專利名稱：用于細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞處理和樣品滲析的區(qū)室化裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于生長(zhǎng)細(xì)胞、處理細(xì)胞和滲析樣品的裝置及方法。
背景技術(shù)：
集成有半透膜的裝置在細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域具有各種用途。其用途包括高密度細(xì)胞培養(yǎng)、共培養(yǎng)、細(xì)胞感染以及樣品滲析。然而，現(xiàn)有裝置存在限制了它們的效率和實(shí)用性的缺點(diǎn)。
用于高濃度細(xì)胞培養(yǎng)的靜態(tài)膜式裝置已經(jīng)被提出并已商業(yè)化。涉及美國(guó)專利5,693,537(Wilson等)的來(lái)自Integra Biosciences的產(chǎn)品CELLineTM是燒瓶狀的商品化裝置，該裝置利用分子量截留值(MWCO)為10,000的半透滲析膜區(qū)室化成兩個(gè)隔間。這些裝置有利地用于小規(guī)模生產(chǎn)，這是因?yàn)樗鼈円子谑褂?。然而，由于這些裝置利用的是片狀滲析膜，因此它們的放大效率不高。為增加所存在的細(xì)胞的數(shù)量，必須增大滲析膜的表面積。由于膜是片狀的，因此裝置的占地面積(footprint)必須按比例加大。具有大占地面積的裝置不能有效地使用培育箱的空間。此外，當(dāng)滲析膜的表面積增大時(shí)，破裂的可能性增大。另一個(gè)缺點(diǎn)是存在于裝置中的培養(yǎng)基的高度有限，當(dāng)需要更多的培養(yǎng)基以滿足存在于裝置中的增多的細(xì)胞的飼養(yǎng)要求時(shí)，需要增大裝置的占地面積。美國(guó)專利4,748,124(Vogler)和美國(guó)專利6,468,792(Bader)也介紹了區(qū)室化的氣體滲透裝置。Vogler的4,748,124披露了用于間隔作用的滲析膜，而B(niǎo)ader的6,468,792則依賴于微孔膜。不幸的是，它們與CELLineTM產(chǎn)品一樣具有放大的局限性。
已經(jīng)試圖通過(guò)使用半透膜來(lái)區(qū)室化裝置以改善滾瓶。然而，每一種嘗試都有其缺點(diǎn)，并且在市場(chǎng)上也幾乎未取得商業(yè)影響。其缺點(diǎn)包括需要非標(biāo)準(zhǔn)的輥筒機(jī)構(gòu)，不能與移液管接合，與用于貼壁培養(yǎng)的常用材料不相容，以及由于可存在于裝置中的培養(yǎng)基的量受限而導(dǎo)致的放大受限。
美國(guó)專利5,449,617和美國(guó)專利5,576,211(Falkenberg等)描述了由滲析膜區(qū)室化的透氣性滾瓶。通過(guò)利用滲析膜使細(xì)胞和細(xì)胞分泌產(chǎn)物與營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基隔離，能夠增大細(xì)胞和細(xì)胞分泌產(chǎn)物的密度。瓶中所容納的培養(yǎng)基的最大體積是360ml，其中60ml存在于細(xì)胞區(qū)室中而300ml存在于營(yíng)養(yǎng)物區(qū)室中。其放大的潛能受360ml的培養(yǎng)基容量的限制，導(dǎo)致放大時(shí)需采用很大數(shù)量的裝置。而且，它也不適于貼壁培養(yǎng)，這是因?yàn)樗鼰o(wú)法提供用于附著的表面積。此外，由于滲析膜與瓶的旋轉(zhuǎn)軸垂直，因此滲析膜僅當(dāng)瓶的直徑增大時(shí)能夠增大表面積。這限制了物質(zhì)傳遞。
美國(guó)專利5,686,301(Falkenberg等)描述了美國(guó)專利5,449,617和美國(guó)專利5,576,211中所限定裝置的改進(jìn)版。披露了這樣的特征能夠防止由于內(nèi)部壓力而導(dǎo)致?lián)p壞的可折疊覆材。然而，沒(méi)有增加能夠存在于裝置中的培養(yǎng)基的體積。而且，也沒(méi)有解決滲析膜表面積有限的問(wèn)題。此外，它仍然不適于貼壁培養(yǎng)。
Vivascience Sartorius Group銷售涉及Falkenberg等的專利的稱為MiniPERM的產(chǎn)品。最大細(xì)胞間隔艙為50ml并且最大營(yíng)養(yǎng)物艙為400ml。因而，能夠存在于市售裝置中的培養(yǎng)基的最大體積僅有450ml。市售裝置的較小的尺寸、對(duì)常規(guī)滾動(dòng)設(shè)備的需求、不能與傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室移液管一起使用、細(xì)胞剪切的能力、不能對(duì)細(xì)胞進(jìn)行顯微觀察以及缺乏用于貼壁培養(yǎng)的適應(yīng)性都限制了它作為傳統(tǒng)瓶的替代品的價(jià)值。
在美國(guó)專利5,702,945(Nagels等)中披露的裝置試圖通過(guò)改善其培養(yǎng)貼壁細(xì)胞的能力來(lái)改進(jìn)MiniPERM裝置。在細(xì)胞培養(yǎng)室中在氣體滲透膜的內(nèi)表面提供一個(gè)細(xì)胞附著基質(zhì)。盡管貼壁培養(yǎng)是可能的，但相對(duì)于傳統(tǒng)瓶來(lái)說(shuō)，它僅為貼壁細(xì)胞提供了很小的表面。而且，對(duì)細(xì)胞匯合與細(xì)胞形態(tài)的顯微評(píng)價(jià)也沒(méi)有完成。
共培養(yǎng)應(yīng)用通常在像來(lái)自Corning的Transwell裝置這樣的小型裝置中進(jìn)行。這些裝置僅用于非常小規(guī)模的培養(yǎng)。美國(guó)專利5,527,705(Mussi等)試圖通過(guò)使用區(qū)室化的滾瓶來(lái)提供用于大規(guī)模共培養(yǎng)的代替品。瓶由兩個(gè)相同長(zhǎng)度的同軸圓筒狀容器隔開(kāi)，其中內(nèi)部容器處于外部貯藏器的中心。微孔膜將存在于內(nèi)部容器中的細(xì)胞群體與存在于外部貯藏器中的細(xì)胞群體物理區(qū)室化。對(duì)如何防止內(nèi)部容器造成對(duì)存在于外部貯藏器中的接種體的擾動(dòng)沒(méi)有進(jìn)行討論或指引。相反，容器之間0.010英寸至約0.040英寸的推薦間距D表明微孔膜可以穿過(guò)存在于外部貯藏器中的液體。因?yàn)閭鹘y(tǒng)滾瓶的推薦接種體積是170ml～225ml，但與微孔膜的接觸根據(jù)間距D發(fā)生在約15ml～80ml處，所以實(shí)際上確實(shí)存在由微孔膜造成的對(duì)接種體的擾動(dòng)。不幸的是，當(dāng)駐留有細(xì)胞的培養(yǎng)基擾動(dòng)時(shí)，細(xì)胞難以正常接種，原因是細(xì)胞的比重通常與培養(yǎng)基的比重接近。因而，當(dāng)區(qū)室化的滾瓶旋轉(zhuǎn)時(shí)，接種體的擾動(dòng)將會(huì)妨礙細(xì)胞適當(dāng)?shù)爻两档酵獠抠A藏器的內(nèi)表面上。使用優(yōu)選從內(nèi)部容器的第一端延展到第二端的支撐部件來(lái)產(chǎn)生間距D，并將進(jìn)一步擾動(dòng)接種體。因而，盡管用于共培養(yǎng)的滾瓶試圖提供Transwell裝置的良好的代替品，但其幾何形狀妨礙了正常的接種過(guò)程。
美國(guó)專利5,866,400(Palsson等)中描述了采用被微孔膜區(qū)室化的裝置以增大載體與靜止靶細(xì)胞之間的接觸頻率。該方法依賴于0.1微米至約2.0微米的微孔膜以將細(xì)胞保持在一個(gè)區(qū)室中，而載體移動(dòng)穿過(guò)被俘獲的細(xì)胞并穿過(guò)微孔膜。相對(duì)于依賴布朗運(yùn)動(dòng)和改善的感染率的方法來(lái)說(shuō)，上述方法增大了載體與細(xì)胞之間的接觸量。為進(jìn)一步增大感染率，可以使用泵使載體再次循環(huán)回到包含細(xì)胞的區(qū)室中。不幸的是，使用泵增大了方法的復(fù)雜性。
通常使用依賴于滲析膜的裝置來(lái)改變存在于裝置中的樣品的分子組成。將樣品放入由滲析膜構(gòu)成的容器中，并將該容器浸于保存滲析液的第二容器中以控制溶液的最終組成。在市場(chǎng)上有兩種類型的產(chǎn)品占主導(dǎo)地位。第一種由滲析管構(gòu)成，例如由Spectrum Labs銷售并在美國(guó)專利5,324,428(Flaherty)和美國(guó)專利5,783,075(Eddleman等)中所描述的產(chǎn)品。膜的表面積與樣品體積的不適宜的比率是固有的。第二種是由PierceChemical銷售的商品名為Slide-A-Lyzer(美國(guó)專利5,503,741-Clark)的筒式產(chǎn)品。其需要使用注射器和針頭，與移液管相比這不是優(yōu)選的液體處理方法。因?yàn)橐竽な瞧降?，所以也限制了其尺寸，樣品體積約為10ml。因而，其迅速大過(guò)了通常的滲析液容器。此外，隨著未被支撐的片狀膜變得越來(lái)越大，其更容易斷裂。
