抗胰高血糖素受體的抗體及其用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗胰高血糖素受體的抗體及其用途，更具體地說，本發(fā)明涉及的是能與人胰高血糖素受體特異性結(jié)合的單克隆抗體，以及它們用于治療或預防哺乳動物中的II型糖尿病以及相關疾病的用途。本發(fā)明提供了一類新的抗胰高血糖素受體的抗體，可以和胰高血糖素受體特異性結(jié)合，通過抑制胰高血糖素與其受體的結(jié)合，降低細胞內(nèi)cAMP水平。
【專利說明】抗胰高血糖素受體的抗體及其用途

【技術(shù)領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種抗體，特別涉及一種抗胰高血糖素受體的抗體及其用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 人胰高血糖素是與胰島素一起作用的重要激素類物質(zhì)，參與人體血液中葡萄糖含 量的調(diào)控。胰高血糖素和胰島素都是多肽類激素。胰高血糖素是在胰腺的α胰島細胞中 產(chǎn)生的，胰島素是在β胰島細胞中產(chǎn)生的。當血糖水平降低時，胰高血糖素主要通過刺激 一些靶細胞(主要是肝細胞）釋放葡萄糖，胰高血糖素和胰島素調(diào)節(jié)血糖的作用正好相反， 胰島素在血糖升高時刺激細胞攝取并儲存葡萄糖，降低血糖濃度。
[0003] 天然人胰高血糖素是由29個氨基酸殘基： NH2-His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-A rg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-COOH 胰高血糖素通過結(jié)合其受體并激活下游信號通路，胰高血糖素受體(簡稱GCGR)屬于 七次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體家族分泌素亞型，配體-受體結(jié)合后，通過激活第二信使腺苷酸環(huán) 化酶來行使功能，升高細胞內(nèi)cAMP水平，繼而啟動葡萄糖的從頭合成途徑和肝糖原降解途 徑，使得血糖濃度升高（Wakelam等，Nature (I986) 323:68_71，Pittner和Fain，Biochem J (1991) 277:371-378)。
[0004] 糖尿病是常見的葡萄糖代謝癥，其特征是高血糖，分為胰島素依賴的I型糖尿病 和胰島素非依賴的II型糖尿病。I型糖尿病患者表現(xiàn)出高血糖和低胰島素血癥，并且對該 病的常規(guī)治療措施為提供胰島素。但是，在某些I型或II型糖尿病中，絕對或相對高的胰 高血糖素導致高血糖。在健康的動物或I型II型糖尿病模型動物中，用選擇性或特異性 的抗體清除血液循環(huán)中的胰高血糖素可以使血糖水平下降（Brand等，Diabetes (1996) 45:1076 Jiang和Zhang, AJP Endo (2003)284 :E671)。這些研究表明，抑制胰高血糖素 或拮抗胰高血糖素受體可以作為糖尿病常規(guī)高血糖治療的輔助手段。
[0005] 通過靶向胰高血糖素受體的抗體阻斷胰高血糖素和胰高血糖素受體的結(jié)合， 也可以作為控制或降低血糖的一種手段，從而成為治療糖尿病的新方法（U.S. Pat. No. 2008/036341 A2 和 U.S. Pat. No. 2012/0128679 A1)。這樣，胰高血糖素或胰高血糖素 受體的拮抗劑可以是小分子，也可以是多肽或抗體類的生物大分子。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一類新的抗胰高血糖素受體的抗體，可以和胰高血糖素受 體特異性結(jié)合，通過抑制胰高血糖素與其受體的結(jié)合，降低細胞內(nèi)cAMP水平，以及制備和 應用這類生物大分子的方法。
[0007] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是： 一種抗胰高血糖素受體的抗體，所述抗體包含以下方案之一的氨基酸序列： a.選自以下序列之一的輕鏈⑶R3序列： 與選自 L1-L6 的輕鏈 CDR3 序列：SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 40、SEQ ID NO: 50其中之一相差總共不超過三個氨基酸添加、替換和/或缺失的 輕鏈CDR3序列； b. 選自以下序列之一的重鏈⑶R3序列： 與選自 H1-H6 的重鏈 CDR3 序列：SEQ ID NO: 7、SEQ ID N0:16、SEQ ID N0:26、SEQ ID N0:35、SEQ ID N0:45、SEQ ID N0:55其中之一相差總共不超過四個氨基酸添加、替換和/ 或缺失的重鏈CDR3序列； c. 方案a的輕鏈⑶R3序列和方案b的重鏈⑶R3序列； 所述抗體與人胰高血糖素受體特異性結(jié)合。
