本發(fā)明涉及姜葉三七、姜葉三七提取物、姜葉三七脂溶性提取物及姜葉三七揮發(fā)油的新用途，即在制備治療和/或預防鼻咽癌藥物方面的新用途。

背景技術：
鼻咽癌是指發(fā)生于鼻咽腔頂部和側壁的惡性腫瘤。是我國高發(fā)惡性腫瘤之一，發(fā)病率為耳鼻咽喉惡性腫瘤之首。常見臨床癥狀為鼻塞、涕中帶血、耳悶堵感、聽力下降、復視及頭痛等。鼻咽癌大多對放射治療具有中度敏感性，放射治療是鼻咽癌的首選治療方法。但是對較高分化癌，病程較晚以及放療后復發(fā)的病例，手術切除和化學藥物治療亦屬于不可缺少的手段。大量的研究證實，腫瘤是一類細胞周期疾病，腫瘤的特征之一是細胞周期異常，使腫瘤細胞無限增殖，細胞周期的任何一個時相的生物合成被阻斷，都可使細胞周期的連續(xù)性中斷，腫瘤治療的中心環(huán)節(jié)就是阻斷腫瘤細胞的細胞周期，誘導細胞凋亡。細胞凋亡發(fā)生于所有的腫瘤組織中，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉移密切相關?；熕幬镏饕ㄟ^誘導癌細胞凋亡達到治療效果，因此，誘導腫瘤細胞凋亡成為研究腫瘤治療的熱點。細胞凋亡的特征是細胞體積縮小，隨即與鄰近的細胞的連接喪失，彼此脫離，失去微絨毛，胞漿濃縮，內質網擴張呈泡狀并與細胞膜融合，線粒體無大的變化，核染色質濃縮呈半月形，染色質凝聚靠近于核膜周邊，核仁裂解，進而細胞膜內陷，形成凋亡小體，細胞凋亡的過程不導致溶酶體破裂，沒有細胞內涵物外泄，故不引起炎癥反應和次級損傷，Ca2+/Mg2+依賴核酸內切酶活性增高，使DNA降解，DNA電泳表現(xiàn)為梯狀，目前這些變化已成為判斷細胞凋亡的重要指標。但是并非意味核酸內切酶的激活是細胞凋亡過程中所必需的，在有些細胞凋亡中不一定出現(xiàn)DNA電泳呈梯狀。細胞凋亡的發(fā)生是否需要新的RNA和蛋白質的主動合成，取決于細胞類型和誘導凋亡的因素，或許某些信號途徑需要新基因的表達，而有些不需要。也有報道凋亡細胞沒有DNA降解，提示DNA降解并非細胞凋亡過程中必不可少。細胞凋亡是一個非常復雜的生理和病理過程，機體內、外多種因素可影響細胞凋亡的發(fā)生，并明顯受到分子遺傳學影響。不同的腫瘤細胞對不同藥物、或相同藥物的不同濃度敏感性不同，可以激活一種腫瘤細胞凋亡作用的物質，可能對另一種腫瘤細胞無效。比如紫杉醇主要適用于卵巢癌和乳腺癌，對肺癌、大腸癌、黑色素瘤、頭頸部癌、淋巴瘤、腦瘤也都有一定療效。而治其他的癌癥則效果不佳。總之，細胞凋亡的分子機制尚不清楚，有待于深入研究。姜葉三七為姜科植物姜葉三七Stahlianthusinvolucratus(KingexBak.)Craib的根狀莖及塊根。具清熱，利濕，止痛，解毒，止血之功效，用于淋濁，胃痛，口瘡，痔瘡，潰瘍，跌打損傷，蛇咬傷，外傷出血等癥，為廣西特色中藥材。“我國姜科藥用植物研究Ⅵ姜三七揮發(fā)油化學成分分析”(發(fā)表于《色譜》1984年第1卷第1期)，用氣液色譜和氣液色譜-質譜法對姜三七揮發(fā)油各成分進行分享和鑒定，鑒定出二氫姜三七酮、α-蒎烯、茨烯、β-蒎烯、蒈烯、檸檬烯、桉葉素、芳樟醇、樟腦、α-胡椒烯、反-丁香烯、香樹烯、γ-衣蘭油烯、杜松烯、姜三七醌等15種成分。申請?zhí)枮镃N200510098945.2“一種姜葉三七的外用藥”，公開了由姜葉三七、鉆石風、倒生蓮、滇崖爬藤、五角楓根、無腺磷木、絡石藤、乙醇組成的一種外用藥，對風濕關節(jié)痛、跌打瘀痛、跌打損傷、外傷出血、關節(jié)疼痛、筋骨扭傷疼痛、筋骨疼痛、瘀腫疼痛、腰膝疼痛、關節(jié)酸痛、外傷瘀痛、軟組織挫傷療效確切，療程更短，效果更佳。