，每次加入藥材總重量3-5倍的水飽和正丁醇，提取時(shí)間為1-3小時(shí)，合并提取液，過濾，回收水飽和正丁醇，得姜葉三七脂溶性成分提取物。本發(fā)明公開了姜葉三七脂溶性成分提取物在制備治療和/或預(yù)防肝癌藥物的應(yīng)用，所述姜葉三七脂溶性成分提取物的制備還可以包括以下步驟：取姜葉三七根莖切碎，加乙醇回流提取2-3次，每次加入藥材總重量3-5倍、體積百分比為30-50％的乙醇，提取時(shí)間為1-3小時(shí)，合并提取液，過濾，回收乙醇，得濃縮液。所述濃縮液加石油醚分3次萃取，每次石油醚用量為濃縮液體積的3-5倍，收集石油醚相，濃縮干燥，得到姜葉三七脂溶性成分提取物。所述濃縮液加乙酸乙酯分3次萃取，每次乙酸乙酯用量為濃縮液體積的3-5倍，收集石油醚相，濃縮干燥，得到姜葉三七脂溶性成分提取物。所述濃縮液加水飽和正丁醇分3次萃取，每次水飽和正丁醇用量為濃縮液體積的3-5倍，收集水飽和正丁醇相，濃縮干燥，得到姜葉三七脂溶性成分提取物。本發(fā)明公開了姜葉三七揮發(fā)油組合物在制備治療和/或預(yù)防肝癌藥物的應(yīng)用，所述姜葉三七揮發(fā)油中含有活性成份，該活性成份由姜葉三七提取的姜葉三七揮發(fā)油活性成份組成，其中包括單萜類化合物，單萜氧化物類化合物，倍半萜類化合物，倍半萜氧化物類化合物。優(yōu)選地，所述的姜葉三七揮發(fā)油活性成份包括：20-30重量份的3,6,7,8-四氫化-3,3,6,6-四甲基環(huán)戊二烯并[E]茚-1(2H)-酮，8-20重量份的莰烯；6-15重量份的1,7,7-三甲基-二環(huán)[2.2.1]庚-2-茨酮，2-8重量份的香樹烯；1-6重量份的氧化石竹烯。更優(yōu)選地，所述的姜葉三七揮發(fā)油活性成份含量包括：24-28重量份的3,6,7,8-四氫化-3,3,6,6-四甲基環(huán)戊二烯并[E]茚-1(2H)-酮，11-15重量份的莰烯；8-12重量份的1,7,7-三甲基-二環(huán)[2.2.1]庚-2-茨酮，3-6重量份的香樹烯；2-5重量份的氧化石竹烯。申請(qǐng)人還提供了一種制備所述姜葉三七揮發(fā)油的方法，它包括如下步驟：取姜葉三七粉碎成粗粉，加入藥材總重量3-7倍的蒸餾水浸泡0.5-3小時(shí)，通過水蒸汽蒸餾提取3-6小時(shí)，收集上層精油，得姜葉三七揮發(fā)油。優(yōu)選地，姜葉三七揮發(fā)油的制備包括以下步驟：取姜葉三七粉碎，加藥材總重量5倍的蒸餾水浸泡1h，通過水蒸汽蒸餾提取4h，收集上層精油得姜葉三七揮發(fā)油組合物?；谏鲜鼋~三七提取物、姜葉三七脂溶性提取物、姜葉三七揮發(fā)油，本發(fā)明的目的是提供以上組合物的一種新用途，即在制備治療和/或預(yù)防肝癌藥物的應(yīng)用。它可以制成注射液、注射用粉針劑，注射用凍干粉針劑、片劑、丸劑、散劑、顆粒劑、合劑、糖漿劑、膠囊劑、滴丸劑制劑，優(yōu)選制成注射液、注射用凍干粉針劑。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學(xué)領(lǐng)域的常規(guī)方法制備。以下是本發(fā)明中藥制劑的藥材來源：姜葉三七：姜科植物姜葉三七Stahlianthusinvolucratus(KingexBak.)Craib的根狀莖及塊根。本發(fā)明公開了姜葉三七在治療肝癌中的新用途，姜葉三七原植物和常規(guī)工藝提取物對(duì)于治療肝癌有一定的治療效果，結(jié)果可見實(shí)驗(yàn)例1和實(shí)驗(yàn)例2，并且，姜葉三七毒性小，不會(huì)產(chǎn)生諸如化療之類的強(qiáng)烈副作用。姜葉三七的揮發(fā)油提取物具有更加出色的療效，如實(shí)驗(yàn)例所示的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，其濃度在120μg/ml時(shí)，就已經(jīng)具有了明顯的活性，在12小時(shí)的時(shí)候?qū)Ω伟┘?xì)胞的抑制率超過了對(duì)照藥物組，即姜葉三七的揮發(fā)油抑制腫瘤活性的效力高于順鉑組，而其濃度在360μg/ml以上時(shí)，其殺滅癌細(xì)胞的活性更是能夠超過90％。