總的來(lái)說(shuō)，以各種半透膜區(qū)室化的各種裝置用于高密度細(xì)胞培養(yǎng)、共培養(yǎng)、細(xì)胞處理以及樣品滲析的用途。然而，這些膜式裝置固有的缺點(diǎn)限制了它們的效率和實(shí)用性。試圖產(chǎn)生高密度細(xì)胞培養(yǎng)的膜式裝置沒(méi)有提供適于有效放大的幾何形狀。在膜式滾瓶中提供放大的共培養(yǎng)的嘗試沒(méi)能使細(xì)胞以與Transwell裝置或傳統(tǒng)的滾瓶相同的方式沉降。由于在載體循環(huán)時(shí)需要泵，因而使用膜式流通裝置來(lái)增大感染率變得復(fù)雜。對(duì)于樣品滲析，滲析管提供的表面積與樣品體積的比率不佳，Slide-A-Lyzer滲析筒需要使用針頭。需要能夠克服這些缺點(diǎn)的改進(jìn)裝置。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是披露被半透膜區(qū)室化的裝置的多種形式，這些裝置比以前的區(qū)室化的細(xì)胞培養(yǎng)、共培養(yǎng)、細(xì)胞處理和實(shí)驗(yàn)室樣品滲析裝置更好?？梢耘渲迷搮^(qū)室化的裝置，使得在旋轉(zhuǎn)或靜止不動(dòng)的同時(shí)能夠進(jìn)行高密度細(xì)胞培養(yǎng)，進(jìn)行共培養(yǎng)而不會(huì)擾動(dòng)接種體，將液體從一個(gè)區(qū)室物理地移動(dòng)至另一個(gè)區(qū)室，以及更有效地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室樣品的滲析。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式，基礎(chǔ)培養(yǎng)基室和細(xì)胞培養(yǎng)室被半透膜區(qū)室化以形成改進(jìn)的高密度細(xì)胞培養(yǎng)裝置?？梢赃M(jìn)行配置以對(duì)先前的高密度滾瓶在許多方面加以改進(jìn)，包括容納更多的培養(yǎng)基、允許使用移液管、使貼壁細(xì)胞就像在傳統(tǒng)的滾瓶中一樣貼壁、允許像在傳統(tǒng)的滾瓶中一樣進(jìn)行顯微觀察，以及對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的滾瓶架發(fā)揮作用。該新型區(qū)室化裝置的好處包括，能夠增大細(xì)胞和細(xì)胞分泌產(chǎn)物的濃度、使得喂養(yǎng)周期之間的持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)、使傳統(tǒng)滾瓶固有的空間浪費(fèi)量最小化、不會(huì)損失傳統(tǒng)滾瓶固有的理想特征例如易用性、微觀評(píng)價(jià)、移液管連接、以及與標(biāo)準(zhǔn)的滾瓶架相容。還可以配置該實(shí)施方式使其比目前使用的實(shí)驗(yàn)室滲析管或筒更有效地滲析實(shí)驗(yàn)室樣品。
根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方式，形成了改進(jìn)的大規(guī)模共培養(yǎng)裝置。通過(guò)使基礎(chǔ)培養(yǎng)基室和細(xì)胞培養(yǎng)室之間形成幾何關(guān)系，對(duì)現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn)，其保留了傳統(tǒng)滾瓶的理想品質(zhì)，例如均勻的細(xì)胞接種、顯微評(píng)價(jià)、移液管連接以及與標(biāo)準(zhǔn)滾瓶架相容。
根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方式，形成了能夠在滾動(dòng)或靜止時(shí)發(fā)揮作用的改進(jìn)的區(qū)室化裝置。該新型區(qū)室化細(xì)胞培養(yǎng)裝置的優(yōu)點(diǎn)包括能夠在滾動(dòng)或非滾動(dòng)時(shí)發(fā)揮作用。當(dāng)處于非滾動(dòng)位置時(shí)，它相對(duì)于現(xiàn)有的非滾動(dòng)的區(qū)室化裝置的改進(jìn)之處在于，它的配置能夠使半透膜的表面積與培養(yǎng)基體積的比率更高、培養(yǎng)基的高度更大和改善放大的效率。
根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方式，在裝置滾動(dòng)的同時(shí)，液體連續(xù)地從一個(gè)區(qū)室移向另一個(gè)區(qū)室。懸掛室部分地由半透膜制造，能夠使液體通過(guò)。當(dāng)懸掛室周圍的區(qū)室繞其轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)懸掛室保持靜止。實(shí)體部件從環(huán)繞室收集培養(yǎng)基，并利用瓶的滾動(dòng)作用使其沉積在懸掛室中。培養(yǎng)基透過(guò)半透膜又回到環(huán)繞室。
根據(jù)本發(fā)明的另一實(shí)施方式，在裝置中存在懸掛室。滾動(dòng)并配置裝置以使懸掛室運(yùn)動(dòng)，從而模擬搖動(dòng)板(shaker plate)的作用。


圖1A和圖1B顯示了區(qū)室化的裝置，將該裝置配置成當(dāng)以與滾瓶相似的方式滾動(dòng)時(shí)能夠培養(yǎng)細(xì)胞。
圖2A和圖2B顯示了怎樣以移液管將培養(yǎng)基和細(xì)胞培養(yǎng)基導(dǎo)入?yún)^(qū)室化的裝置中。
圖3A、圖3B、圖3C和圖3D顯示了怎樣改變基礎(chǔ)培養(yǎng)基室的幾何形狀以使對(duì)接種體的擾動(dòng)最小化的例子。
圖4A、圖4B、圖4C和圖4D顯示了怎樣將基礎(chǔ)培養(yǎng)基室從接種位置移動(dòng)到喂養(yǎng)位置的例子。
圖5A和圖5B顯示了怎樣形成能夠?qū)⒒A(chǔ)培養(yǎng)基保留在基礎(chǔ)培養(yǎng)基室中的基礎(chǔ)培養(yǎng)基入口蓋的一個(gè)例子。
圖6顯示了當(dāng)區(qū)室化的裝置處于水平位置時(shí)用移液管從基礎(chǔ)培養(yǎng)基室收集基礎(chǔ)培養(yǎng)基的一種配置。
圖7A和圖7B顯示了使圓筒形半透膜與基礎(chǔ)培養(yǎng)基室以液密封方式相匹配的一種配置。圖7C顯示了使半透膜片與基礎(chǔ)培養(yǎng)基室以液密封方式相匹配的一種配置。
圖8A和圖8B顯示了由細(xì)胞培養(yǎng)室收集液體的各種配置。
圖9A、圖9B和圖9C顯示了當(dāng)區(qū)室化的裝置滾動(dòng)時(shí)以上下運(yùn)動(dòng)來(lái)?yè)u動(dòng)區(qū)室化裝置的配置。
圖10顯示了有利于實(shí)驗(yàn)室樣品滲析的區(qū)室化裝置的截面圖。
圖11A顯示了未滾動(dòng)時(shí)起作用的區(qū)室化裝置的剖視圖。圖11B顯示了圖11A的區(qū)室化裝置在滾動(dòng)時(shí)的剖視圖。圖11C、圖11D和圖11E顯示了怎樣構(gòu)造非滾動(dòng)的區(qū)室化裝置以改變半透膜的表面積與細(xì)胞培養(yǎng)基體積的比率并控制通過(guò)半透膜的液體通量的剖視圖。
圖12A顯示了能夠?qū)⒘黧w從一個(gè)區(qū)室物理地轉(zhuǎn)移至另一個(gè)區(qū)室的區(qū)室化裝置。圖12B、圖12C和圖12D顯示了該過(guò)程是如何發(fā)生的。
圖13A、圖13B、圖13C和圖13D顯示了配置有能夠運(yùn)動(dòng)以形成與搖動(dòng)板類似的液體作用的懸掛室的區(qū)室化裝置。
圖14顯示了用于產(chǎn)生實(shí)施例1、實(shí)施例2和實(shí)施例3的數(shù)據(jù)的區(qū)室化裝置的截面圖。
圖15A和圖15B顯示了實(shí)施例4的區(qū)室化裝置，該裝置配置成在非滾動(dòng)位置培養(yǎng)細(xì)胞。
具體實(shí)施例方式
圖1A顯示了區(qū)室化裝置10的剖視圖，將該裝置配置成當(dāng)以與滾瓶相似的方式滾動(dòng)時(shí)能夠培養(yǎng)細(xì)胞。基礎(chǔ)培養(yǎng)基室15存在于區(qū)室化的瓶10中。細(xì)胞培養(yǎng)室20通過(guò)半透膜25與基礎(chǔ)培養(yǎng)基室15隔開(kāi)。蓋子50保護(hù)區(qū)室化的裝置10不受污染。圖1B顯示了圖1A的A-A截面。半透膜25形成了部分基礎(chǔ)培養(yǎng)基室15。基礎(chǔ)培養(yǎng)基30存在于基礎(chǔ)培養(yǎng)基室15中，細(xì)胞培養(yǎng)基35存在于細(xì)胞培養(yǎng)室20中?；A(chǔ)培養(yǎng)基30與細(xì)胞培養(yǎng)基35之間的聯(lián)系通過(guò)半透膜25進(jìn)行。通過(guò)以該方式構(gòu)成區(qū)室化的裝置10，可以在細(xì)胞培養(yǎng)室20中濃縮細(xì)胞和細(xì)胞分泌產(chǎn)物，原因是當(dāng)培養(yǎng)基在基礎(chǔ)培養(yǎng)基室15中進(jìn)行交換時(shí)，細(xì)胞和細(xì)胞分泌產(chǎn)物能夠保留在細(xì)胞培養(yǎng)室20中。當(dāng)在培養(yǎng)區(qū)室20中培養(yǎng)細(xì)胞，并在基礎(chǔ)培養(yǎng)基室15中培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，區(qū)室化的裝置10也可以用于共培養(yǎng)。
