專利名稱：細(xì)胞培養(yǎng)容器、細(xì)胞培養(yǎng)容器的制造方法以及培養(yǎng)細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到細(xì)胞剝離特性優(yōu)良的細(xì)胞培養(yǎng)容器、該細(xì)胞培養(yǎng)容器的制造方法以及通過該細(xì)胞培養(yǎng)容器培養(yǎng)的培養(yǎng)細(xì)胞。
背景技術(shù)：
近些年來，用于醫(yī)療目的的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)不斷進(jìn)步，并已實(shí)際應(yīng)用于皮膚移植等領(lǐng)域。另外，并未停留在從少量細(xì)胞向皮膚等組織的移植，面向角膜、牙齒、骨骼、臟器等復(fù)雜器官的自體移植及異體移植的培養(yǎng)技術(shù)也取得了進(jìn)步。
在細(xì)胞培養(yǎng)中需使用玻璃或樹脂制成的培養(yǎng)皿等容器。例如，公開了下面所述的培養(yǎng)皿。利用移液器將規(guī)定濃度的膠原溶液注入到培養(yǎng)容器中，使之形成表面，涂布后，干燥15分鐘～72小時(shí)?；蛘?，將規(guī)定濃度的膠原溶液涂布于硅膜等具有伸縮性的培養(yǎng)基材上，在15～42℃的孵箱中進(jìn)行20～120分鐘的聚合，之后將所述硅膜等具有伸縮性的培養(yǎng)基材放置在UV燈下15分鐘～72小時(shí)，待膠原干燥之后再用磷酸緩沖液潤(rùn)濕，之后通過使之伸展10～40％并固定等方法制成細(xì)胞培養(yǎng)用器皿(參見專利文獻(xiàn)1)。
根據(jù)上述第1種方法，雖然可以在與細(xì)胞具有親和性的膠原上進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。但存在的問題是由于細(xì)胞與培養(yǎng)容器的附著力較強(qiáng)，因此，難以剝離細(xì)胞。對(duì)于這種附著力，如果以機(jī)械方式剝離細(xì)胞，則會(huì)對(duì)細(xì)胞造成物理性損傷，如果用胰蛋白酶等酶進(jìn)行化學(xué)處理，則會(huì)破壞細(xì)胞表面的膜蛋白質(zhì)，從而降低移植后的細(xì)胞向組織的固著率。
發(fā)明人等在以下的專利文獻(xiàn)中披露了解決上述問題的細(xì)胞培養(yǎng)容器。使用的方法為通過在設(shè)有能夠控制形狀的有機(jī)聚合物制成的柱狀微小突起群的功能性基板上進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，易于將培養(yǎng)液分配至細(xì)胞下部，并且，可改善細(xì)胞的剝離性(參見專利文獻(xiàn)2)。
上述第2種方法通過減少細(xì)胞與培養(yǎng)容器表面接觸的部位來降低表面附著力，由此來解決剝離問題。但是，其存在的問題為在使用此方法時(shí)，在片材的端部、或放置有功能性基板的器皿的底面上未設(shè)置機(jī)能性基板之處也會(huì)吸附細(xì)胞，因此會(huì)降低細(xì)胞的培養(yǎng)效率。此外，存在的問題還有當(dāng)在微小突起的上面培養(yǎng)的細(xì)胞表現(xiàn)出與在通常的培養(yǎng)容器中培養(yǎng)時(shí)不同的性狀時(shí)，在這種微小突起的上面培養(yǎng)的細(xì)胞與在沒有微小突起的平滑部上培養(yǎng)的細(xì)胞混合在一起了。
特開2002-142751號(hào)公報(bào)(實(shí)施例A)[專利文獻(xiàn)2]特開2004-170935號(hào)公報(bào)(實(shí)施例5)發(fā)明內(nèi)容發(fā)明所要解決的的問題本發(fā)明的目的在于提供細(xì)胞培養(yǎng)容器，其能夠通過簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)防止剝離時(shí)對(duì)細(xì)胞的損傷，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的輸送及舊廢物的排出，同時(shí)，能夠提高這種結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)的培養(yǎng)效率的改善效果。
用于解決問題的手段為了解決上述課題，本發(fā)明首先提供了一種細(xì)胞培養(yǎng)容器，該容器的特征在于形成具有等效直徑比在培養(yǎng)容器中培養(yǎng)的細(xì)胞小的多個(gè)突起物的培養(yǎng)面以及圍繞培養(yǎng)面的培養(yǎng)面?zhèn)缺?，培養(yǎng)面?zhèn)缺诘母鱾€(gè)部位與其附近的培養(yǎng)面上的突起物的間隔小于培養(yǎng)細(xì)胞的直徑。由于細(xì)胞培養(yǎng)容器的培養(yǎng)面端部附近無未形成突起物的部位，因此，能夠更有效地發(fā)揮突起物賦予培養(yǎng)細(xì)胞的效果。在這里之所以使用“等效直徑”這一術(shù)語，是因?yàn)橥黄鹞锏钠拭娌⒉灰欢ㄊ菆A形，也可能是橢圓形、多邊形、非對(duì)稱形等形狀，為了包含所有這些形狀，在本發(fā)明中使用了等效直徑。在本發(fā)明中，等效直徑指突起物底面上剖面的直徑。
不能忽視對(duì)容器粘附力較強(qiáng)的細(xì)胞系對(duì)培養(yǎng)面?zhèn)缺诘奈?。另外，存在在這樣的側(cè)壁上培養(yǎng)的細(xì)胞不喜歡混合到培養(yǎng)面上的細(xì)胞系。對(duì)于這種細(xì)胞系而言，最好在培養(yǎng)面?zhèn)缺谏弦苍O(shè)置與培養(yǎng)面相同的突起物，但是在這樣做有困難的情況下，也可以通過表面結(jié)構(gòu)或材質(zhì)使培養(yǎng)面?zhèn)缺诰哂屑?xì)胞非接合性。此外，可以通過在具有微小突起物的培養(yǎng)面與培養(yǎng)面?zhèn)缺谥g形成圍繞培養(yǎng)面且比培養(yǎng)面低的緩沖面，由此可以防止吸附于培養(yǎng)面?zhèn)缺谏系募?xì)胞移動(dòng)并移動(dòng)至具有突起物的培養(yǎng)面。即使在這種情況下，仍可以通過使培養(yǎng)面的微小突起物中離緩沖面最近的微小突起物與培養(yǎng)面端部間的距離小于培養(yǎng)細(xì)胞的直徑，從而能夠更有效地發(fā)揮在培養(yǎng)面上突起物賦予培養(yǎng)細(xì)胞的效果。
為了遍布培養(yǎng)液，可以對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)容器的培養(yǎng)面表面進(jìn)行親水處理，以促進(jìn)培養(yǎng)液的流動(dòng)。但是，根據(jù)培養(yǎng)的細(xì)胞種類，必須對(duì)容器表面進(jìn)行疏水處理，或用金屬或蛋白質(zhì)等覆蓋容器表面。因此，本發(fā)明可以僅對(duì)形成于細(xì)胞培養(yǎng)容器的微小突起物與細(xì)胞接觸的前端部實(shí)施細(xì)胞培養(yǎng)必需的疏水處理，或者金屬包被、蛋白質(zhì)包被等細(xì)胞培養(yǎng)所必需的處理。
此外，在對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞要求取向性等特定形狀時(shí)，可根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞的形狀對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)容器底面的一部分進(jìn)行疏水處理等特定處理。在本發(fā)明中，可在容器表面有選擇地對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)容器表面微小突起物的前端部進(jìn)行疏水處理或金屬包被、蛋白質(zhì)包被等細(xì)胞培養(yǎng)所必需的處理。
發(fā)明效果通過采用本發(fā)明，可防止剝離時(shí)對(duì)細(xì)胞的損傷，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的輸送及舊廢物質(zhì)的排出，同時(shí)，通過設(shè)置這些突起物能夠獲得進(jìn)一步提高培養(yǎng)效率的改善效果。此外，還具有防止在未設(shè)置突起物的部位培養(yǎng)的細(xì)胞與突起物上的細(xì)胞混合的效果。