[0008] 所述抗體還包含以下方案的一種或幾種組合的氨基酸序列： a. 選自以下之一的輕鏈⑶R1序列： 與選自 L1-L6 的輕鏈 CDR1 序列：SEQ ID N0:10、SEQ ID N0:19、SEQ ID N0:29、SEQ ID N0:38、SEQ ID N0:48、SEQ ID N0:58其中之一相差不超過三個氨基酸添加、替換和/或缺 失的輕鏈⑶R1 ; b. 選自以下之一的輕鏈⑶R2序列： 與選自 L1-L6 的輕鏈 CDR2 序列：SEQ ID N0:11、SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:39、SEQ ID NO:49其中之一相差不超過兩個氨基酸添加、替換和/或缺失的輕鏈CDR2 ; c. 選自以下之一的重鏈⑶R1序列： 與選自 H1-H6 的重鏈CDR1 序列：SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 24、SEQ ID N0:33、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO: 53其中之一相差不超過兩個氨基酸添加、替換和/或缺失的重鏈⑶R1 ; d. 選自以下之一的重鏈⑶R2序列： 與選自 H1-H6 的重鏈 CDR2 序列：SEQ ID NO: 6、SEQ ID N0:15、SEQ ID N0:25、SEQ ID N0:34、SEQ ID N0:44、SEQ ID N0:54其中之一相差不超過三個氨基酸添加、替換和/或缺 失的重鏈序列。
[0009] -種抗胰高血糖素受體的抗體，所述抗體包含以下方案之一的氨基酸序列： a. 選自以下方案之一的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列： i. 具有與選自L1-L6的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列：SEQ ID NO: 13、SEQ ID NO: 22、SEQ ID NO: 31、SEQ ID NO: 41、SEQ ID NO: 51、SEQ ID NO: 59 其中之一至少 80% 相同的氨基酸 序列； ii. 具有與編碼L1-L6的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列的多聚核苷酸序列：SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 32、SEQ ID NO: 42、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 60 其中之一至少 80%相同的多聚核苷酸序列編碼的氨基酸序列； b. 選自以下方案之一的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列： i. 具有與H1-H6的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列：SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 17、SEQ ID N0: 27、SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 46、SEQ ID NO: 56 其中之一至少 80% 相同的氨基酸序列； ii. 具有與編碼H1-H6的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列的多聚核苷酸序列：SEQ ID N0:9、SEQ ID NO: 18、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 37、SEQ ID NO: 47、SEQ ID NO: 57 其中之一至少 80% 相同的多聚核苷酸序列編碼的氨基酸序列； c. a的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列和b的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列； 所述抗體與人胰高血糖素受體特異性結(jié)合。