此外，公開號為CN1814229的專利申請“一種土千年健祛濕鎮(zhèn)痛藥酒”、公開號為CN1742972的專利申請“一種四葉細辛外用藥”、公開號為CN1814230的專利申請“一種山野豌豆活絡鎮(zhèn)痛藥”、公開號為CN1814228的專利申請“一種矮人陀活絡傷濕止痛膏”、公開號為CN101766729的專利申請“祛濕止痛液及穴敷治療方法”均提及姜葉三七或土田七在跌打損傷或風濕疾病方面的治療效果。在現(xiàn)有公開文獻中，或提到姜葉三七的揮發(fā)油成分，或提到姜葉三七治療跌打損傷等疾病的效果，但未見公開使用姜葉三七、姜葉三七提取物、姜葉三七脂溶性提取物及姜葉三七揮發(fā)油用于治療腫瘤、各種癌癥的效果，尚未有人公開姜葉三七可用于治療鼻咽癌，亦沒有報道公開姜葉三七對鼻咽癌細胞周期、增殖或凋亡的影響。

技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供姜葉三七植物在制備治療和/或預防鼻咽癌藥物的應用；本發(fā)明的目的是提供姜葉三七提取物在制備治療和/或預防鼻咽癌藥物的應用；本發(fā)明的目的是提供姜葉三七揮發(fā)油提取物在制備治療和/或預防鼻咽癌藥物的應用；本發(fā)明的另一目的是提供姜葉三七揮發(fā)油的制備方法。姜葉三七為姜科植物姜葉三七Stahlianthusinvolucratus(KingexBak.)Craib的根狀莖、塊根。秋末冬初葉片枯黃后采挖，除去雜質，洗凈，置沸水中稍燙，曬干。收載于《廣西中藥材標準》1990年版第8頁。姜葉三七的別名有三七姜、姜葉三七、土田七、竹葉三七、姜葉三七、雞心七、紅沙姜、尖三七、拖顛槍(壯族)、內消子、打不死等。根據發(fā)明人對姜葉三七植物、姜葉三七提取物、姜葉三七脂溶性提取物以及姜葉三七揮發(fā)油進行臨床研究和藥效學研究，發(fā)現(xiàn)姜葉三七植物、姜葉三七提取物、姜葉三七脂溶性提取物以及姜葉三七揮發(fā)油能夠通過抑制鼻咽癌細胞增殖、影響鼻咽癌細胞發(fā)生凋亡，以及影響鼻咽癌細胞周期的改變，達到抗鼻咽癌細胞活性、治療鼻咽癌的功效。在此基礎上，本發(fā)明人通過對姜葉三七揮發(fā)油的有效成分進行有目的提取及含量控制以后，使其用于治療和/或預防癌癥的效果更顯著。姜葉三七揮發(fā)油與其他姜葉三七提取物相比，對鼻咽癌細胞HEPG2更具有顯著的抑制作用，可有效抑制細胞周期的正常轉換，使細胞在G1期堆積，細胞阻滯于G1期，從而阻止細胞的有絲分裂，使細胞增殖受到抑制。本發(fā)明專利臨床應用的安全性較高，在鼻咽癌的藥物治療中不失為一種好藥，其拓寬了中藥制劑治療鼻咽癌的新方法，在不能開展介入治療的基層醫(yī)院尤為適用。因此，申請人提供姜葉三七植物、姜葉三七提取物、姜葉三七脂溶性提取物、姜葉三七揮發(fā)油用于制備治療和/或預防鼻咽癌藥物方面的新用途。本發(fā)明公開了姜葉三七提取物在制備治療和/或預防鼻咽癌藥物的應用，所述姜葉三七提取物的制備包括以下步驟：取姜葉三七根莖切碎，加水提取煎煮兩次，第一次加入藥材重量2-6倍量的水煎煮，沸騰后煮1-3小時，第二次加入藥材重量1-4倍量的水煎煮1-3小時，過濾，混合兩次煎煮液，濃縮至藥材總重量的0.5-2倍，即得。本發(fā)明公開了姜葉三七提取物在制備治療和/或預防鼻咽癌藥物的應用，所述姜葉三七提取物的制備還包括以下步驟：取姜葉三七根莖切碎，加入乙醇回流提取2-3次，第一次加入2-6倍體積百分比為40-70％的乙醇，提取1-3小時，第二次加入1-4倍量體積百分比為40-70％的乙醇提取1-3小時，合并煎液，過濾，回收乙醇，制成干膏，即得。本發(fā)明還公開了姜葉三七脂溶性成分提取物在制備治療和/或預防鼻咽癌藥物的應用，所述姜葉三七脂溶性成分提取物的制備包括以下步驟：取姜葉三七根莖切碎，加石油醚回流提取2-3次，每次加入藥材總重量3-5倍的石油醚，提取時間為1-3小時，合并提取液，過濾，回收石油醚，得姜葉三七脂溶性成分提取物。