本發(fā)明涉及抗糖尿病藥物技術領域，尤其涉及一種含野菊花提取物的抗糖尿病藥物。

背景技術：

糖尿病是以慢性高血糖癥狀為特征的系統(tǒng)性疾病，其主要危險在于其導致的并發(fā)癥，最常見如：足病、腎病、眼病、腦病、心臟病、皮膚病等。1型糖尿病的病因是自體免疫系統(tǒng)破壞β細胞，導致胰島素不能產生。2型糖尿病的病因主要是細胞不再同胰島素結合，導致身體不能利用胰島素。95％以上的糖尿病屬于2型糖尿病。糖尿病是僅次于癌癥和心血管疾病的第三大殺手。據估計，到2030年，全世界將有3.66億糖尿病患者。亞洲人的發(fā)病率(10-12％)高于歐洲人的發(fā)病率(4-5％)。根據國際糖尿病聯合會(IDF)數據，2013年，我國糖尿病人數位居全球之冠。因此，糖尿病對我國國民健康危害極大。

LXR激動劑可顯著下調小鼠肝臟中糖異生酶如磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和葡萄糖-6-磷酸酶的表達，促進肝糖利用。研究報道指出LXR激動劑T0901317治療可以大幅降低糖尿病大鼠血漿葡萄糖水平。LXR激動劑作用于胰島素抵抗的zucker大鼠可以提高其胰島素敏感性，并對糖異生基因產生抑制作用，并顯著提高胰島素分泌和胰島素的血漿濃度。LXR激動劑也可促進脂肪和肌肉細胞中葡萄糖的吸收，并誘導主要的葡萄糖轉運子GLUT1和GLUT4的表達。此外，LXR激動劑能通過調控膽固醇的吸收、合成、代謝 和轉運調節(jié)膽固醇水平，降低糖尿病伴隨的脂質代謝紊亂、高脂血癥風險。因此，LXR是近年來研究抗糖尿病藥物的熱門靶標，開發(fā)新型LXR激動劑作為治療糖尿病的潛在藥物一直是韋氏、科華、輝瑞等龍頭藥企的重點方向。

現有LXR激動劑主要包括天然的氧化性甾醇和叔胺類化合物(T0901317和GW3965)的衍生物，分子量在300-650之間。然而，到目前為止，這些化合物由于激動活性差、生物活性低而無法走進臨床試驗，或由于人體毒副作用而止步于臨床試驗。LXR激動劑治療高脂血癥的嘗試仍未成功，而對現有LXR激動劑先導化合物進行結構改造的努力顯得力不從心。

中藥是中國勞動人民幾千年來與疾病作斗爭的實踐經驗總結，從中藥資源寶庫中尋找先導化合物是我國藥物開發(fā)的優(yōu)勢之一。野菊花屬于菊科菊花種野菊花亞種，野生于山坡草地、田邊、路旁等野生地帶，因具有抗炎、抗菌以及保護心血管的生物功效而被廣泛用于中藥處方、茶飲中。1987年于德泉從野菊花中鑒別出野菊花醇的結構(野菊花化學成分的研究.藥學學報，1987，22(11):837-840.)，2000年M.Yoshikawa鑒別出野菊花抑制NO生成的活性成分倍半萜烯(Chemical&pharmaceutical bulletin，2000，48(5):651-656.)，2002年H.Matsuda鑒別出野菊花抑制醛酮還原酶的活性成分黃酮苷衍生物(Chemical&pharmaceutical bulletin，2002，50(7):972-975.)，2005年W.Cheng報道了野菊花粗提物的抗炎活性(Journal of ethnopharmacology，2005，101(1-3):334-337.)。至此，野菊花的活性成分還遠未被完全開發(fā)和利用。

技術實現要素：

本發(fā)明針對現有的LXR激動劑因激動活性差、生物活性低而無法走進臨床試驗，LXR激動劑治療糖尿病的嘗試仍未成功的問題，提供一種有效成分為野菊花提取物且活性優(yōu)于LXR激動劑GW395的抗糖尿病藥物。