[0010] 方案c中a的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域序列與b的重鏈可變結(jié)構(gòu)域序列的組合選自以下之 一：L1H1、L1H1、L2H2、L3H3、L4H4、L5H5 和 L6H6。
[0011] 所述抗體選自鼠源抗體、嵌合抗體、單克隆抗體、多克隆抗體、重組抗體、抗原結(jié)合 抗體片段、單鏈抗體、雙鏈抗體、三鏈抗體、四鏈抗體、Fab片段、F(fa'）x片段、結(jié)構(gòu)域抗體、 IgD抗體、IgE抗體、IgM抗體、IgGl抗體、IgG2抗體、IgG3抗體、IgG4抗體中的一種。
[0012] 當所述抗體與人胰高血糖素受體結(jié)合時： a. 與人胰高血糖素受體的氨基酸Gln27至Glnl42特異性結(jié)合； b. 以彡100 nM的IC50值降低胰高血糖素信號傳導； c. 在動物模型中降低血糖； d. (a)和（b)兩者； e. (a)、（b)和（c)。
[0013] 所述動物模型為ob/ob小鼠模型。
[0014] 一種分離的核酸，其包含編碼權(quán)利要求3的抗體的輕鏈可變結(jié)構(gòu)域、重鏈可變結(jié) 構(gòu)域或輕鏈可變結(jié)構(gòu)域和重鏈可變結(jié)構(gòu)域兩者的多聚核苷酸序列。
[0015] 一種重組表達載體，其包含權(quán)利要求8的核酸。
[0016] 一種宿主細胞，其包含權(quán)利要求9的載體。
[0017] -種生產(chǎn)抗胰高血糖素受體的抗體的方法，包括在允許表達所述抗體的條件下培 養(yǎng)權(quán)利要求10的宿主細胞。
[0018] 一種藥用組合物，其包含與藥用可接受載體混合的權(quán)利要求3的抗體或人源化抗 體。
[0019] 一種用于治療II型糖尿病的試劑盒，其包含權(quán)利要求12的藥用組合物。
[0020] 本發(fā)明的有益效果是：提供一類新的抗胰高血糖素受體的抗體，可以和胰高血糖 素受體特異性結(jié)合，通過抑制胰高血糖素與其受體的結(jié)合，降低細胞內(nèi)cAMP水平。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1是單克隆抗體A-ι和表達有hGCGR的CH0-DHFR細胞特異性結(jié)合的流式分析 結(jié)果，灰色峰和虛線峰為陰性對照，雜交瘤細胞上清結(jié)合CH0-DHFR-GCGR對應的實線峰有 明顯右移。
[0022] 圖2是單克隆抗體A-2和表達有hGCGR的CH0-DHFR細胞特異性結(jié)合的流式分析 結(jié)果，灰色峰和虛線峰為陰性對照，雜交瘤細胞上清結(jié)合CH0-DHFR-GCGR對應的實線峰有 明顯右移。
[0023] 圖3是單克隆抗體A-3和表達有hGCGR的CH0-DHFR細胞特異性結(jié)合的流式分析 結(jié)果，灰色峰和虛線峰為陰性對照，雜交瘤細胞上清結(jié)合CH0-DHFR-GCGR對應的實線峰有 明顯右移。
[0024] 圖4 是Hi tHunter cAMP方法檢測純化的雜交瘤細胞上清中的抗體抑制 Glucagon對GCGR受體的激活作用圖。

【具體實施方式】
[0025] 下面通過具體實施例，并結(jié)合附圖，對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步的具體說明。
[0026] 本發(fā)明中，若非特指，所采用的原料和設備等均可從市場購得或是本領域常用的。 下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領域的常規(guī)方法。
[0027] 本發(fā)明涉及抗體例如可與人胰高血糖素受體（GCGR)特異性結(jié)合的抗體。這些包 括可抑制或阻斷胰高血糖素與人GCGR結(jié)合并降低胰高血糖素經(jīng)受體信號傳導的抗原結(jié)合 蛋白。在一個實施方案中提供了包括拮抗性抗體的可降低動物血糖的鼠源抗體。