本發(fā)明公開了姜葉三七脂溶性成分提取物在制備治療和/或預防鼻咽癌藥物的應用，所述姜葉三七脂溶性成分提取物的制備還可以包括以下步驟：取姜葉三七根莖切碎，加乙酸乙酯回流提取2-3次，每次加入藥材總重量3-5倍的乙酸乙酯，提取時間為1-3小時，合并提取液，過濾，回收乙酸乙酯，得姜葉三七脂溶性成分提取物。本發(fā)明公開了姜葉三七脂溶性成分提取物在制備治療和/或預防鼻咽癌藥物的應用，所述姜葉三七脂溶性成分提取物的制備還可以包括以下步驟：取姜葉三七根莖切碎，加水飽和正丁醇回流提取2-3次，每次加入藥材總重量3-5倍的水飽和正丁醇，提取時間為1-3小時，合并提取液，過濾，回收水飽和正丁醇，得姜葉三七脂溶性成分提取物。本發(fā)明公開了姜葉三七脂溶性成分提取物在制備治療和/或預防鼻咽癌藥物的應用，所述姜葉三七脂溶性成分提取物的制備還可以包括以下步驟：取姜葉三七根莖切碎，加乙醇回流提取2-3次，每次加入藥材總重量3-5倍、體積百分比為30-50％的乙醇，提取時間為1-3小時，合并提取液，過濾，回收乙醇，得濃縮液。所述濃縮液加石油醚分3次萃取，每次石油醚用量為濃縮液體積的3-5倍，收集石油醚相，濃縮干燥，得到姜葉三七脂溶性成分提取物。所述濃縮液加乙酸乙酯分3次萃取，每次乙酸乙酯用量為濃縮液體積的3-5倍，收集石油醚相，濃縮干燥，得到姜葉三七脂溶性成分提取物。所述濃縮液加水飽和正丁醇分3次萃取，每次水飽和正丁醇用量為濃縮液體積的3-5倍，收集水飽和正丁醇相，濃縮干燥，得到姜葉三七脂溶性成分提取物。本發(fā)明公開了姜葉三七揮發(fā)油組合物在制備治療和/或預防鼻咽癌藥物的應用，所述姜葉三七揮發(fā)油中含有活性成份，該活性成份由姜葉三七提取的姜葉三七揮發(fā)油活性成份組成，其中包括單萜類化合物，單萜氧化物類化合物，倍半萜類化合物，倍半萜氧化物類化合物。優(yōu)選地，所述的姜葉三七揮發(fā)油活性成份包括：20-30重量份的3,6,7,8-四氫化-3,3,6,6-四甲基環(huán)戊二烯并[E]茚-1(2H)-酮，8-20重量份的莰烯；6-15重量份的1,7,7-三甲基-二環(huán)[2.2.1]庚-2-茨酮，2-8重量份的香樹烯；1-6重量份的氧化石竹烯。更優(yōu)選地，所述的姜葉三七揮發(fā)油活性成份含量包括：24-28重量份的3,6,7,8-四氫化-3,3,6,6-四甲基環(huán)戊二烯并[E]茚-1(2H)-酮，11-15重量份的莰烯；8-12重量份的1,7,7-三甲基-二環(huán)[2.2.1]庚-2-茨酮，3-6重量份的香樹烯；2-5重量份的氧化石竹烯。申請人還提供了一種制備所述姜葉三七揮發(fā)油的方法，它包括如下步驟：取姜葉三七粉碎成粗粉，加入藥材總重量3-7倍的蒸餾水浸泡0.5-3小時，通過水蒸汽蒸餾提取3-6小時，收集上層精油，得姜葉三七揮發(fā)油。優(yōu)選地，姜葉三七揮發(fā)油的制備包括以下步驟：取姜葉三七粉碎，加藥材總重量5倍的蒸餾水浸泡1h，通過水蒸汽蒸餾提取4h，收集上層精油得姜葉三七揮發(fā)油組合物?；谏鲜鼋~三七提取物、姜葉三七脂溶性提取物、姜葉三七揮發(fā)油，本發(fā)明的目的是提供以上組合物的一種新用途，即在制備治療和/或預防鼻咽癌藥物的應用。它可以制成注射液、注射用粉針劑，注射用凍干粉針劑、片劑、丸劑、散劑、顆粒劑、合劑、糖漿劑、膠囊劑、滴丸劑制劑，優(yōu)選制成注射液、注射用凍干粉針劑。上述各種劑型的藥物均可以按照藥學領域的常規(guī)方法制備。以下是本發(fā)明中藥制劑的藥材來源：姜葉三七：姜科植物姜葉三七Stahlianthusinvolucratus(KingexBak.)Craib的根狀莖及塊根。本發(fā)明公開了姜葉三七在治療鼻咽癌中的新用途，姜葉三七原植物和常規(guī)工藝提取物對于治療鼻咽癌有一定的治療效果，結果可見實驗例1和實驗例2，并且，姜葉三七毒性小，不會產生諸如化療之類的強烈副作用。