為實現上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案。

一種含野菊花提取物的抗糖尿病藥物，包括野菊花提取物和/或藥學上可接受的載體，所述野菊花提取物中含有以下結構的倍半萜類化合物：

所述野菊花提取物中所含的倍半萜類化合物的結構式是(化合物1)：

所述野菊花提取物中所含的倍半萜類化合物的結構式是(化合物2)：

所述野菊花提取物中所含的倍半萜類化合物的結構式是(化合物3)：

所述野菊花提取物中所含的倍半萜類化合物的結構式是(化合物4)：

與現有技術相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明的抗糖尿病藥物中的野菊花提取物含有以上公開的倍半萜類化合，這些倍半萜類化合物能顯著抑制3T3-L1前脂肪細胞分化過程中甘油三酯和總脂肪的積累，抑制效果優(yōu)于陽性對照化合物小檗堿；還能明顯激動肝X受體α和β(LXRα和LXRβ)，激動效果強于現有的LXR激動劑工具分子GW3965；尤其是化合物4，其激動效果明顯優(yōu)于GW3965。此外，這些倍半萜類化合物還能調節(jié)對膽固醇代謝至關重要的轉錄因子SREBP-1c、PPARγ和CEBPδ的mRNA表達量。因此，含有所公開的野菊花提取物的抗糖尿病藥物具有良好的降血糖效果， 在治療糖尿病方面有良好的發(fā)展前景。

附圖說明

圖1為實施例1中從野菊花提取物中分離的化合物1、2、4抑制總脂肪積累的活性數據；

圖2為實施例1中從野菊花提取物中分離的化合物1-4抑制甘油三酯積累的活性數據；

圖3為實施例1中從野菊花提取物中分離的化合物4激活LXRα和LXRβ的活性數據；

圖4為實施例1中從野菊花提取物中分離的化合物3和化合物4上調膽固醇調節(jié)過程中關鍵轉錄因子的mRNA表達的活性數據(PPARγ)；

圖5為實施例1中從野菊花提取物中分離的化合物3和化合物4上調膽固醇調節(jié)過程中關鍵轉錄因子的mRNA表達的活性數據(SREBP-1c)；

圖6為實施例1中從野菊花提取物中分離的化合物3和化合物4上調膽固醇調節(jié)過程中關鍵轉錄因子的mRNA表達的活性數據(CEBPδ)。

具體實施方式

為了更充分理解本發(fā)明的技術內容，下面結合具體實施例對本發(fā)明的技術方案作進一步介紹和說明。

實施例1

本實施例提供一種含野菊花提取物的抗糖尿病藥物，由野菊花提取物和/或藥學上可接受的載體組成。野菊花提取物中含有以下結構的倍半萜類化合物：

以上所述的野菊花提取物由以下方法制備而得。本實施例還對野菊花提取物中的倍半萜類化合物進行了生理活性分析。

野菊花提取物的制備方法包括以下步驟：

(1)提取

稱取7.0Kg干野菊花，在常溫常壓下用10L的乙醇(95％)浸泡干野菊花24h，然后過濾，收集濾液。重復提取野菊花三次，合并三次提取的濾液，然后將濾液置于水浴中常壓濃縮，得到2.0Kg提取物浸膏。

(2)萃取

將提取物浸膏放入5L水中，攪拌使提取物浸膏變成渾濁懸浮液，然后用乙酸乙酯萃取，得萃取液，濃縮萃取液得濃縮物，濃縮物干燥后得到425g萃取物。

(3)柱層析

萃取物用甲醇溶解后吸附于等重量的200-300目的硅膠中，硅膠在室溫 下干燥后得到層析樣品，然后用2.0Kg的200-300目硅膠對層析樣品進行柱層析，依次用石油醚、氯仿進行梯度洗脫，收集氯仿流出液；濃縮氯仿流出液，得到120g初層析物。