圖1為模式圖，其顯示了本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)容器的一個(gè)例子的鳥瞰圖。
圖2為模式圖，其顯示了本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)容器的一個(gè)例子的剖面圖。
圖3為模式圖，其顯示了本發(fā)明中細(xì)胞培養(yǎng)容器的另一個(gè)例子的鳥瞰圖。
圖4為模式圖，其顯示了本發(fā)明中細(xì)胞培養(yǎng)容器的另一個(gè)例子的剖面圖。
圖5為模式圖，其顯示了本發(fā)明中細(xì)胞培養(yǎng)容器的第三個(gè)例子的鳥瞰圖。
圖6為模式圖，其顯示了本發(fā)明中細(xì)胞培養(yǎng)容器的第三個(gè)例子的剖面圖。
圖7為顯示本發(fā)明中細(xì)胞培養(yǎng)容器的制造工序的模式圖。
圖8為顯示本發(fā)明中另外的細(xì)胞培養(yǎng)容器的制造工序的模式圖。
圖9為顯示本發(fā)明中第三種細(xì)胞培養(yǎng)容器的制造工序的模式圖。
圖10為顯示本發(fā)明中細(xì)胞培養(yǎng)容器的使用方法的模式圖。
圖11為模式圖，其顯示了在培養(yǎng)面沒有突起物的區(qū)域的細(xì)胞培養(yǎng)容器中的細(xì)胞培養(yǎng)。
圖12為顯示本發(fā)明中突起物的掃描電子顯微鏡照片的模式圖。
圖13為顯示實(shí)施例1中模具的制造工序的模式圖。
圖14為模式圖，其顯示了實(shí)施例2中培養(yǎng)面?zhèn)缺诘镍B瞰圖。
圖15為模式圖，其顯示了實(shí)施例2中培養(yǎng)面?zhèn)缺诘闹圃旃ば颉?br> 圖16為模式圖，其顯示了實(shí)施例4中細(xì)胞培養(yǎng)容器的鳥瞰圖。
圖17為模式圖，其顯示了實(shí)施例4中突起物的掃描電子顯微鏡照片。
符號(hào)說明100細(xì)胞培養(yǎng)容器101突起物102培養(yǎng)面103培養(yǎng)面?zhèn)缺?04緩沖面105容器原料106、117模具107培養(yǎng)液108細(xì)胞109附著于平坦部的細(xì)胞110培養(yǎng)面基底111第一模具原型部件112第二模具原型部件113模具原型114復(fù)制材料115模具復(fù)制品116鎳板
具體實(shí)施例方式
下面，參照附圖對(duì)本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)容器進(jìn)行詳細(xì)說明。
圖1是表示本發(fā)明中細(xì)胞培養(yǎng)容器100的第一形式的鳥瞰圖。在裝入細(xì)胞及其培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)容器100的培養(yǎng)面102上形成等效直徑小于培養(yǎng)細(xì)胞的突起物101。這些突起物101的等效直徑優(yōu)選在10nm以上，10μm以下，高度優(yōu)選在10nm以上、1mm以下，另外，為了減少與細(xì)胞的接觸面積，將其設(shè)定為遠(yuǎn)小于細(xì)胞直徑，例如細(xì)胞直徑的1/5以下。突起物101相互之間的間隔也必須為小于細(xì)胞直徑的值。換句話說，使突起物的剖面面積小于細(xì)胞的剖面面積，形成在細(xì)胞剖面內(nèi)布置多個(gè)突起的形狀。此外，由于必須使培養(yǎng)液充分浸透到突起物101的下部，因此，這些突起物101的高度要足夠高，例如為等效直徑以上，最好是等效直徑的5倍以上。但是，從結(jié)構(gòu)強(qiáng)度來考慮，最好在100倍以下。雖然一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)容器100可以只有一個(gè)培養(yǎng)面102，但也可以如圖1所示，通過培養(yǎng)面?zhèn)缺?03將其分隔為2個(gè)以上，從而利用一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)容器100就可在多種條件下培養(yǎng)細(xì)胞。
圖2(a)為概念圖，其顯示了本發(fā)明中細(xì)胞培養(yǎng)容器100的第一形式中圖1所示的AB之間的剖面圖。圖2(b)為重點(diǎn)表示圖2(a)的培養(yǎng)面102與培養(yǎng)面?zhèn)缺?03之間邊界部的概念圖。突起物101一直延伸到培養(yǎng)面?zhèn)缺?03附近，突起物101實(shí)際上全面覆蓋了培養(yǎng)面102。將位于培養(yǎng)面?zhèn)缺?03與培養(yǎng)面102的邊界線處的任意位置與最近的突起物101之間的距離I設(shè)計(jì)為小于培養(yǎng)細(xì)胞的等效直徑。含有突起物101的培養(yǎng)面102與培養(yǎng)面?zhèn)缺?03形成一體，并由相同的材料形成。如果在培養(yǎng)面?zhèn)缺?03也形成突起物101，則能夠更有效地發(fā)揮突起物101的效果，因此是最優(yōu)選的，但在加工困難的情況下，可以采用比培養(yǎng)面102更不易使細(xì)胞吸附的其它表面結(jié)構(gòu)，或者實(shí)施具有細(xì)胞非粘附性的表面處理。培養(yǎng)面?zhèn)缺?03的高度優(yōu)選能夠保持培養(yǎng)液不從培養(yǎng)面102的表面溢出的高度。雖然這一高度可根據(jù)培養(yǎng)面102的面積及形狀、親水性及分布在培養(yǎng)面102上的培養(yǎng)液的量選擇最佳值，但是，培養(yǎng)面?zhèn)缺?03距離培養(yǎng)面102的高度h優(yōu)選在0.05mm以上、100mm以下。此外，該培養(yǎng)面?zhèn)缺?03優(yōu)選高于培養(yǎng)面102上的突起物101，更優(yōu)選設(shè)定為突起物101高度的10倍以上。雖然該高度取決于培養(yǎng)面102的形狀，但是，高度的下限取決于能否在具有突起物101的培養(yǎng)面102上保持適量的培養(yǎng)液，高度的上限取決于對(duì)培養(yǎng)液或細(xì)胞的操作性。此外，由于培養(yǎng)面?zhèn)缺?03相對(duì)于培養(yǎng)面102的傾斜角度e會(huì)妨礙培養(yǎng)液的保持和細(xì)胞在培養(yǎng)面?zhèn)缺?03上的附著，因此，優(yōu)選45度以上。另外，也可根據(jù)需要形成具有多個(gè)臺(tái)階的階梯狀培養(yǎng)面?zhèn)缺?03，以便于在培養(yǎng)面?zhèn)缺?03上形成表面結(jié)構(gòu)。
圖3是顯示本發(fā)明中細(xì)胞培養(yǎng)容器100的第二種形式的鳥瞰圖。雖然培養(yǎng)面102上的突起物101的形狀與第一種形式相同，但是，培養(yǎng)面?zhèn)缺?03由細(xì)胞附著性低于培養(yǎng)面102的材料形成，并連接至培養(yǎng)面102上。培養(yǎng)面?zhèn)缺?03與培養(yǎng)面102之間的接合采用可在不損傷突起物101的情況下可拆卸的結(jié)構(gòu)，從而易于例如培養(yǎng)后的觀察操作。
圖4為概念圖，其顯示了本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)容器100的第二種形式中圖1所示的AB之間剖面圖。與第一種形式相同，形成突起物101直至培養(yǎng)面?zhèn)缺?03附近，并且，突起物101實(shí)質(zhì)上覆蓋了培養(yǎng)面102的整個(gè)表面。將位于培養(yǎng)面?zhèn)缺?03與培養(yǎng)面102的邊界線處的任意位置與最近的突起物101之間的距離I設(shè)計(jì)為小于所培養(yǎng)細(xì)胞的等效直徑。
圖5為顯示本發(fā)明中細(xì)胞培養(yǎng)容器100的第三種形式的鳥瞰圖。培養(yǎng)面102上的突起物101的形狀與第一、第二種形式相同，在培養(yǎng)面102與培養(yǎng)面?zhèn)缺?03之間圍繞培養(yǎng)面102設(shè)置位置比培養(yǎng)面102低的緩沖面104。這樣，即使細(xì)胞吸附于培養(yǎng)面?zhèn)缺?03上，通過形成該緩沖面104，仍能夠防止吸附于培養(yǎng)面?zhèn)缺?03上的細(xì)胞移動(dòng)到培養(yǎng)面102上。