姜葉三七的揮發(fā)油提取物具有更加出色的療效，如實驗例所示的細胞實驗，其濃度在120μg/ml時，就已經具有了明顯的活性，當濃度為240μg/ml時，作用12小時后對鼻咽癌細胞的抑制率超過了對照藥物組，即姜葉三七的揮發(fā)油抑制鼻咽癌細胞活性高于順鉑組，而其濃度在360μg/ml以上時，其殺滅鼻咽癌細胞的活性更是能夠超過90％。附圖說明圖1是姜葉三七揮發(fā)油對鼻咽癌細胞株(CNE-2)增殖抑制率線圖圖2是姜葉三七揮發(fā)油對鼻咽癌細胞株CNE-2凋亡的形態(tài)變化圖3是姜葉三七揮發(fā)油對CNE-2細胞周期的影響圖4是姜葉三七揮發(fā)油對鼻咽癌細胞株(CNE-2)早期凋亡AnnexinV-PI雙染色法熒光散點圖圖5姜葉三七揮發(fā)油對鼻咽癌細胞株(CNE-2)凋亡率條形圖具體實施方式下面通過實施例進一步說明本發(fā)明。應該理解的是，本發(fā)明的實施例是用于說明本發(fā)明而不是對本發(fā)明的限制。根據本發(fā)明的實質對本發(fā)明進行的簡單改進都屬于本發(fā)明要求保護的范圍。除非另有說明，本發(fā)明中的百分數(shù)是重量百分數(shù)(乙醇為體積百分比)。實施例1：姜葉三七揮發(fā)油取新鮮姜葉三七150g粉碎成粗粉，加藥材450ml的蒸餾水浸泡0.5h，通過水蒸汽蒸餾提取3h，收集上層精油，得姜葉三七揮發(fā)油1.7ml。對所得姜葉三七揮發(fā)油進行檢測，成分含量結果：3,6,7,8-四氫化-3,3,6,6-四甲基環(huán)戊二烯并[E]茚-1(2H)-酮為24％，莰烯為15％；1,7,7-三甲基-二環(huán)[2.2.1]庚-2-茨酮為12％，香樹烯為3％；氧化石竹烯為2％。實施例2：姜葉三七揮發(fā)油取新鮮姜葉三七根莖150g粉碎，加750ml的蒸餾水浸泡1h，通過水蒸汽蒸餾提取4h，收集上層精油，得姜葉三七揮發(fā)油組合物2.2ml。對所得姜葉三七揮發(fā)油進行檢測，成分含量結果：3,6,7,8-四氫化-3,3,6,6-四甲基環(huán)戊二烯并[E]茚-1(2H)-酮為28％，莰烯為11％；1,7,7-三甲基-二環(huán)[2.2.1]庚-2-茨酮為8％，香樹烯為6％；氧化石竹烯為5％。實施例3：姜葉三七揮發(fā)油取姜葉三七干燥根莖150g粉碎，加1050ml蒸餾水浸泡3h，通過水蒸汽蒸餾提取6h，收集上層精油，得姜葉三七揮發(fā)油組合物2.0ml。對所得姜葉三七揮發(fā)油進行檢測，成分含量結果：3,6,7,8-四氫化-3,3,6,6-四甲基環(huán)戊二烯并[E]茚-1(2H)-酮為30％，莰烯為20％；1,7,7-三甲基-二環(huán)[2.2.1]庚-2-茨酮為15％，香樹烯為2％；氧化石竹烯為1％。實施例4：姜葉三七脂溶性成分提取物取姜葉三七根莖5000g切碎，加石油醚回流提取2次，第一次加入20000ml石油醚，提取2小時，第二次加入15000ml石油醚提取2小時，合并提取液，過濾，回收石油醚，得姜葉三七脂溶性成分提取物。實施例5：姜葉三七脂溶性成分提取物取姜葉三七根莖5000g切碎，加石油醚回流提取3次，第一次加入25000ml石油醚，提取3小時，第二次加入20000ml石油醚提取2小時，第三次加入15000ml石油醚提取時間為1小時，合并提取液，過濾，回收石油醚，得姜葉三七脂溶性成分提取物。實施例6：姜葉三七脂溶性成分提取物取姜葉三七根莖5000g切碎，加乙酸乙酯回流提取3次，第一次加入25000ml乙酸乙酯，提取3小時，第二次加入20000ml乙酸乙酯提取2小時，第三次加入15000ml乙酸乙酯，提取時間為1小時，合并提取液，過濾，回收乙酸乙酯，得姜葉三七脂溶性成分提取物。實施例7：姜葉三七脂溶性成分提取物取姜葉三七根莖5000g切碎，加水飽和正丁醇回流提取3次，第一次加入25000ml水飽和正丁醇，提取3小時，第二次加入20000ml水飽和正丁醇提取2小時，第三次加入15000ml水飽和正丁醇提提取時間為1小時，合并提取液，過濾，回收水飽和正丁醇，得姜葉三七脂溶性成分提取物。