本發(fā)明涉及中藥提取物領(lǐng)域,具體涉及一種地衣提取物及含有該提取物的藥物制劑,該地衣提取物可以應(yīng)用于糖尿病的治療。
背景技術(shù):
地衣是低等植物的重要類群,為菌藻共生體。其中的共生菌以子囊菌為主,少數(shù)為擔(dān)子菌,共生藻為藍(lán)藻或綠藻。由于地衣的生物學(xué)特性主要是菌藻共生體中真菌的體現(xiàn),故又稱為地衣型真菌。地衣被認(rèn)為是生物互惠共生現(xiàn)象中最完善的典型。全世界已知地衣500多個屬,26000多個種,我國有232屬1766種。地衣入藥在我國具有悠久的歷史,《詩經(jīng)》中就有關(guān)于松蘿藥用的記載。據(jù)各種本草及有關(guān)資料記載,約有200種地衣入藥。
地衣是真菌和藻類高度結(jié)合的共生復(fù)合體,由于地衣共生的特殊性,其含有的初生代謝產(chǎn)物(多糖類)和次生代謝產(chǎn)物(酚酸類)構(gòu)成了天然有機(jī)化合物獨(dú)特的類群。近幾年從地衣植物中分離得到了許多具有活性的新化合物,包括:地衣多糖、地衣酸(縮酚酸類、縮酚酸環(huán)醚類、縮酚酮類和二苯并呋喃類)和醌類等其他成分。
地衣入藥在我國已有悠久的歷史,早在公元前600年西周時期的《詩經(jīng)》中,就有松蘿的記載;南北朝梁·陶弘景所著的《名醫(yī)別錄》中記載石濡(石蕊)“可明目,益精氣”;李時珍的《本草綱目》中記述了多種地衣的形態(tài)、習(xí)性及藥效,如“女蘿(松蘿)能療痰熱溫虐,可為吐湯,利水道”,“石濡有生津利咽、解熱化痰”。近年藥理研究發(fā)現(xiàn),地衣具有抗腫瘤、抗病毒、抗輻射、抗菌、抗氧化等多方面的生物活性。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
本發(fā)明的目的在于提供一種地衣提取物,其制備方法和液相分析方法,含有該提取物的藥物制劑及利用該提取物制備治療糖尿病的藥物的用途。
本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的:
一種地衣提取物,該提取物由以下方法制備:
(a)將干燥的地衣用75%乙醇溶液熱回流提取,合并提取液,濃縮至無醇味得到乙醇提取濃縮液;(b)將步驟(a)所得乙醇提取濃縮液用水稀釋,依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取,減壓濃縮,分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物;(c)正丁醇萃取物用水溶解,過濾,用大孔樹脂富集活性成分,先用10%乙醇沖洗10個柱體積除去大極性成分,再用65%乙醇洗脫12個柱體積,收集65%洗脫液,減壓濃縮,即得地衣提取物。
進(jìn)一步地,步驟(c)中所述大孔樹脂為AB-8型大孔樹脂。
為了能夠通過建立HPLC指紋圖譜的方法控制不同批次制備的地衣提取物的批間差異,所述地衣提取物的液相分析方法為:
色譜柱:Diamonsil C18柱(4.6mm×250mm,5μm);
流動相:A為乙腈,B為0.1%磷酸溶液(三乙胺調(diào)節(jié)pH值至6.2);
梯度洗脫程序:0.01~70min,A 20%→80%;
流動相流速:1.0mL·min-1;
檢測波長:240nm;
柱溫:30℃;
進(jìn)樣量:10μL。
藥物制劑,含有治療有效量的所述地衣提取物和藥學(xué)上可接受的載體。
所述的地衣提取物在制備治療糖尿病的藥物中的應(yīng)用。
所述的藥物制劑在制備治療糖尿病的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明提取物用作藥物時,可以直接使用,或者以藥物制劑的形式使用。
所述藥物制劑含有治療有效量的本發(fā)明地衣提取物,其余為藥物學(xué)上可接受的、對人和動物無毒和惰性的可藥用載體和/或賦形劑。
所述的可藥用載體或賦形劑是一種或多種選自固體、半固體和液體稀釋劑、填料以及藥物制品輔劑。將本發(fā)明的藥物制劑以單位體重服用量的形式使用。本發(fā)明提取物可通過口服或注射的形式施用于需要治療的患者。用于口服時,可將其制成片劑、緩釋片、控釋片、膠囊、滴丸、微丸、混懸劑、乳劑、散劑或顆粒劑、口服液等;用于注射時,可制成滅菌的水性或油性溶液、無菌粉針、脂質(zhì)體或乳劑等。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):本發(fā)明通過對地衣進(jìn)行提取、除雜、富集處理,能得到具有糖尿病治療作用的提取物;本發(fā)明提供的液相分析方法可以用于建立該提取物的指紋圖譜,用于控制不同批次制備的提取物的批間差異。
附圖說明