半透膜25的特征決定了什么可以允許在基礎(chǔ)培養(yǎng)基30和細(xì)胞培養(yǎng)基35之間通過(guò)，以及什么可以保留在細(xì)胞培養(yǎng)室20中?？梢缘玫降脑S多信息源描述了半透膜25的何種特征對(duì)于特定細(xì)胞的培養(yǎng)應(yīng)用是優(yōu)選的。例如，CELLineTM產(chǎn)品依賴于10,000MWCO再生醋酸纖維素薄膜，已經(jīng)證實(shí)其在高密度單克隆抗體繁殖中極為有效。在需要共培養(yǎng)的情況中，半透膜能夠用于分離細(xì)胞使其不進(jìn)行物理接觸，但是允許所分泌的產(chǎn)物來(lái)回通過(guò)半透膜。微孔膜通常用于共培養(yǎng)應(yīng)用。能夠用于為選擇適宜的半透膜提供指導(dǎo)的信息來(lái)源包括Wilson等的5,693,537、Vogler的4,748,124、Bader的6,468,792、Mussi等的5,527,705、Millipore(Billerica，MA)、Spectrum Laboratories Inc.(Rancho Dominguez，CA)和BiovestInternational(Coon Rapids，MN)。
裝置外殼40可以是任何生物相容性材料。在優(yōu)選實(shí)施方式中，它是剛性的并任選地透明性的。聚苯乙烯是用于燒瓶和滾瓶的常用材料。如果裝置外殼由聚苯乙烯制造，則可以顯示出與傳統(tǒng)裝置相同的附著特性。這有助于科學(xué)家將培養(yǎng)物從傳統(tǒng)燒瓶和滾瓶中按比例縮放至區(qū)室化的裝置中。在優(yōu)選實(shí)施方式中，裝置外殼是圓筒形的以便于滾動(dòng)。然而，其他形狀也是可以的。例如，在美國(guó)專利5,866,419(Meder)中描述的形狀易于集成在設(shè)計(jì)中。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到通過(guò)將圓筒形外殼安裝在非圓筒形裝置外殼上，非圓筒形的裝置外殼的形狀可以適用于滾瓶架?；A(chǔ)培養(yǎng)基室優(yōu)選與裝置外殼的形狀一致以使半透膜至裝置外殼的距離相對(duì)于其周長(zhǎng)是均勻的。
盡管本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)意識(shí)到利用隔膜和無(wú)菌管連接等，可以有很多方法來(lái)構(gòu)建作為封閉系統(tǒng)的區(qū)室化裝置。然而，當(dāng)需要保持傳統(tǒng)裝置的簡(jiǎn)易性時(shí)，使用移液管是有利的。圖2A和圖2B顯示了怎樣用移液管將培養(yǎng)基和細(xì)胞培養(yǎng)基導(dǎo)入?yún)^(qū)室化的裝置中。在圖2A中，使用移液管65將基礎(chǔ)培養(yǎng)基30通過(guò)基礎(chǔ)培養(yǎng)基室入口45分配到基礎(chǔ)培養(yǎng)基室15中。在圖2B中，使用移液管65將細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)基35通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)室入口60分配到細(xì)胞培養(yǎng)室20中。
基礎(chǔ)培養(yǎng)基室的作用是，容納足夠的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以提供適宜的基質(zhì)來(lái)源和適宜的用于廢產(chǎn)物的接收器。因而，首要的設(shè)計(jì)考慮是對(duì)于給定的細(xì)胞用途所需的培養(yǎng)基量。相對(duì)傳統(tǒng)裝置來(lái)說(shuō)增大基礎(chǔ)培養(yǎng)基的體積能夠降低給料頻率。例如，如果存在于傳統(tǒng)滾瓶中的300ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基能夠支持300×106個(gè)細(xì)胞并且需要每天更換，那么將600ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基放入基礎(chǔ)培養(yǎng)基室中能夠使給料計(jì)劃降低至每?jī)商煲淮巍⒓?xì)胞和小體積細(xì)胞培養(yǎng)基放入細(xì)胞培養(yǎng)室中，并將相對(duì)較大體積的培養(yǎng)基放入基礎(chǔ)培養(yǎng)基室中能夠增大細(xì)胞密度。例如，如果在傳統(tǒng)滾瓶中在300ml培養(yǎng)基中通常存在300×106個(gè)細(xì)胞，則將細(xì)胞和10ml細(xì)胞培養(yǎng)基放入細(xì)胞培養(yǎng)室中，并將300ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基放入基礎(chǔ)培養(yǎng)基室中將使細(xì)胞密度增大30倍而不會(huì)改變給料計(jì)劃。
用于基礎(chǔ)培養(yǎng)基室的一個(gè)設(shè)計(jì)思路涉及穿過(guò)半透膜的靜水壓力差。當(dāng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的高度超過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)基的高度時(shí)，例如像圖1B所示，將會(huì)產(chǎn)生穿過(guò)膜的靜水壓力差。因而，來(lái)自基礎(chǔ)培養(yǎng)基室中的液體將傾向于進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)室。應(yīng)當(dāng)注意的是要確保進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)室的液體不會(huì)稀釋存在于細(xì)胞培養(yǎng)基中的重要物質(zhì)，例如血清。該影響可以通過(guò)適當(dāng)選取半透膜而得到控制。所考慮的因素包括MWCO、材料、表面積和膜厚。通常，在給定的靜水壓力差下與超濾半透膜相比，微孔半透膜將更快地使液體通過(guò)該膜。液體通量也與表面積成比例。當(dāng)正確設(shè)計(jì)區(qū)室化裝置時(shí)，應(yīng)當(dāng)對(duì)各種具體情況下的流體通量特征進(jìn)行評(píng)價(jià)。例如，當(dāng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的高度超過(guò)半透膜2.0英寸時(shí)，我們已經(jīng)確定表面積為3cm2的來(lái)自AKZO Noble的10,000MWCO再生纖維素膜在5天內(nèi)幾乎不會(huì)使液體通過(guò)。另一方面，當(dāng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基的初始高度超過(guò)半透膜2.0英寸時(shí)，我們還已經(jīng)確定表面積為3cm2的來(lái)自Nucleopore的0.4微米的微孔膜在5天內(nèi)使液體高度下降了1.75英寸。
基礎(chǔ)培養(yǎng)基的高度可以通過(guò)基礎(chǔ)培養(yǎng)基室的幾何形狀進(jìn)行控制。對(duì)于給定體積的培養(yǎng)基，簡(jiǎn)單構(gòu)建基礎(chǔ)培養(yǎng)基室以增加長(zhǎng)度將降低培養(yǎng)基的高度。因而，靜水壓力差可以由基礎(chǔ)培養(yǎng)基室的幾何形狀而降低。
當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)基的蛋白質(zhì)濃度相對(duì)于基礎(chǔ)培養(yǎng)基而增大時(shí)液體也會(huì)運(yùn)動(dòng)穿過(guò)半透膜，就像細(xì)胞和細(xì)胞分泌產(chǎn)物以高密度存在時(shí)的情況一樣。細(xì)胞培養(yǎng)基的高摩爾滲透壓濃度將拖曳液體由基礎(chǔ)培養(yǎng)基穿過(guò)半透膜。這對(duì)于利用滲析膜區(qū)室化的市售裝置來(lái)說(shuō)是很平常的?？梢哉{(diào)整方案以使任何對(duì)培養(yǎng)基有害的影響最小化。例如，在血清存在于細(xì)胞培養(yǎng)基中，而不是存在于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的應(yīng)用中，CELLineTM產(chǎn)品文獻(xiàn)建議使血清的濃度比在傳統(tǒng)裝置中使用時(shí)增大約5％。在該方式中，液體穿過(guò)滲析膜傳輸而導(dǎo)致的血清的稀釋將不會(huì)使?jié)舛鹊陀诋?dāng)細(xì)胞由深低溫保藏增大規(guī)模時(shí)經(jīng)歷的濃度。
優(yōu)選以最有效使用半透膜的方式構(gòu)建基礎(chǔ)培養(yǎng)間區(qū)室。這可以通過(guò)配置基礎(chǔ)培養(yǎng)基室使其在區(qū)室化裝置旋轉(zhuǎn)時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。這樣做能夠使半透膜的全部表面積變得濕潤(rùn)，并能夠增大基礎(chǔ)培養(yǎng)基與細(xì)胞培養(yǎng)基之間的物質(zhì)傳遞。在共培養(yǎng)的情況中，其中細(xì)胞附著于半透膜上，這樣做能夠增大細(xì)胞存在的表面積并允許所附著的細(xì)胞以與傳統(tǒng)滾瓶相似的方式進(jìn)行氣體交換。