(4)二次層析

用200-300目硅膠對初層析物進行柱層析，用復合洗脫液進行梯度洗脫，復合洗脫液由石油醚和乙酸乙酯組成，所用的系列極性的復合洗脫液如下：90:10、80:20、70:30、60:40、50:50、40:60、20:80(石油醚與乙酸乙酯的體積比)。通過薄層色譜(TLC)跟蹤流出液，根據TLC反映的層析情況，合并溶解有相同極性(在該TLC層析條件下)的物質的流出液，從而依次收集到極性由小到大的流份A、流份B、流份C和流份D。分別濃縮各流份，對應得到18g提取物A、29g提取物B、19g提取物C和15g提取物D。提取物A、提取物B、提取物C和提取物D組成本實施例的抗糖尿病藥物中所述的野菊花提取物。

分別對提取物A、提取物B、提取物C、提取物D作進一步分離提純。經過進一步分離提純，可得到如下結構通式的倍半萜類化合物：

具體的分離提純步驟如下(5)-(8)所述。

(5)分離提純化合物1

提取物A通過使用MCI柱進行柱層析，用甲醇/水進行梯度洗脫，所用 的系列極性的甲醇/水洗脫液如下：20:80、30:70、40:60、50:50、60:40、70:30、80:20、90:10(甲醇與水的體積比)，收集流出液，濃縮流出液后得到提取物A1。

提取物A1再通過使用MCI柱進行柱層析，依次用石油醚/乙酸乙酯、氯仿/甲醇進行梯度洗脫，所用的系列極性的石油醚/乙酸乙酯洗脫液如下：90:10、80:20、70:30(石油醚與乙酸乙酯的體積比)，所用的系列極性的氯仿/甲醇洗脫液如下：95:5、80:20(氯仿與甲醇的體積比)，收集流出液，濃縮流出液后得到提取物A2。

提取物A2再通過使用反相硅膠柱進行柱層析，用甲醇/水進行梯度洗脫，所用的甲醇/水洗脫液的體積比為70:30和60:40，收集流出液，濃縮流出液后可得到化合物1，化合物1為白色粉末。

分別測化合物1的質譜、核磁共振氫譜、核磁共振碳譜，由測試所得數據可知化合物1的分子量是592.3，分子式是C₃₅H₄₄O₈?；衔?的質譜、核磁共振氫譜、核磁共振碳譜與文獻1中的化合物2的相應圖譜一致，因此化合物1的結構式是：(文獻1：Chrysanolide A,an unprecedented sesquiterpenoid trimer from the flowers of Chrysanthemum indicum L.RSC Advances,2013,3(26):10168.)

具體的測試數據如下：

HRESI-MS m/z 591.2936[M-H]^-。

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ:6.18(1H，dd，J＝5.84，1.00Hz，H-3`)，6.16(1H，dd，J＝5.84，1.00Hz，H-3``)，6.03(1H，d，J＝3.64Hz，13`-Ha)，5.30(1H，d，J＝3.28Hz，13`-Hb)，5.88(1H，d，J＝5.48Hz，H-2`)，5.55(1H，ddd，J＝3.68，4.24，2.04Hz，H-8)，5.49(1H，m，J＝1.36Hz，H-3)，4.08(1H，t，J＝9.72Hz，H-6`)，3.96(1H，t，J＝9.80Hz，H-6)，3.54(1H，t，J＝8.65Hz，H-7)，2.95(1H，dd，J＝6.20，3.04Hz，H-7`)，2.74(1H，m，J＝7.96Hz，H-5)，2.56(1H，dt，J＝10.68，7.60Hz，H-1)，2.36(1Hd，J＝12.12Hz，H-13a)，1.49(1H，s，H-13b)，2.26(1H，d，J＝4.54Hz，H-9a)，1.97(1H，d，H-9b)，2.18(1H，m，H-8`a)，1.46(1H，m，H-8`b)，2.24-2.04(2H，m，H-2)，1.95(1H，m，H-5`)，1.80(2H，m，H-9`)，1.97(3H，d，J＝7.36Hz，3``-CH<sub>3</sub>)，1.89(3H，s，2``-CH₃-)，1.89(3H，s，H-15)，1.46(3H，s，H-14`)，1.29(3H，s，H-15`)，1.21(3H，s，H-14)。