附圖說明圖1是姜葉三七揮發(fā)油對(duì)肝癌細(xì)胞株(HepG2)增殖抑制率線圖圖2是姜葉三七揮發(fā)油對(duì)肝癌細(xì)胞株HepG2凋亡的形態(tài)變化圖3是姜葉三七揮發(fā)油對(duì)HepG2細(xì)胞周期的影響圖4是姜葉三七揮發(fā)油對(duì)肝癌細(xì)胞株(HepG2)早期凋亡AnnexinV-PI雙染色法熒光散點(diǎn)圖圖5是姜葉三七揮發(fā)油對(duì)肝癌細(xì)胞株(HepG2)凋亡率條形圖具體實(shí)施方式下面通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。應(yīng)該理解的是，本發(fā)明的實(shí)施例是用于說明本發(fā)明而不是對(duì)本發(fā)明的限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行的簡單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。除非另有說明，本發(fā)明中的百分?jǐn)?shù)是重量百分?jǐn)?shù)(乙醇為體積百分比)。實(shí)施例1：姜葉三七揮發(fā)油取新鮮姜葉三七150g粉碎成粗粉，加藥材450ml的蒸餾水浸泡0.5h，通過水蒸汽蒸餾提取3h，收集上層精油，得姜葉三七揮發(fā)油1.7ml。對(duì)所得姜葉三七揮發(fā)油進(jìn)行檢測(cè)，成分含量結(jié)果：3,6,7,8-四氫化-3,3,6,6-四甲基環(huán)戊二烯并[E]茚-1(2H)-酮為24％，莰烯為15％；1,7,7-三甲基-二環(huán)[2.2.1]庚-2-茨酮為12％，香樹烯為3％；氧化石竹烯為2％。實(shí)施例2：姜葉三七揮發(fā)油取新鮮姜葉三七根莖150g粉碎，加750ml的蒸餾水浸泡1h，通過水蒸汽蒸餾提取4h，收集上層精油，得姜葉三七揮發(fā)油組合物2.2ml。對(duì)所得姜葉三七揮發(fā)油進(jìn)行檢測(cè)，成分含量結(jié)果：3,6,7,8-四氫化-3,3,6,6-四甲基環(huán)戊二烯并[E]茚-1(2H)-酮為28％，莰烯為11％；1,7,7-三甲基-二環(huán)[2.2.1]庚-2-茨酮為8％，香樹烯為6％；氧化石竹烯為5％。實(shí)施例3：姜葉三七揮發(fā)油取姜葉三七干燥根莖150g粉碎，加1050ml蒸餾水浸泡3h，通過水蒸汽蒸餾提取6h，收集上層精油，得姜葉三七揮發(fā)油組合物2.0ml。對(duì)所得姜葉三七揮發(fā)油進(jìn)行檢測(cè)，成分含量結(jié)果：3,6,7,8-四氫化-3,3,6,6-四甲基環(huán)戊二烯并[E]茚-1(2H)-酮為30％，莰烯為20％；1,7,7-三甲基-二環(huán)[2.2.1]庚-2-茨酮為15％，香樹烯為2％；氧化石竹烯為1％。實(shí)施例4：姜葉三七脂溶性成分提取物取姜葉三七根莖5000g切碎，加石油醚回流提取2次，第一次加入20000ml石油醚，提取2小時(shí)，第二次加入15000ml石油醚提取2小時(shí)，合并提取液，過濾，回收石油醚，得姜葉三七脂溶性成分提取物。實(shí)施例5：姜葉三七脂溶性成分提取物取姜葉三七根莖5000g切碎，加石油醚回流提取3次，第一次加入25000ml石油醚，提取3小時(shí)，第二次加入20000ml石油醚提取2小時(shí)，第三次加入15000ml石油醚提取時(shí)間為1小時(shí)，合并提取液，過濾，回收石油醚，得姜葉三七脂溶性成分提取物。實(shí)施例6：姜葉三七脂溶性成分提取物取姜葉三七根莖5000g切碎，加乙酸乙酯回流提取3次，第一次加入25000ml乙酸乙酯，提取3小時(shí)，第二次加入20000ml乙酸乙酯提取2小時(shí)，第三次加入15000ml乙酸乙酯，提取時(shí)間為1小時(shí)，合并提取液，過濾，回收乙酸乙酯，得姜葉三七脂溶性成分提取物。