圖1為地衣提取物HPLC液相圖譜。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容,但并不以此限定本發(fā)明保護(hù)范圍。盡管參照較佳實(shí)施例對本發(fā)明作了詳細(xì)說明,本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解,可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換,而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。
實(shí)施例1:地衣提取物制備
藥材來源:地衣購自安徽亳州中藥材市場,產(chǎn)地陜西。
主要試劑:食品級乙醇購自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司;醫(yī)藥級AB-8大孔樹脂購自天津波鴻樹脂有限公司;乙腈為HPLC級,購于TEDIA;85%磷酸為HPLC級,購于TEDIA;色譜用純凈水為哇哈哈純凈水。
制備方法:將10kg干燥的地衣用75%乙醇溶液熱回流提取(25L×3次),合并提取液,濃縮至無醇味得到乙醇提取濃縮液(3L);將所得乙醇提取濃縮液用水稀釋至4L,依次用石油醚(4L×3次)、乙酸乙酯(4L×3次)和水飽和的正丁醇(4L×3次)萃取,減壓濃縮,分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物275g;(c)正丁醇萃取物用1L水溶解,醫(yī)用脫脂棉過濾,用AB-8大孔樹脂(2kg,柱體積1.5L)富集活性成分,先用10%乙醇沖洗10個柱體積(15L)除去大極性成分,再用65%乙醇洗脫12個柱體積(18L),收集65%洗脫液,減壓濃縮,即得地衣提取物115g。
實(shí)施例2:液相色譜分析
供試品溶液配制:取實(shí)施例1方法制得的地衣提取物5mg至50mL棕色容量瓶中,加30mL 20%乙腈水溶液超聲溶解,冷卻至室溫后,繼續(xù)加20%乙腈水溶液定容。
分析方法:
高效液相色譜儀:Agilent 1260,二元泵;
色譜柱:Diamonsil C18柱(4.6mm×250mm,5μm);
流動相:A為乙腈,B為0.1%磷酸溶液(三乙胺調(diào)節(jié)pH值至6.2);
梯度洗脫程序:0.01~70min,A 20%→80%;
流動相流速:1.0mL·min-1;
檢測波長:240nm;
柱溫:30℃;
進(jìn)樣量:10μL。
用制備的10批次的地衣提取物進(jìn)行分析,進(jìn)行色譜峰匹配,結(jié)果1~9號峰在10批樣品色譜圖中均出現(xiàn)。因此標(biāo)定9個峰為共有色譜峰,據(jù)此建立該提取物的HPLC質(zhì)量控制圖譜,結(jié)果見圖1。該10批次的提取物藥理活性相似。
實(shí)施例3:地衣提取物藥理試驗(yàn)
一、材料和方法
1、材料
(1)實(shí)驗(yàn)樣品:地衣提取物(MGC)自制。
(2)實(shí)驗(yàn)動物:雄性昆明種小白鼠,體重(22±2)g,由南京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。
(3)主要試劑:四氧嘧啶購自Sigma公司;消渴丸購自廣州中藥一廠;
血糖試劑盒購自北京中生生物工程技術(shù)公司;
SOD,GSH-Px,MDA試劑盒購自南京建成生物工程研究所;
TC,TG,HDL-C測試盒購自上??菩郎锛夹g(shù)研究所。
(4)主要儀器:Shimadzu UV-265FW紫外-可見分光光度計,日本。
2、方法
(1)實(shí)驗(yàn)性四氧嘧啶糖尿病小鼠模型的復(fù)制
四氧嘧啶配成體積分?jǐn)?shù)為2%的生理鹽水溶液。小鼠禁食24h后按200mg·kg-1劑量進(jìn)行四氧嘧啶腹腔注射,72h后用尿糖試紙檢測尿糖,用血糖測定試劑盒檢測空腹血糖,選取血糖值大于11.1mmol·L-1、尿糖呈強(qiáng)陽性(+++)的小鼠作為高血糖模型小鼠。
(2)地衣提取物對四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖的影響
實(shí)驗(yàn)型糖尿病小鼠隨機(jī)分為7組,即正常對照組(Control)、高血糖模型組(Alloxan)、陽性對照組和4個試驗(yàn)組。實(shí)驗(yàn)期間,正常對照組和高血糖組灌胃生理鹽水;4個試驗(yàn)組灌胃地衣提取物(MGC),劑量分別為50、100、300、500mg·kg-1BW;陽性對照組灌胃消渴丸(XKW),劑量為840mg·kg-1BW,試驗(yàn)期間自由飲水和攝食,試驗(yàn)期30d。末次給藥后,禁食12h,眼竇靜叢取血,分離血清作血糖和血脂指標(biāo)的檢測。處死動物后,立即取出動物的肝組織作成肝勻漿以測定超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSHPx)、丙二醛(MDA)。
(3)觀察指標(biāo)與方法