圖6為概念圖，其顯示了本發(fā)明中細(xì)胞培養(yǎng)容器100的第三種形式中圖1所示的AB之間的剖面。突起物101形成至緩沖面104附近，突起物101實(shí)質(zhì)上全面覆蓋了培養(yǎng)面102。將培養(yǎng)面102的緩沖面104側(cè)的端部的各部位與其最近的突起物101之間的距離I設(shè)計(jì)為所培養(yǎng)細(xì)胞的等效直徑以下。緩沖面104最好具有阻止移動(dòng)到其上的細(xì)胞進(jìn)一步向培養(yǎng)面102移動(dòng)的深度。雖然該深度因細(xì)胞種類及培養(yǎng)條件而不同，但是，距離培養(yǎng)面102的高度應(yīng)在0.01mm以上，為了形成可使培養(yǎng)液浸透培養(yǎng)面102的結(jié)構(gòu)，定為小于培養(yǎng)面?zhèn)缺?03的高度的值。另外，為了阻止細(xì)胞向培養(yǎng)面102移動(dòng)，緩沖面的寬度(從培養(yǎng)面?zhèn)缺谥僚囵B(yǎng)面端部的距離)d最好大于培養(yǎng)細(xì)胞的等效直徑。
本發(fā)明中細(xì)胞培養(yǎng)容器100的材料雖沒有特殊限制，但可根據(jù)所需的加工精度、表面特性、光學(xué)特性、強(qiáng)度等進(jìn)行選擇。具體來說，可以采用聚乙烯、聚丙烯、聚乙烯醇、聚偏氯乙烯、聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯、聚氯乙烯、聚苯乙烯、ABS樹脂、AS樹脂、丙烯酸樹脂、聚酰胺、聚縮醛、聚對(duì)苯二甲酸丁二醇酯、玻璃強(qiáng)化聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯、聚碳酸酯、改性聚苯醚、聚苯硫醚、聚醚醚酮、液晶聚合物、氟樹脂、聚芳酯、聚砜、聚醚砜、聚酰胺酰亞胺、聚醚酰亞胺、熱塑性聚酰亞胺等熱塑性樹脂、或酚醛樹脂、蜜胺樹脂、尿素樹脂、環(huán)氧樹脂、不飽和聚酯樹脂、醇酸樹脂、硅樹脂、鄰苯二甲酸二烯丙酯樹脂、聚酰胺二馬來酰亞胺、聚二酰胺三氮雜茂等熱固性樹脂、以及混合了上述二種以上的材料。此外，也可以使用玻璃類等無機(jī)物。由于細(xì)胞培養(yǎng)容器100的材料一般要求對(duì)細(xì)胞具有親和性，因此，必須根據(jù)培養(yǎng)的細(xì)胞確認(rèn)親和性來選擇。另外，為了易于進(jìn)行培養(yǎng)的評(píng)價(jià)，在細(xì)胞培養(yǎng)容器100中最好使用對(duì)于觀察時(shí)所用波長(zhǎng)的光是透明的且實(shí)質(zhì)上不會(huì)產(chǎn)生該波長(zhǎng)的熒光的材料。此外，例如，除了聚乳酸、聚己內(nèi)酯等脂肪族聚酯或多酸酐、合成多肽等合成系以外，通過使用殼聚糖或纖維素等天然物系等生物降解性樹脂，可以構(gòu)成在培養(yǎng)后能夠易于生物降解細(xì)胞培養(yǎng)容器100。
本發(fā)明中突起物101的材料雖沒有特殊限制，但可根據(jù)所需的加工精度、表面特性、光學(xué)特性、強(qiáng)度等選擇上述樹脂組合物、或玻璃類等無機(jī)物。優(yōu)選這些突起群與培養(yǎng)面102形成一體。
圖7顯示了形成本發(fā)明中細(xì)胞培養(yǎng)容器100的第一種形式的方法。圖7顯示了通過所謂納米壓印法(nanoimprint)形成細(xì)胞培養(yǎng)容器100。將容器原料105加熱軟化，將形成限定突起物101、培養(yǎng)面102及培養(yǎng)面?zhèn)缺?03形狀的模具106按壓在該容器原料105上，以此方式將模具106的形狀轉(zhuǎn)印至容器原料105上，從而獲得具有突起物101、培養(yǎng)面102、及培養(yǎng)面?zhèn)缺?03的細(xì)胞培養(yǎng)容器100。
圖8顯示了形成本發(fā)明中細(xì)胞培養(yǎng)容器100的第二種形式的方法。圖8顯示了通過所謂納米壓印法形成細(xì)胞培養(yǎng)容器100。將容器原料105加熱軟化，將形成限定突起物101、培養(yǎng)面102的模具106按壓在該容器原料105上，由此將模具106的形狀轉(zhuǎn)印到容器原料105上。之后，通過使另外形成的培養(yǎng)面?zhèn)缺?03與培養(yǎng)面102接合，從而能夠獲得細(xì)胞培養(yǎng)容器100。
圖9顯示了形成本發(fā)明中細(xì)胞培養(yǎng)容器100的第三種形式的方法。圖9顯示了使用所謂納米壓印法形成細(xì)胞培養(yǎng)容器100。將容器原料105加熱軟化，將形成限定突起物101、培養(yǎng)面102、培養(yǎng)面?zhèn)缺?03及緩沖面104的形狀的模具106按壓在該容器原料105上，由此將模具106的形狀轉(zhuǎn)印到容器原料105上，從而能夠獲得具有突起物101、培養(yǎng)面102、培養(yǎng)面?zhèn)缺?03及緩沖面104的細(xì)胞培養(yǎng)容器100。
此外，在上述第一至第三種形式的形成方法中，也可采用高縱橫比納米壓印法，該方法在將模具106按壓在容器原料105上后，使模具106從容器原料105上剝離時(shí)，通過使在模具106中與突起物101相當(dāng)?shù)男螤顑?nèi)填充的容器原料105延伸，從而能夠形成縱橫比高于模具106上形狀的突起物101。通過該方法，可以方便地形成高縱橫比的圖案。
以上在各個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)容器100的形成中所用的模具106要求在表面形成與細(xì)胞培養(yǎng)容器100上的突起物101相當(dāng)?shù)男螤?，即等效直徑?0nm以上且10μm以下、高度在10nm以上且1mm以下的形狀。因此，模具至少含有金屬、碳或硅等無機(jī)物、及樹脂組合物的一種，其表面形狀通過光刻法、電子束直接描繪法、粒子束加工法、掃描微探針加工法等微加工法或微粒子的自身組織化或由這些方法形成的主模板(マスタ)、通過納米壓印法、噴射成型法、無電解電鍍法等進(jìn)行形狀轉(zhuǎn)印來形成。此外，與突起物101的微小形狀相比，規(guī)定培養(yǎng)面?zhèn)缺?03的形狀為宏觀尺寸的形狀，若在形成這種形狀時(shí)并用機(jī)械加工及使多個(gè)模具接合等方法，則可形成高精度的模具106。此外，通過在規(guī)定宏觀尺寸的方法中組合焦點(diǎn)深度大的光刻法、激光加工法或微粒子的本身組織化法等方法，能夠?qū)ε囵B(yǎng)面?zhèn)缺?03實(shí)施微細(xì)加工，從而使其具有細(xì)胞非附著性。在圖7～圖9中，形成突起物101的方法雖采用了將模具106壓在軟化后的容器原料105上的所謂納米壓印法，但是，除此之外也可使用以噴射成型法為代表的樹脂成型法、或者通過不用模具的激光加工法等直接進(jìn)行加工。
在本發(fā)明中，細(xì)胞培養(yǎng)容器根據(jù)需要，實(shí)施通過浸入含有過氧化氫或臭氧等氧化劑的溶劑或紫外線照射、等離子處理等氣相處理進(jìn)行親水處理，或者通過浸入溶液形成的多聚賴氨酸、白蛋白、膠原蛋白、纖連蛋白、血纖蛋白原、玻連蛋白、層粘連蛋白等蛋白質(zhì)包被，或者通過電鍍、氣相蒸鍍法形成的金屬包被，通過光或電子束、粒子束等進(jìn)行一項(xiàng)以上的表面改性，并實(shí)施細(xì)胞培養(yǎng)所必需的表面處理。此外，也可使用由硅橡膠或樹脂膜、金屬薄膜等彈性體形成的壓?；虿糠址峙浞ㄟM(jìn)行加熱，或用含有樹脂膠、硅潤(rùn)滑脂、氟系包被劑等疏水劑或蛋白質(zhì)的溶劑進(jìn)行部分涂布，根據(jù)需要進(jìn)行表面內(nèi)的分布，例如僅在突起物101的前端部或培養(yǎng)面?zhèn)缺?03進(jìn)行表面處理。