實(shí)施例7：姜葉三七脂溶性成分提取物取姜葉三七根莖5000g切碎，加水飽和正丁醇回流提取3次，第一次加入25000ml水飽和正丁醇，提取3小時(shí)，第二次加入20000ml水飽和正丁醇提取2小時(shí)，第三次加入15000ml水飽和正丁醇提提取時(shí)間為1小時(shí)，合并提取液，過濾，回收水飽和正丁醇，得姜葉三七脂溶性成分提取物。實(shí)施例8：姜葉三七脂溶性成分提取物取姜葉三七干燥根莖5000g切碎，加入乙醇回流提取2次，第一次加入25000ml體積百分比為40％的乙醇，提取3小時(shí)，第二次加入15000ml體積百分比為50％的乙醇提取2小時(shí)，合并提取液，過濾，回收乙醇，濃縮液加石油醚分3次萃取，每次石油醚用量分別為濃縮液體積的5倍、4倍、3倍，收集石油醚相，濃縮干燥，得到姜葉三七脂溶性成分提取物。實(shí)施例9：姜葉三七脂溶性成分提取物取姜葉三七干燥根莖5000g切碎，加入乙醇回流提取3次，第一次加入20000ml體積百分比為30％的乙醇，提取3小時(shí)，第二次加入15000ml體積百分比為40％的乙醇提取2小時(shí)，第三次加入10000ml體積百分比為50％的乙醇提取1小時(shí)，合并提取液，過濾，回收乙醇，濃縮液加乙酸乙酯分3次萃取，每次乙酸乙酯用量分別為濃縮液體積的5倍、4倍、3倍，收集乙酸乙酯相，濃縮干燥，得到姜葉三七脂溶性成分提取物。實(shí)施例10：姜葉三七脂溶性成分提取物取姜葉三七干燥根莖5000g切碎，加入乙醇回流提取3次，第一次加入20000ml體積百分比為30％的乙醇，提取3小時(shí)，第二次加入15000ml體積百分比為40％的乙醇提取2小時(shí)，第三次加入10000ml體積百分比為50％的乙醇提取1小時(shí)，合并提取液，過濾，回收乙醇，濃縮液加水飽和正丁醇分3次萃取，每次水飽和正丁醇用量分別為濃縮液體積的5倍、4倍、3倍，收集水飽和正丁醇相，濃縮干燥，得到姜葉三七脂溶性成分提取物。實(shí)施例11：姜葉三七水提物取新鮮姜葉三七根莖1000g切碎，第一次加6000ml煎煮，沸騰后保持3h，第二次加4000ml水煎煮提取1h。合并兩次煎液，過濾，濃縮至2000ml，得姜葉三七水提物。實(shí)施例12：姜葉三七脂溶性成分提取物取新鮮姜葉三七根莖1000g切碎，加乙醇回流提取2次，第一次加入6倍體積百分比為70％的乙醇，提取3小時(shí)，第二次加入4倍量體積百分比為40％的乙醇提取1小時(shí)，合并煎液，過濾，回收乙醇，制成干膏，即得姜葉三七脂溶性成分提取物。實(shí)施例13：姜葉三七揮發(fā)油注射液將實(shí)施例1-3中的姜葉三七揮發(fā)油與葡萄糖、適量助溶劑、適量溶劑混合均勻，濾過，滅菌，制備得到注射液。實(shí)施例14：姜葉三七揮發(fā)油凍干粉針劑將實(shí)施例1-3中的姜葉三七揮發(fā)油與葡萄糖、適量助溶劑、適量溶劑混合均勻，滅菌，分裝于安瓿或西林瓶等容器中，在無菌密閉環(huán)境中，低溫下凍結(jié)，再通過降低環(huán)境氣壓，緩慢升高制品溫度的方法使制品中的溶媒升華，留下固體形態(tài)的藥物，即得本發(fā)明的凍干粉針。實(shí)施例15：姜葉三七揮發(fā)油取姜葉三七干燥根莖150g粉碎，加600ml蒸餾水浸泡2h，通過水蒸汽蒸餾提取5h，收集上層精油，得姜葉三七揮發(fā)油組合物1.9ml。對(duì)所得姜葉三七揮發(fā)油進(jìn)行檢測(cè)，成分含量結(jié)果：3,6,7,8-四氫化-3,3,6,6-四甲基環(huán)戊二烯并[E]茚-1(2H)-酮為20％，莰烯為8％；1,7,7-三甲基-二環(huán)[2.2.1]庚-2-茨酮為6％，香樹烯為8％；氧化石竹烯為6％。藥效實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)例1本發(fā)明對(duì)肝癌細(xì)胞增殖抑制作用取實(shí)施例2、5、6、7、11、12中的姜葉三七揮發(fā)油組合物、石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、水飽和正丁醇提取物、水提物和乙醇提取物，用RPMI1640培養(yǎng)液將上述提取物進(jìn)行稀釋，0.22μm微孔濾器抽濾除菌，4℃保存?zhèn)溆?。