血糖(BG)的測定:各實(shí)驗(yàn)鼠禁食10h后采血,采用葡萄糖氧化酶法進(jìn)行血糖測定。
血清甘油三酯(TG)、血清總膽固醇(TC)及血清高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)測定:分離血清,按試劑盒方法進(jìn)行,以島津UV-265FW紫外-可見分光光度計比色測定。
肝超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)及丙二醛(MDA)測定:分離肝組織作成肝組織勻漿液,按試劑盒方法進(jìn)行。
(4)統(tǒng)計學(xué)處理:結(jié)果以表示。采用SAS統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析。
二、結(jié)果與分析
1、地衣提取物對實(shí)驗(yàn)性糖尿病小鼠血糖的影響
如表1所示,與高血糖模型組的血糖值相比,100、300mg·kg-1BW劑量組及XKW組明顯降低(P<0.01),500mg·kg-1BW組差異有顯著性(P<0.05),50mg·kg-1bw組差異無顯著性,表明地衣提取物(MGC)對高血糖模型小鼠具有降低血糖的作用,而且這種降糖作用以中劑量100mg·kg-1BW效果最佳,其降糖效果與消渴丸組的降糖效果相當(dāng)(P>0.01)。表1中,*P<0.05,**P<0.01vs Alloxan,△△P<0.01vs MGC100;▲▲P<0.01vs XKW。
表1地衣提取物(MGC)對高血糖模型糖尿病小鼠血糖的影響
2、地衣提取物對實(shí)驗(yàn)性糖尿病小鼠血脂的影響
糖尿病常伴隨著高脂血癥。本實(shí)驗(yàn)利用四氧嘧啶(Alloxan)復(fù)制糖尿病小鼠后,由表2所示,高血糖模型組小鼠TC和TG高于空白對照組(P<0.01),HDL-C低于空白對照組(P<0.01)。給予MGC和XKW后,各劑量組小鼠TC、TG和HDL-C有明顯恢復(fù),其中100mg·kg-1bw組的TC、TG和HDL-C與高血糖模型組比較,差異有顯著性(P<0.01);300mg·kg-1bw組和XKW組的TC均低于高血糖模型組(P<0.05),TG低于高血糖模型組(P<0.01),HDL-C高于高血糖模型組(P<0.01);100mg·kg-1bw組對糖尿病小鼠血脂的調(diào)節(jié)作用與XKW組相當(dāng),兩組的TC、TG、HDL-C含量差異均無顯著性(P>0.01)。結(jié)果表明地衣提取物能有效促進(jìn)糖尿病小鼠血脂水平的恢復(fù)。表2中,*P<0.05,**P<0.01vs Alloxan;△P<0.05,△△P<0.01vs MGC100。
表2地衣提取物對實(shí)驗(yàn)性糖尿病小鼠血脂的影響
3、地衣提取物對實(shí)驗(yàn)性糖尿病小鼠抗氧化能力的影響
機(jī)體的SOD、GSH-Px和MDA含量是評價其抗氧化能力的重要指標(biāo)。由表3所示,與正常組相比,高血糖模型組SOD、GSH-Px活性降低(P<0.01),MDA含量上升,表明高血糖模型小鼠的抗氧化能力明顯低于正常小鼠。但給予MGC和XKW后,各劑量組小鼠SOD、GSH-Px和MDA有明顯恢復(fù),其中100、300mg·kg-1bw組及XKW組SOD活性與高血糖模型組比較差異有顯著性(P<0.05),GSH-Px活性與高血糖模型組比較差異有顯著性(P<0.01),MDA含量降低(P<0.01)。100、300mg·kg-1bw組的SOD含量與XKW組差異無顯著性(P>0.01),100mg·kg-1bw組的GSH-Px、MDA含量與XKW組差異無顯著性(P>0.01)。結(jié)果表明地衣提取物能有效促進(jìn)糖尿病小鼠肝臟抗氧化能力的恢復(fù),其中100mg·kg-1bw對糖尿病小鼠肝臟抗氧化能力的恢復(fù)作用與XKW相當(dāng)。表3中,*P<0.05,**P<0.01vs Alloxan;△P<0.05,△△P<0.01vs MGC100。
表3地衣提取物對實(shí)驗(yàn)性糖尿病小鼠抗氧化能力的影響
實(shí)施例4:片劑的制備
按實(shí)施例1方法先制得提取物,按其與賦形劑重量比為1:10的比例加入賦形劑,制粒壓片。
實(shí)施例5:口服液的制備
按實(shí)施例1方法先制得提取物,按常規(guī)口服液制法制成口服液。
實(shí)施例6:膠囊劑或顆粒劑的制備
按實(shí)施例1方法先制得提取物,按其與賦形劑重量比為1:9的比例加入賦形劑,制成膠囊或顆粒劑。
實(shí)施例7:注射液的制備
按實(shí)施例1方法制得提取物,加注射用水,精濾,灌封滅菌制成注射液。
實(shí)施例8:無菌粉針的制備
按實(shí)施例1方法先制得提取物,溶于無菌注射用水中,攪拌使溶,用無菌抽濾漏斗過濾,再無菌精濾,分裝于安瓿,低溫冷凍干燥后無菌熔封得粉針劑。