實施例8：姜葉三七脂溶性成分提取物取姜葉三七干燥根莖5000g切碎，加入乙醇回流提取2次，第一次加入25000ml體積百分比為40％的乙醇，提取3小時，第二次加入15000ml體積百分比為50％的乙醇提取2小時，合并提取液，過濾，回收乙醇，濃縮液加石油醚分3次萃取，每次石油醚用量分別為濃縮液體積的5倍、4倍、3倍，收集石油醚相，濃縮干燥，得到姜葉三七脂溶性成分提取物。實施例9：姜葉三七脂溶性成分提取物取姜葉三七干燥根莖5000g切碎，加入乙醇回流提取3次，第一次加入20000ml體積百分比為30％的乙醇，提取3小時，第二次加入15000ml體積百分比為40％的乙醇提取2小時，第三次加入10000ml體積百分比為50％的乙醇提取1小時，合并提取液，過濾，回收乙醇，濃縮液加乙酸乙酯分3次萃取，每次乙酸乙酯用量分別為濃縮液體積的5倍、4倍、3倍，收集乙酸乙酯相，濃縮干燥，得到姜葉三七脂溶性成分提取物。實施例10：姜葉三七脂溶性成分提取物取姜葉三七干燥根莖5000g切碎，加入乙醇回流提取3次，第一次加入20000ml體積百分比為30％的乙醇，提取3小時，第二次加入15000ml體積百分比為40％的乙醇提取2小時，第三次加入10000ml體積百分比為50％的乙醇提取1小時，合并提取液，過濾，回收乙醇，濃縮液加水飽和正丁醇分3次萃取，每次水飽和正丁醇用量分別為濃縮液體積的5倍、4倍、3倍，收集水飽和正丁醇相，濃縮干燥，得到姜葉三七脂溶性成分提取物。實施例11：姜葉三七水提物取新鮮姜葉三七根莖1000g切碎，第一次加6000ml煎煮，沸騰后保持3h，第二次加4000ml水煎煮提取1h。合并兩次煎液，過濾，濃縮至2000ml，得姜葉三七水提物。實施例12：姜葉三七脂溶性成分提取物取新鮮姜葉三七根莖1000g切碎，加乙醇回流提取2次，第一次加入6倍體積百分比為70％的乙醇，提取3小時，第二次加入4倍量體積百分比為40％的乙醇提取1小時，合并煎液，過濾，回收乙醇，制成干膏，即得姜葉三七脂溶性成分提取物。實施例13：姜葉三七揮發(fā)油注射液將實施例1-3中的姜葉三七揮發(fā)油與葡萄糖、適量助溶劑、適量溶劑混合均勻，濾過，滅菌，制備得到注射液。實施例14：姜葉三七揮發(fā)油凍干粉針劑將實施例1-3中的姜葉三七揮發(fā)油與葡萄糖、適量助溶劑、適量溶劑混合均勻，滅菌，分裝于安瓿或西林瓶等容器中，在無菌密閉環(huán)境中，低溫下凍結，再通過降低環(huán)境氣壓，緩慢升高制品溫度的方法使制品中的溶媒升華，留下固體形態(tài)的藥物，即得本發(fā)明的凍干粉針。實施例15：姜葉三七揮發(fā)油取姜葉三七干燥根莖150g粉碎，加600ml蒸餾水浸泡2h，通過水蒸汽蒸餾提取5h，收集上層精油，得姜葉三七揮發(fā)油組合物1.9ml。對所得姜葉三七揮發(fā)油進行檢測，成分含量結果：3,6,7,8-四氫化-3,3,6,6-四甲基環(huán)戊二烯并[E]茚-1(2H)-酮為20％，莰烯為8％；1,7,7-三甲基-二環(huán)[2.2.1]庚-2-茨酮為6％，香樹烯為8％；氧化石竹烯為6％。藥效實驗實驗例1本發(fā)明對鼻咽癌細胞增殖抑制作用取實施例2、5、6、7、11、12中的姜葉三七揮發(fā)油組合物、石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、水飽和正丁醇提取物、水提物和乙醇提取物，用RPMI1640培養(yǎng)液將上述提取物進行稀釋，0.22μm微孔濾器抽濾除菌，4℃保存?zhèn)溆?。以MTT法檢測本發(fā)明對鼻咽癌細胞增殖抑制作用。