許多設(shè)計(jì)方法可以保證基礎(chǔ)培養(yǎng)基室在區(qū)室化裝置旋轉(zhuǎn)時(shí)旋轉(zhuǎn)，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的那樣?；A(chǔ)培養(yǎng)基室可以向裝置外殼相同的方向或相反的方向旋轉(zhuǎn)。例如，將基礎(chǔ)培養(yǎng)基室與裝置外殼物理連接可以使其按相同方向旋轉(zhuǎn)。應(yīng)當(dāng)選擇并配置物理連接點(diǎn)，以避免干擾液體從細(xì)胞培養(yǎng)室中抽出。允許基礎(chǔ)培養(yǎng)基室向裝置外殼相反方向旋轉(zhuǎn)可以通過(guò)各種方法實(shí)現(xiàn)，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的那樣。在該情況中，圓筒形基礎(chǔ)培養(yǎng)基室和裝置外殼是優(yōu)選的。無(wú)論基礎(chǔ)培養(yǎng)基室是否與裝置外殼物理連接，反向旋轉(zhuǎn)可以僅通過(guò)基礎(chǔ)培養(yǎng)基室與裝置外殼之間的摩擦力而實(shí)現(xiàn)。改變基礎(chǔ)培養(yǎng)基室與裝置外殼之間接觸點(diǎn)的表面拋光可以改變摩擦力。基礎(chǔ)培養(yǎng)基室與裝置外殼之間的齒輪界面是實(shí)現(xiàn)反向旋轉(zhuǎn)的另一種方式。應(yīng)當(dāng)注意的是該界面不會(huì)妨礙細(xì)胞培養(yǎng)基圍繞細(xì)胞培養(yǎng)室的長(zhǎng)度自由移動(dòng)。如果需要與瓶殼物理連接的基礎(chǔ)培養(yǎng)基室反向旋轉(zhuǎn)，則任何允許基礎(chǔ)培養(yǎng)基室朝裝置外殼的相反方向旋轉(zhuǎn)的聯(lián)接都是足夠的。例如，無(wú)摩擦旋轉(zhuǎn)接頭就是一種選擇。
用于基礎(chǔ)培養(yǎng)基室的另一種設(shè)計(jì)考慮涉及其與細(xì)胞培養(yǎng)基室中的細(xì)胞培養(yǎng)基的物理接觸。物理接觸會(huì)造成細(xì)胞培養(yǎng)基中的擾動(dòng)，并影響貼壁細(xì)胞沉積在裝置外殼上的方式，并在懸浮細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用中會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞切變?？蛇x的幾何形狀的例子、和每個(gè)使接種體和細(xì)胞培養(yǎng)基接觸的例子如圖3A、圖3B和圖3C中所示。在圖3A中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基室15A沿整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)室20A延伸。在圖3B中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基室15B沿整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)室20B延伸，但設(shè)計(jì)其輪廓使得基礎(chǔ)培養(yǎng)基室15B在除存在半透膜25的區(qū)域之外的區(qū)域中避免與細(xì)胞培養(yǎng)基35接觸。在圖3C中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基室15C沿整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)室20C延伸，并且與圖3A的構(gòu)造相比，其在裝置外殼40下部的上方抬高了更大的距離。
接種體以不同的方式與每一種構(gòu)造的基礎(chǔ)培養(yǎng)基室接觸。在圖3A中，與細(xì)胞培養(yǎng)基35的接觸沿基礎(chǔ)培養(yǎng)基室15A的長(zhǎng)度進(jìn)行。在圖3B中，與細(xì)胞培養(yǎng)基35的接觸沿基礎(chǔ)培養(yǎng)基室15B的小部分長(zhǎng)度進(jìn)行，該部分長(zhǎng)度優(yōu)選主要由半透膜25構(gòu)成。在圖3C中，未與細(xì)胞培養(yǎng)基35接觸，原因是基礎(chǔ)培養(yǎng)基室15C當(dāng)瓶外殼滾動(dòng)時(shí)保持抬高。當(dāng)使用圖3C的構(gòu)造時(shí)，在細(xì)胞由細(xì)胞培養(yǎng)基35結(jié)種后，有兩種選擇使細(xì)胞培養(yǎng)基通過(guò)半透膜25與基礎(chǔ)培養(yǎng)基聯(lián)系。第一種選擇是通過(guò)增大細(xì)胞培養(yǎng)基室20C中細(xì)胞培養(yǎng)基35的體積直至其與半透膜25接觸。第二種選擇是在接種后降低基礎(chǔ)培養(yǎng)基室15C，如圖3D中所示，以使半透膜25與細(xì)胞培養(yǎng)基35接觸。該第二種選擇與第一種選擇相比允許更小體積的細(xì)胞培養(yǎng)基存在于細(xì)胞培養(yǎng)基室20C中。圖3D顯示了調(diào)換位置以使小體積的細(xì)胞培養(yǎng)基35存在于細(xì)胞培養(yǎng)基室20C中并與半透膜25接觸的基礎(chǔ)培養(yǎng)基室15C。
將基礎(chǔ)培養(yǎng)基室15C移動(dòng)至較低的位置可以通過(guò)許多方式實(shí)現(xiàn)，正如細(xì)胞培養(yǎng)裝置設(shè)計(jì)和機(jī)械工程領(lǐng)域的技術(shù)人員所知的那樣。可以使用各種機(jī)制。一種技術(shù)是利用基礎(chǔ)培養(yǎng)基的重量驅(qū)動(dòng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基室至較低的位置，如圖4A～圖4D中所示。當(dāng)向基礎(chǔ)培養(yǎng)基室中添加培養(yǎng)基時(shí)上述技術(shù)使得基礎(chǔ)培養(yǎng)基室自動(dòng)地移動(dòng)至給料位置。圖4A和圖4D顯示了由區(qū)室化裝置300后部觀察的透視圖，該裝置據(jù)是能夠?qū)崿F(xiàn)上述目的一種配置方式。圖4B顯示了圖4A的區(qū)室化裝置300的后視圖。圖4C顯示了圖4D的區(qū)室化裝置300的后視圖。將基礎(chǔ)培養(yǎng)基室15C固定在無(wú)摩擦的狹縫311中。無(wú)摩擦的狹縫311與和定位環(huán)305配套的連桿310結(jié)合。最佳如圖4B所示，基礎(chǔ)培養(yǎng)基室15C被抬高以使其不會(huì)干擾接種體或細(xì)胞培養(yǎng)基。定位環(huán)305與裝置外殼40作無(wú)摩擦接觸。平衡配重320與定位環(huán)305連接，連桿310直接安裝在定位環(huán)305上與平衡配重320相反的位置上。平衡配重320比基礎(chǔ)培養(yǎng)基室15C重。因而平衡配重320強(qiáng)迫定位環(huán)305旋轉(zhuǎn)直至平衡配重320處于最低點(diǎn)，迫使連桿310和基礎(chǔ)培養(yǎng)基室15C正好位于其上方。重力使得基礎(chǔ)培養(yǎng)基室15C落至狹縫311所允許的最低點(diǎn)。可以改變狹縫311的尺寸以將基礎(chǔ)培養(yǎng)基室15C放置在相對(duì)于裝置外殼40的任何所需的高度。當(dāng)細(xì)胞需要給料時(shí)，向基礎(chǔ)培養(yǎng)基室15C添加基礎(chǔ)培養(yǎng)基可以自動(dòng)地使基礎(chǔ)培養(yǎng)基室15C與細(xì)胞培養(yǎng)基接觸。當(dāng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基室15C的重量超過(guò)平衡配重320的重量時(shí)，由于所添加的基礎(chǔ)培養(yǎng)基的重量，使基礎(chǔ)培養(yǎng)基室15C離開(kāi)中心的任何運(yùn)動(dòng)都將利用重力使其被放置在較低的位置。該運(yùn)動(dòng)可以用移液管使基礎(chǔ)培養(yǎng)基室15C稍微移動(dòng)、僅來(lái)自通過(guò)將區(qū)室化裝置300由層流罩傳送至培養(yǎng)箱的簡(jiǎn)單動(dòng)作、或是來(lái)自裝置外殼40上的輥筒機(jī)構(gòu)的作用而產(chǎn)生。一旦基礎(chǔ)培養(yǎng)基室15C離開(kāi)中心，則形成杠桿臂并且其重量克服了平衡配重320，無(wú)摩擦定位環(huán)305旋轉(zhuǎn)直至基礎(chǔ)培養(yǎng)基室15C變得位于可能的最低點(diǎn)?；_315與裝置外殼40接觸。通過(guò)在基腳315與裝置外殼40之間產(chǎn)生適宜量的摩擦，基礎(chǔ)培養(yǎng)基室15C可以朝裝置外殼40的相反方向滾動(dòng)。
構(gòu)建基礎(chǔ)培養(yǎng)基室以使基礎(chǔ)培養(yǎng)基存在于基礎(chǔ)培養(yǎng)基室中可以通過(guò)許多方式實(shí)現(xiàn)。如果基礎(chǔ)培養(yǎng)基的高度低于基礎(chǔ)培養(yǎng)基室入口的高度，則培養(yǎng)基室入口僅僅是開(kāi)口。然而，如果需要基礎(chǔ)培養(yǎng)基的高度超過(guò)基礎(chǔ)培養(yǎng)基室入口的高度，則需要密封以防止基礎(chǔ)培養(yǎng)基涌入細(xì)胞培養(yǎng)室中。圖5A和圖5B顯示了怎樣形成能夠用于將基礎(chǔ)培養(yǎng)基保留在基礎(chǔ)培養(yǎng)基室中的基礎(chǔ)培養(yǎng)基入口蓋的一個(gè)例子。當(dāng)需要保持諸如燒瓶或滾瓶等傳統(tǒng)裝置的簡(jiǎn)易性時(shí)對(duì)于液體處理能夠使用移液管是有利的。圖5A和圖5B中所示的構(gòu)造適于使移液管進(jìn)入。在圖5A中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基室入口蓋80由移液管65驅(qū)動(dòng)張開(kāi)，螺旋彈簧85由其原始位置被推動(dòng)，基礎(chǔ)培養(yǎng)基30被導(dǎo)入基礎(chǔ)培養(yǎng)基室15D中。當(dāng)將移液管65移開(kāi)時(shí)，螺旋彈簧85推動(dòng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基移液管入口蓋80回到密封位置。這使得基礎(chǔ)培養(yǎng)基室中完全充滿培養(yǎng)基，并當(dāng)區(qū)室化裝置10A如圖5B中所示側(cè)放時(shí)能夠保留培養(yǎng)基30。