以MTT法檢測(cè)本發(fā)明對(duì)肝癌細(xì)胞增殖抑制作用。1試樣及實(shí)驗(yàn)藥物1.1肝癌細(xì)胞培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞(HepG2)用含10％胎牛血清及100μg/ml青霉素-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，置37℃、5％CO2、飽和濕度條件下的恒溫密閉培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并傳代。0.02EDTA-0.25％胰蛋白酶消化，每2～3d傳代一次。1.2實(shí)驗(yàn)藥物實(shí)驗(yàn)組：實(shí)施例2、5、6、7、11、12。對(duì)比例藥物：順鉑，生產(chǎn)廠家德州德藥制藥有限公司；批號(hào)：國藥準(zhǔn)字H37020524；濃度3μg/ml。2MTT法檢測(cè)姜葉三七提取物對(duì)肝癌細(xì)胞增殖抑制作用表1本發(fā)明實(shí)施例和順鉑對(duì)肝癌細(xì)胞增殖的抑制率實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：實(shí)施例2對(duì)肝癌細(xì)胞增殖抑制作用明顯強(qiáng)于其他實(shí)施例組和順鉑組；各實(shí)施例組與順鉑組相比，對(duì)肝癌細(xì)胞增殖抑制作用有弱有強(qiáng)，但是均體現(xiàn)對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖有抑制作用。由以上可得結(jié)論：1、姜葉三七揮發(fā)油對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用明顯優(yōu)于姜葉三七經(jīng)其他提取方法獲得的提取物，以及明顯優(yōu)于順鉑。。2、姜葉三七石油醚提取物、乙酸乙酯提取物對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用優(yōu)于姜葉三七水飽和正丁醇提取物、姜葉三七水提物、姜葉三七乙醇提取物以及順鉑。3、姜葉三七水提物、乙醇提取物以及水飽和正丁醇提取物對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用與順鉑組相比較差，但同樣能顯示出對(duì)肝癌細(xì)胞增殖有抑制作用。實(shí)驗(yàn)例2姜葉三七揮發(fā)油體外抗肝癌腫瘤活性實(shí)驗(yàn)1儀器與試藥1.1儀器揮發(fā)油測(cè)定器符合中國藥典一部附錄XD揮發(fā)油測(cè)定法的有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)；Galaxy170S型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(德國Eppendorf公司)，MLDEL680型酶標(biāo)儀(日本BIO-RAD公司)，Axiovert-40型倒置相差顯微鏡(德國蔡司公司)，SW-CJ-2F型超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)。1.2試劑胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基均購自美國hyclone公司；DMSO、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)均購自Sigma公司；乙醚等其他試劑均為國產(chǎn)分析純。1.3實(shí)驗(yàn)藥物實(shí)驗(yàn)組：實(shí)施例1，姜葉三七揮發(fā)油。