[0028] 本發(fā)明進一步提供可特異性結(jié)合至人胰高血糖素受體的抗體相關的組合物、試劑 盒和方法。也提供了核酸分子及其衍生物和片段，其包含編碼與胰高血糖素受體結(jié)合的多 肽的全部或部分的多聚核苷酸，例如編碼全部或部分抗胰高血糖素受體抗體、抗體片段或 抗體衍生物的核酸。本發(fā)明進一步提供包含該類核酸的載體和質(zhì)粒以及包含該類核酸和/ 或載體和質(zhì)粒的細胞和細胞系。所提供方法包括，例如，制備、鑒定或分離與人GCGR結(jié)合的 抗體例如抗GCGR抗體的方法，測定該抗體是否與GCGR結(jié)合的方法、以及將與GCGR結(jié)合的 抗體給予動物模型的方法。
[0029] 定義 使用標準的單字母或三字母縮寫表明多聚核苷酸和多肽序列。除非另外指明，多肽序 列的氨基端在左而它們的羧基端在右，單鏈核酸序列和雙鏈核酸序列的上游鏈的5'端在左 而它們的3'端在右。多肽的具體部分可由氨基酸殘基編號表示，例如氨基酸27至142,或 由該位點的實際殘基表示例如Gln27至Glnl42。也可通過解釋其與參比序列的差異描述 具體的多肽或多聚核苷酸序列。具體輕鏈和重鏈可變結(jié)構(gòu)域的多聚核苷酸和多肽可表示為 L1 ("輕鏈可變結(jié)構(gòu)域Γ')，Η1 ("重鏈可變結(jié)構(gòu)域1")。包含輕鏈和重鏈的抗原結(jié)合蛋白或 抗體可通過結(jié)合輕鏈的名稱和重鏈可變結(jié)構(gòu)域的名稱表示。例如，"L4H7"表示包含L4輕 鏈可變結(jié)構(gòu)域和Η7重鏈可變結(jié)構(gòu)域的抗體。
[0030] 除非本文另外定義，與本文相關的科學和技術(shù)術(shù)語應具有本領域普通技術(shù)人員所 理解的含義。進一步，除非上下文另有要求，單數(shù)術(shù)語應包括復數(shù)并且復數(shù)含義術(shù)語應包 括單數(shù)含義。通常，與本文所述細胞和組織培養(yǎng)、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學和 蛋白質(zhì)核酸化學以及雜交相關的命名法和技術(shù)為本領域熟知和經(jīng)常使用的。本發(fā)明的方 法和技術(shù)通常根據(jù)本領域已知的常規(guī)方法以及本說明書引用和討論的各種普通和更具體 的參考文獻所描述的進行，除非另外說明。參見，例如，Sambrook等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 2 版.,Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)和 Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992),以及 Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990)，均以參考形式并于本文。酶反應和純化技術(shù)根據(jù)操作說明進 行，如本領域通常完成或本文所述。與本文描述的分析化學、合成有機化學和醫(yī)學和藥學化 學相關的木語學以及實驗操作和技術(shù)均為本領域熟知和普遍使用者。標準技術(shù)可用于化學 合成、化學分析、藥物制備、制劑和給藥以及患者的治療。
[0031] 以下術(shù)語，除非另外指明，應理解為具有以下含義：術(shù)語"分離的分子"（其中所述 分子為例如多肽、多聚核苷酸或抗體）為就其來源或衍生源而言（1)與在天然狀態(tài)下與其 相伴的天然相關組分分離，（2)基本與同種的其它分子游離（3)由不同種細胞表達或（4)不 天然存在。因此，化學合成或由與其天然來源的細胞不同的細胞體系表達的分子將與天然 相關組分"分離"。也可使用本領域已知的純化技術(shù)通過分離使分子基本與其天然相關組分 游離。例如，可使用聚丙烯酰胺凝膠電泳測定多肽樣品的純度并使用本領域熟知的技術(shù)將 凝膠染色以觀察該多肽。對于某些目的，可使用HPLC或其它本領域熟知的純化方法提供更 高的分辨率。
[0032] 術(shù)語"肽"、"多肽"和"蛋白"均指包含兩個或多個通過肽健相互連接的氨基酸的 分子。這些術(shù)語涵蓋例如天然和人工蛋白、蛋白片段和蛋白序列的多肽類似物(例如突變蛋 白、變異體和融合蛋白）以及轉(zhuǎn)錄后或否則為共價或非共價修飾的蛋白。肽、多肽或蛋白可 為單體或多聚體。
[0033] 多肽(例如抗體）的"變異體"包含相對于另一多肽序列在氨基酸序列中插入、缺失 和/或替換了一個或多個氨基酸殘基的氨基酸序列。本發(fā)明的變異體包括融合蛋白。