當(dāng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基室配置有基礎(chǔ)培養(yǎng)基入口蓋時(shí)，在運(yùn)輸過(guò)程中或使用時(shí)壓力會(huì)在基礎(chǔ)培養(yǎng)基室中累積。運(yùn)輸時(shí)，由于溫度的變化和高度的變化氣體在地面或空運(yùn)時(shí)通常會(huì)發(fā)生膨脹。使用時(shí)，由于溫度的變化培養(yǎng)基會(huì)排出氣體，增大的氣體體積使基礎(chǔ)培養(yǎng)基室中壓力增大。如果加入基礎(chǔ)培養(yǎng)基室中的半透膜的類型不具有足夠的適應(yīng)性，則壓力的增加將會(huì)損壞基礎(chǔ)培養(yǎng)基室的完整性。那些本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)知道當(dāng)壓力增大時(shí)有許多方式可以對(duì)基礎(chǔ)培養(yǎng)基室進(jìn)行排氣。例如，可以在基礎(chǔ)培養(yǎng)基室中裝入傘狀止回閥或提升閥。
當(dāng)使用移液管從基礎(chǔ)培養(yǎng)基室移走培養(yǎng)基時(shí)，使區(qū)室化裝置位于更接近水平而不是垂直的角度將更便于在流動(dòng)罩中進(jìn)行處理。當(dāng)區(qū)室化裝置定位在更接近水平而不是垂直的角度時(shí)，接近基礎(chǔ)培養(yǎng)基室低點(diǎn)的一種方法是在基礎(chǔ)培養(yǎng)基室中形成導(dǎo)管。圖6顯示了能夠?qū)崿F(xiàn)上述目的的一種實(shí)施方式的橫截面。移液管65嵌入移液管接口66中，從而形成了從基礎(chǔ)培養(yǎng)基室15E的低部至移液管65的流體流動(dòng)通路。移液管接口66應(yīng)當(dāng)如此構(gòu)建以使其與移液管65形成密封，但優(yōu)選易于松開(kāi)移液管65以使移液管65不會(huì)與其真空泵脫離。其全部?jī)?nèi)容在此引入的同時(shí)待審的美國(guó)專利申請(qǐng)10/460,850和同時(shí)待審的美國(guó)專利申請(qǐng)60/517,288是提供關(guān)于該特征的指導(dǎo)的信息來(lái)源。
半透膜應(yīng)當(dāng)以液密方式固定在基礎(chǔ)培養(yǎng)基室上。圖7A和圖7B顯示了當(dāng)半透膜25A被擠出時(shí)將半透膜25A安裝在基礎(chǔ)培養(yǎng)基室15F上的一種構(gòu)造。圖7B是圖7A的細(xì)節(jié)A的放大圖。密封墊90與基礎(chǔ)培養(yǎng)基室15F的外殼匹配，半透膜25A放置在密封墊90上，并以液密的方式通過(guò)保持線100固定在密封墊90上。圖7C顯示了通過(guò)粘合劑110固定在基礎(chǔ)培養(yǎng)基室15G上的片狀半透膜25B。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到可以由很多方法使半透膜固定在基礎(chǔ)培養(yǎng)基室上，所述方法包括機(jī)械擠壓、粘合劑、封裝化合物和聲波焊接等。
從細(xì)胞培養(yǎng)室收集液體可以通過(guò)各種方式實(shí)現(xiàn)。圖8A顯示了一種非常簡(jiǎn)單的方法，其中將移液管65以這樣的方式定位以使其頂端與在裝置外殼40A的長(zhǎng)度上延伸的凹槽67接觸。凹槽67提供了用于收入細(xì)胞培養(yǎng)基、和放入移液管65的頂端的部位。輪緣69確保瓶子能夠平滑滾動(dòng)。圖8B顯示了收集細(xì)胞培養(yǎng)基35的另一種方法。區(qū)室化裝置10B垂直取向。移液管65的頂端放入穿過(guò)基礎(chǔ)培養(yǎng)基室15H并進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)室20D中的導(dǎo)管120中。導(dǎo)管120以液密的方式通過(guò)基礎(chǔ)培養(yǎng)基室15H以防止損失基礎(chǔ)培養(yǎng)基30?；A(chǔ)培養(yǎng)基室15H位于距裝置外殼壁41預(yù)定距離的位置從而能夠在導(dǎo)管120的遠(yuǎn)端收集細(xì)胞培養(yǎng)基35。在該方式中，施加于移液管65的真空將細(xì)胞培養(yǎng)基35經(jīng)導(dǎo)管120抽出而進(jìn)入移液管65。導(dǎo)管120的頂端應(yīng)當(dāng)對(duì)移液管65密封，但不會(huì)施加更多的力使得當(dāng)試圖拔出移液管65時(shí)移液管65會(huì)卡在導(dǎo)管120中。同時(shí)待審的美國(guó)專利申請(qǐng)10/460,850和同時(shí)待審的美國(guó)專利申請(qǐng)60/517,288是提供關(guān)于該特征的指導(dǎo)的信息來(lái)源。
在區(qū)室化裝置不是封閉系統(tǒng)的情況中，進(jìn)入基礎(chǔ)培養(yǎng)基室和/或細(xì)胞培養(yǎng)室的入口可以用具有與傳統(tǒng)滾瓶的蓋子相同功能的蓋子蓋住。在處于松開(kāi)位置時(shí)，允許進(jìn)行氣體交換并防止污染。在處于封閉位置時(shí)，能夠捕獲氣體，例如在有5％CO2的環(huán)境存在于細(xì)胞培養(yǎng)室中的情況，不過(guò)區(qū)室化的裝置是在溫暖的室內(nèi)運(yùn)行。如果將區(qū)室化裝置構(gòu)建為封閉系統(tǒng)，可以周期性地噴射氣體以控制氧氣和pH，或至少一部分裝置外殼是透氣性的從而進(jìn)行足夠的氣體交換而維持培養(yǎng)。同時(shí)待審的美國(guó)專利申請(qǐng)10/961,814對(duì)于透氣性裝置外殼提供了有益的參考。
對(duì)于附著細(xì)胞培養(yǎng)，可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的任何方法增大區(qū)室化的裝置內(nèi)用于細(xì)胞附著的表面積。指導(dǎo)來(lái)源包括美國(guó)專利3,941,661、4,317,886、4,824,787、4,829,004、4,912,058或6,130,080中所描述的內(nèi)容。
在需要額外混合細(xì)胞培養(yǎng)基的情況中，例如當(dāng)細(xì)胞培養(yǎng)基的體積非常小時(shí)，半透膜的位置遠(yuǎn)離細(xì)胞培養(yǎng)基部分，和/或由于任何其他原因，其也能夠?qū)崿F(xiàn)。圖9A顯示了當(dāng)區(qū)室化瓶子滾動(dòng)時(shí)以上下運(yùn)動(dòng)來(lái)?yè)u動(dòng)區(qū)室化瓶子的配置。圖9B和圖9C顯示了圖9A在不同時(shí)間點(diǎn)的截面圖。偏心輪140安置在裝置外殼40B的一端的附近。正如圖9B和圖9C中所示，當(dāng)區(qū)室化的瓶子10C旋轉(zhuǎn)時(shí)，偏心輪140升高并降低裝置外殼40B的一端。在該方式中，細(xì)胞培養(yǎng)基35反復(fù)地來(lái)回?fù)u動(dòng)，從而打破可能形成的任何濃度梯度。如果需要，可以將第二偏心輪安裝在裝置外殼的相反末端以提供更有力的搖動(dòng)作用?？梢岳贸膱A之外的其他形狀，例如在點(diǎn)位上產(chǎn)生的簡(jiǎn)單凸出部。在凸出部經(jīng)過(guò)滾瓶架的輥時(shí)裝置外殼將被抬高。在瓶每一端的多于一個(gè)凸出部、和/或多個(gè)凸出部，可以用來(lái)使得搖動(dòng)作用更加劇烈。
也可以使用區(qū)室化裝置來(lái)提供用于滲析實(shí)驗(yàn)室樣品的更有效的裝置。圖10顯示了被配置以實(shí)現(xiàn)該目的區(qū)室化裝置10D的一種實(shí)施方式。滲析液區(qū)室415通過(guò)以前描述的用于形成基礎(chǔ)培養(yǎng)基室的任何一種方式形成。樣品區(qū)室420通過(guò)以前描述的用于形成細(xì)胞培養(yǎng)室的任何一種方式形成。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，半透膜25C的MWCO將小于100,000道爾頓，通常為3,000道爾頓～30,000道爾頓，滲析液區(qū)室415具有正如前述用于基礎(chǔ)培養(yǎng)基入口蓋那樣配置的滲析液區(qū)室入口蓋480，區(qū)室化裝置10D將配置成在滾瓶架中滾動(dòng)，蓋450可以存在以防止樣品435的意外濺出或污染。在使用時(shí)，滲析液430放在滲析液區(qū)室415中，樣品435放在樣品區(qū)室420中。區(qū)室化裝置10D以任何所需速度在滾瓶架中滾動(dòng)。使用在圖9A～圖9C中預(yù)先描述過(guò)的技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)額外的混合。滲析液可以周期性地移走和替換。相比于用于滲析實(shí)驗(yàn)室樣品的其他方法和裝置，該實(shí)施方式的優(yōu)點(diǎn)很多，在回顧美國(guó)專利5,324,428、美國(guó)專利5,783,075和美國(guó)專利5,503,741的現(xiàn)有技術(shù)后可以對(duì)此有最好的理解。較大的樣品體積可以用膜表面積與樣品體積的高比例來(lái)處理，不需要攪棒，不需要在滲析液容器中將裝置適當(dāng)定向，不需要針頭，液體易于以標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室工具如移液管和抽吸器進(jìn)行處理，當(dāng)從滲析液容器中移走滲析膜時(shí)可以避免因液體從滲析膜上滴落而導(dǎo)致的雜亂，易于保持樣品的無(wú)菌性，甚至易于保持滲析液的無(wú)菌性。