¹³C-NMR(101MHz，CDCl₃)δ:54.6(C-1)，33.5(C-2)，125.8(C-3)，144.8(C-4)，54.9(C-5)，79.0(C-6)，47.8(C-7)，70.1(C-8)，38.3(C-9)，73.6(C-10)，59.0(C-11)，178.3(C-12)，37.4(C-13)，33.7(C-14)，18.5(C-15)，64.8(C-1`)，133.8(C-2`)，140.6(C-3`)，57.4(C-4`)，65.9(C-5`)，79.4(C-6`)，43.1(C-7`)，23.7(C-8`)，34.9(C-9`)，72.9(C-10`)，141.3(C-11`)，170.2(C-12`)，118.4(C-13`)，15.5(C-14`)，29.9(C-15`)，166.5(C-1``)，126.6(C-2``)，143.4(C-3``)，16.3(C-4``)，20.6(C-5``)。

(6)分離提純化合物2

提取物B先通過使用300g的硅膠進行柱層析，用氯仿/乙酸乙酯進行梯度洗脫，所用系列極性的氯仿/乙酸乙酯洗脫液如下：100:0、90:10、80:20、70:30(氯仿與乙酸乙酯的體積比)，收集流出液，濃縮流出液后得到提取物 B1。提取物B1再依次通過使用Sephadex LH-20(甲醇/氯仿，體積比為50:50)、Rp-18(梯度洗脫，所用系列極性的甲醇/水洗脫液的體積比為：70:30、80:20、90:10、100:0)、制備HPLC(甲醇/水，體積比為60:40)進行柱層析，可分離得到化合物2，化合物2為白色固體。

分別測化合物2的質譜、核磁共振氫譜、核磁共振碳譜，由測試所得數據可知化合物2的分子量是306，分子式是C₁₇H₂₂O₅。化合物2的質譜、核磁共振氫譜、核磁共振碳譜與文獻2中的化合物12的相應圖譜一致，因此化合物2的結構式是：(文獻2：Cumambrin A in Chrysanthemum boreale Makino Preparation,X-ray Crystal Structure and ¹³C-and ¹H-NMR Study of Cumambrin A[J]Kor.J.Pharmacogn,1996,27:207-211.)

具體的測試數據如下：

EI-MSm/z＝307.2([M+H]⁺)。

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ:6.18(1H，d，J＝3.44Hz，H-13)，5.50(1H，d，J＝2.96Hz，H-13)，5.50(1H，d，J＝2.96Hz，H-3)，5.16(1H，ddd，J＝7.04，5.72，1.12Hz，H-8)，3.99(1H，m，H-6)，3.89(1H，tt，J＝9.36，3.12Hz，H-7)，2.76(1H，dd，J＝10.84，4.12Hz，H-5)，2.58(1H，dd，J＝18.44，8.20Hz，H-1)，2.31(1H，dd，J＝16.68，5.80Hz，H-9)，1.84(1H，d，J＝16.68Hz，H-9)，2.27-2.18(1H，m，H-2)，2.13-2.03(1H，m，H-2)，1.90(3H，s，H-14)，1.24(3H， s，H-15)，2.16(3H，s，OAc)。

¹³C-NMR(101MHz，CDCl₃)δ:54.4(C-1)，33.7(C-2)，125.6(C-3)，138.6(C-4)，54.5(C-5)，80.4(C-6)，46.6(C-7)，73.9(C-8)，39.0(C-9)，73.6(C-10)，143.9(C-11)，169.6(C-12)，121.5(C-13)，33.7(C-14)，18.0(C-15)，170.3(C-16)，21.6(C-17)。

(7)分離提純化合物3

提取物C先通過MCI柱進行柱層析，用甲醇/水進行梯度洗脫，所用系列極性的甲醇/水洗脫液如下：20:80、30:70、40:60、50:50、60:40、70:30、80:20、90:10(甲醇與水的體積比)，收集流出液，濃縮流出液后得到提取物C1。提取物C1再依次通過使用硅膠柱(梯度洗脫，所用系列極性的氯仿/甲醇洗脫液的體積比為：95:5、85:15、70:30)、Sephadex LH-20(甲醇)進行柱層析可得到化合物3，化合物3為白色固體。

分別測化合物3的質譜、核磁共振氫譜、核磁共振碳譜，由測試所得數據可知化合物3的分子量是246.1，分子式是C₁₅H₁₈O₃?；衔?的質譜、核磁共振氫譜、核磁共振碳譜與文獻3中的化合物1的相應圖譜一致，因此化合物3的結構式是：(文獻3：Conformational analysis of achillinand leukodin[J]J Nat Prod,1988,51(2):22-228.)