與前面所述的培養(yǎng)面102不同，圖3、圖4、圖8中使用的培養(yǎng)面?zhèn)缺?03是通過機(jī)械加工、成型加工等形成的。其材料可從前面所述的細(xì)胞培養(yǎng)容器100使用的材料中選擇。此處，若利用與培養(yǎng)面102相同的材料形成培養(yǎng)面?zhèn)缺?03，則能夠形成接合后的形狀保持和接合強(qiáng)度優(yōu)良的結(jié)構(gòu)，其外觀為如圖1所示的結(jié)構(gòu)。在所述培養(yǎng)面?zhèn)缺?03與培養(yǎng)面102的接合時(shí)，除使用由精度高的加熱加壓或振動(dòng)熔接、紅外線激光熔接等形成的熱接合以外，還可使用粘合劑。但是，在熱接合時(shí)，必須選擇不會(huì)使培養(yǎng)面102上的突起物101表現(xiàn)出超過允許范圍的變形的條件，在使用粘合劑接合時(shí)，必須選擇粘合劑不會(huì)蔓延到培養(yǎng)面102表面，另外，固化后細(xì)胞不會(huì)吸附于表面且溶出物對(duì)細(xì)胞沒有毒性的條件。此外，如果使用以PDMS(聚二甲基硅氧烷)樹脂為代表的具有彈性且與細(xì)胞培養(yǎng)容器100的粘附性很高的材料形成培養(yǎng)面?zhèn)缺?03，則只要將培養(yǎng)面?zhèn)缺?03與細(xì)胞培養(yǎng)容器100貼緊就可獲得足夠的粘結(jié)強(qiáng)度。若通過這種結(jié)構(gòu)形成培養(yǎng)面?zhèn)缺?03，則可以在不損傷突起物101和其上培養(yǎng)的細(xì)胞的前提下，取下培養(yǎng)面?zhèn)缺?03，從而易于進(jìn)行例如培養(yǎng)后的觀察操作。此外，為了減小培養(yǎng)面?zhèn)缺?03與培養(yǎng)面102表面的突起物101之間的距離，必須預(yù)先精確地使形成突起物101的位置與培養(yǎng)面?zhèn)缺?03的形狀或位置吻合。因此，如圖8(d)所示，可以使形成突起物101的范圍大于培養(yǎng)面102，在接合時(shí)通過培養(yǎng)面?zhèn)缺?03僅將培養(yǎng)面?zhèn)缺?03正下方的突起物101壓下，或者用培養(yǎng)面?zhèn)缺?03的下部將突起物101覆蓋，從而可減小培養(yǎng)面102中剩余的突起物101與培養(yǎng)面?zhèn)缺?03之間的距離。
本發(fā)明中細(xì)胞培養(yǎng)容器100雖具有二個(gè)以上的多個(gè)培養(yǎng)面102，但使用時(shí)也可將細(xì)胞培養(yǎng)容器100的培養(yǎng)面102單獨(dú)拆分以便在其它培養(yǎng)場(chǎng)所或其它的培養(yǎng)時(shí)使用。而且，還可將細(xì)胞培養(yǎng)容器100的一部分中妨礙培養(yǎng)的部分切斷除去。在進(jìn)行這種切斷的情況下，通過預(yù)先在細(xì)胞培養(yǎng)容器100中加設(shè)有助于切斷的結(jié)構(gòu)，例如切開線或能夠彎折切斷的切割線、切口，就能容易地進(jìn)行切斷。
本發(fā)明中細(xì)胞培養(yǎng)容器100在制造后必須將其運(yùn)送至實(shí)際培養(yǎng)細(xì)胞的場(chǎng)所。此時(shí)，必須防止從外界混入塵土、細(xì)菌等異物。因此，必須使用將細(xì)胞培養(yǎng)容器100整體裝入袋中并通過熱封等封閉入口或通過貼膜密封等方法使培養(yǎng)面102與外界隔離以便僅使培養(yǎng)面102及培養(yǎng)面?zhèn)缺?03中培養(yǎng)時(shí)與培養(yǎng)液接觸的部分封閉的包裝工序。為了在包裝后殺滅殘留于培養(yǎng)面102上的微生物，最好進(jìn)行滅菌處理。雖然代表性的滅菌處理方法是使用高溫蒸汽的高壓滅菌法，但其存在因細(xì)胞培養(yǎng)容器100的材料或突起物101形狀而由高溫蒸汽引發(fā)變形、變質(zhì)的可能性。因此，滅菌處理最好采用以低于構(gòu)成細(xì)胞培養(yǎng)容器的材料的玻璃化轉(zhuǎn)變點(diǎn)的溫度實(shí)施的UV照射或環(huán)氧乙烷氣體滅菌、伽馬射線滅菌等方法。當(dāng)然，在采用耐熱樹脂或玻璃類的情況下，則可以使用高壓滅菌法。滅菌處理一般是在包裝后進(jìn)行的，但可根據(jù)滅菌處理的方法決定是否需要選擇可透過蒸汽的包裝，并且需要在包裝上設(shè)置滅菌處理前后會(huì)發(fā)生變化的指示物以區(qū)分是否進(jìn)行了滅菌處理。
圖10顯示了本發(fā)明中細(xì)胞培養(yǎng)容器100的使用方法。將培養(yǎng)液107注滿培養(yǎng)面102，在突起物101上布置細(xì)胞108。之后，通過一般方法培養(yǎng)細(xì)胞108。在本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)容器100中，由于細(xì)胞108與培養(yǎng)面102的接觸是通過突起物101形成點(diǎn)接觸的，因此，可防止細(xì)胞108剝離時(shí)產(chǎn)生損傷。此外，還可通過培養(yǎng)的細(xì)胞108改變突起物101的形狀或?qū)ν黄鹞?01的表面處理，以便在剝離時(shí)不產(chǎn)生損傷地形成品質(zhì)優(yōu)良的培養(yǎng)細(xì)胞。此外，在本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)容器100中，由于突起物101實(shí)際上全面覆蓋了培養(yǎng)面102，因此，在圖11所示的端部存在于平面部的細(xì)胞培養(yǎng)容器100中附著于培養(yǎng)面102的平坦部上的細(xì)胞109是不存在的，因此，可有效發(fā)揮突起物101對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)的改善效果。此外，通過實(shí)質(zhì)上消除細(xì)胞108附著于培養(yǎng)面102上的平坦部區(qū)域，并且根據(jù)需要形成阻礙細(xì)胞108吸附于培養(yǎng)面?zhèn)缺?03上、或即使吸附，也可防止吸附于該部位的細(xì)胞108轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)面102上的結(jié)構(gòu)，由此能夠獲得在突起物101對(duì)細(xì)胞108具有特殊影響時(shí)，防止混合在未形成突起物101的部位培養(yǎng)的細(xì)胞108的效果。細(xì)胞108的概念也包含以培養(yǎng)組織、器官為代表的組織化培養(yǎng)細(xì)胞。
如圖10所示，在本發(fā)明中細(xì)胞培養(yǎng)容器100在培養(yǎng)面102處設(shè)有培養(yǎng)液107和細(xì)胞108的狀態(tài)下，根據(jù)常規(guī)方法，通常是置于恒溫恒濕的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并根據(jù)需要進(jìn)行培養(yǎng)液107的更換、細(xì)胞108的取出、添加試劑、振蕩操作、顯微鏡觀察等操作，有時(shí)還需在用冷凍機(jī)進(jìn)行冷凍操作的單元操作間、進(jìn)行操作的裝置之間移動(dòng)。在進(jìn)行這些操作和移動(dòng)時(shí)，要防止細(xì)胞培養(yǎng)容器100彎曲變形而使培養(yǎng)液107、細(xì)胞108偏斜、或從培養(yǎng)面102泄漏，因此，細(xì)胞培養(yǎng)容器100最好整體具有足夠的剛性。例如，至少細(xì)胞培養(yǎng)容器100的周邊部位或培養(yǎng)面102之外的部分區(qū)域采用厚度大于0.5mm的剛性結(jié)構(gòu)。此外，為了減輕構(gòu)成培養(yǎng)面102的部件中的吸光或螢光，促進(jìn)來自外部的溫度傳導(dǎo)，培養(yǎng)面102可以設(shè)計(jì)為比周邊部位薄。為了獲得更輕的高剛性的結(jié)構(gòu)，通過在細(xì)胞培養(yǎng)容器100的端部等處進(jìn)行彎折而形成增加強(qiáng)度的區(qū)域，或者使培養(yǎng)面?zhèn)缺?03相對(duì)于培養(yǎng)面102的反向側(cè)為中空結(jié)構(gòu)，從而能夠除去不影響強(qiáng)度及操作性的部位。此外，如果細(xì)胞培養(yǎng)容器100單獨(dú)個(gè)體不具有足夠的強(qiáng)度時(shí)，可以在細(xì)胞培養(yǎng)容器100中形成培養(yǎng)面102之后，在細(xì)胞培養(yǎng)容器100安裝其它具有剛性的部件，由此賦予剛性。