可以將區(qū)室化裝置配置成使其在未滾動(dòng)時(shí)發(fā)揮作用。例如，當(dāng)需要減少細(xì)胞切變時(shí)，或當(dāng)無(wú)法得到滾動(dòng)設(shè)備時(shí)不滾動(dòng)是有利的。圖11A顯示了以不需要滾動(dòng)的方式配置的區(qū)室化裝置10E的截面圖。透氣性底部150允許通過(guò)區(qū)室化裝置10E的底部進(jìn)行氣體交換。透氣性材料可以是細(xì)胞培養(yǎng)裝置設(shè)計(jì)領(lǐng)域中的技術(shù)人員所知的任何材料。同時(shí)待審的美國(guó)專利申請(qǐng)10/961,814是能夠提供指導(dǎo)的許多信息來(lái)源之一?；A(chǔ)培養(yǎng)基室15I位于距透氣性底部150預(yù)定距離的位置。細(xì)胞培養(yǎng)室20E包含細(xì)胞培養(yǎng)基35，基礎(chǔ)培養(yǎng)基室15I包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基30。圖11B顯示了區(qū)室化裝置10E如何在滾動(dòng)位置起作用。如前所述，可以進(jìn)入任何一個(gè)區(qū)室。
當(dāng)處于非滾動(dòng)位置起作用時(shí)，細(xì)胞存在于透氣性底部150的附近。細(xì)胞培養(yǎng)基35與基礎(chǔ)培養(yǎng)基30通過(guò)半透膜25D進(jìn)行聯(lián)系。控制細(xì)胞培養(yǎng)基35的體積可以利用基礎(chǔ)培養(yǎng)基室15I與透氣性底部150的距離和與裝置外殼40的距離而實(shí)現(xiàn)。當(dāng)該距離變小時(shí)，對(duì)于任何給定高度的細(xì)胞培養(yǎng)基，體積減小從而濃度增大。在同時(shí)待審的美國(guó)專利申請(qǐng)10/961,814中描述了通過(guò)將培養(yǎng)基放在超過(guò)傳統(tǒng)常識(shí)的高度以獲得優(yōu)點(diǎn)的能力。
該配置的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是平衡穿過(guò)半透膜的靜水壓力的能力。很容易構(gòu)建基礎(chǔ)培養(yǎng)基的體積與細(xì)胞培養(yǎng)基的體積具有高比例的構(gòu)造，但基礎(chǔ)培養(yǎng)基與細(xì)胞培養(yǎng)基之間仍存在微小的高度差。因而，濃度優(yōu)勢(shì)和給料頻率優(yōu)勢(shì)仍然存在，而穿過(guò)半透膜的靜水壓力驅(qū)動(dòng)力減小。如圖11A中所示，細(xì)胞培養(yǎng)基35的高度與基礎(chǔ)培養(yǎng)基30的高度相等，平衡了穿過(guò)半透膜25D的靜水壓力。通過(guò)計(jì)算多種可能的幾何關(guān)系中的一種可以很容易地理解體積差。例如，如果區(qū)室化裝置是圓筒形的，基礎(chǔ)培養(yǎng)基體積將為1100ml而細(xì)胞培養(yǎng)基體積將為295ml，基礎(chǔ)培養(yǎng)基室15I距裝置外殼40C的每一邊為10mm，距透氣性底部150為10mm，細(xì)胞培養(yǎng)基放置在15mm的高度，裝置外殼的直徑為11cm。因而，基礎(chǔ)培養(yǎng)基與細(xì)胞培養(yǎng)基的比率約為3.7，表明細(xì)胞和細(xì)胞分泌蛋白增加，根據(jù)給料計(jì)劃可能增加了大約3.7倍。全部?jī)?nèi)容通過(guò)參考在此引入的同時(shí)待審的美國(guó)專利申請(qǐng)10/961,814給出了關(guān)于培養(yǎng)基高度和對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)與分泌產(chǎn)物的影響的指導(dǎo)。
圖11C、圖11D和圖11E顯示了怎樣改變半透膜的面積與基本培養(yǎng)基體積的比率以改變物質(zhì)傳遞或靜水壓力驅(qū)動(dòng)的流體通量。在圖11C中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基室15J的底部由半透膜25E構(gòu)成，使基礎(chǔ)培養(yǎng)基30在基礎(chǔ)培養(yǎng)基30的較低部位進(jìn)行物質(zhì)傳遞。在圖11D中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基室15K的底部和側(cè)邊由半透膜25F構(gòu)成，使基礎(chǔ)培養(yǎng)基30在其底部和側(cè)邊進(jìn)行物質(zhì)傳遞，因而增大了可以用于物質(zhì)傳遞的表面積。在圖11E中，培養(yǎng)基室15L的側(cè)邊由半透膜25G構(gòu)成，使基本培養(yǎng)基30在其側(cè)邊進(jìn)行物質(zhì)傳遞。
根據(jù)用于半透膜的材料類型和是否滾動(dòng)區(qū)室化裝置，可能需要半透膜外部周圍的結(jié)構(gòu)支撐物。例如，如果半透膜膨脹并牢固地壓在裝置外殼上，則細(xì)胞培養(yǎng)基會(huì)被物理地堵塞或阻礙其移動(dòng)到半透膜的周邊附近。阻止半透膜與裝置外殼進(jìn)行有害的物理接觸可以通過(guò)包括使用稀松組織網(wǎng)的任何方式實(shí)現(xiàn)。如果半透膜外部周圍提供結(jié)構(gòu)支撐物，則網(wǎng)或其它的物理結(jié)構(gòu)應(yīng)當(dāng)允許在使細(xì)胞培養(yǎng)基在半透膜表面周圍運(yùn)動(dòng)的同時(shí)使盡可能多的細(xì)胞培養(yǎng)基與半透膜進(jìn)行接觸。在使用結(jié)構(gòu)支撐物之前，應(yīng)當(dāng)進(jìn)行物質(zhì)傳遞評(píng)價(jià)，以確定相對(duì)于沒(méi)有支撐物來(lái)說(shuō)任何給定的支撐物構(gòu)造的效果。葡萄糖由基礎(chǔ)培養(yǎng)基室至細(xì)胞培養(yǎng)室的傳送速率是測(cè)定結(jié)構(gòu)支撐物對(duì)物質(zhì)傳遞的作用的一種方式。在諸如再生纖維素等親水膜的情況中，傳遞不需要結(jié)構(gòu)支撐物就能夠充分地進(jìn)行。
圖12A、圖12B、圖12C和圖12D顯示了配置成像滾瓶一樣滾動(dòng)的能夠由一個(gè)區(qū)室向另一個(gè)區(qū)室物理傳輸流體的區(qū)室化裝置的圖。區(qū)室化裝置200包含其底部由半透膜230構(gòu)成的懸掛室210。環(huán)繞室220以裝置外殼235為界。懸掛室210以當(dāng)裝置外殼繞其旋轉(zhuǎn)時(shí)保持在原位的方式與裝置外殼235相配合。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的許多任何機(jī)械安裝方法都可以應(yīng)用，包括使用軸承、無(wú)摩擦的單點(diǎn)連接裝置、旋轉(zhuǎn)滑動(dòng)接頭等。當(dāng)將蓋移去時(shí)，入口225允許移液管接近每一個(gè)區(qū)室。在操作時(shí)，當(dāng)區(qū)室化裝置200滾動(dòng)時(shí)收集器240從環(huán)繞室220收集液體并將其傳送至懸掛室210。從圖12A的截面A-A的透視面觀看的圖12B、圖12C和圖12D顯示了對(duì)于在環(huán)繞室220和懸掛室210之間進(jìn)行的液體傳遞各事件的出現(xiàn)順序。在圖12B中，培養(yǎng)基250存在于環(huán)繞室220和懸掛室210中。收集器240浸沒(méi)在存在于環(huán)繞室220中的培養(yǎng)基250中。在圖12C中，區(qū)室化裝置200如旋轉(zhuǎn)箭頭260所示按反時(shí)針?lè)较蛐D(zhuǎn)。收集器240從培養(yǎng)基250中升起并裝滿了培養(yǎng)基250。在圖12D中，區(qū)室化裝置200如旋轉(zhuǎn)箭頭260所示進(jìn)一步按反時(shí)針?lè)较蛐D(zhuǎn)。收集器240位于懸掛室210的上方并以使得培養(yǎng)基250通過(guò)重力排出的方式定向。培養(yǎng)基250脫離收集器240并進(jìn)入懸掛室210。培養(yǎng)基250也穿過(guò)半透膜230，并進(jìn)入環(huán)繞室220。通過(guò)平衡由收集器傳輸至懸掛室的培養(yǎng)基的體積和通過(guò)半透膜離開(kāi)懸掛室的培養(yǎng)基的量，在培養(yǎng)基不斷地從一個(gè)區(qū)室移至另一個(gè)區(qū)室的同時(shí)在每一個(gè)區(qū)室中保持恒定的培養(yǎng)基體積。改變所用的收集器的數(shù)目、收集器的液體容量、旋轉(zhuǎn)速率、半透膜的滲透性、和半透膜的表面積都可以達(dá)成上述平衡。在優(yōu)選實(shí)施方式中，裝置外殼235是圓筒形的以使旋轉(zhuǎn)時(shí)產(chǎn)生平穩(wěn)運(yùn)動(dòng)并且是透明的以便監(jiān)測(cè)流體的流動(dòng)。