對(duì)比例藥物：順鉑，生產(chǎn)廠家德州德藥制藥有限公司；批號(hào)：國藥準(zhǔn)字H37020524；濃度3μg/ml。1.4供試肝癌細(xì)胞人肝癌細(xì)胞(HepG2)由桂林醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。2方法與結(jié)果2.1方法2.1.1藥物配制用RPMI1640培養(yǎng)液將實(shí)施例1所得的揮發(fā)油提取物(20mg/mL)按1:10、1:13、1:20、1:40比例進(jìn)行稀釋，0.22μm微孔濾器抽濾除菌，4℃保存?zhèn)溆谩?.1.2實(shí)驗(yàn)分組：A：空白對(duì)照組B：120μg/ml姜葉三七揮發(fā)油組C：240μg/ml姜葉三七揮發(fā)油組D：360μg/ml姜葉三七揮發(fā)油組E：480μg/ml姜葉三七揮發(fā)油組2.1.3腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞(HepG2)用含10％胎牛血清及100μg/ml青霉素-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，置37℃、5％CO2、飽和濕度條件下的恒溫密閉培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并傳代。0.02EDTA-0.25％胰蛋白酶消化，每2～3d傳代一次。2.1.4MTT法檢測(cè)本發(fā)明藥物對(duì)肝癌細(xì)胞增殖抑制作用將對(duì)數(shù)生長期的肝癌細(xì)胞按每孔4000個(gè)接種96孔培養(yǎng)板，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h，24h，36h，48h，60h待細(xì)胞貼壁后，將不同濃度姜葉三七揮發(fā)油分別加入細(xì)胞株已長成單層的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)濃度重復(fù)5個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)立兩個(gè)對(duì)照組：一個(gè)為空白對(duì)照組(不加細(xì)胞)，一個(gè)為細(xì)胞對(duì)照組(加1640培養(yǎng)液，姜葉三七揮發(fā)油的濃度為0)。置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束前4h，吸棄培養(yǎng)板中液體，PBS沖洗3次，在避光條件下每孔加入MTT(5mg/ml)20μl，置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h，去上清液后每孔加DMSO150μl，水平搖床震蕩10min，酶標(biāo)讀數(shù)儀比色(波長490nm)測(cè)吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。按以下公式計(jì)算實(shí)驗(yàn)藥物和對(duì)照藥物對(duì)肝癌細(xì)胞(HepG2)的抑制作用。細(xì)胞抑制率(％)＝(1-藥物作用組吸光度值/細(xì)胞對(duì)照組吸光度值)×100％。2.1.5Hoechst33258染色觀察細(xì)胞形態(tài)取浸泡于70％乙醇中的潔凈蓋玻片，置于六孔板內(nèi)，設(shè)置A組(空白對(duì)照組)，B組(120μg/ml)C組(240μg/ml)，D組(360μg/ml)，無菌超凈臺(tái)內(nèi)用無菌的PBS三遍，再用細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌一遍。取對(duì)數(shù)生長期不同肝癌細(xì)胞(HepG2))，每孔接種5ｘ104個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)過夜。