下面，通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
實(shí)施例1下面對(duì)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例進(jìn)行說明。圖12為通過本實(shí)施例制成的培養(yǎng)面102的掃描型電子顯微鏡照片的模式圖。在培養(yǎng)面102中形成多個(gè)突起物101。突起物101的材料為聚苯乙烯，其分子量為2000至384萬，分子量的上限還可擴(kuò)展到600萬。
突起物101是底面直徑為500nm、高度為1μm的圓柱形狀。高度與一邊之比為2，可知大于1。突起物101的間隔為1μm，這個(gè)值為小于通常細(xì)胞直徑的值。此外，突起物101的排列法為圖12所示的2維正方形排列。
突起物101前端部的直徑為400nm，小于底面部，可知呈末端張開形狀。在本實(shí)施例中，突起物101的形狀雖然是從底部向前端部逐漸變細(xì)的形狀，但是，其它例如不存在變細(xì)部分的柱形形狀或者從底部向前端部逐漸變細(xì)并在前端部又變粗的蘑菇形狀，均能獲得突起物101的功能。
突起物101與培養(yǎng)面基底110一樣也由聚苯乙烯制成，兩者連接形成一體。
由于突起物101的前端部比突起物101的底面部細(xì)并呈末端張開形狀，因此，能夠獲得突起物101難以從培養(yǎng)面基底110脫落的效果。而且，由于突起物101與培養(yǎng)面基底110的材料相同，并且，兩者形成一體，因此，能夠進(jìn)一步加強(qiáng)不會(huì)從基板上脫落的效果。
在本實(shí)施例中，雖然突起物101與培養(yǎng)面基底110的材料使用了聚苯乙烯，但是，也可根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞種類、細(xì)胞培養(yǎng)容器100的使用方法，在前面列舉的可作為細(xì)胞培養(yǎng)容器100的材料中進(jìn)行選擇。在后面所述的制造方法中，通過根據(jù)不同的材料改變條件，從而能夠經(jīng)過同樣的工序進(jìn)行制造。
圖1是由本實(shí)施例制成的細(xì)胞培養(yǎng)容器100的模式圖。細(xì)胞培養(yǎng)容器100全體均采用了前面所述分子量的聚苯乙烯材料，并且，具有具有突起物101的培養(yǎng)面102和培養(yǎng)面?zhèn)缺?03。培養(yǎng)面102為一片邊長(zhǎng)1cm的正方形，培養(yǎng)面?zhèn)缺?03圍繞培養(yǎng)面102大致垂直豎立，其高度為0.7mm。此外，細(xì)胞培養(yǎng)容器100在中央部形成了二個(gè)培養(yǎng)面102，相互之間相隔5mm的距離。
上述細(xì)胞培養(yǎng)容器100利用下述方法制備。圖7是本實(shí)施例中細(xì)胞培養(yǎng)容器100的制備工序。在本方法中，通過納米壓印法形成細(xì)胞培養(yǎng)容器100。先將所述的聚苯乙烯制成的容器原料105(20mm×40mm、厚1mm)加熱至150℃并使其軟化。以4MPa的沖壓壓力、180s的時(shí)間，將形成限定突起物101、培養(yǎng)面102及培養(yǎng)面?zhèn)缺?03的形狀的鎳制模具106壓在軟化的容器原料105上。之后，在不解除加壓壓力的情況下冷卻到35℃后，取出模具106和容器原料105，從容器原料105上垂直地提起模具106，從而使其剝離，從而獲得具有突起物101、培養(yǎng)面102及培養(yǎng)面?zhèn)缺?03的細(xì)胞培養(yǎng)容器100。
模具106的制造方法如圖13所示。圖13(a)所示的第一模具原型部件111是具有限定突起物101、培養(yǎng)面102及培養(yǎng)面?zhèn)缺?03形狀的結(jié)晶方位(100)為1cm方形的雙面研磨硅晶片，第二模具原型部件112是限定培養(yǎng)面?zhèn)缺?03的最上部和其他區(qū)域形狀的20mm×40mm平滑的陽極接合用玻璃板。通過光刻法在第一模具原型部件111上形成與上述細(xì)胞培養(yǎng)容器100上的突起物101相當(dāng)?shù)奈⒓?xì)凹凸形狀，通過刻模機(jī)從直徑為200mm的硅晶片以規(guī)定的尺寸切出后進(jìn)行洗滌。之后，如圖12(b)所示，通過陽極接合法(400℃，1kV)將第一模具原型部件111與第二模具原型部件112接合，以形成模具原型113。這時(shí)，通過第一模具原型部件111的高度確定培養(yǎng)面?zhèn)缺?03的高度，但該高度可通過在第一模具原型部件111與第二模具原型部件112之間設(shè)置規(guī)定的隔板等方法改變。此外，如果在第二模具原型部件112中預(yù)先形成限定了培養(yǎng)面?zhèn)缺诘闹辽僖徊糠中螤畹男螤?，則能以更大的范圍調(diào)整高度。根據(jù)這些隔板和各模具原型部件的材料、接合界面的平滑度及形狀，模具原型部件的接合法除了陽極接合法之外，還可從形成金屬系、無機(jī)系或有機(jī)系粘結(jié)層的方法、熔接法等方法中選擇，由此能夠提高加工精度。用氟系樹脂脫模劑對(duì)模具原型113施予脫模處理之后，如圖13(c)所示，以150℃、10MPa，在20mm×40mm、厚2mm的聚苯乙烯制復(fù)制材料114上加壓，在冷卻到25℃之后，將模具原型113剝離，由此形成模具復(fù)制品115。用無電解電鍍法在模具復(fù)制品115上形成一層鎳薄膜之后，再用電解電鍍法將鎳薄膜增加到3mm的厚度，從而形成模具106。之后，還要在模具106上含有規(guī)定突起物101、培養(yǎng)面102及培養(yǎng)面?zhèn)缺?03的部位的區(qū)域?qū)嵤┧ǖ姆禈渲撃Ｌ幚怼?br> 除了上述電鍍法之外，也可使用復(fù)制成型中使用的納米轉(zhuǎn)印法或鑄造法，形成使用了耐熱性和強(qiáng)度均優(yōu)良的樹脂的模具106，由于后者的形成工序比電鍍法更為簡(jiǎn)單，因此，更為理想。此外，在形成少量試驗(yàn)品的情況下，也可將模具原型113直接用作模具106。
在本實(shí)施例中，可通過在模具106中，在培養(yǎng)面102與培養(yǎng)面?zhèn)缺?03之間加設(shè)與圍繞培養(yǎng)面102設(shè)置的低于培養(yǎng)面102的緩沖面104的形狀，形成前面所述本發(fā)明的第三種形式所示的結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明中，雖然材料采用了厚度為1mm的聚苯乙烯制成的容器原料105，但是，厚度必須根據(jù)所要求的培養(yǎng)面102的面積及培養(yǎng)面?zhèn)缺?03的高度選擇最合適的厚度。例如，在對(duì)于具有大于本實(shí)施例中培養(yǎng)面102的培養(yǎng)面102的細(xì)胞培養(yǎng)容器100中，為了保證操作時(shí)容器整體的剛性，細(xì)胞培養(yǎng)容器100的周邊部或培養(yǎng)面的厚度必須在0.5mm以上。但是，考慮到節(jié)省細(xì)胞培養(yǎng)容器100整體所占的空間及操作性，容器原料105的厚度必須在兼顧上述剛性的前提下選擇最佳值。此外，在培養(yǎng)面102是與廣泛應(yīng)用的微孔板一樣的互相分離的直徑16mm的圓形(相當(dāng)于24孔微孔板)、直徑8mm的圓形(相當(dāng)于96孔微孔板)、直徑4mm的圓形(相當(dāng)于384孔微孔板)、直徑2mm的圓形(相當(dāng)于1536孔微孔板)等時(shí)，則培養(yǎng)面102的厚度、培養(yǎng)面?zhèn)缺?03的厚度可以為小于0.5mm的值。但是，這些微孔板也必須保持作為容器整體的剛性，因此，例如優(yōu)選要在微孔板的邊緣或多個(gè)培養(yǎng)面102之間的區(qū)域中設(shè)置至少厚度為0.5mm以上的區(qū)域。為了賦予這種剛性，在胞培養(yǎng)容器100上形成培養(yǎng)面102之后，另外安裝外框或底板等加強(qiáng)部件。特別是當(dāng)以微孔板形狀形成細(xì)胞培養(yǎng)容器100時(shí)，各培養(yǎng)面102中培養(yǎng)面?zhèn)缺?03的高度大多為1cm左右，但是，該高度可以根據(jù)培養(yǎng)面102的面積改變。特別是在減小培養(yǎng)面102的面積以與上述384孔微孔板或1536孔微孔板相當(dāng)時(shí)，只需要1～100μl左右的必需培養(yǎng)液，因此，培養(yǎng)面?zhèn)缺?03的高度可以取更小的值。