該配置有助于進(jìn)行各種應(yīng)用。主要的貢獻(xiàn)是能夠連續(xù)地從一個(gè)區(qū)室向另一個(gè)區(qū)室移動(dòng)液體而不需要泵。例如，如果將要轉(zhuǎn)導(dǎo)造血細(xì)胞，則連續(xù)移動(dòng)載體使其通過(guò)造血細(xì)胞，這樣能夠產(chǎn)生比簡(jiǎn)單布朗運(yùn)動(dòng)更高的接觸頻率。造血細(xì)胞可以放置在懸掛室中，可以選擇半透膜的特性以將所述細(xì)胞保持在懸掛室中，但允許培養(yǎng)基和載體通過(guò)。當(dāng)利用收集器將載體引入懸掛室中時(shí)，在重力作用下載體移向環(huán)繞室，與造血細(xì)胞接觸。沒(méi)有轉(zhuǎn)導(dǎo)造血細(xì)胞并轉(zhuǎn)到環(huán)繞室的載體隨后通過(guò)收集器又回到懸掛室中，并具有另一機(jī)會(huì)來(lái)轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。在該情況中，存在于懸掛室中的培養(yǎng)基不能被完全排盡是重要的，因?yàn)檫@會(huì)造成細(xì)胞死亡。
可以利用該配置的其他例子包括需要以細(xì)胞分泌產(chǎn)物、或任何外部因素灌注每一個(gè)區(qū)室、或用于共培養(yǎng)。在該情況中，細(xì)胞可以位于懸掛室和環(huán)繞室中。環(huán)繞細(xì)胞的流體連續(xù)地從環(huán)繞室移至懸掛室，并重新回來(lái)。
在使用傳統(tǒng)培養(yǎng)裝置的許多應(yīng)用中，它們被放置在搖動(dòng)板上。當(dāng)將區(qū)室化裝置以當(dāng)裝置外殼繞懸掛室旋轉(zhuǎn)時(shí)保持在原位的懸掛室構(gòu)成時(shí)，可以產(chǎn)生類似搖動(dòng)板的作用。圖13A、圖13B、圖13C和圖13D顯示了該區(qū)室化裝置的截面圖。圖13A～圖13D描述了當(dāng)區(qū)室化裝置旋轉(zhuǎn)時(shí)懸掛室和細(xì)胞培養(yǎng)基經(jīng)歷的運(yùn)動(dòng)。優(yōu)選構(gòu)建區(qū)室化裝置使其在標(biāo)準(zhǔn)滾瓶架上滾動(dòng)。區(qū)室化裝置10F與懸掛室210A結(jié)合。圖13A顯示了靜止的懸掛室210A。當(dāng)裝置外殼235A如旋轉(zhuǎn)方向箭頭236所示繞懸掛室210A旋轉(zhuǎn)時(shí)，如圖13B中所示，裝置外殼凸出部275與懸掛室凸出部280接觸并驅(qū)動(dòng)懸掛室離開(kāi)其靜止位置。該接觸迫使懸掛室210A繞其與裝置外殼235A接觸的樞軸點(diǎn)旋轉(zhuǎn)，直至裝置外殼凸出部275不再與懸掛室凸出部280接觸為止，在該點(diǎn)懸掛室210A往回?cái)[動(dòng)通過(guò)其初始位置，如圖13C中所示。由于重力對(duì)懸掛室210A施加力，正如圖13D中所示懸掛室變?yōu)殪o止。對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)基35的攪動(dòng)量可以根據(jù)旋轉(zhuǎn)速率、裝置外殼凸出部與懸掛室凸出部之間的接觸時(shí)間和裝置外殼凸出部的數(shù)量而變化。
在細(xì)胞的培養(yǎng)需要透氣膜的情況中，如圖13A～圖13D中所示的配置有助于周期性地混合細(xì)胞。在該情況中，對(duì)半透膜230A的材料的選擇是基于對(duì)存在于其上的細(xì)胞提供氣體傳輸?shù)哪芰?。美?guó)專利5,693,537是對(duì)于透氣膜材料的選擇提供指導(dǎo)的許多信息來(lái)源中的一個(gè)。共同待審的美國(guó)專利10/961,814描述了怎樣構(gòu)建用于培養(yǎng)細(xì)胞的透氣性裝置，并提供了能夠應(yīng)用于懸掛室210A的設(shè)計(jì)以使培養(yǎng)性能最優(yōu)化的具體設(shè)計(jì)屬性的指導(dǎo)。
實(shí)施例實(shí)施例1用貼壁細(xì)胞對(duì)區(qū)室化裝置的細(xì)胞密度增加和血清使用減少進(jìn)行評(píng)價(jià)如圖14中所示構(gòu)建區(qū)室化裝置試驗(yàn)器具500。通過(guò)改進(jìn)Corning850cm2的滾瓶得到裝置外殼。除去瓶的底部以形成裝置外殼540。如圖所示基礎(chǔ)培養(yǎng)基室515位于裝置外殼540的遠(yuǎn)端。裝置底部541以液密方式安裝，由此完成組裝工序并形成液密細(xì)胞培養(yǎng)室520。半透膜525由長(zhǎng)為1.0英寸直徑為4.4英寸的14,000MWCO纖維素膜構(gòu)成，形成表面積為89cm2的半透膜。由每英寸16股的直徑為0.020英寸的聚丙烯股線構(gòu)成的網(wǎng)530限制半透膜525的膨脹?？捎糜诩?xì)胞附著的裝置外殼540的內(nèi)表面積是存在于基礎(chǔ)培養(yǎng)基室515與入口535之間的表面，約為490cm2。
在相對(duì)于傳統(tǒng)滾瓶的六個(gè)區(qū)室化裝置試驗(yàn)器具500中評(píng)價(jià)粘著CHO細(xì)胞系CHO-ACE005的生長(zhǎng)。對(duì)在高密度下支撐細(xì)胞生長(zhǎng)和減少血清使用的能力進(jìn)行評(píng)估。為評(píng)估區(qū)室化裝置中在高密度下細(xì)胞的生長(zhǎng)，將培養(yǎng)基的體積與生長(zhǎng)表面積的比率減小至適當(dāng)?shù)陀趥鹘y(tǒng)的Corning490cm2的滾瓶對(duì)照的比率。傳統(tǒng)的Corning490cm2的滾瓶對(duì)照包含115ml培養(yǎng)基，而每一個(gè)區(qū)室化裝置試驗(yàn)器具500在細(xì)胞培養(yǎng)室520中僅包含30ml。額外的85ml培養(yǎng)基供給物由基礎(chǔ)培養(yǎng)基室515提供。因而，所有的試驗(yàn)裝置均具有總共115ml培養(yǎng)基，但相對(duì)于傳統(tǒng)瓶中的115ml，區(qū)室化裝置試驗(yàn)器具500中僅有30ml與細(xì)胞直接接觸。
如果區(qū)室化裝置能夠減少血清的使用則能夠獲得進(jìn)一步的好處。為評(píng)價(jià)該潛在的好處，全部六個(gè)區(qū)室化裝置試驗(yàn)器具500在細(xì)胞培養(yǎng)室520中都具有10％的血清。三個(gè)區(qū)室化裝置試驗(yàn)器具500在基礎(chǔ)培養(yǎng)基室515中具有10％的血清，三個(gè)區(qū)室化裝置試驗(yàn)器具500在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中沒(méi)有血清。
將DMEM培養(yǎng)基用于所述補(bǔ)充有血清的全部裝置。所有的裝置在37℃、95％相對(duì)濕度(RH)和5％CO2下以1RPM(轉(zhuǎn)/分鐘)旋轉(zhuǎn)。
將貼壁細(xì)胞以PBS沖洗，并用兩輪胰蛋白酶處理(0.25％胰島素，1mMEDTA·4Na)收集。使用錐蟲(chóng)藍(lán)使細(xì)胞染色以確定生存能力并用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)。細(xì)胞密度，在表E1中定義為“細(xì)胞/ml”，由每ml細(xì)胞培養(yǎng)基計(jì)算。因而，將從每一個(gè)區(qū)室化裝置試驗(yàn)器具回收的細(xì)胞總量除以30ml，而將從每一個(gè)滾瓶對(duì)照回收的細(xì)胞總量除以115ml。將所有值取平均并將結(jié)果總結(jié)于表E1中。
表E1

表E1清楚地顯示了區(qū)室化裝置能夠使細(xì)胞培養(yǎng)更為有效的能力。盡管血清的使用減小了10倍以上，但所培養(yǎng)的能生存的細(xì)胞的數(shù)量并未受到妨礙。此外，培養(yǎng)基中細(xì)胞濃度增加了近4倍。
實(shí)施例2用懸浮細(xì)胞對(duì)區(qū)室化裝置的抗體密度增加和血清使用減少進(jìn)行評(píng)價(jià)如前述實(shí)施例1中所述構(gòu)建4個(gè)γ-輻射過(guò)的區(qū)室化裝置試驗(yàn)器具500，并如圖14中所示。進(jìn)行試驗(yàn)以評(píng)價(jià)相對(duì)于傳統(tǒng)滾瓶區(qū)室化裝置試驗(yàn)器具增大所分泌抗體密度、增加所分泌抗體的量和減少血清的能力。
將分泌IgG單克隆抗體的22×106個(gè)鼠雜交瘤細(xì)胞懸浮在25ml培養(yǎng)基中并接種至每一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)室520中，將75ml培養(yǎng)基放入每一個(gè)基礎(chǔ)培養(yǎng)基室515中。將分泌IgG單克隆抗體的22×106個(gè)鼠雜交瘤細(xì)胞懸浮在100ml培養(yǎng)基中并接種至傳統(tǒng)的Corning490cm2的滾瓶對(duì)照中。每天監(jiān)測(cè)葡萄糖的消耗量。對(duì)于傳統(tǒng)的Corning490cm2的滾瓶對(duì)照和兩個(gè)區(qū)室化裝置試驗(yàn)器具500中的所有培養(yǎng)基來(lái)說(shuō)，F(xiàn)BS血清濃度都為10％。然而，兩個(gè)區(qū)室化裝置試驗(yàn)器具500在細(xì)胞培養(yǎng)室520中包含10％濃度的FBS血清，而在基礎(chǔ)培養(yǎng)基室515中沒(méi)有FBS血清。所有裝置在37℃、95％RH和5％CO2的環(huán)境條件下以1RPM旋轉(zhuǎn)。每5天從每一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)室520和滾瓶對(duì)照中收集樣品。進(jìn)行ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)以確定抗體產(chǎn)量。結(jié)果如表E2.1和E2.2所示。