具體的測試數據如下：

EI-MSm/z＝247.1([M+H]⁺)。

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ:6.14(1H，q，J＝1.32，H-3)，3.59(1H，td， J＝11.20，10.08，1.36Hz，H-6)，3.39(1H，d，J＝10.04Hz，H-5)，2.41(3H，s，H-14)，2.41(1H，m，H-9a)，2.24(1H，ddd，J＝13.64，6.72，1.52Hz，H-9b)，2.33(1H，dd，J＝3.88，1.44Hz，H-11)，2.27(3H，s，H-15)，1.97(1H，m，H-8a)，1.94(1H，m，J＝12.44，2.72Hz，H-7)，1.34(1H，dd，J＝12.12，1.64Hz，H-8b)，1.25(3H，dd，J＝6.84，1.60Hz，H-13)。

¹³C-NMR(101MHz，CDCl₃)δ:196.0(C-2)，177.6(C-12)，170.0(C-4)，152.2(C-10)，135.6(C-3)，132.0(C-1)，84.3(C-6)，56.5(C-7)，52.7(C-5)，41.2(C-11)，37.7(C-9)，26.1(C-8)，21.7(C-14)，19.9(C-15)，12.4(C-13)。

(8)分離提純化合物4

提取物D先通過使用Sephadex LH-20柱進行柱層析(甲醇)，收集流出液，濃縮流出液后得到提取物D1。

提取物D1通過使用MCI柱進行柱層析，以甲醇/水進行梯度洗脫以除去色素，所用系列極性的甲醇/水洗脫液如下：20:80、30:70、40:60、50:50、60:40、70:30、80:20、90:10、100:0(甲醇與水的體積比)，收集流出液，濃縮流出液后得到提取物D2。

提取物D2再依次通過使用硅膠(梯度洗脫，所用系列極性的氯仿/乙酸乙酯洗脫液的體積比為：90:10至30:70)、Rp-18(梯度洗脫，所用系列極性的甲醇/水洗脫液的體積比為60:40至90:10)、Toyopearl HW-40(甲醇)、硅膠(梯度洗脫，所用系列極性的氯仿/甲醇洗脫液的體積比為100:0、90:10、80:20)、Sephadex LH-20(甲醇/氯仿，體積比為50:50)、Rp-8(梯度洗脫，所用系列極性的甲醇/水洗脫液的體積比為60:40、70:30、80:20、90:10)、制備HPLC(甲醇/水，體積比為65:35)進行柱層析，得到化合物4，化合物4 為白色固體。

分別測化合物4的質譜、核磁共振氫譜、核磁共振碳譜，由測試所得數據可知化合物4的分子量是798.4，分子式是C₄₇H₅₈O₁₁?；衔?的質譜、核磁共振氫譜、核磁共振碳譜與文獻1中的化合物3的相應圖譜一致，因此化合物4的結構式是：(文獻1：Chrysanolide A,an unprecedented sesquiterpenoid trimer from the flowers of Chrysanthemum indicum L.RSC Advances,2013,3(26):10168.)