雖然為了防止培養(yǎng)液在培養(yǎng)面102中沉淀，培養(yǎng)面102的形狀最優(yōu)選是圓形，但為了使模具106上的第一模具原型部件111的刻模工序更容易，因此，在本實(shí)施例中培養(yǎng)面102的形狀為正方形。除此之外，根據(jù)培養(yǎng)方法和制造方法、培養(yǎng)面102在細(xì)胞培養(yǎng)容器100上的布置，培養(yǎng)面102的形狀也可采用橢圓形或多邊形等形狀，但形狀沒有特殊限制。培養(yǎng)面102的大小、深度以及培養(yǎng)面102在一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)容器100上的數(shù)量可根據(jù)培養(yǎng)的細(xì)胞系、培養(yǎng)用途來選擇最佳值。例如，雖然在采用細(xì)胞培養(yǎng)容器100作為用于獲得較大培養(yǎng)組織或相同條件下的大量培養(yǎng)細(xì)胞的制備手段時(shí)，可以加大培養(yǎng)面102，但是，若在以試驗(yàn)方式、在多種條件下進(jìn)行分析培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)面102較小，從而具有如微孔板那樣的形狀，該形狀在一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)容器100內(nèi)具有相互分離的許多培養(yǎng)面102，因?yàn)橛糜谂囵B(yǎng)的試劑和細(xì)胞數(shù)量少，因此優(yōu)選。此外，可以根據(jù)培養(yǎng)的用途，在每個(gè)分離的區(qū)域中改變培養(yǎng)面102的突起物101的表面處理，前端部的形狀或直徑、高度等形狀或布置，從而可以測(cè)試由在相同條件下培養(yǎng)相同種類細(xì)胞時(shí)的突起物101的形狀、布置引起的培養(yǎng)細(xì)胞的狀態(tài)變化，或可以形成在培養(yǎng)不同類型的細(xì)胞時(shí)，最適于每一細(xì)胞種類的突起物101的圖形。此外，通過在各個(gè)培養(yǎng)面102中改變面內(nèi)的突起物101的形狀或布置，僅用一個(gè)培養(yǎng)面102就能測(cè)試培養(yǎng)細(xì)胞的狀態(tài)變化，從而可用于如探索最適合該培養(yǎng)細(xì)胞的突起物101的圖形那樣的用途。
下面，對(duì)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例進(jìn)行說明。圖2為由本實(shí)施例制成的細(xì)胞培養(yǎng)容器100的模式圖。細(xì)胞培養(yǎng)容器100中具有突起物101的培養(yǎng)面102采用了與實(shí)施例1分子量相同的聚苯乙烯，培養(yǎng)面?zhèn)缺?03由形狀如圖14所示的高0.7mm的PDMS(聚二甲基硅氧烷、ダウ·コ一ニング公司)形成。培養(yǎng)面102為一片邊長(zhǎng)0.9cm的正方形，培養(yǎng)面?zhèn)缺?03圍繞培養(yǎng)面102大致垂直豎立。此外，在細(xì)胞培養(yǎng)容器100的中央部形成兩處培養(yǎng)面102，它們相互之間相隔5mm。在培養(yǎng)面102上形成的突起物101是底面直徑為500nm、高度為1μm的圓柱形狀，其結(jié)構(gòu)與實(shí)施例1完全相同。
上述細(xì)胞培養(yǎng)容器100由以下所述的方法制成。圖8為本實(shí)施例中細(xì)胞培養(yǎng)容器100的制造工序。先將所述的聚苯乙烯容器原料105(20mm×40mm、厚1mm)加熱至150℃并使其軟化，將形成限定突起物101、培養(yǎng)面102(邊長(zhǎng)1cm的正方形)的形狀的鎳制模具106壓在容器原料105上并以4MPa的壓力加壓180s。之后，在不解除加壓壓力的情況下，冷卻到35℃后，取出模具106和容器原料105，從容器原料105垂直方向上提起模具106，由此實(shí)現(xiàn)剝離，從而形成了突起物101、培養(yǎng)面102。之后，使由其它模具、通過鑄造法形成的圖14所示的PDMS培養(yǎng)面?zhèn)缺?03與培養(yǎng)面102貼緊，獲得細(xì)胞培養(yǎng)容器100。
雖然模具106的制造方法與實(shí)施例1相同，但是，由于培養(yǎng)面?zhèn)缺?03是之后接合的，因此，在模具106中不必形成與該部位相當(dāng)?shù)男螤?。但是，為了增加培養(yǎng)面?zhèn)缺?03的高度，在模具106中可以形成與培養(yǎng)面?zhèn)缺?03下部相當(dāng)?shù)男螤?。此外，雖然在培養(yǎng)面?zhèn)缺?03的形成中也使用了模具，并且，該模具大多用鐵、鎳等金屬制成，但是，根據(jù)加工精度、方便性、可視性等的必要性，也可由有機(jī)樹脂、硅晶片、玻璃等無機(jī)物形成。作為形成培養(yǎng)面?zhèn)缺?03的模具的成型方法，可以根據(jù)其加工精度和模具材料，從之前所述用于形成細(xì)胞培養(yǎng)容器100的模具106的制造方法中選擇。
本實(shí)施例中培養(yǎng)面?zhèn)缺?03的形成方法如圖15所示。在本實(shí)施例中，通過對(duì)厚度為2mm的鎳板116進(jìn)行機(jī)械加工，形成模具117，該模具用于形成與培養(yǎng)面?zhèn)缺?03相當(dāng)?shù)木哂羞呴L(zhǎng)0.90cm、高度1mm的凸起形狀的形狀。之后，對(duì)模具表面實(shí)施氟系脫模處理，使固化前的PDMS與固化劑混合，在模具117中鑄造0.7mm厚后實(shí)施120℃、10分鐘的熱處理，并且在使PDMS固化之后，將其從模具上取下，從而形成培養(yǎng)面?zhèn)缺?03。由于細(xì)胞附著性較低，因此，以此方式形成的PDMS養(yǎng)面?zhèn)缺?03適于細(xì)胞培養(yǎng)容器100。由于PDMS制成的培養(yǎng)面?zhèn)缺?03與培養(yǎng)面102的附著性較高，因此，通過將培養(yǎng)面?zhèn)缺?03緊貼于培養(yǎng)面102上的所定位置處，就能獲得細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)所需的粘附性。此外，培養(yǎng)面102的突起物101如上所述，形成于邊長(zhǎng)為1cm的正方形區(qū)域中，培養(yǎng)面?zhèn)缺?03以覆蓋培養(yǎng)面102的端部0.05cm的方式粘緊，從而能夠使培養(yǎng)面?zhèn)缺?03與突起物101的距離等于作為突起物101的間隔的1μm。此外，在培養(yǎng)所需的細(xì)胞之后，通過除去培養(yǎng)液并使培養(yǎng)面?zhèn)缺?03與培養(yǎng)面102分離，從而易于除去培養(yǎng)面?zhèn)缺?03。因此，可以拆下在觀察時(shí)形成障礙的培養(yǎng)面?zhèn)缺?03，從而非常適于用直立型光學(xué)顯微鏡進(jìn)行高清晰度的觀察或者用掃描型電子顯微鏡對(duì)培養(yǎng)后的細(xì)胞形狀進(jìn)行評(píng)價(jià)。
本實(shí)施例也與實(shí)施例1相同，培養(yǎng)面102的大小、深度以及一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)容器100上培養(yǎng)面102的數(shù)量可根據(jù)培養(yǎng)的細(xì)胞系或培養(yǎng)用途選擇最佳值。例如，在將細(xì)胞培養(yǎng)容器100作為獲得大量相同條件下的培養(yǎng)細(xì)胞的制備手段時(shí)，最好加大培養(yǎng)面102，但是，在多種條件下進(jìn)行試驗(yàn)性分析時(shí)，培養(yǎng)面102較小，若在一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)容器100內(nèi)具有如微孔板那樣的形狀，該形狀具有許多培養(yǎng)面102，則能夠減少培養(yǎng)時(shí)使用的試劑和細(xì)胞數(shù)量，因此優(yōu)選。