1試樣及實驗藥物1.1鼻咽癌細胞培養(yǎng)人鼻咽癌細胞(CNE-2)用含10％胎牛血清及100μg/ml青霉素-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，置37℃、5％CO2、飽和濕度條件下的恒溫密閉培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并傳代。0.02EDTA-0.25％胰蛋白酶消化，每2～3d傳代一次。1.2實驗藥物實驗組：實施例2、5、6、7、11、12。對比例藥物：順鉑，生產廠家德州德藥制藥有限公司；批號：國藥準字H37020524；濃度3μg/ml。2MTT法檢測姜葉三七提取物對鼻咽癌細胞增殖抑制作用表1本發(fā)明實施例和順鉑對鼻咽癌細胞增殖的抑制率實驗結果顯示：實施例2對鼻咽癌細胞增殖抑制作用明顯強于其他實施例組和順鉑組；各實施例組與順鉑組相比，對鼻咽癌細胞增殖抑制作用有弱有強，但是均體現(xiàn)對鼻咽癌細胞的增殖有抑制作用。由以上可得結論：1、姜葉三七揮發(fā)油對鼻咽癌細胞的增殖抑制作用明顯優(yōu)于姜葉三七經其他提取方法獲得的提取物，以及明顯優(yōu)于順鉑。。2、姜葉三七石油醚提取物、乙酸乙酯提取物對鼻咽癌細胞的增殖抑制作用優(yōu)于姜葉三七水飽和正丁醇提取物、姜葉三七水提物、姜葉三七乙醇提取物以及順鉑。3、姜葉三七水提物、乙醇提取物以及水飽和正丁醇提取物對鼻咽癌細胞的增殖抑制作用與順鉑組相比較差，但同樣能顯示出對鼻咽癌細胞增殖有抑制作用。實驗例2姜葉三七揮發(fā)油體外抗鼻咽癌細胞活性實驗1儀器與試藥1.1儀器揮發(fā)油測定器符合中國藥典一部附錄XD揮發(fā)油測定法的有關標準；Galaxy170S型CO2細胞培養(yǎng)箱(德國Eppendorf公司)，MLDEL680型酶標儀(日本BIO-RAD公司)，Axiovert-40型倒置相差顯微鏡(德國蔡司公司)，SW-CJ-2F型超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司)。1.2試劑胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基均購自美國hyclone公司；DMSO、四甲基偶氮唑藍(MTT)均購自Sigma公司；乙醚等其他試劑均為國產分析純。1.3實驗藥物實驗組：實施例1，姜葉三七揮發(fā)油。對比例藥物：順鉑，生產廠家德州德藥制藥有限公司；批號：國藥準字H37020524；濃度3μg/ml。1.4供試鼻咽癌細胞人鼻咽癌細胞(CNE-2)由桂林醫(yī)學院科學實驗中心提供。2方法與結果2.1方法2.1.1藥物配制用RPMI1640培養(yǎng)液將實施例1所得的揮發(fā)油提取物(20mg/mL)按1:10、1:13、1:20、1:40比例進行稀釋，0.22μm微孔濾器抽濾除菌，4℃保存?zhèn)溆谩?.1.2實驗分組：A：空白對照組B：120μg/ml姜葉三七揮發(fā)油組C：240μg/ml姜葉三七揮發(fā)油組D：360μg/ml姜葉三七揮發(fā)油組E：480μg/ml姜葉三七揮發(fā)油組2.1.3鼻咽癌細胞培養(yǎng)人鼻咽癌細胞(CNE-2)用含10％胎牛血清及100μg/ml青霉素-鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基，置37℃、5％CO2、飽和濕度條件下的恒溫密閉培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并傳代。0.02EDTA-0.25％胰蛋白酶消化，每2～3d傳代一次。