具體的測試數據如下：

EI-MS m/z＝799.40([M+H]⁺)。

¹H-NMR(400MHz，CDCl₃)δ:6.25(1H，d，J＝5.36Hz，H-3`)，6.06(1H，d，J＝3.16Hz，H-3``)，5.99(1H，d，J＝5.24Hz，H-13``a)，5.32(1H，d，J＝5.60Hz，H-13``b)，5.88(1H，d，J＝5.40Hz，H-2``)，5.85(1H，d，J＝5.48Hz，H-2`)，5.46(1H，s，H-8)，5.34(1H，m，J＝2.76Hz，H-3)，4.14(1H，t，J＝9.60Hz，H-6`)，4.00(1H，t，J＝9.60Hz，H-6``)，3.88(1H，t，J＝9.76Hz，H-6)，3.48(1H，dd，J＝18.28，9.08Hz，H-7)，3.18(1H，d，J＝18.84，9.56Hz，H-7`)，2.81(1H，m，J＝17.12，9.20Hz，H-5``)，2.73(1H，m，J＝17.68，8.20Hz，H-5)，2.53(1H， dd，J＝17.68，7.88Hz，H-5`)，2.38(1H，d，J＝11.80Hz，H-7``)，2.11(2H，s，H-9)，1.84(3H，s，H-OAc)，1.84(3H，s，H-15)，1.37(3H，s，H-14`)，1.32(3H，s，H-15``)，1.29(3H，s，H-15`)，1.25(3H，s，H-14``)，1.19(3H，s，H-14)。

¹³C-NMR(101MH，CDCl₃)δ:179.4(C-12)，178.7(C-12``)，170.9(C-OAc)，170.6(C-12`)，144.1(C-4)，141.3(C-11``)，141.1(C-3`)，139.9(C-3``)，134.3(C-2`)，133.6(C-2``)，125.5(C-3)，118.7(C-13``)，80.1(C-6`)，78.8(C-6``)，77.4(C-6)，73.4(C-10)，73.1(C-10`)，71.8(C-10``)，70.9(C-8)，66.3(C-5`)，65.8(C-5``)，64.5(C-1`)，64.3(C-1``)，60.4(C-11)，57.7(C-11`)，56.8(C-4`)，56.7(C-4``)，54.2(C-1)，54.0(C-5)，47.1(C-7)，43.9(C-7`)，43.5(C-7``)，38.4(C-9)，36.8(C-13)，36.8(C-13`)，35.5(C-9`)，35.0(C-9``)，33.6(C-14)，33.3(C-2)，29.8(C-14`)，29.4(C-14``)，23.5(C-8`)，22.3(C-8``)，22.2(C-OAc)，18.2(C-15)，15.5(C-15`)，15.3(C-15`)。

由以上對提取物A、提取物B、提取物C、提取物D的進一步分離提純的結果可證實，本實施例的野菊花提取物中含有上述的化合物1、化合物2、化合物3和化合物4。

化合物1-4的藥效相關實驗如下。

試驗1：化合物1-4抑制甘油三酯積累、總脂肪積累的活性測定。

(1)細胞培養(yǎng)

3T3-L1(小鼠胚胎成纖維細胞，前脂肪細胞)采用完全培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基中添加10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素)在37℃、體積分數5％CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

(2)藥物干預

待測化合物以DMSO配成10mM母液，測試時稀釋成不同濃度工作液。為校正母液溶劑DMSO影響，空白對照添加0.1％DMSO。

3T3-L1接種于48孔板中培養(yǎng)至完全接觸(第0天)，將培養(yǎng)基換成分化培養(yǎng)基I或加入指定濃度待測化合物的分化培養(yǎng)基I培養(yǎng)3天(第3天)。分化培養(yǎng)基I配方：完全培養(yǎng)基中添加2μg/mL胰島素，100ng/mL地塞米松，0.5mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤和10ng/mL生物素。

分化培養(yǎng)基和待測化合物作用第3天，將培養(yǎng)基更換成分化培養(yǎng)基II或加入指定濃度待測化合物的分化培養(yǎng)基II繼續(xù)培養(yǎng)3天(第6天)。分化培養(yǎng)基II配方：完全培養(yǎng)基中添加2μg/mL胰島素。

第6天，收獲細胞進行甘油三酯或油紅O染色分析。

(3)甘油三酯測試

收獲處理后的3T3-L1細胞，冰PBS(0.2M NaCl，10mM Na₂HPO₄，3mM KCl，2mM KH₂PO₄，pH 7.4)洗滌兩次，超聲破碎細胞，使用甘油三酯試劑盒和多功能酶標儀檢測546nm處吸光度，從而計算細胞破碎液中甘油三酯含量。結果以空白對照細胞甘油三酯含量百分比的形式表示。