下面，對(duì)在本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)容器100實(shí)施適于細(xì)胞培養(yǎng)的表面處理的例子進(jìn)行說明。作為親水化處理，對(duì)通過實(shí)施例1的方法形成突起物101的細(xì)胞培養(yǎng)容器100進(jìn)行氧等離子處理(100W，30s)。使以小于突起物101高度的可涂布50μg/mL的膠原I溶液(Cultrex(注冊(cè)商標(biāo))Bovine Collagen I，溶劑0.02M醋酸水溶液)的由表面親水化PDMS制成的平滑壓模緊貼該細(xì)胞培養(yǎng)容器100內(nèi)部的突起物101的前端部。在除去平滑壓模之后，在室溫下保持1小時(shí)后再用PBS(磷酸緩沖液)洗滌，僅對(duì)突起物101的前端部施加了由膠原I形成的修飾，并進(jìn)行適合細(xì)胞培養(yǎng)的表面處理。
在本實(shí)施例中，雖然在突起物101形成之后，用一種蛋白質(zhì)膠原進(jìn)行了修飾，但處理方法并不局限于此，可以根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞的種類、細(xì)胞培養(yǎng)容器100及突起物101的材料，進(jìn)行氧等離子處理(例如100W，30s)、紫外線照射、浸入過氧化氫水、臭氧水等的親水處理、以氨基、羰基、甲基、CF3基等為代表的官能團(tuán)的導(dǎo)入、以及多聚賴氨酸、白蛋白、膠原蛋白、纖連蛋白、血纖蛋白原、玻連蛋白、層粘連蛋白等蛋白質(zhì)包被等不同的適當(dāng)表面處理。此外，還可通過僅對(duì)突起物101的一部分進(jìn)行表面處理來控制培養(yǎng)細(xì)胞的形狀。
下面，給出了利用本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)容器100進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，提高細(xì)胞剝離性的例子。
圖16為利用實(shí)施例1的方法在本實(shí)施例中制成的細(xì)胞培養(yǎng)容器100的形狀例子。圖17顯示了形成于細(xì)胞培養(yǎng)容器100上的突起物101的排列例子。在本實(shí)施例中，為了研究培養(yǎng)的細(xì)胞的剝離性與培養(yǎng)面102上的突起物101的形狀之間的關(guān)系，在細(xì)胞培養(yǎng)容器100中形成突起物101的直徑R分別為四個(gè)的(a)180nm、(b)240nm、(c)500nm、(d)2μm的四個(gè)培養(yǎng)面102。形成的突起物101的高度H在四個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)容器100中均為1μm。突起物101的排列如圖17所示，為二維正方形格子形狀，相鄰?fù)黄鹞?01的間隔D為直徑R的2倍。這些突起物101連續(xù)形成于各培養(yǎng)面102中并一直延伸到培養(yǎng)面?zhèn)缺?03附近。
為了進(jìn)行剝離性評(píng)價(jià)，在各個(gè)培養(yǎng)面102上將人類間葉系干細(xì)胞(CAMBREX公司、Cyro hMSC No.2051)接種于培養(yǎng)基(CAMBREX公司、ブレツトキツトMSCGM(間葉系干細(xì)胞增殖用培養(yǎng)基))中，并在37℃·5％CO2條件下的孵箱中培養(yǎng)5天。為了進(jìn)行比較，在一般使用的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用器皿(Corning公司)中也以同樣的條件進(jìn)行人類間葉系干細(xì)胞的培養(yǎng)。
經(jīng)5天培養(yǎng)之后，通過培養(yǎng)基中產(chǎn)生的水流剝離各個(gè)培養(yǎng)面102上的人類間葉系干細(xì)胞，從而評(píng)價(jià)其剝離性。水流是通過在250μl用電動(dòng)移液器(EDP Plus EP-250)中安裝容量為200μl的移液器芯，并從各培養(yǎng)面102附近、以相對(duì)于底面呈70度的角度排出培養(yǎng)時(shí)使用的培養(yǎng)基而產(chǎn)生的。
在排出一次培養(yǎng)基后，用顯微鏡觀察各個(gè)培養(yǎng)面102上細(xì)胞的剝離，結(jié)果由表1所示?？梢源_定在本發(fā)明中形成的任一培養(yǎng)面102與作為比較例的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用器皿相比較，其人類間葉系干細(xì)胞的剝離性提高。其表明來自細(xì)胞培養(yǎng)容器100的人類間葉系干細(xì)胞的剝離性決定于突起物101的直徑R，在直徑較大的R＝2μm時(shí)，剝離性最大。因此，表明作為附著性細(xì)胞的人類間葉系干細(xì)胞的附著力在突起物101上變小，剝離性優(yōu)良。此外，即使在任一培養(yǎng)面102上，仍可以在整個(gè)培養(yǎng)面102上觀察到該效果，由此表明在未發(fā)揮突起物101的效果的情況下，附著于培養(yǎng)面102上的人類間葉系干細(xì)胞實(shí)際上是不存在的。
表1

+++剝離非常好，++剝離較好，+能夠剝離，±僅能剝離一點(diǎn)，-完全不能剝離
權(quán)利要求
1.細(xì)胞培養(yǎng)容器，該容器包括具有等效直徑比培養(yǎng)的細(xì)胞細(xì)小的多個(gè)突起物的培養(yǎng)面以及圍繞培養(yǎng)面的培養(yǎng)面?zhèn)缺诘膬蓚€(gè)部位，其特征在于等效直徑比培養(yǎng)的細(xì)胞細(xì)小的突起物形成于整個(gè)培養(yǎng)面，在培養(yǎng)面?zhèn)缺谂c培養(yǎng)面的邊界線上的任意位置與最接近的突起物的距離小于所培養(yǎng)細(xì)胞的直徑。
2.細(xì)胞培養(yǎng)容器，該容器包括具有等效直徑比培養(yǎng)的細(xì)胞細(xì)小的多個(gè)突起物的培養(yǎng)面以及圍繞培養(yǎng)面的培養(yǎng)面?zhèn)缺诘膬蓚€(gè)部位，其特征在于在培養(yǎng)面?zhèn)缺谂c培養(yǎng)面之間還形成有比培養(yǎng)面低的緩沖面，等效直徑比培養(yǎng)的細(xì)胞細(xì)小的突起物形成于整個(gè)培養(yǎng)面，在緩沖面?zhèn)鹊呐囵B(yǎng)面端部的任意位置與最接近的突起物的距離小于培養(yǎng)細(xì)胞的直徑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)容器，其特征在于培養(yǎng)面由培養(yǎng)面?zhèn)缺诜譃?個(gè)以上。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)容器，其特征在于含有表面的突起物的培養(yǎng)面與培養(yǎng)面?zhèn)缺谟上嗤牟牧闲纬桑倚纬梢惑w。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)容器，其特征在于表面的突起物和培養(yǎng)面由相同的材料制成，培養(yǎng)面?zhèn)缺诘闹辽僖徊糠钟膳c培養(yǎng)面不同的材料形成。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)容器，其特征在于表面的突起物和培養(yǎng)面由相同的材料制成，培養(yǎng)面?zhèn)缺诘闹辽僖徊糠挚梢詮呐囵B(yǎng)面上取下。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)容器，其特征在于在培養(yǎng)面?zhèn)缺谏闲纬傻刃е睆奖扰囵B(yǎng)的細(xì)胞細(xì)小的突起物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)容器，其特征在于通過在培養(yǎng)面?zhèn)缺谏闲纬杀砻娼Y(jié)構(gòu)或形成細(xì)胞難附著性的表面修飾，與培養(yǎng)面相比，細(xì)胞難以吸附于培養(yǎng)面?zhèn)缺谏稀?br> 9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)容器，其特征在于所述突起物的間隔小于該細(xì)胞的直徑。