2.1.4MTT法檢測本發(fā)明藥物對鼻咽癌細胞增殖抑制作用將對數(shù)生長期的鼻咽癌細胞按每孔4000個接種96孔培養(yǎng)板，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h，24h，36h，48h，60h待細胞貼壁后，將不同濃度姜葉三七揮發(fā)油分別加入細胞株已長成單層的96孔細胞培養(yǎng)板中，每個濃度重復5個復孔，同時設立兩個對照組：一個為空白對照組(不加細胞)，一個為細胞對照組(加1640培養(yǎng)液，姜葉三七揮發(fā)油的濃度為0)。置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結束前4h，吸棄培養(yǎng)板中液體，PBS沖洗3次，在避光條件下每孔加入MTT(5mg/ml)20μl，置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h，去上清液后每孔加DMSO150μl，水平搖床震蕩10min，酶標讀數(shù)儀比色(波長490nm)測吸光度。實驗重復3次。按以下公式計算實驗藥物和對照藥物對鼻咽癌細胞(CNE-2)的抑制作用。細胞抑制率(％)＝(1-藥物作用組吸光度值/細胞對照組吸光度值)×100％。2.1.5Hoechst33258染色觀察細胞形態(tài)取浸泡于70％乙醇中的潔凈蓋玻片，置于六孔板內，設置A組(空白對照組)，B組(120μg/ml)C組(240μg/ml)，D組(360μg/ml)，無菌超凈臺內用無菌的PBS三遍，再用細胞培養(yǎng)液洗滌一遍。取對數(shù)生長期不同鼻咽癌細胞(CNE-2)，每孔接種5ｘ104個細胞培養(yǎng)過夜。經不同濃度姜葉三七揮發(fā)油處理24h后，吸盡培養(yǎng)液，PBS洗滌3次，加入0.5ml固定液，固定30分鐘。去固定液，用PBS洗2遍，每次3分鐘，吸盡液體。加入0.5mlHoechst33258染色液，染色10分鐘。去染色液，用PBS洗2遍，每次3分鐘，吸盡液體。滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細胞的蓋玻片，讓細胞接觸封片液，盡量避免氣泡。用的熒光激發(fā)波長350nm左右，發(fā)射波長460nm左右，在熒光顯微鏡下可檢測到呈藍色的細胞核。2.1.6流式細胞儀檢測揮發(fā)油對鼻咽癌細胞周期與細胞凋亡的影響人鼻咽癌細胞(CNE-2)分為四組：A組(空白對照組)、B組(120μg/ml)、C組(240μg/ml)、D組(360μg/ml)，經處理后，收集所有細胞(貼壁及懸浮細胞)后用PBS清洗一次，每組分別加入100μlbuffer，吹打均勻，再分別加入3μlPI和3μAnnexin-V，避光染色1小時，加入200μlbuffer，200目濾網過濾細胞，收集于流式細胞儀上樣管內。使用488nm激光作為激發(fā)波長，525nm作為檢測波長，在流式細胞儀上對每個樣品中1萬個細胞采集熒光強度數(shù)據。2.1.7流式細胞儀檢測鼻咽癌細胞的周期取對數(shù)生長期不同鼻咽癌細胞(CNE-2)分為A組(空白對照組)，B組(120μg/ml)C組(240μg/ml)，D組(360μg/ml)經不同處理后，于15ml離心管中收集所有細胞(貼壁及懸浮細胞)后用PBS清洗一次，每組分別加入1mL預冷PBS重懸，吹打均勻。將離心管放置于渦旋震蕩器上，邊震蕩邊加入9ml70％冰凍乙醇固定，放置-20℃過夜。染色前用預冷PBS洗滌,離心(2000r/min，4℃)5min，去除固定液，用500μLRNaseA消化，37℃水浴30min，再加入25μL碘化丙啶(propdiumiodide，PI)染色液混勻，室溫避光染色30min，200目濾網過濾細胞，收集于流式細胞儀上樣管內。流式細胞儀進行DNA含量和細胞周期分析,得出細胞各周期階段的百分率。2.1.8統(tǒng)計學分析所有實驗數(shù)據以均數(shù)±標準差表示，使用SPSS17.0錄入和分析數(shù)據，多組間資料比較采用單因素方差分析(One-WayANOVA)檢驗，P<0.05表示差異具有顯著性。