(4)油紅O染色

3T3-L1細胞以10％(V/V)福爾馬林溶液室溫固定1小時，以新制備的油紅O工作溶液60℃染色30分鐘，蒸餾水洗兩次，則總脂肪被油紅O染成紅色，以裝有CCD數碼相機的倒置顯微鏡觀察并拍照。拍攝過程中放大倍數、光強度不變。

(5)結果處理

根據甘油三酯試劑盒和多功能酶標儀檢測546nm處吸光度，減去空白對 照組的本底吸光度值，比上陰性對照組細胞吸光度值，結果以陰性對照組細胞甘油三酯含量百分比的形式表示。所有數據均表示為平均值±標準方差。

測試結果如圖1和圖2所示。由圖2可知，化合物1-4均能不同程度降低3T3-L1細胞內甘油三酯積累，其中CI-15處理6天后的3T3-L1細胞內幾乎沒有油滴積累，甘油三酯含量為零。由圖1可知，降甘油三酯效果最好的化合物1、化合物2和化合物4明顯降低3T3-L1細胞內總脂肪滴含量。

試驗2：化合物4激動LXR的活性測定。

(1)細胞培養(yǎng)

HEK293T(人源胚胎腎細胞)采用完全培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基中添加10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素)在37℃、體積分數5％CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

(2)藥物干預

HEK293T細胞以每孔2×104個細胞的密度平鋪在96孔板中，培養(yǎng)至細胞生長到約90％覆蓋率，按照脂質體Lipofectamine TM2000試劑說明書，將6.5μg pGL3/(DR-4)-c-fos-FF-luc(螢火蟲熒光素酶報告基因)質粒、1.3μg pSG5/hLXRα(或pSG5/hLXRβ，肝X受體α或β)質粒、1.3μg pSG5/hRXRα(視黃酸X受體)質粒和0.13μgpCMV/Renilla-luc(海腎熒光素酶報告基因)質粒與10μLLipofectamine^TM 2000脂質體試劑充分混勻，室溫靜置30分鐘，將脂質體-DNA溶液加入到96孔板中，每孔5μL。

培養(yǎng)5小時后換成完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)5小時。

加入待測化合物母液使工作濃度為10μM，與細胞共培養(yǎng)20小時。使用多功能酶標儀工作站Flex Station 3檢測螢火蟲熒光素酶活性和海腎熒光 素酶活性。

(3)結果處理

結果分析用海腎熒光素酶活性校正螢火蟲熒光素酶活性，故校正酶活性＝螢火蟲熒光素酶活性值/海腎熒光素酶活性值。相對熒光素酶活性值＝實驗組校正酶活性值/陰性對照組校正酶活性值。

測試結果如圖3所示，化合物4激動LXRα的活性強于現有的LXRα激動劑工具分子GW3965，化合物4激動LXRβ的活性與現有LXRβ激動劑工具分子GW3965相當。

試驗3：化合物3和化合物4上調LXR通路上關鍵轉錄因子的mRNA表達量的活性測定。

(1)細胞培養(yǎng)

3T3-L1(小鼠胚胎成纖維細胞，前脂肪細胞)采用完全培養(yǎng)基(DMEM培養(yǎng)基中添加10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素)在37℃、體積分數5％CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

(2)藥物干預

待測化合物以DMSO配成10mM母液，測試時稀釋成不同濃度工作液。為校正母液溶劑DMSO影響，空白對照添加0.1％DMSO。

3T3-L1接種于48孔板中培養(yǎng)至完全接觸(第0天)，將培養(yǎng)基換成分化培養(yǎng)基I或加入指定濃度待測化合物的分化培養(yǎng)基I培養(yǎng)24小時(第1天)。收獲細胞進行熒光定量PCR擴增。