表E2.1與滾瓶對(duì)照比較的區(qū)室化裝置試驗(yàn)器具中單克隆抗體的濃度

表E2.1證明，相對(duì)于傳統(tǒng)滾瓶對(duì)照來(lái)說(shuō)，每一個(gè)區(qū)室化裝置試驗(yàn)器具500產(chǎn)生至少增大16倍的IgG單克隆抗體濃度。
表E2.2所產(chǎn)生的單克隆抗體

表E2.2證明，在區(qū)室化裝置試驗(yàn)器具500(n＝4)中產(chǎn)生的抗體的總量與傳統(tǒng)滾瓶對(duì)照(n＝2，根據(jù)不成對(duì)t試驗(yàn)分析p＜0.001)相比至少增大了52％。同樣重要的是，所使用的減少了13倍的FBS血清對(duì)所生成的IgG總量沒(méi)有影響(p＜0.05)。此外，每mg所生成的抗體所用的葡萄糖的量至少減少了28％，表明可以更有效地使用培養(yǎng)基?？偟膩?lái)說(shuō)，區(qū)室化裝置增加產(chǎn)量、濃縮產(chǎn)品的能力導(dǎo)致下游處理時(shí)充分減小了成本。此外，減少使用昂貴的血清能夠降低培養(yǎng)過(guò)程的成本。因而，區(qū)室化裝置遠(yuǎn)比傳統(tǒng)的滾瓶更加優(yōu)異。
實(shí)施例3用懸浮細(xì)胞來(lái)對(duì)區(qū)室化裝置的細(xì)胞密度增大進(jìn)行評(píng)價(jià)除了沒(méi)有網(wǎng)530之外，如圖14中所示構(gòu)造區(qū)室化試驗(yàn)裝置。半透膜525未被限制，并在操作時(shí)由膨脹而擴(kuò)張與裝置外殼540接觸。裝置外殼540在基礎(chǔ)培養(yǎng)基室515與入口535之間擴(kuò)張約7英寸，形成適于細(xì)胞培養(yǎng)的約為600cm2的裝置外殼表面積。
將兩個(gè)區(qū)室化試驗(yàn)裝置和T-175對(duì)照燒瓶基于細(xì)胞密度進(jìn)行比較。培養(yǎng)基由補(bǔ)充有10％Hyclone胎牛血清和1％Gibco青霉素鏈霉素的Hyclone培養(yǎng)基(編號(hào)#SH30382.02)構(gòu)成。培養(yǎng)條件是37℃、95％RH和5％CO2。所有的裝置都以1RPM旋轉(zhuǎn)。每一個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)室520在25ml培養(yǎng)基中接種有25×106個(gè)鼠雜交瘤細(xì)胞。每一個(gè)基礎(chǔ)培養(yǎng)基室515接收170ml培養(yǎng)基。T-175對(duì)照燒瓶在25ml相同培養(yǎng)基中接種有25×106/ml個(gè)鼠雜交瘤細(xì)胞。
所有的試驗(yàn)裝置根據(jù)需要喂養(yǎng)以維持細(xì)胞活力。表E3顯示了最大成活細(xì)胞密度，和在每個(gè)裝置中得到的最大成活細(xì)胞。
表E3

相對(duì)于常用組織培養(yǎng)瓶，區(qū)室化裝置的增大細(xì)胞密度的能力得到了證明。細(xì)胞密度至少增加約600％。
實(shí)施例4用懸浮細(xì)胞對(duì)非滾動(dòng)區(qū)室化裝置的細(xì)胞和細(xì)胞分泌蛋白密度的增加進(jìn)行評(píng)價(jià)進(jìn)行試驗(yàn)以評(píng)價(jià)區(qū)室化裝置在非滾動(dòng)狀態(tài)發(fā)揮作用的能力。形成三個(gè)非滾動(dòng)區(qū)室化裝置的配置，每一個(gè)都具有不同的半透膜表面積。相對(duì)于傳統(tǒng)的T-175燒瓶，對(duì)這些配置進(jìn)行評(píng)價(jià)。在應(yīng)用鼠雜交瘤以獲得單克隆抗體時(shí)，進(jìn)行關(guān)于細(xì)胞密度的比較。
以與圖11E和圖11D中所述的相似的方式構(gòu)造兩種類型的區(qū)室化試驗(yàn)裝置，并進(jìn)一步分別如圖15A和圖15B所示進(jìn)行限定。所述區(qū)室化實(shí)驗(yàn)室裝置以下分別稱為試驗(yàn)裝置600A和試驗(yàn)裝置600B。試驗(yàn)裝置600A和試驗(yàn)裝置600B與細(xì)胞培養(yǎng)基接觸的半透膜的表面積不同。對(duì)于每一個(gè)試驗(yàn)裝置，通過(guò)改進(jìn)Corning850cm2滾瓶來(lái)形成裝置外殼。將瓶的底部除去以形成裝置外殼640。基礎(chǔ)培養(yǎng)基室615位于所示位置。由0.004英寸厚的98cm2二甲基硅酮構(gòu)成的透氣性裝置底部650以液密方式安裝在裝置外殼640上，由此形成液密細(xì)胞培養(yǎng)室620。每一個(gè)裝置中的半透膜625由14,000MWCO纖維素膜構(gòu)成。如圖15A所示，試驗(yàn)裝置600A具有包含圓筒形基礎(chǔ)培養(yǎng)基室615的周邊的半透膜625，半透膜625從基礎(chǔ)培養(yǎng)基室615的底部延伸1.0英寸的高度。如圖15B所示，試驗(yàn)裝置15B具有包含圓筒形基礎(chǔ)培養(yǎng)基室615的周邊，并包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基室615的底部的半透膜625，半透膜625從基礎(chǔ)培養(yǎng)基室615的底部延伸1.0英寸的高度。表4E總結(jié)了兩種類型的區(qū)室化試驗(yàn)裝置和對(duì)照T-175燒瓶。
在Hyclone培養(yǎng)基中培養(yǎng)鼠雜交瘤細(xì)胞。使用標(biāo)準(zhǔn)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器和錐蟲(chóng)藍(lán)排除法監(jiān)測(cè)細(xì)胞數(shù)目和生存能力。每個(gè)區(qū)室化裝置在“0天”時(shí)以鼠雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行接種。結(jié)果如表E4.1所示。
表E4.1

這些結(jié)果清楚地表明了非轉(zhuǎn)動(dòng)區(qū)室化裝置與傳統(tǒng)培養(yǎng)裝置如組織培養(yǎng)瓶相比能夠以更高的密度培養(yǎng)細(xì)胞的能力。重要地是，增大半透膜的表面積能夠產(chǎn)生額外的培養(yǎng)容量而不會(huì)增大裝置的占地面積。這使得能夠更有效地使用空間。
本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行很多改進(jìn)而不會(huì)脫離其精神。因而，本發(fā)明的范圍并不限于所描述的實(shí)施方式。相反，可以根據(jù)所附權(quán)利要求和其等價(jià)方案對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行解釋。各公報(bào)、專利、專利申請(qǐng)和此處引用的參考文獻(xiàn)都在此通過(guò)參考引入。
權(quán)利要求
1.一種區(qū)室化裝置，該區(qū)室化裝置包括(a)裝置外殼，(b)包含半透膜的基礎(chǔ)培養(yǎng)基室，(c)細(xì)胞培養(yǎng)室，(d)基礎(chǔ)培養(yǎng)基室入口，(e)細(xì)胞培養(yǎng)室入口，(f)所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基室的長(zhǎng)度小于所述細(xì)胞培養(yǎng)室的長(zhǎng)度。
全文摘要
一種通用的區(qū)室化細(xì)胞培養(yǎng)裝置(10)，該裝置具有分離區(qū)室(15，20)的選擇透過(guò)性膜(25)，相對(duì)于傳統(tǒng)裝置，裝置(10)能夠提供許多屬性。該裝置可以在滾動(dòng)或靜止時(shí)配置用于高密度細(xì)胞培養(yǎng)、共培養(yǎng)和樣品滲析。該裝置也能夠配置用于在各區(qū)室間連續(xù)移動(dòng)液體。與其他膜式細(xì)胞培養(yǎng)和生物處理裝置相比，該裝置所具備的各種屬性包括更大的細(xì)胞容量、更大的細(xì)胞分泌產(chǎn)物容量、更高的細(xì)胞和產(chǎn)物密度、大的培養(yǎng)基容量、使外部生長(zhǎng)因素的使用最低化、與標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞培養(yǎng)設(shè)備和方案相容、大的放大效率、滾動(dòng)或靜止時(shí)發(fā)揮作用的能力、進(jìn)行灌注而無(wú)需使用泵的能力以及更有效的樣品滲析。
文檔編號(hào)C12M3/06GK1878858SQ200480033137
公開(kāi)日2006年12月13日 申請(qǐng)日期2004年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月10日
發(fā)明者約翰·R·威爾遜, 丹·韋爾奇, 艾莉森·羅貝克, 道格拉斯·A·佩奇 申請(qǐng)人:威爾森沃爾夫制造公司