經(jīng)不同濃度姜葉三七揮發(fā)油處理24h后，吸盡培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，加入0.5ml固定液，固定30分鐘。去固定液，用PBS洗2遍，每次3分鐘，吸盡液體。加入0.5mlHoechst33258染色液，染色10分鐘。去染色液，用PBS洗2遍，每次3分鐘，吸盡液體。滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細(xì)胞的蓋玻片，讓細(xì)胞接觸封片液，盡量避免氣泡。用的熒光激發(fā)波長350nm左右，發(fā)射波長460nm左右，在熒光顯微鏡下可檢測(cè)到呈藍(lán)色的細(xì)胞核。2.1.6流式細(xì)胞儀檢測(cè)揮發(fā)油對(duì)肝癌細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡的影響人肝癌細(xì)胞(HepG2)分為四組：A組(空白對(duì)照組)、B組(120μg/ml)C組(240μg/ml)，D組(360μg/ml)，經(jīng)處理后，收集所有細(xì)胞(貼壁及懸浮細(xì)胞)后用PBS清洗一次，每組分別加入100μlbuffer，吹打均勻，再分別加入3μlPI和3μAnnexin-V，避光染色1小時(shí)，加入200μlbuffer，200目濾網(wǎng)過濾細(xì)胞，收集于流式細(xì)胞儀上樣管內(nèi)。使用488nm激光作為激發(fā)波長，525nm作為檢測(cè)波長，在流式細(xì)胞儀上對(duì)每個(gè)樣品中1萬個(gè)細(xì)胞采集熒光強(qiáng)度數(shù)據(jù)。2.1.7流式細(xì)胞儀檢測(cè)肝癌細(xì)胞的周期取對(duì)數(shù)生長期不同肝癌細(xì)胞(HepG2)分為A組(空白對(duì)照組)，B組(120μg/ml)C組(240μg/ml)，D組(360μg/ml)經(jīng)不同處理后，于15ml離心管中收集所有細(xì)胞(貼壁及懸浮細(xì)胞)后用PBS清洗一次，每組分別加入1mL預(yù)冷PBS重懸，吹打均勻。將離心管放置于渦旋震蕩器上，邊震蕩邊加入9ml70％冰凍乙醇固定，放置-20℃過夜。染色前用預(yù)冷PBS洗滌,離心(2000r/min，4℃)5min，去除固定液，用500μLRNaseA消化，37℃水浴30min，再加入25μL碘化丙啶(propdiumiodide，PI)染色液混勻，室溫避光染色30min，200目濾網(wǎng)過濾細(xì)胞，收集于流式細(xì)胞儀上樣管內(nèi)。流式細(xì)胞儀進(jìn)行DNA含量和細(xì)胞周期分析,得出細(xì)胞各周期階段的百分率。2.1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS17.0錄入和分析數(shù)據(jù)，多組間資料比較采用單因素方差分析(One-WayANOVA)檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有顯著性。2.2結(jié)果2.2.1本發(fā)明對(duì)肝癌細(xì)胞生長抑制作用采用MTT實(shí)驗(yàn)分析實(shí)驗(yàn)藥物對(duì)人肝癌細(xì)胞(HepG2)增殖的影響，結(jié)果如表2及圖1所示：表2：不同時(shí)間人肝癌細(xì)胞株(HepG2)增殖抑制率(％，n＝3)注：*：實(shí)施例組與順鉑組(陽性對(duì)照組)比較，P值<0.05，即實(shí)施例組與順鉑組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，由其抑制率分析可知，實(shí)施例組對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制率高于順鉑組，說明實(shí)施例組的抗肝癌細(xì)胞活性要高于順鉑組。