(3)熒光定量PCR

使用RNAiso Plus提取3T3-L1細胞的總RNA，通過Oligo dT18將1μg 總RNA逆轉錄為cDNA，通過定量PCR技術，使用Toyobo公司ThunderBirdSYBR qPCR Mix試劑按照說明書對引物進行PCR擴增。每組樣品3個復孔，以保證實驗數據的有效性。使用β-actin為內參，檢測目的基因相對于內參基因的表達變化來定量。采用2^-ΔΔCt方法分析數據(即實驗組目的基因相對于對照組的表達量的變化倍數)。

所用引物為：

β-actin(sense:5’-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAA-3’；antisense:5’-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCC-3’)、

SREBP-1c(sense:5’-CAGCTCAGAGCCGTGGTGA-3’；antisense:5’-TGTGTGCACTTCGTAGGGTC-3’)、

PPAR-γ(sense:5’-TGCTGTTATGGGTGAAACTCTG-3’；antisense:5’-GAAATCAACTGTGGTAAAGGGC-3’)、

CEBPδ(sense:5’-AGCCCAACTTGGACGCCAG-3’；antisense:5’-TCGTCGTACATGGCAGGAGT-3’)。

(4)結果處理

檢測目的基因相對于內參基因的表達變化來定量。采用2^-ΔΔCt方法分析數據(即實驗組目的基因相對于對照組的表達量的變化倍數)。

測試結果如圖4-6所示，10μM濃度下的化合物4能顯著增加3T3-L1細胞內SREBP-1c的mRNA表達量(化合物4處理過的細胞SREBP-1c的mRNA表達量為空白對照組的8倍)，同時增加PPARγ和CEBPδ的mRNA表達量(均為3倍)。化合物3能顯著增加PPARγ和CEBPδ的mRNA表達量。

實施例2

本實施例提供一種含野菊花提取物的抗糖尿病藥物，含有實施例1中所述的化合物1和/或藥學上可接受的載體，有效成分是化合物1。

由實施例1中的測試結果可知，本實施例的含野菊花提取物的抗糖尿病藥物具有減少3T3-L1前脂肪細胞分化過程中油滴積累及甘油三酯積累的效果，因此具有良好的降血糖效果，在治療糖尿病方面有良好的發(fā)展前景。

實施例3

本實施例提供一種含野菊花提取物的抗糖尿病藥物，含有實施例1中所述的化合物2和/或藥學上可接受的載體，有效成分是化合物2。

由實施例1中的測試結果可知，本實施例的含野菊花提取物的抗糖尿病藥物具有減少3T3-L1前脂肪細胞分化過程中油滴積累及甘油三酯積累的效果，因此具有良好的降血糖效果，在治療糖尿病方面有良好的發(fā)展前景。

實施例4

本實施例提供一種含野菊花提取物的抗糖尿病藥物，含有實施例1中所述的化合物3和/或藥學上可接受的載體，有效成分是化合物3。

由實施例1中的測試結果可知，本實施例的含野菊花提取物的抗糖尿病藥物具有減少3T3-L1前脂肪細胞分化過程中油滴積累及甘油三酯積累的效果，及提高PPARγ、SREBP-1c、CEBPδ的mRNA表達量的效果，因此具有良好的降血糖效果，在治療糖尿病方面有良好的發(fā)展前景。

實施例5

本實施例提供一種含野菊花提取物的抗糖尿病藥物，含有實施例1中所述的化合物4和/或藥學上可接受的載體，有效成分是化合物4。

由實施例1中的測試結果可知，本實施例的含野菊花提取物的抗糖尿病藥物具有減少3T3-L1前脂肪細胞分化過程中油滴積累及甘油三酯積累的效果，及提高PPARγ、SREBP-1c、CEBPδ的mRNA表達量的效果，因此具有良好的降血糖效果，在治療糖尿病方面有良好的發(fā)展前景。

以上所述僅以實施例來進一步說明本發(fā)明的技術內容，以便于讀者更容易理解，但不代表本發(fā)明的實施方式僅限于此，任何依本發(fā)明所做的技術延伸或再創(chuàng)造，均受本發(fā)明的保護。