2.2結果2.2.1本發(fā)明對鼻咽癌細胞生長抑制作用采用MTT實驗分析實驗藥物對人鼻咽癌細胞(CNE-2)增殖的影響，結果如表2及圖1所示：表2：不同時間人鼻咽癌細胞株(CNE-2)增殖抑制率注：◇：實施例組與順鉑組(陽性對照組)比較，P值>0.05，即實施例組與順鉑組比較沒有統(tǒng)計學差異，說明實施例組的抗鼻咽癌細胞活性基本等同于順鉑組。*：實施例組與順鉑組(陽性對照組)比較，P值<0.05，即實施例組與順鉑組比較具有統(tǒng)計學差異，由其抑制率分析可知，實施例組對鼻咽癌細胞的抑制率高于順鉑組，說明實施例組的抗鼻咽癌細胞活性要高于順鉑組?！鳎簩嵤├M與順鉑組(陽性對照組)比較，P值<0.01，即實施例組與順鉑組比較具有顯著性的統(tǒng)計學差異，由其抑制率分析可知，實施例組比順鉑組抑制率低，說明實施例組的抗鼻咽癌細胞活性要低于順鉑組或不具有抗鼻咽癌細胞活性。對表2實驗數(shù)據進行統(tǒng)計分析后可知，在作用24小時后，本發(fā)明揮發(fā)油對人鼻咽癌細胞(CNE-2)的IC50為300μg/ml。實驗結果表明：本發(fā)明的揮發(fā)油對人鼻咽癌細胞株(CNE-2)具有顯著的抑制作用，其效果明顯優(yōu)于對照藥物順鉑組。并且隨作用時間的延長和藥物濃度的增加，其抑制作用逐漸增強，表現(xiàn)出明顯的量-效和時-效關系。2.2.2Hoechst33258染色觀察細胞形態(tài)Hoehst33258染色法觀察細胞核形態(tài)變化，結果如圖2所示，A組細胞核形態(tài)完整，核膜光滑，染色質均勻，部分可見分裂期細胞核的形態(tài)變化；B組、C組、D組均可見凋亡期細胞核的形態(tài)變化，即核膜消失，核邊沿呈毛刺狀，核染色加深，部分細胞核固縮、碎裂成核膜包裹著的碎塊，呈顆粒狀，形成凋亡小體，出現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)(如箭頭所示)。在同等數(shù)量細胞接種后，隨藥物劑量的增加，不同劑量濃度實驗組的細胞數(shù)也明顯減少，間接說明姜葉三七揮發(fā)油對鼻咽癌細胞株凋亡的作用隨劑量增加而逐漸增強。2.2.3流式細胞儀檢測姜葉三七揮發(fā)油組合物對不同鼻咽癌細胞周期的影響流式細胞術(FCM)結果如圖3及表3顯示：不同質量濃度姜葉三七揮發(fā)油作用人鼻咽癌細胞(CNE-2)24h后，與A組(空白組)比較，B、C、D組(低中劑量組)細胞數(shù)量的變化：圖3和表3說明，在CNE-2，B、C組中G0/G1期細胞數(shù)量增加，S期、G2/M期細胞比例減少，而D組(360μg/ml實驗組)G1期細胞比例降低，可能是由于姜葉三七揮發(fā)油將CNE-2阻滯在G1期，引起鼻咽癌細胞凋亡，進而導致G1期細胞比例降低的，提示姜葉三七揮發(fā)油對CNE-2細胞具有明顯的G1期阻滯作用。表3：姜葉三七揮發(fā)油對CNE-2細胞周期的影響(％)2.2.4流式細胞儀檢測鼻咽癌細胞的凋亡經流式細胞儀檢測姜葉三七揮發(fā)油作用24小時后，人鼻咽癌細胞(CNE-2)的凋亡率如圖4、圖5所示，可觀察到隨姜葉三七揮發(fā)油濃度的增加，人鼻咽癌細胞(CNE-2)發(fā)生凋亡的比例逐漸增加。在對CNE-2凋亡的影響中，B組引起細胞凋亡率為6％，與空白對照比較P＝0.085>0.05，無明顯差異，不具有統(tǒng)計學意義。C組和D組凋亡率急劇上升，未呈現(xiàn)出明顯的早期凋亡，直接引起細胞的中、晚期凋亡或細胞壞死，C組、D組與空白組相比有明顯差異。實驗結果表明：對CNE-2腫瘤細胞，姜葉三七揮發(fā)油低劑量無明顯影響作用，中高劑量組有顯著作用。姜葉三七揮發(fā)油對CNE-2細胞具有明顯的G1期阻滯作用，阻止細胞的有絲分裂，使細胞增殖受到抑制，從而達到抗鼻咽癌細胞活性作用。