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)容器，其特征在于表面的突起物的等效直徑在10nm以上且10μm以下，高度在10nm以上且1mm以下。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)容器，其特征在于培養(yǎng)面?zhèn)缺诰嚯x培養(yǎng)面的高度為0.05mm以上且100mm以下，相對(duì)于培養(yǎng)面的傾斜角度為45度以上。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)容器，其特征在于含有細(xì)胞培養(yǎng)容器的厚度為0.5mm以上的區(qū)域。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)容器，其特征在于在細(xì)胞培養(yǎng)容器的整體或其一部分上實(shí)施親水處理、疏水化處理、金屬層的形成、或有機(jī)物涂覆中任意一種以上的處理。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)容器，其特征在于在細(xì)胞培養(yǎng)容器內(nèi)的特定區(qū)域有選擇地實(shí)施親水處理、疏水化處理、金屬層的形成、或有機(jī)物涂覆中任意一種以上的處理。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)容器，其特征在于對(duì)構(gòu)成細(xì)胞培養(yǎng)容器內(nèi)的突起物的各個(gè)突起物有選擇地實(shí)施親水處理、疏水化處理、金屬層的形成、或有機(jī)物涂覆中任意一種以上的處理。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)容器，其特征在于僅在構(gòu)成細(xì)胞培養(yǎng)容器內(nèi)的突起物的突起群的前端部上實(shí)施親水處理、疏水化處理、金屬層的形成、或有機(jī)物涂覆中任意一種以上的處理。
17.細(xì)胞培養(yǎng)容器的制造方法，其中，所述細(xì)胞培養(yǎng)容器包括具有等效直徑比培養(yǎng)的細(xì)胞細(xì)小的多個(gè)突起物的培養(yǎng)面以及圍繞培養(yǎng)面的培養(yǎng)面?zhèn)缺诘膬蓚€(gè)部位，其特征在于，該方法包括以下工序?qū)⑿螤钆c含有培養(yǎng)面表面的多個(gè)突起物的培養(yǎng)面和培養(yǎng)面?zhèn)缺诘男螤钕喈?dāng)?shù)囊粋€(gè)模具放置在軟化狀態(tài)的容器原料上，在容器原料上形成含有突起物的培養(yǎng)面和培養(yǎng)面?zhèn)缺诘男螤畹墓ば?，和從容器原料上取下模具的工序?br> 18.細(xì)胞培養(yǎng)容器的制造方法，其中，所述細(xì)胞培養(yǎng)容器包括具有等效直徑比培養(yǎng)的細(xì)胞細(xì)小的多個(gè)突起物的培養(yǎng)面以及圍繞培養(yǎng)面的培養(yǎng)面?zhèn)缺诘膬蓚€(gè)部位，其特征在于，該方法包括以下工序?qū)⑿螤钆c含有培養(yǎng)面表面的多個(gè)突起物的培養(yǎng)面相當(dāng)?shù)囊粋€(gè)模具放置在軟化狀態(tài)的容器原料上，在容器原料上形成含有突起物的培養(yǎng)面的形狀的工序，從容器原料上取下模具的工序，和使培養(yǎng)面?zhèn)缺谂c容器原料接合的工序。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的細(xì)胞培養(yǎng)容器的制造方法，其特征在于模具具有確定比圍繞培養(yǎng)面的培養(yǎng)面低的緩沖面的形狀。
20.根據(jù)權(quán)利要求17所述的細(xì)胞培養(yǎng)容器的制造方法，其特征在于還包括切斷制造的細(xì)胞培養(yǎng)容器的一部分的工序。
21.根據(jù)權(quán)利要求17所述的細(xì)胞培養(yǎng)容器的制造方法，其特征在于還包括使制造的細(xì)胞培養(yǎng)容器的培養(yǎng)面與外界隔離的包裝工序。
22.根據(jù)權(quán)利要求17所述的細(xì)胞培養(yǎng)容器的制造方法，其特征在于還包括以比構(gòu)成細(xì)胞培養(yǎng)容器的材料的玻璃化轉(zhuǎn)變點(diǎn)低的溫度對(duì)制造的細(xì)胞培養(yǎng)容器的培養(yǎng)面實(shí)施滅菌處理的工序。
23.培養(yǎng)細(xì)胞，其特征在于該細(xì)胞由權(quán)利要求1所述的細(xì)胞培養(yǎng)容器培養(yǎng)。
24.用于培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)容器，其特征在于該容器包括培養(yǎng)面以及圍繞培養(yǎng)面的培養(yǎng)面?zhèn)缺诘膬蓚€(gè)部位，其中所述培養(yǎng)面具有等效直徑比培養(yǎng)的細(xì)胞細(xì)小的多個(gè)突起物，該培養(yǎng)面由培養(yǎng)面?zhèn)缺诜譃槎鄠€(gè)區(qū)域，培養(yǎng)面?zhèn)缺诰嚯x培養(yǎng)面的高度為0.05mm以上且100mm以下，細(xì)胞培養(yǎng)容器的至少一部分的厚度為0.5mm以上。
25.用于培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)容器，其特征在于該容器包括具有等效直徑比培養(yǎng)的細(xì)胞細(xì)小的多個(gè)突起物的培養(yǎng)面，圍繞培養(yǎng)面的培養(yǎng)面?zhèn)缺冢约霸谂囵B(yǎng)面?zhèn)缺诤团囵B(yǎng)面之間位于比培養(yǎng)面低的位置的緩沖面，該培養(yǎng)面通過培養(yǎng)面?zhèn)缺诒环譃槎鄠€(gè)區(qū)域，該緩沖面的寬度大于培養(yǎng)細(xì)胞的直徑。
26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的細(xì)胞培養(yǎng)容器，其特征在于在培養(yǎng)面?zhèn)缺诘囊徊糠稚闲纬捎糜谇袛嗉?xì)胞培養(yǎng)容器的切口或切割線。
27.根據(jù)權(quán)利要求24所述的細(xì)胞培養(yǎng)容器，其特征在于形成于培養(yǎng)面上的突起物的表面處理、高度、前端部直徑、等效直徑、間隔或布置的至少一種形狀在被分開的每個(gè)區(qū)域均是不同的。
全文摘要
本發(fā)明的目的在于提供細(xì)胞培養(yǎng)容器，其能夠通過簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)防止剝離時(shí)對(duì)細(xì)胞的損傷，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的輸送及舊廢物的排出，同時(shí)，能夠提高這種結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)的培養(yǎng)效率的改善效果。為了實(shí)現(xiàn)上述課題，本發(fā)明提供了一種細(xì)胞培養(yǎng)容器，其特征在于形成具有等效直徑小于在培養(yǎng)容器中培養(yǎng)的細(xì)胞的多個(gè)突起物的培養(yǎng)面以及圍繞培養(yǎng)面的培養(yǎng)面?zhèn)缺?，在培養(yǎng)面?zhèn)缺谂c培養(yǎng)面的邊界線上的任意位置與最接近的突起物的距離小于培養(yǎng)的細(xì)胞直徑。細(xì)胞培養(yǎng)容器的突起物能夠更有效地對(duì)細(xì)胞提供有助于培養(yǎng)細(xì)胞的效果。
文檔編號(hào)C12M3/00GK1876804SQ200610089950
公開日2006年12月13日 申請(qǐng)日期2006年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月30日
發(fā)明者桑原孝介, 宮內(nèi)昭浩, 久野范人 申請(qǐng)人:株式會(huì)社日立制作所