對(duì)表2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析后可知，在作用24小時(shí)后，本發(fā)明揮發(fā)油物對(duì)人肝癌細(xì)胞(HepG2)的IC50為198μg/ml。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：本發(fā)明的揮發(fā)油對(duì)人肝癌細(xì)胞株(HepG2)具有顯著的抑制作用，其效果明顯優(yōu)于對(duì)照藥物順鉑組。并且隨作用時(shí)間的延長和藥物濃度的增加，其抑制作用逐漸增強(qiáng)，表現(xiàn)出明顯的量-效和時(shí)-效關(guān)系。2.2.2Hoechst33258染色觀察細(xì)胞形態(tài)Hoehst33258染色法觀察細(xì)胞核形態(tài)變化，結(jié)果如圖2所示，A組細(xì)胞核形態(tài)完整，核膜光滑，染色質(zhì)均勻，部分可見分裂期細(xì)胞核的形態(tài)變化；B組、C組、D組均可見凋亡期細(xì)胞核的形態(tài)變化，即核膜消失，核邊沿呈毛刺狀，核染色加深，部分細(xì)胞核固縮、碎裂成核膜包裹著的碎塊，呈顆粒狀，形成凋亡小體，出現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)(如箭頭所示)。在同等數(shù)量細(xì)胞接種后，隨藥物劑量的增加，不同劑量濃度實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞數(shù)也明顯減少，間接說明姜葉三七揮發(fā)油對(duì)肝癌細(xì)胞株凋亡的作用隨劑量增加而逐漸增強(qiáng)。2.2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)姜葉三七揮發(fā)油組合物對(duì)不同肝癌細(xì)胞周期的影響流式細(xì)胞術(shù)(FCM)結(jié)果如圖3及表3顯示：不同質(zhì)量濃度姜葉三七揮發(fā)油作用人肝癌細(xì)胞(HepG2)24h后，與A組(空白組)比較，B、C、D組(低中劑量組)細(xì)胞數(shù)量的變化：圖3和表3說明，在HepG2細(xì)胞中，B、C、D組中G0/G1期細(xì)胞增多，S期和G2/M期細(xì)胞減少，顯示姜葉三七揮發(fā)油可有效抑制細(xì)胞周期的正常轉(zhuǎn)換，使細(xì)胞在G1期堆積，細(xì)胞阻滯于G1期，從而阻止細(xì)胞的有絲分裂，使細(xì)胞增殖受到抑制。表3：姜葉三七揮發(fā)油對(duì)HepG2細(xì)胞周期的影響(％)2.2.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)肝癌細(xì)胞的凋亡經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)姜葉三七揮發(fā)油作用24小時(shí)后，人肝癌細(xì)胞(HepG2)的凋亡率如圖4、圖5所示，可觀察到隨姜葉三七揮發(fā)油濃度的增加，人肝癌細(xì)胞(HepG2)發(fā)生凋亡的比例逐漸增加。對(duì)HepG2凋亡的影響中，各組與空白對(duì)照比較P＝0.00<0.01，具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。B、C兩組的凋亡率無明顯區(qū)別，D組凋亡率急劇上升，絕大多數(shù)凋亡的細(xì)胞仍處于早期凋亡。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：姜葉三七揮發(fā)油低、中、高劑量組均對(duì)HepG2腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)出明顯的影響作用，可有效抑制細(xì)胞周期的正常轉(zhuǎn)換，使細(xì)胞在G1期堆積，細(xì)胞阻滯于G1期，阻止細(xì)胞的有絲分裂，使細(xì)胞增殖受到抑制，從而達(dá)到抗HepG2腫瘤活性作用。