[0034] 多肽的"衍生物"為經(jīng)化學修飾的多肽(例如，抗體)，例如通過與其它化學部分例 如聚乙二醇、白蛋白（例如人血清白蛋白）結(jié)合、磷酸化和糖基化。除非另外說明，術(shù)語"抗 體"包括除包含兩個全長重鏈和兩個全長輕鏈的抗體外的其衍生物，變異體、片段和突變蛋 白，其實例見下文。
[0035] "抗體"為包含與抗原結(jié)合部分并任選為允許抗原結(jié)合部分采取促進該抗體與該 抗原結(jié)合的構(gòu)象的支架或框架部分的蛋白?？贵w的實例包括抗體、抗體片段(例如抗體的 抗原結(jié)合部分)、抗體衍生物和抗體類似物。該抗體可包含例如可選擇的蛋白支架或具有移 植CDRs或CDRs衍生物的人工支架。該支架包括但不限于包含被引入的例如以穩(wěn)定化該 抗原結(jié)合蛋白的三維結(jié)構(gòu)的抗體衍生支架以及包含例如生物相容性多聚體的全合成支架。 參見，例如，Korndorfer 等，2003, Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics, Volume 53，Issue 1:121-129; Roque 等，2004，Biotechnol. Prog. 20:639-654。此外， 可使用模擬肽抗體（"PAMs"）以及基于模擬抗體的支架，其如支架一樣利用纖維蛋白連接 素。
[0036] 抗體可具有例如天然免疫球蛋白的結(jié)構(gòu)。"免疫球蛋白"為四聚體分子。在天然的 免疫球蛋白中，各四聚體由兩個相同的多肽鏈對組成，各對具有一個"輕"（約25 kDa)和一 個"重"鏈（約50-70kDa)。各鏈的氨基端包括約100至110或更多氨基酸的可變結(jié)構(gòu)域， 主要與抗原識別相關。各鏈的羧基端部分確定了主要與效應器作用相關的恒定區(qū)。人的輕 鏈分為κ和λ輕鏈。重鏈分為μ、δ、α或ε，并確定了抗原的同種型，例如分別為IgM、 IgD、IgG、IgA和IgE。在輕鏈和重鏈中，可變和恒定區(qū)由約12或更多個氨基酸的"J"區(qū)連 接，重鏈也包括約10多個氨基酸的"D"區(qū)。參見，F(xiàn)undamental Immunology Ch.7(Paul編 著，第2版.Raven Press (1989))(其完整內(nèi)容以參考形式并于本文用于任何目的)。各 輕/重鏈對的可變區(qū)形成抗體結(jié)合位點，這樣一個完整的免疫球蛋白具有兩個結(jié)合位點。 [0037] 天然免疫球蛋白鏈顯示出由三個高度可變區(qū)連接的相對保守骨架區(qū)（FR)的相同 基本結(jié)構(gòu)，也被稱作互補決定區(qū)或⑶Rs。從N端到C端，輕和重鏈均包含結(jié)構(gòu)域FR1XDR1、 FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。各結(jié)構(gòu)域氨基酸的分配與Kabat等在SequencesofProteins of Immunological Interest,第 5 版，，US Dept, of Health and Human Services, PHS, NIH，NIH Publication no. 91-3242. 1991 中的定義一致。
[0038] 除非另外指明，"抗體"指完整的免疫球蛋白或其可與完整抗體競爭特異性結(jié)合的 抗原結(jié)合部分?？捎芍亟MDNA技術(shù)或通過酶或化學裂解完整抗體生產(chǎn)抗原結(jié)合部分。抗原 結(jié)合部分包括，尤其是^&1^&13'、？(&13'） 2、？1結(jié)構(gòu)域抗體（(^1^)，包括互補決定區(qū)（0)1^) 的片段、單鏈抗體（scFv)、嵌合抗體、雙鏈抗體（diabodies)、三鏈抗體（triabodies)、四鏈 抗體（tetrabodies)和至少包含足以賦予多肽特異抗原結(jié)合的免疫球蛋白的一部分的多 肽。
[0039] Fab片段為具有'、VH、（^和CH1結(jié)構(gòu)域的單價片段；F(ab'）2片段為具有兩個在 鉸鏈區(qū)由二硫鍵連接的Fab片段的二價片段；Fd片段具有V H或 '結(jié)構(gòu)域；dAb片段具有VH 結(jié)構(gòu)域、'結(jié)構(gòu)域，或VH或 '結(jié)構(gòu)域的抗原結(jié)合片段(美國專利號6846634、6696245,美國 專利申請
【發(fā)明者】張 成, 汪笑峰, 景書謙 申請人:杭州鴻運華寧生物醫(yī)藥工程有限公司